Pathfinder Herpes Simplex Virus Type 1 og test

Pathfinder Herpes Simplex Virus Type 1 og 2 25215 50 test Til identifikation og typebestemmelse af Herpes Simplex Virus i direkte kliniske prøver og cellekulturisolater. INDHOLDSFORTEGNELSE Leksikon... 1 Formål... 124 Oversigt og Forklaring... 124 Principper for Procedure... 125 Reagenssæt... 125 Advarsler og Forholdsregler... 127 Prøvetagning og Klargøring... 127 Analyseprocedure... 131 Kvalitetskontrol... 132 Fortolkning af Resultater... 133 Begrænsninger... 135 Forventede Værdier... 136 Specifikationer for Særlig Ydeevne... 136 Referencer... 159 123

FORMÅL Pathfinder Direct Antigen Detection System til Herpes Simplex Virus (HSV) Type 1 og 2 er en direkte fluorescerende procedure til identifikation og typebestemmelse af herpes simplex virus i direkte kliniske prøver og cellekulturisolater. En samtidig indsamling af direkte kliniske og cellekulturprøver er nødvendig. Bekræft alle direkte kliniske prøver, som er negative eller har et utilstrækkeligt antal celler, ved hjælp af opfølgningstest af cellekulturisolatet. OVERSIGT OG FORKLARING Laboratoriediagnosen af HSV-infektion er vigtig i flere henseender i patienthåndteringen. En specifik HSV-diagnose kan føre til en hurtig behandling med den rette antivirale agens (1, 2, 3). En specifik diagnose indgår ikke kun i forebyggelsen af en HSV-infektion, men giver også nyttige oplysninger om behandlingen. For visse gravide kvinder med aktivt HSV på fødselstidspunktet kan kejsersnit reducere risikoen for at overføre virussen til det nyfødte barn (4). HSV-typebestemmelsen har en potentiel prognostisk, terapeutisk og epidemiologisk betydning. Infektioner med genital HSV Type 2 (HSV-2) vender oftere tilbage end infektioner med genital HSV Type 1 (HSV-1) (5). Derudover kan HSV-1 og HSV-2 reagere forskelligt på behanding (6). Visse epidemiologiske studier har foreslået en forbindelse mellem HSV-2 og livmoderhalskræft (7). Eftersom andre studier imidlertid har givet modstridende resulater (8), kræves der yderligere forskning for at bevise eller afvise denne forbindelse. HSV-typebestemmelsen kan også være vigtig i andre epidemiologiske studier af HSV-infektion. Den accepterede metode til identifikation af HSV er i øjeblikket isolation af virussen i cellekulturer. Cellekulturmetoderne øger små mængder af virus, men kræver 1 7 dage for at blive fuldført (9). Metoder, der er baseret på konstatering og typebestemmelse af kulturer, omfatter også biologiske metoder som f.eks. plakdannelse i kyllingefosterceller (9), immunologiske metoder ved hjælp af polyklonale antisera til HSV-1 og HSV-2 (9) og restriktionsnukleaseanalyse (10). Det største problem med immunologiske test som f.eks. neutralisering, immunofluorescens og immunoperoxidase er krydsreaktivitet mellem de konventionelle polyklonale antisera. Selvom restriktionsnukleaseanalyse er en pålidelig typebestemmelsesmetode, tager den lang tid at udføre og kræver betragtelig teknisk ekspertise. De seneste fremskridt inden for monoklonal antistofproduktion har frembragt antistoffer, der er meget specifikke for HSV-1 og HSV-2. Kliniske undersøgelser har vist, at disse antistoffer er effektive i diagnosticeringen af HSV-infektioner (11, 12). Pathfinder Direct Antigen Detection System til Herpes Simplex Virus bruger fire fluorescein-konjugerede, monoklonale antistoffer til at identificere og typebestemme HSV i direkte kliniske prøver og cellekulturisolater. Testen kombinerer monoklonale antistoffers 124

specificitet og reproducerbarhed med en direkte fluorescenstests hastighed og enkelhed. Inden for en time efter modtagelsen af en direkte klinisk prøve kan der udføres en formodet identifikation og typebestemmelse af HSV. Direkte kliniske prøver, der er negative eller ikke indeholder et tilstrækkeligt antal celler, kræver en opfølgningstest af cellekulturen. Det er derfor nødvendigt at indsamle cellekultur og direkte prøver samtidigt. Til typebestemmelse af cellekulturisolater tilbyder denne test et simpelt og pålideligt alternativ til restriktionsnukleaseanalyse. PRINCIPPER FOR PROCEDURE Denne test bruger fire fluorescein-konjugerede, monoklonale antistoffer (2 HSV-1, 2 HSV-2) til at identificere og typebestemme herpes simplex virus. HSV-1-antistoffer reagerer over for polypeptider med en omtrentlig molekylær vægt på henholdsvis 150.000 og 85.000 dalton. Et HSV-2- antistof reagerer over for polypeptider med en omtrentlig molekylær vægt på mellem 43.000 og 50.000 daltons. Det andet HSV-2-antistof reagerer over for en polypeptid med en omtrentlig molekylær vægt på 79.000 daltons. Når de monoklonale antistoffer til HSV 1 og HSV 2 bliver tilsat særskilte brønde på en prøveplade reagerer de med de virale agenser i de inficerede celler. En vaskeprocedure fjerner ubundet antistof. Under det fluorescerende mikroskop vises de celler, der er inficeret med HSV, med en særlig æblegrøn fluorescens i forhold til den rødligt farvede baggrund. REAGENSSÆT Til in vitro-diagnosticering Kun til professionel brug Opbevar antistofferne og kontrolpladerne ved 2 8 C. Opbevar fosfatbufret salt ved 2 26 C. Når reagenserne er åbnet, er de alle stabile til og med udløbsdatoen, der er angivet på etiketten, når de opbevares ved de angivne temperaturer og er uden synlige tegn på kontaminering. Hvis der er mistanke om ukorrekt opbevaring eller håndtering af kittet under forsendelsen, så kør testen, men brug kun positive og negative kontroller og hold øje med de forventede resultater. 1. HSV Type 1 monoklonalt antistof, 2,5 ml 2. HSV Type 2 monoklonalt antistof, 2,5 ml Hver flaske indeholder 2,5 ml fluorescein-konjugeret, murint antistof til HSV-1 eller HSV-2 med Evans Blue Counterstain, albomin fra kvægserum, en inhibitor for uspecifik farvning, og 0,1% natriumazid. Det flydende antistof er den aktive opløsning. Fortynding af antistoffet mindsker testens sensitivitet. Tegn på mulig nedbrydning er: Skygge- eller sedimentformationer i flasken. Ændringer i den forventede reaktivitet over for positive og negative kontrolprøver. 125

3. Fosfatbufret salt (PBS), ph 7,3 ± 0,10, 11,34 gm, 2 flasker, kat.nr. 31098 Hver flaske indeholder 11,34 gm fosfatbufret salt, der er forberedt med dibasisk natriumfosfat, monobasisk natriumfosfat og natriumklorid. Opløs indholdet af en flaske i destilleret vand, så volumen er 1 liter. Det forstærkede, fosfatbufrede salt er stabilt i en ubestemt periode ved 2-26 C. I en opløsning er det stabilt i tre måneder ved 2-26 C. Tegn på mulig nedbrydning er: Ændring af ph. Skyggeforekomster, der kan angive mikrobiel kontamination. BEMÆRK! Undgå at bruge reagenser fra andre producenter eller efter udløbsdatoen. Yderligere nødvendigt materiale tilgængeligt hos Bio-Rad 1. Pathfinder -kontrolplader, 5 stk., kat.nr. 12000150 Hver plade indeholder en brønd hver med HSV-1 (American Tissue Culture Collection (ATCC)-stamme F(1)) og HSV-2 (ATCC-stamme MS), der er inficeret med Vero-celler, og to brønde med uinficerede Veroceller. Den fikseringsproces, der er anvendt i produktionen af disse plader, har vist sig at deaktivere HSV. Før hver test skal du fjerne den ene kontrolplade fra køleskabet. Lad pladen få stuetemperatur i folieposen. Ændringer i den forventede reaktivitet over for HSVantistofferne er tegn på mulig nedbrydning. ADVARSEL! Hold om kanten på pladerne. Tryk aldrig på folieposens overflade. 2. Pathfinder -monteringsmedium 2,75 ml, kat. nr. 30693 Hver flaske indeholder 2,75 ml af en Tris-buffer bestående af en glycerolopløsning med en lysblegningshæmmer og konserveringsmiddel. Tegn på mulig nedbrydning omfatter en ændring i den forventede reaktivitet for positive og negative kontroller eller en kraftigere grøn baggrund på kontrolobjektglassene Pathfinder Mounting Medium er specielt udviklet til at kompletere Pathfinder flourescerende antistofprodukter. For et optimalt resultat, bør dette medium anvendes, når direkte prøvemateriale og isolater af cellekulturer skal analyseres med dette Pathfinder -kit. Valgfrit materiale som kan bestilles hos Bio-Rad 1. Pathfinder HSV DFA Collection Slides (90 plader), katalog nr. 30494 2. HSV Type 1 monoklonalt antistof, 5 ml, katalog nr. 30490 3. HSV Type 2 monoklonalt antistof, 5 ml, katalog nr. 30491 126

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Reagenser, der indeholder natriumazid ADVARSEL Antistofferne indeholder 0,1% natriumazid (NaN 3 ). H303: Kan være skadelig ved indtagelse. H313: Kann beim Hautkontakt gesundheitsschädlich sein. P312: I tilfælde af ubehag ring til en GIFTINFORMATION eller en læge. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og dermed danne højeksplosive metalazider. Ved bortskaffelse af væsker skal der skylles med store mængder vand for at forhindre dannelse af azider. Yderligere oplysninger finder du i Manual Guide (Safety Management No. CDC-22), der er udgivet af Centers for Disease Control (13). Affald fra produktet og emballagen skal ske i overensstemmelse med alle gældende lokale og nationale bestemmelser. Sikkerhedsdatabladet er tilgængelig på bio-rad.com og efter anmodning. Kontrolslides Fikseringsprocessen, der anvendes til fremstillingen af Pathfinder kontrolslides, har vist sig at inaktivere HSV. Men slides skal dog altid håndteres og bortskaffes som potentielt smittefarligt materiale. Patientprøver Følg de faste procedurer til forebyggelse af biologiske farer, ved indsamling og behandling af prøver til chlamydiatest. Disse produkter skal dog behandles som potentielt smitsomme ifølge almengyldige forholdsregler og regler for god, klinisk laboratoriepraksis, uafhængigt af deres oprindelse, behandling eller forudgående certificering. Overhold Standard och Universelle forholdsregler; håndter disse reagenser, alt humant blod og alle prøver, som om de kan overføre en smittefarlig sygdom, i et BSL2- laboratorium, og følg retningslinjerne fra gældende Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 17 fra CDC/NIH, Laboratory Biosafety Manual 18 fra WHO eller tilsvarende. Opbevar og bortskaf disse materialer og deres beholdere i overensstemmelse med lokale regulativer og retningslinjer. Viral Isolation Kun laboratorier, der har erfaring med vævskulturprocedurer til viral isolation, må forsøge at isolere HSV. PRØVETAGNING OG KLARGØRING Prøvetagningen er et kritisk trin i identifikationen og typebestemmelsen af herpes simplex-virus. Det personale, der indsamler HSV-prøver, skal være veluddannet for at minimere forekomsten af utilstrækkelige prøver. Nedenfor finder du en anbefalet procedure til indsamling af prøver fra orale, genitale, cervikale læsioner og fra hudlæsioner. Ydeligere oplysninger om prøvetagning kan du finde i referencematerialet om virologiske teknikker (9). 127

ADVARSEL! Følg de faste procedurer til forebyggelse af biologiske farer, når du indsamler og behandler HSV-prøver. Betragt alle prøver og alt materiale, som de kommer i berøring med, som potentielt inficeret, og bortskaf prøverne på korrekt vis. Benyt et relevant desinfektionsmiddel til desinficeringen. Undgå at pipettere med munden. Forebyg dannelse af aerosoler. Se reference 14 efter flere oplysninger om forebyggelse af laboratorieinfektioner. Prøvetagning (orale, genitale og cervikale læsioner og hudlæsioner) til direkte kliniske prøver og cellekulturprøver Nødvendige materialer, der ikke medfølger 1. Steril 27-nål (til åbning af en oral eller genital blære eller en hudblære eller fjerne skorpe på en indtørret læsion). 2. Steril vatpind (til fjernelse af pus fra en ulcerogen læsion). 3. Prøvetagningsmaterialer Sterile vatpinde Brug vatpinde, der ikke hæmmer væksten af HSV eller cellekulturen. Undgå brug af kalciumalginatvatpinde, fordi de kan hæmme væksten af HSV (15). Transportmedium, 0,5 1 ml Brug et transportmedium, der ikke hæmmer væksten af HSV eller cellekulturen. Glasmikroskopplader Brug plader med følgende specifikationer: Brønddiameter: 7 10 mm. Minimumafstand mellem brønde: 5 mm. Antal prøver pr. plade: 1. Tilføj to brønde på almindelige glasplader med en voks- eller raderingspen. HPLC-acetone Opbevar i en glasbeholder. Beholder til transport af prøver til laboratoriet. Boks til opbevaring af standardmikroskopplader. Procedure til indsamling af prøver Bemærk! Vær omhyggelig ved prøvetagningen for at undgå komtaminering af prøvestedet. 1. Afmærk pladen med patientens navn eller identifikationsnummer ved hjælp af en blyant. Placer pladen på en plan flade. 2. Blotlæg læsionens base ved at følge de rette instruktioner nedenfor. Undgå at berøre læsionens base. Bortskaf vatpinden eller nålen i en beholder til biologisk farligt affald. 128

BEMÆRK! Prøver fra vesikulære læsioner foretrækkes fremfor ulcerogene eller udtørrede læsioner, fordi den virale titer øges, når læsionen bliver til et sår, får skorpe og heler. Vesikulær læsion Åbn en cervikal læsion med en steril vatpind. Åbn orale og genitale læsioner og hudlæsioner med en steril 27-nål. Ulcerogen læsion Fjern eventuelt pus fra læsionen med en steril vatpind. Indtørret læsion Løft skorpen af læsionen med en steril nål. 3. Indsaml en cellekulturprøve og en direkte klinisk prøve fra infektionsstedet. BEMÆRK! Undgå at frigøre blod, når du skraber læsionens base med vatpinden. Antistoffer i serummet kan blokere virale antistofbindingssteder eller hæmme viral replikation i cellekulturen. Prøvetagning af cellekultur Skrab læsionens base med en steril vatpind, og placer straks vatpinden i transportmediet til cellekultur. Direkte klinisk prøvetagning a. Skrab læsionens base grundigt med en anden, steril vatpind. Den direkte, kliniske prøve skal indeholde inficerede celler fra læsionens base. b. Tryk og rul vatpinden mod de to brønde på glaspladen, som dækker begge brønde, men sørg for at blive inden for kanten på den enkelte brønd. Undgå at smøre vatpinden på brønden, fordi det kan fremkalde øget cellenedbrydning. c. Undersøg pladen makroskopisk for tilstrækkelig celledækning. Hvis brøndene stadig virker gennemsigtige, skal du gentage trin 3b. Bortskaf vatpinden i en beholder til biologisk farligt affald. d. Lad prøven lufttørre grundigt i 5 10 minutter. Hvis prøven ikke er tør, kan cellerne blive vasket af pladen under fikseringen. e. Skyl pladen med 0,5 ml acetone, og lad det fordampe helt. 4. Send prøverne til laboratoriet til umiddelbar behandling. Undgå ekstreme temperaturer under transport af prøver. Hvis det ikke er muligt at behandle prøverne inden for fire timer, skal du følge anvisningerne for opbevaring. a. Placer den direkte prøveplade i en prøveopbevaringskasse. Opbevar cellekulturprøven og den direkte prøveplade ved 2 8 C i op til 24 timer. b. Ved opbevaring i længere tid: Nedfrys cellekulturprøven til -70 C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Undgå at opbevare cellekulturprøven ved -20 C. 129

Opbevar den direkte prøveplade i en pladeopbevaringskasse ved -20 C i op til 72 timer. Behandling af cellekulturprøver Nødvendige materialer, der ikke medfølger 1. Cellekulturlinje Brug en cellekulturlinje, der er sensitiv over for HSV-infektioner f.eks. human diploid fibroblast, primær kaninnyre, human fosternyre eller abenyre (Vero). BEMÆRK! Valget af cellekulturlinje kan påvirke sensitiviteten af HSV-isolationen for den enkelte cellekultur. 2. Kontrolprøver af cellekultur Negativ kontrolprøve cellekultur, der er inokuleret med transportmedium. Positive kontrolprøver cellekulturer, der er inokuleret med kendte HSV-1- og HSV-2-stammer. HSV-1- og HSV-2-stammer til klargøring af kontrolprøver kan fås hos ATCC, ATCC.org. Se afsnittet Kvalitetskontrol på indlægssedlen for at få flere oplysninger om kontrolprøver af cellekulturer. 3. Andet tilbehør og udstyr til cellekulturprøver kulturmedium, kulturrør osv. 4. Pasteur-pipetter 5. Centrifuge med en kapacitet på 500 X G 6. Glasmikroskopplader Se forrige afsnit efter specifikationer. 7. Stænkbakke eller Coplin-kar til fiksering af plader 8. Kold acetone (2 8 C) 9. Boks til opbevaring af standardmikroskopplader. Procedure for klargøring af plader fra cellekulturisolater BEMÆRK! Håndter patientprøver og kontrolprøver af cellekultur på samme måde. 1. Følg den etablerede metode til isolation af HSV i cellekulturer (9). 2. Når infektionen når en cytopatisk effekt (CPE) på 2 3+, skal du dekantere mediet fra kulturrøret og erstatte det med 1,0 ml fosfatbufret salt (PBS). 3. Skrab cellerne af røret med en Pasteur-pipette af glas. 4. Centrifuger celleopløsningen ved 500 X G i fem minutter. 5. Luft eller dekanter supernatanten, og opløs cellekoncentratet i 50μL PBS. 130

6. Afmærk patient- og kontrolpladen. Overfør ens mængder til de to brønde på pladen, og lad dem lufttørre grundigt i 10 20 minutter. (Den faktiske tørretid afhænger af stuetemperaturen og luftfugtigheden). Hvis prøven ikke er tør, kan cellerne blive vasket af pladen under fikseringen. 7. Undersøg pladen makroskopisk for tilstrækkelig celledækning. Brøndene skal være uigennemsigtige. 8. Fikser pladen i 10 minutter i en stænkbakke, der er fyldt med kold acetone (2 8 C). Lad pladen lufttørre helt. 9. Test pladen for HSV, så snart det er muligt. Hvis det er nødvendigt, kan du opbevare pladen i maksimalt 24 timer ved 2 8 C eller 72 timer ved -20 C. ANALYSEPROCEDURE Medfølgende materialer 1. HSV Type 1 monoklonalt antistof 2. HSV Type 2 monoklonalt antistof 3. Fosfatbufret salt Nødvendige materialer, der ikke medfølger 1. Pathfinder HSV-kontrolplader Bio-Rad Laboratories kat.nr. 12000150 2. Pathfinder -monteringsmedium Bio-Rad Laboratories kat. nr. 30693 3. Destilleret eller afioniseret vand. 4. Kontrolprøver til cellekulturer kræves kun, når du tester cellekulturisolater. Klargør som anvist i afsnittet Prøvetagning og klargøring. 5. Fugtkammer 6. Plastikvaskeflaske 7. Coplin-kar eller stænkbakke til vask af plader 8. Magnetisk rørepind (valgfri) 9. Glasdækstrimmel, 24 mm x 60 mm Bio-Rad Laboratories kat. nr.102610 10.Fluorescerende mikroskop Hvis du vil se prøver, der er farvet med fluoresceinisothiocyanat, skal du bruge et filtersystem, der giver en spændingsbølgelængde på 480 490 nm og en emissionsbølgelængde på 510 nm eller mere. Mikroskopfiltrenes og lyskildens type og tilstand kan påvirke den fluorescerende reaktions intensitet. Procedure for fluorescerende analyse 1. Klargør PBS som beskrevet på side 126. 2. Fjern patientprøve- og kontrolprøveplader fra køleskabet eller fryseren. Lad pladerne med patient- og cellekulturkontrolprøver nå stuetemperatur, mens de er i opbevaringsbeholderne (5 10 minutter). 131

Lad Pathfinder -kontrolpladen få stuetemperatur i folieposen (5 10 minutter). BEMÆRK! Afsnittet Kvalitetskontrol på indlægssedlen anbefaler de rette kontrolprøver til test af de direkte kliniske prøver og cellekulturisolaterne. Se på side 132. 3. Fjern patient- og cellekulturkontrolpladerne fra opbevaringsbeholderne, og afmærk den første brønd på hver plade som HSV-1 og den anden brønd som HSV-2. Fjern Pathfinder -kontrolpladen fra folieposen. Placer alle plader i fugtkammeret. 4. Tilsæt en dråbe (omtrent 30 μl) HSV-1 monoklonalt antistof til den første brønd og en dråbe HSV-2 monoklonalt antistof til den anden brønd på hver patient- og cellekulturkontrolplade. Tilsæt en dråbe af det rette monoklonale antistof til hver brønd på Pathfinder -kontrolpladen. Dæk hver brønd helt med antistof. BEMÆRK! Når du kombinerer HSV-1- og HSV2-antistoffer for at screene for HSV, reduceres testens sensitivitet. 5. Tildæk fugtkammeret, og inkuber pladerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Undgå, at antistofferne tørrer på pladerne. 6. Rens forsigtigt hver plade med et en stråle af PBS. Placer strålen oven over brøndene, så PBS vasker ned over hver brønd. Undgå, at strålen rammer direkte på brøndene. 7. Vask pladerne i 10 15 minutter i et Coplin-kar eller en stænkbakke, der er fyldt med PBS. Udskift bufferen en gang i løbet af denne periode. Bevæg forsigtigt stænkbakken flere gange eller brug en magnetisk rørepind under vaskningen. 8. Fjern hver plade fra PBS-opløsningen, og lad den løbe af på en papirserviet. Anvend 3 4 dråber monteringsmedium pr. plade. Tildæk pladen omhyggeligt, og fjern alle luftbobler. BEMÆRK! Brug altid Pathfinder -monteringsmedium Bio-Rad Laboratories kat.nr. 30693 9. Undersøg pladerne under et fluorescerende mikroskop med en total forstørrelse på 100 400X. Hvis det er nødvendigt, skal du opbevare pladerne et mørkt sted ved 2 8 C og aflæse dem inden for 24 timer. KVALITETSKONTROL Test af direkte kliniske prøver Hvis du vil kontrollere den flurescerende procedures og mikroskopets ydeevne, skal du benytte en Pathfinder -kontrolplade i hver serie af plader med direkte prøver. 132

Test af cellekulturisolater Når du tester cellekulturisolater for HSV, skal du medtage en Pathfinder - kontrolplade og en negativ kulturkontrolplade i hver kørsel. Pathfinder - kontrolpladen bekræfter den fluorescerende procedures og mikroskopets ydeevne. Den negative kulturkontrolprøve tester kontaminationen af cellekulturen og gør det lettere at fortolke patientresultaterne. For hver ny serie af celler eller HSV-antistoffer, skal du evaluere to positive kulturkontrolprøveplader en, der indeholder HSV-1-inficerede celler, og en, der indeholder HSV-2-inficerede celler. Disse plader bekræfter cellekultursystemets ydeevne og omfatter følgende kontrolprøver, som gør det lettere at fortolke patientresultaterne: Positive HSV-1- og HSV-2-kontrolprøver. Interne typebestemmelseskontrolprøver af monoklonale antistoffer (HSV-1-inficerede celler, der er farvet med HSV-2-antistof og vice versa, bør vise sig negative). BEMÆRK! Cellekulturkontrolprøver gør det lettere at fortolke patientresultaterne, fordi: De viser positive og negative reaktioner på den cellelinje, der bruges til patientprøverne. Klargøringen af plader fra kontrol- og patientkulturer er ens. Se i afsnittet Fortolkning af resultater på denne indlægsseddel for at få en nærmere beskrivelse af kontrolprøvernes reaktioner. Gentag testen, hvis kontrolprøverne ikke reagerer korrekt. FORTOLKNING AF RESULTATER Aflæs først kontrolpladerne. Hvis kontrolpladerne viser den rette reaktivitet, skal du fortolke patientprøvepladerne. Gentag testen, hvis kontrolprøverne ikke reagerer korrekt. Nedenfor finder du beskrivelser af de positive og negative resultater. BEMÆRK! Evans Blue Counterstain farver de uinficerede celler og baggrunden for de inficerede celler rød. En mat grøn farvning af hele celler er ikke specifik. Se bort fra farvning af rester uden for cellerne. Positive resultater En positiv prøve viser en specifik æblegrøn fluorescens. HSV-1-inficerede celler viser normalt en cytoplasmisk farvning. HSV-2-inficerede celler kan farve cytoplasmaet, kernen eller begge, afhængigt af infektionscyklussens udviklingsstadie. Når de inficerede celler (af begge HSV-typer) er runde, kan farvningen virke koncentreret om kernen, fordi cytoplasmaet dækker kernen. Farvningsmønsteret kan ikke anvendes som den eneste indikator for HSV-typebestemmelsen. Fortolkning af positivitet og type skal foregå ved hjælp af en bestemt fluorescerende reaktion med en af de monoklonale antistoffer. Uspecifik farvning kan forekomme som ikke-cellebestemt 133

fluorescens eller som en gul eller hvid farve i stedet for den forventede æblegrønne farve. Positiv kontrolprøve Den metode, der anvendes til behandling af kontrolpladerne, kan resultere i morfologiske forskelle i cellerne. Celler, der vokser på en dækstrimmel eller en pladebrønd (som f.eks. Pathfinder -kontrolplader), er normalt aflange. Celler, der er skrabet af kulturer og placeret på plader (f.eks. kulturkontrolplader), er normalt runde. En acceptabel, positiv kontrolprøve skal indeholde mindst 10 celler, der fremviser en specifik fluorescens pr. lavspændingsfelt. Positiv patientprøve En patientprøve, der indeholder en eller flere celler (ikke-overfladiske epitelceller eller kulturceller) viser en specifik æblegrøn fluorescens i den eller de HSV-1- og/eller HSV-2-brønde, der betragtes som positive. Der kan forekomme blandede infektioner med både HSV-1- og HSV-2-inficerede celler. Hvis du vil udelukke muligheden af krydskontamination, skal du placere cellekulturisolaterne på to særskilte plader, før du tester dem for hvert antistof. Negative resulater Negative prøver viser ingen specifik fluorescens. Cellerne bliver røde på grund af baggrundsfarvningen. Prøver, der ikke indeholder et tilstrækkeligt antal ikke-overfladiske epitelceller eller kulturceller, betragtes som utilstrækkelige og kan ikke fortolkes. Negative kontrolresultater En acceptabel, negativ kontrolprøve skal indeholde mindst 50 celler pr. brønd og ikke fremvise nogen specifik fluorescens. De plader, der indeholder færre end 50 celler, er ikke tilstrækkelige til at bestemme et negativt HSV-resultat. Den uspecifikke farvning på pladen skal være minimal. Negative patientprøver En acceptabel direkte prøve skal indeholde mindst 10 ikke-overfladiske epitelceller. En acceptabel kulturprøve skal indeholde mindst 50 celler pr. brønd. Disse prøver betragtes som negative for HSV, hvis både HSV-1- og HSV-2-brønde indeholder tilstrækkelige celler til fortolkning, og ingen af brøndene viser specifik fluorescens. Der kan forekomme nogen uspecifik farvning af celler og rester. BEMÆRK! Direkte kliniske prøver, der er negative eller indeholder et utilstrækkeligt antal celler, kræver en opfølgningstest af cellekulturen. 134

BEGRÆNSNINGER 1. Hvis antistofferne tørrer på pladen under inkubationen, kan en fortolkning af mønsteret blive besværliggjort, og resultaterne kan være ugyldige. 2. Evaluering af prøver med ét af antistofreagenserne udelukker ikke muligheden for en infektion med den anden HSV-type. Sørg derfor for at evaluere prøver med begge antistofreagenser. 3. En uspecifik baggrundsfarvning af patientprøver kan skyldes en film på glaspladen eller absorption af vand fra acetonefiksativet. Mulige løsninger er: Rens glaspladerne med acetone (5 10 minutter), og tør grundigt før de tages i brug. Du kan også bruge de glasplader, der findes i Pathfinder Specimen Collections Kits. Prøv med en ny flaske acetone, og sørg for at skrue hætten helt fast. 4. Denne tests ydeevne for patientprøver, der er indsamlet under eller efter antiviral behandling, er ukendt. 5. En plade, der er klargjort med en direkte klinisk prøve, indeholder muligvis ikke det tilstrækkelige antal celler til at kunne identificere HSVtypen. I så fald er det nødvendigt at isolere virussen i cellekulturen og udføre en fluorescenstest af cellekulturisolatet for at identificere og typebestemme virussen. Følgende fremgangsmåde for prøvetagning og klargøring er afgørende for at opnå de rette prøver: Tag en prøve af hver vesikulære læsion. Skrab læsionens base grundigt nok til at få et antal ikke-overfladiske epitelceller. Tryk og rul vatpinden til den direkte prøve mod pladen for at opnå den rette celledækning. 6. Hvorvidt HSV-isolationen i cellekulturen lykkes, afhænger af korrekt prøvetagning, transport og klargøring. Kun laboratorier, der har erfaring med cellekulturprocedurer til viral isolation, må forsøge at isolere HSV. Et negativt kulturresultat udelukker ikke muligheden af en HSV-infektion hos patienten. Fortolk denne test sammen med patientens kliniske præsentation og andre laboratorieresultater. 7. Se i afsnittet Specifikationer for særlig ydeevne på denne indlægsseddel for at få oplysninger om sensitiviteten i forskellige prøvetagningsituationer. Der findes ikke tilstrækkelige data til at kunne understøtte denne test i andre situationer. 8. De kliniske implikationer ved brug af denne test til prøver fra asymptomatiske patienter er ukendte. 9. Denne test kan påvise ikke-levedygtig (kulturnegativ) HSV eller HSVantigener i direkte kliniske prøver. 135

10.Undgå at bruge direkte prøveresultater som den eneste metode til diagnosticering af HSV, når der overvejes at udføre et kejsersnit. Førkulturresultater (når de findes) og den bedste kliniske vurdering skal have forrang. FORVENTEDE VÆRDIER Se under del 1a, 1b og 2a i Specifikationer for særlig ydeevne. De forventede værdier kan variere, afhængigt af den testede patientgruppe. SPECIFIKATIONER FOR SÆRLIG YDEEVNE 1. HSV-identifikation Sammenligning af Pathfinder HSV-reagenser og cellekulturmetoder a. Direkte kliniske prøver Der blev udført interne undersøgelser af to uafhængige fortolkere til at vurdere Pathfinder -reagensernes evne til at identificere HSV i direkte kliniske prøver. De uafhængige undersøgelsessteder er et statsligt ejet lægeklinik i Vestarmerika og en klinik for kønssygdomme i en storby i Midtvesten. Prøverne til de interne undersøgelser blev taget fra et børnehospital i Østamerika. Prøverne blev taget fra vokse og børn med læsioner, der viste tegn på HSV-infektion. Forskerne indsamlede prøver fra hver patient og sendte dem til laboratoriet til inokulation i en kultur og klargøring af direkte prøveplader. De uafhængige forskere behandlede og evaluerede de direkte prøveplader og oprettede kulturer for de prøver, der var indsamlet det pågældende sted. De direkte prøver fra børnehospitalet i Østamerika blev behandlet og evalueret internt. Børnehospitalets forskere oprettede kulturerne på disse prøver. Alle forskere anvendte humane fibroblastre til cellekulturer. Med henblik på at bekræfte de positive cellekulturresultater blev der forberedt plader fra positive kulturer (2 3+ CPE) og testet for HSV ved hjælp af fluorescerende reagenser. De uafhængige forskere betragtede cellekulturerne som negative for HSV, hvis de ikke viste den karakteristiske CPE inden for syv dages inokulation. Børnehospitalets forskere observerede kulturerne i mindst 14 dage, før de rapporterede et negativt resultat. Tabel 1 viser en oversigt over resultaterne pr. forsker. Af de 165 direkte prøver, der blev indsamlet til undersøgelsen, var 145 egnede til fortolkning. De resterende 20 prøver var uegnede på grund at et utilstrækkeligt antal celler. (Af disse utilstrækkelige prøver var 17 kulturpositive, mens 3 var kulturnegative). Procentdelen af utilstrækkelige prøver varierede pr. forsker ( 6 16 %), hvilket understreger vigtigheden af korrekt prøvetagning og pladeklargøring. For de egnede prøver viste Pathfinder -reagenserne en overordnet 136

sensitivitet på 80 % og en specificitet på 98 % i forhold til cellekulturmetoderne. Table 1 - HSV-identifikation i direkte kliniske prøveresultater pr. forsker SP FP FN SN Utilstrækkelig Pathfinder -reagenser + + - - Cellekulturmetode + - + - Nr. (%) I alt Forsker A 34 0 6 18 11 (16 %) 69 Forsker B 21 1 6 18 3 (6 %) 49 Intern 26 0 8 7 6 (13%) 47 I alt 81 1 20 43 20 165 Sensitivitet = SP SN = 80% Specificitet = SP + FN SN + FP = 98% BEMÆRKNING: SP = sand positiv, FP = falsk positiv, FN = falsk negativ, SN = sand negativ. Tabel 2 viser resultaterne, når de er kategoriseret efter køn og læsionens placering. Disse data angiver ingen markante forskelle i specificiteten og sensitiviteten for genitale læsioner hos mænd og kvinder. Table 2 - HSV-identifikation i direkte kliniske prøveresultater efter køn og læsionens placering Forventet værdi Læsions placering mand kvinde Sensitivitet Specificitet Positiv Negativ SP SN SP SN SP + FN SN + FP SP + FP SN + FN Genital 69 79% 95% 97% 67% 38/48 20/21 38/39 20/30 Genital 43 81% 100% 100% 67% 25/31 12/12 25/25 12/18 Anal 8 3 71% 100% 100% 67% 5/7 4/4 5/5 4/6 Andet 10 11 86% 100% 100% 78% 12/14 7/7 12/12 7/9 Ukendt 1 I alt 88 57 Bemærk! Beregningerne i Tabel 1 og Tabel 2 er baseret på en sammenligning med cellekulturmetoden som reference. b. Cellekulturisolater Forsker A og B evaluerede Pathfinder -reagensernes evne til at identificere HSV i cellekulturisolater. Se i del 1a under Specifikationer for særlig ydeevne for at få en beskrivelse af undersøgelsessteder, patientgrupper og cellekulturmetoder. Cellekulturisola-terne er primært hentet fra genitale og anale læsioner. 137

Forskerne forberedte plader fra HSV-positive og HSV-negative kulturer og testede derefter disse plader for HSV ved hjælp af Pathfinder -reagenserne. Cellekulturerne blev betragtet som positive for HSV, hvis de udviklede karakteristisk CPE inden for syve dages inokulation med en forventet HSV-prøve. de blev betragtet som negative, hvis der ikke forekom CPE efter syv dage. Resultaterne i Tabel 3 viser, at Pathfinder -reagenserne havde en sensitivitet og specificitet på 100 % til sammenligning med cellekulturmetoderne. Table 3 - HSV-identifikation i cellekulturisolater Cellekulturmetode Pathfinder -reagenser Positiv Negativ Positiv 70 0 Negativ 0 41 2. HSV-typebestemmelse a. Sammenligning af typebestemmelsesresultater for direkte kliniske prøver og cellekulturisolater De uafhængige forskere, der er beskrevet i del 1a i dette afsnit, typebestemte de direkte kliniske prøver og de positive cellekulturer (2-3+ CPE) ved hjælp af Pathfinder -reagenser. Tabel 4 præsenterer typebestemmelsesresultaterne for patienter med positive direkte prøver og positive cellekulturer. De typebestemmelsesresultater, der er opnået for de direkte kliniske prøver, stemte i 98 % af tilfældene overens med dem, der blev opnået for cellekulturisolaterne. Ud af 49 HSV-2-isolater var 45 hentet fra genitale læsioner, mens 4 var hentet fra anale læsioner. De seks HSV-1-isolater var hentet fra følgende læsioner: genitale (5) og anale (1). Table 4 - HSV-typebestemmelse af direkte kliniske prøver og cellekulturisolater Cellekulturmetode HSV-1 HSV-2 HSV-1 5 0 Direkte kliniske prøver HSV-2 1* 49 *Det kan ikke udelukkes, at der kan forekomme tekniske fejl i behandlingen af de direkte kliniske prøveplader og kulturprøvepladerne. b. Sammenligning af Pathfinder HSV-reagenser med restriktionsnukleaseanalyse I en særskilt undersøgelse har Bio-Rad og en uafhængigt forsker (C) typebestemt i alt 69 HSV-isolater ved hjælp af restriktionsnukleaseanalyse og ved hjælp af aflæsning af direkte 138

fluorescens i Pathfinder HSV-reagenser. Prøverne til denne undersøgelse bestod af kliniske isolater, der var dyrket i Vero (abenyre)- eller WI-38 (humant fibroblast)-celler, indtil cellerne fremviste 3+ CPE. De interne forskere anvendte en tilpasset Lonsdale-metode (10), mens det uafhængige laboratorium anvendte den metode til restriktionsnukleaseanalyse, som er beskrevet af Arens og Swierkosz (16). Tabel 5 præsenterer resultaterne af denne undersøgelse. Ved typebestemmelse af HSV-1- og HSV-2-isolaterne var overensstemmelsen mellem restriktionsnukleaseanalysen og Pathfinder HSV-reagenser 100 %. Table 5 - HSV-typebestemmelse med Pathfinder -reagenser og restriktionsnukleaseanalyse Restriktionsnukleaseanalyse Pathfinder -reagenser HSV-1 HSV-2 HSV-1 40 0 HSV-2 0 29 3. Krydsreaktivitet Pathfinder HSV monoklonale antistoffer viste ingen krydsreaktioner med de cellelinjer, der blev anvendt til HSV-isolationen. Med undtagelse af Staphylococcus aureus (Cowan-stamme) reagerede antistofferne ikke over for de organismer, der blev testet for krydsreaktivitet. De evaluerede cellelinjer var: Vero (abenyre), HEp-2 (humane epitelceller) og WI-38 (humane fibroblaster). Tabel 6 viser de organismer, der blev testet for krydsreaktivitet. 139

Table 6 - Organismer, der blev testet for krydsreaktivitet HSV-1 monoklonalt antistof Organisme Antal isolater Reaktivitet HSV-2 monoklonalt antistof Antal isolater Reaktivitet Herpes-virusser Cytomegalovirus 10 Negativ 6 Negativ Varicella Zoster-virus 3 Negativ 10 Negativ Epstein Barr-virus (EBV) 1 1 Negativ 1 Negativ Almindelig cellekultur Kontaminanter Mycoplasma orale 1 Negativ 1 Negativ Mycoplasma salivarium 1 Negativ 1 Negativ Mycoplasma arginini 1 Negativ 1 Negativ Mycoplasma hyorheinis 1 Negativ 1 Negativ Acoleplasma laidlarvii 1 Negativ 1 Negativ Andre organismer Candida albicans 1 Negativ 1 Negativ Candida parapsilosis 1 Negativ 1 Negativ Mycoplasma hominis 1 Negativ 1 Negativ Chlamydia trachomatis 1 Negativ 1 Negativ Staphylococcus aureus 2 1 Positiv 1 Positiv (Cowan-stamme) 1 Prøven var en EBV-transformeret cellelinje - P3HR-1. 2 Det antages, at krysreaktion mellem Cowan-stammen for Staphylococcus og de HSV monoklonale antistoffer ikke påvirker fortolkningen af testresultaterne af følgende grunde: Fjernelse af pus fra læsionerne forud for prøvetagningen bør resultere i prøver med ringe eller ingen mængder Staphylococcus aureus. Hvis Staphylococcus aureus forekommer, er der imidlertid tale om en bakteriecelle, der bør skille sig tydeligt ud fra en HSV-inficeret pattedyrcelle. 140

REFERENCES / BIBLIOGRAPHIE / REFERENCIAS / LITERATUR / BIBLIOGRAFIA / REFERÊNCIAS / REFERENCER / REFERENSER 1. Whitley RJ, Alford CA. Antiviral agents: Clinical status report. Hospital Practice V16, 109-121, (1981). 2. Whitley RJ, et al. Infections caused by herpes simplex virus in the immunocompromised host: Natural history and atopical acyclovir therapy. Journal of Infectious Diseases V150, No. 3, 323-329, (1984). 3. Straus SE, Seidlin M, Takiff H. Management of mucocutaneous herpes simplex virus infections. Drugs V27, 364-372, (1984). 4. Nahmias AJ, Keyserling HL, Kerrick GM. Herpes simplex, in Remington JS, Klein JO (eds). Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant Second Edition, 636-678, WB Saunders Co, Philadelphia, (1983). 5. Reeves WC, Corey L, Adams HG, Vontver LA, Holmes KK. Risk of recurrence after first episodes of genital herpes. Relation to HSV type and antibody response. New England Journal of Medicine V305, No. 5, 315-319, (1981). 6. DeClercq E, et al. Comparative efficacy of antiherpes drugs against different strains of herpes simplex virus. Journal of Infectious Diseases V141, No. 5, 563-574, (1980). 7. Nahmias AJ, Norrild B. Oncogenic potential of herpes simplex viruses and their association with cervical neoplasia, in Rapp F (ed). Oncogenic Herpesviruses Volume 2, 24-45, CRC Press Inc, Boca Raton, Florida, (1980). 8. Vonka V, et al. Prospective study on the relationship between cervical neoplasia and herpes simplex type-2 virus. II. Herpes simplex type-2 antibody presence in sera taken at enrollment. International Journal of Cancer V33, 61-66, (1984). 9. Rawls WE. Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 and Herpesvirus Simiae, in Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections Fifth Edition, 309-373. American Public Health Association, Washington, DC, (1979). 10.Lonsdale DM. A rapid technique for distinguishing herpes-simplex virus type 1 from type 2 by restriction-enzyme technology. Lancet 849-852. (April 21, 1979). 11.Nowinski RC, et al. Monoclonal antibodies for diagnosis of infectious diseases in humans. Science V219, 637-644. (1983). 159

12.Goldstein LC, Corey L, McDougall JK, Tolentino E, Nowinski RC. Monoclonal antibodies to herpes simplex viruses: Use in antigenic typing and rapid diagnosis. Journal of Infectious Diseases V147, No. 5, 829-837, (1983). 13.Manual Guide Safety Management No. CDC-22, Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts. Center for Disease Control, Atlanta GA, (April 30, 1976). 14.Pike RM, Richardson JH. Prevention of laboratory infections, in Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections Fifth Edition, 49-63, American Public Health Association, Washington, DC, (1979). 15.Crane LR, Gutterman PA, Chapel T, Lerner AM. Incubation of swab materials with HSV. Journal of Infectious Diseases V141, 531, (1980). 16.Arens MQ, Swierkosz EM. Simplified method for typing herpes simplex virus by restriction endonuclease analysis. Journal of Clinical Microbiology V17, No. 3, 548-551, (1983). 17.US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed. Washington, DC: US Government Printing Office, HHS Publication No. (CDC) 21-1112. December 2009. 18.World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual. 3rd ed. Geneva: World Health Organization, 2004. 160

Bio-Rad Laboratories For Customer Orders and Technical Service Call: 1-800-2-BIO-RAD Website: www.bio-rad.com Bio-Rad Laboratories Main Office: 4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547 Ph. (510) 724-7000, Fx. (510) 741-5824 Also in: AUSTRALIA - Regents Park, Ph. 61-2-9914-2800, Fx. 61-2-9914-2888 AUSTRIA - Vienna, Ph. 43-1-877-8901, Fx. 43-1-876-5629 BELGIUM - Nazareth, Ph. 32-9-385-5511, Fx. 32-9-385-6554 BRAZIL - Rio de Janeiro, Ph. 5521-3461-5202, Fx. 5521-2224-6524 CANADA - Montreal, Ph.1-514-334-4372,Fx. 1-514-334-4415 CZECH REPUBLIC - Prague, Ph. 420-2-41430532, Fx. 420-2-41431642 CHINA - Shanghai, Ph. 86-21-63052255, Fx. 86-21-53964775 DENMARK - Herlev, Ph. 45-4452-1000, Fx. 45-4452-1001 FINLAND - Espoo, Ph. 358-9-804-22-00, Fx. 358-9-804-11-10 FRANCE - Marnes-la-Coquette, Ph. 33-1-4795-6000,Fx. 33-1-4741-9133 GERMANY - Munich, Ph. 49-89-318840, Fx. 49-89-318-84100 HONG KONG - Quarry Bay, Ph. 852-2789-3300, Fx. 852-2789-1257 INDIA - Gurgaon, Ph. 91-124-6398112, Fx. 91-124-6398115 ISRAEL - Rishon Le Zion, Ph. 972-3-9514127, Fx. 972-3-9514129 ITALY - Milan, Ph. 39-02-216091, Fx. 39-02-21609-398 JAPAN - Tokyo, Ph.81-3-5811-6290, Fx. 81-3-5811-6282 KOREA - Seoul, Ph. 82-2-3473-4460, Fx. 82-2-3472-7003 LATIN AMERICA - Miami Lakes, Florida, Ph. 305-894-5950, Fx. 305-894-5960 MEXICO - Mexico D.F., Ph. 5255-5534-2552, Fx. 5255-5524-5555 THE NETHERLANDS - Veenendaal, Ph. 31-318-540666, Fx. 31-318-542216 NEW ZEALAND - Auckland, Ph. 64-9-415-2280, Fx. 64-9-415-2284 NORWAY - Oslo, Ph. 47-23-38-41-30, Fx. 47-23-38-41-39 POLAND - Warsaw, Ph. 48-22-331-99-99, Fx. 48-22-331-99-98 PORTUGAL - Amadora, Ph. 351-21-472-7700, Fx. 351-21-472-7777 RUSSIA - Moscow, Ph. 7-095-721-14-00, Fx. 7-095-721-14-12 SINGAPORE, Ph. 65-6415-3188, Fx. 65-6415-3189 SOUTH AFRICA - Johannesburg, Ph. 27-11-442-85-08, Fx. 27-11-442-85-25 SPAIN - Madrid, Ph. 34-91-590-5200, Fx. 34-91-590-5211 SWEDEN - Sundbyberg, Ph. 46-8-555-127-00, Fx. 46-8-555-127-80 SWITZERLAND - Reinach, Ph. 41-61-717-95-55, Fx. 41-61-717-95-50 THAILAND - Bangkok, Ph. 662-651-8311, Fx. 662-651-8312 UNITED KINGDOM - Hemel Hempstead, Ph. 44-208-328-2000, Fx. 44-208-328-2550 Revised October 2013 506654