Opgave 1 - Human alkalisk phosphatase

Transkript

1 Opgave 1 - Human alkalisk phosphatase Delopgave 1 Jeg skal beskrive de sekundære proteinstrukturer, der findes i human alkalisk phosphatase. Rækkefølgen af aminosyrer kaldes proteinets primærstruktur. Denne struktur er afgørende for proteinets struktur, idet aminosyrerne i primærstrukturen danner hydrogenbindinger mellem hinanden, hvorved den sekundære struktur opstår. Den sekundære struktur er defineret som den rumlige struktur af polypeptidkæden. De to bedst definerede sekundære strukturer kaldes α helix og β sheets. α helixen er formet som en spiral, hvor aminosyrerne vender deres radikaler udad, og strukturen holdes sammen af hydrogenbindinger, der opstår mellem en aminosyrers aminogruppe (NH- gruppe) og en anden aminosyrers cabonylgruppe. Eksempler på α helix markeres på figuren med rød på nedenstående figur (samt med øvrige eksempler på bilag 1).

2 β sheets er foldeblade, og kan beskrives som en anderledes rummelig form af hydrogenbindinger imellem aminosyrer. Modsat α helixer, som har meget kompakte strukturer, er B sheets udstrakte. β sheets udgøres af en eller flere β strenge. Delopgave 2 Jeg skal vurdere om patienten har et forhøjet indhold af human alkalisk phosphatase i blodet. Det fremgår, at normale værdier for aktivitet af human alkalisk phosphatase i blodserum er U/L. Der gælder følgende sammenhæng mellem absorbans (A) og enzymets aktivitet (ea), som måles i U/L: A = 3,0 10!! L U ea Jeg oplyses, at når man skal undersøge, om en patient har et forhøjet indhold af enzymet i blodserum, skal man anvende et substrat, der ved hjælp af enzymet, spaltes til et gult produkt. Eftersom jeg videre oplyses, at man i en prøve af blodserum fra en patient målte absorbansen af det gule produkt til at være 0,365, må der gælde, at jeg skal sætte A = 0,365 og løse ligningen for enzymaktiviteten ea således: 0,365 = 3,0 10!! U L ea Ligningen løses for ea vha. CAS- værktøjet WordMatMac. ea = 121,6667 U L Heraf fremgår det, at aktiviteten af human alkalisk phosphatase er 122!. Idet normale værdier! for aktivitet af human alkalisk phosphatase i blodserum er !, vurderer jeg, at patienten! har et forhøjet indhold af human alkalisk phosphatase i blodet. Delopgave 3 Jeg skal argumentere for, at enzymets human alkalisk phosphatase følger Michaelis- Menten kinetik. Jeg oplyses i figur 2 en række sammenhørende værdier for koncentration af substrat og initialhastighed for human alkalisk phosphatase. Jeg indtaster disse værdier i LoggerPro, og udfører regression som følger Michaelis- Menten modellen som er defineret således: v = V!"# S S + K!

3 hvoraf v = reaktionshastigheden, S = substratkoncentrationen. Jeg placerer substratkoncentrationen på x- aksen og reaktionshastigheden på y- aksen. Heraf indtegner jeg og får jeg følgende tendenslinje: Forskriften af tendenslinjen bestemt ved regressionen lyder: v = 18,9 µμm/min S S + 5,06 µμm Det fremgår af ovenstående figur, at der umiddelbart ikke er nogen målinger, som afviger systematisk. Derfor, kan jeg argumentere for, at eftersom de værdier, som er angivet i figur 2 passer med definitionen på Michaelis- Menten modellen, må der gælde, at enzymet human alkalisk phosphatase følger Michaelis- Menten kinetik. Jeg bestemmer ud fra funktionsudtrykket hhv. v!"# og K! Der gælder at: K! = 5,06 µμm v!"# = 18,9 µμm/min

4 Delopgave 4 Jeg skal beregne ligevægtskonstanten for reaktion 2, som lyder: Jeg opskriver først ligevægtsbrøken: Zn!! (!") + EDTA!!!! (!") ZnEDTA (!") Y = ZnEDTA!! Zn!! EDTA!! Jeg oplyses, at i en opløsning, hvor ligevægten havde indstillet sig, var der følgende aktuelle koncentrationer: Jeg ved at K er ligevægtskonstanten, og at den er lig med ligevægtsbrøken, når der er ligevægt. Derfor må der gælde at jeg kan beregne ligevægtskonstanten for reaktion (2) således: K = 9,8 10!! M 1,6 10!!" M 2,0 10!! M = 3, !" M Det vil sige, ligevægtskonstanten for reaktion (2) er K = 3,06 10!" M. Delopgave 5 Jeg skal forklare, hvad størrelsen af ligevægtskonstanten viser om EDTA s evne til at hæmme human alkalisk phosphatases katalytiske aktivitet. Enzymer er meget specifikke mht. hvilke reaktioner, de katalyserer, og hvilke substrater de binder. Denne specifitet skyldes enzymernes tredimensionelle form og struktur samt enzymets aktive center, som er det sted, hvor substratet bindes. Det er i enzymets aktive center, at de katalytiske grupper, der kan bryde eller danne bindinger, befinder sig. Når et substrat skal bindes til det aktive center på et enzym, dannes der et enzym- substrat- kompleks (ES- kompleks). Der findes flere former for bindinger, som kan resultere i at substratet bindes til det aktive site, fx: hydrogenbindinger, elektrisk tiltrækning eller frastødning og ved

5 hydrofobe vekselvirkninger. De kræfter, som holder enzymer og deres substrater sammen, er forholdsvis svage, og kræfterne virker kun, hvis enzymet og substratet passer godt sammen. Man sammenligner denne binding mellem substrat og enzym som en lås og en nøgle. Det fremgår, at ligevægtskonstanten er stor. Det vil sige, tælleren er stor, og nævneren er lille, og derfor er ZnEDTA!! > Zn!! EDTA!!. Der oplyses, at enzymet har både zink og magnesium (som er divalente metalioner) som cofaktorer. Begge disse metalioner har en dobbelt positiv ladning, hvilket betyder, at de kan binde et eller to molekyler til enzymet. Eftersom Zn!! er knyttet som coenzym til enzymet human alkalisk phosphatase, indgår coenzymet i reaktionen, som enzymet foretager. Ud fra tælleren, ses det, at EDTA!! har let ved at indgå i ligevægt med zinkioner fra enzymets aktive center og blive til ZnEDTA!!. Ud fra figur 3b ses det, at der er fire negativt ladede grupper i EDTA!!. Derfor, som opgaven også skriver, er det et uegnet antikoagulationsmiddel, idet EDTA!! binder sig sammen med Zn!!. Når dette sker, kan substratet ikke længere bindes sig til aktive center. Dette resulterer i, at enzymets katalytiske aktivitet hæmmes af EDTA!!. Altså må der gælde ud fra størrelsen af ligevægtskonstanten, at EDTA hæmmer human alkalisk phosphatases katalytiske aktivitet. Opgave 2 - Seglcelleanæmi Delopgave 1 Det fremgår af opgavebeskrivelsen, af seglcelleanæmi er en arvelig sygdom, der skyldes en mutation i genet for hæmoglobins β kæde på kromosom nr. 11. Figur 2 viser et udsnit af aminosyrerækkefølgen for hæmoglobins β kæde dannet fra henholdsvis et normalt og et muteret gen. Jeg skal opskrive en mulig RNA- sekvens, der koder for aminosyrerne 4-7 dannet fra henholdsvis det normale og det muterede gen. Jeg markerer dette på figuren: Jeg ved, at RNA- strengen i sin nukleotid- sekvens er komplementær til den DNA- streng, der fungerer som skabelon i syntesen af RNA et. Jeg opskriver nu en mulig RNA- sekvens for hhv. det normale og det muterede gen ud fra ændringen i aminosyresekvensen:

6 Proteinsekvens af normalt hæmoglobin (Hb- A): Aminosyrer (4-7): thr- pro- glu- glu Nukleotider (4-7): ACT- CCT- GAG- GAG Proteinsekvens af (det muterede gen og dermed) seglcelleanæmisk hæmoglobin (Hb- S): Aminosyrer (4-7): thr- pro- val- glu Nukleotider (4-7): ACT- CCT- GTG- GAG Det fremgår heraf, at der sker en udskiftning af den 6. aminosyre glutaminsyre med aminosyren valin. Dette kaldes overordnet set en punktmutation, idet en base udskiftes med en anden. Mere specifikt, kaldes det en missense mutation, idet trinukleotidsekvensen koder for en ny mutation, hvoraf resultatet bliver, at en enkelt aminosyre i den lange polypeptidkæde ændres. Delopgave 2 Jeg skal argumentere for hvilken ladning hhv. glutaminsyre og vlain vil bidrage med i hæmoglobins β kæde ved ph = 7. Ved ph = 7 må der gælde, at der er tale om en neutral ph. Jeg har netop karakteriseret seglcelleanæmi som en punktmutation, hvilket betyder, at hæmoglobins β kæde udskiftes med valin. Disse aminosyrer har forskellig struktur:

7 Det fremgår, at glutaminsyre har en carboxylsyre mere end valin. En carboxylsyre indeholder to O- atomer ( COOH), hvoraf det af strukturformlen fremgår, at det ene O- atom er bundet i en OH- gruppe, og at det andet O- atom er bundet til det C- atom, hvortil OH- gruppen også er bundet. En carboxylsyre kan afgive en proton i form af en hydron (H! ), hvorfor det karakteriseres som en syre. Dette betyder også, at gruppen kan blive negativt ladet, hvilket er tilfældet ved neutral ph. Altså, vil glutaminsyre ved ph = 7 bidrage med en negativ ladning i hæmoglobins β kæde. Valin har i stedet to CH! grupper, hvilket indikerer, at gruppen er upolær. Derfor, vil valin ved ph = 7 bidrage med en uladet siddegruppe i hæmoglobins β kæde. Delopgave 3 Proteiners tertiære struktur er den samlede opbygning af proteinet. Den tertiære struktur opstår når der opstår bindinger mellem den sekundære struktur i polypeptidkæden. Herved opnår proteinets overordnede struktur. Bindingerne dannes mellem radikalerne. Disse bindinger kan fx være ionbindinger, svovlbroer, londonbindinger eller dipol- dipolbindinger. Når man har med svovlbroer at gøre, skyldes det SH- bindinger. Ionbindinger skyldes aminosyrerne har forskellig ladning. Hvis det er dipol- dipolbindinger skyldes det, at begge aminosyrer har en polær R- gruppe, mens Londonbindinger sker imellem upolære stoffer. I dette tilfælde erstattes glutaminsyre (en stærk polær sidegruppe) med valin (en upolær sidegruppe) på overfladen. Derfor vil mutationen (udskiftningen af glutaminsyre med valin) føre til at proteinets tertiære struktur ændres. Der vil blive dannet nogle andre bindinger mellem den sekundære struktur, således at proteinets kæde enten vil foldes forkert eller slet ikke. Altså, kan udskiftningen af glutaminsyre med valin have afgørende betydning for proteinets tertiære struktur. Videre, kan det bl.a. medføre, at der er frie β- kæder, som svømmer rundt inde i cellen. Disse kæder vil kunne sætte sig på bl.a. blodcellens cellemembran og give anledning til sejlcelleanæmi, ødelæggelse af membranen og/eller aggregation af blodet. Dette skyldes, at raskt hæmoglobin (Hb- A) har to uladede grupper, når det ikke er iltet, mens muteret hæmoglobin (Hb- S) har fire uladede grupper, når molekylet ikke er iltet. Den lave iltspænding er med til at give de røde blodlegemer deres karakteristiske seglecelleform. Delopgave 4 Jeg skal forklare på hvilken måde Cas- enzymet adskiller sig fra almindelige restriktionsenzymer.

8 Først og fremmest, vil jeg redegøre for almindelige restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer er specifikke og klipper DNA over ved specifikke baserækkefølger. De fleste restriktionsenzymer spalter de to nukleotidstrenge forskudt, hvilket betyder, at der på de spaltede DNA- stykker fremkommer enkeltstrengende ender, der er komplimentære til hinanden. Disse enkeltstrengede ender kaldes sticky ends, og de kan bindes til hinanden, da de er komplementære. Hvis det gen, som man ønsker at indsplejse, behandles med samme restriktionsenzym som plasmidet, vil man få samme type klæbrige ender. Ved indsplejsningen blander man det åbnede plasmid og det tilskårne gen. I nogle tilfælde vil genet klæbrige ender binde sig til de klæbrige ender på det åbne plasmid, mens plasmidet i andre tilfælde blot vil lukkes igen. Figur 4 viser princippet i CRISPR. Dette indsætter jeg herunder: Ud fra figur 4a, fremgår det, at der ses dobbeltstrenget DNA. Her tilføres Cas- enzymet, som fungerer som et særligt restriktionsenzym. Cas- enzymet adskiller sig fra et almindeligt restriktionsenzym, idet Cas- enzymet i forvejen er bundet til et stykke RNA med en kendt basesekvens. Cas- enzymet fungerer nu sammen med RNA- strengen som et restriktionsenzym, idet Cas- enzymet i ledskab med den bundne RNA- streng nu tilsættes på det sted på DNA- strengen, hvor det defekte gen sidder. I figur 4b, fremgår det, at RNA- strengen baseparrer med DNA, og at Cas- enzymet klipper sekvensen over. Cas- enzymet adskiller sig fra almindeligt restriktionsenzym, da restriktionsenzymet plejer at indeholde plasmidet, som indeholder det funktionelt gen fra starten af. I stedet ses det på figur 4b, at cas- enzymet klipper det defekte gen over. Umiddelbart syner det ud fra figuren ikke af, at Cas- enzymet klipper enderne palindromt. Dette er en anden måde hvormed Cas- enzymet adskiller sig fra almindelige

9 restriktionsenzymer. Midt i det defekte gen indsættes så et funktionelt gen, som medfører, at det defekte gen ikke længere kommer til udtryk. På trods af at være et særligt restriktionsenzymet, lykkes samme proces; det ønskede gen indsplejses. Delopgave 5 Jeg vurderer, at teknikken CRISPR er anvendelig i forbindelse med behandling af seglcelleanæmi. Rask hæmoglobin er et stort molekyle, som består af 574 aminosyrer, som er indgrupperet i fire subunits hhv. to alfa- globiner og to beta- globiner. Glutaminsyre, som har en negativ ladet sidegruppe bliver, som tidligere nævnt, erstattet af valin, som har en upolær sidegruppe. Hb- A, raskt hæmoglobin, har to uladede grupper, når det ikke er iltet, mens Hb- S, muteret hæmoglobin, i stedet har fire uladede grupper, når molekylet ikke er iltet. Det betyder, at beta- globinmolekylet vil klumpe sammen. På figur 4b ses det, at der indsættes et funktionelt gen, som medfører, at det defekte gen ikke længere kommer til udtryk. Dette betyder, at beta- globinmolekylet, såfremt metoden forløber som den skal, ikke længere vil klumpe sammen. Metoden er god, idet cas- enzymet både muliggør indsættelse af et funktionelt gen, mens det samtidig sørger for at det defekte gen klippes midt over. Dette er en effektiv måde hvormed man kan sikre, at det defekte gen ikke længere kommer til udtryk. Metoden er særlig smart, idet den tager højde for at der findes nogle DNA- sekvenser der kaldes introns og nogle andre sekvenser, der kaldes extrons. Hvis der sker en mutation i de ikke- kodende DNA- sekvenser, introns. Introns ligger spredt og kan bl.a. ligge i en proteinkodende sekvens og blive transskriberet af DNA et. Dog klippes introner ud af mrna et af spliceosomer, inden det translateres til protein i ribosomerne. Derfor, skal man være sikker på hvor man indsætter det funktionelle gen. Ved at indsætte det direkte i det defekte gen, undgår man denne bekymring. Endvidere er seglcelleanæmi er en autosomal recessiv sygdom, som betyder, at sygdomsgenet befinder sig på autosomerne, og at sygdommen er recessiv betyder, at en enkel kopi af et sygdomsgen ikke er nok til, at sygdommen kommer til udtryk. I nogle tilfælde, vil individet have det muterede gen Hb- S og et andet defekt globin. Der vil altså være to defekte gener. Her er det smart at anvende metoden vist i CRISPR, eftersom Cas- enzymet er bundet til en RNA- sekvens, som varierer alt afhængig af hvad man ønsker at anvende sekvensen til. På denne måde, kan man tilpasse enzymet til at deaktivere de defekte gener, hvad enten det kun er Hb- S eller også et andet defekt globin.

10 Det kan dog være fordelagtigt, at man har seglcelleanæmi, hvis man inficeres med malaria. Derfor, vil det ikke altid være smart at behandle med den teknik, som er vist i figur 4 - princippet i CRISPR. Dette skyldes, at malariaparasitter ikke kan leve i kroppen, hvis man har seglcelleanæmi. I et sådant tilfælde, vil de seglformede røde blodlegemer sendes til milten, med henblik på at få dem elimineret. Her registrerer milten, at seglformede røde blodlegemer er formede forkert, og søger for, at ødelægge så mange seglformede celler som muligt. En anden måde malariainfektionen bekæmpes, når man har seglcelleanæmi er ved, at cellen meget let beskadiges, fordi cellemembranen består af seglformede røde blodlegemer, som har en usædvanlige form, bliver. Den seglformede celle vil pga. sin struktur miste næringsstoffer, bl.a. kalium, som er nødvendige for parasittens overlevelse. Derfor, vil parasitten ikke overleve. Altså, er det ikke smart at ødelægge genet. Opgave 3 - Fotosyntese Delopgave 1 Jeg skal beskrive forskellen mellem chlorophyl a s og b s kemiske struktur. Det fremgår af de to strukturformler angivet i opgaven, at de to pigmenter minder meget om hinanden. Clorophyl a og b er begge opbygget af lange carbonkæder og ringsystemer, som består af konjugerede dobbeltbindinger og har kompleksbundet magnesium. Klorofyl har både en polær og upolær ende. I den upolære, hydrofobe ende, sidder CH- bindinger. De polære egenskaber af klorofyl findes i porphyrinringen. Her er bindingerne mellem nitrogen og magnesium polære, eftersom forskellen i elektronegativitet er 1,73 (3,04-1,31). Det der adskiller de to pigmenter er, at der i chlorophyl a øverst til venstre i molekylet sidder en CH! gruppe, mens der i chlorophyl b er en CHO gruppe. Dette betyder, at chlorophyl a er mere upolær end chlorophyl b, som er mere polær. Jeg markerer forskellen på figuren:

11 Delopgave 2 Tyndtlagskromatografi er en hurtig og nem måde, der kan bruges til at adskille forskellige komponenter i en prøve og efterfølgende identificere dem vha. referencer dvs. molekyler, som man kender. Adskillelsen sker ved, at en væske (en mobil fase) trænger op gennem en TLC- plade (en stationær fase). Den mobile fase opløser prøven og trækker de forskellige komponenter i prøven med sig. De enkelte komponenter påvirkes forskelligt af den stationære fase. Alt efter hvilken komponent, det er, vil den bevæge sig med væsken en bestemt afstand fra det punkt, hvor prøven blev afsat. En TLC- plade består typisk af en metal-, glas- eller plasticplade, hvorpå der er et tyndt lag af f.eks. kiselgel. TLC pladen er lavet af silica gel hvilket vil sige, pladen er opbygget af polære OH- grupper og mange polære bindinger mellem oxygen og silicium (EN 3,44 1,9 = 1,54). Eftersom polære molekyler er dipoler, altså elektronskyen er forskudt mod én ende af molekyle, vil den polære TLC- plade vil danne dipol- dipol bindinger med et andet polært stof. Dipol- dipol bindinger er midlertidige og bliver derfor brudt undervejs i bevægelsen gennem den mobile fase og gelen, men medfører, at et polært stof hverken vil bevæge sig ligeså hurtigt eller ligeså langt gennem pladen. Det oplyses, at der i dette tilfælde blev anvendt en upolær løbevæske.

12 Eftersom jeg i delopgave 1 har begrundet, at chlorophyl a er mest upolær, må der gælde, at chlorophyl a er bånd 1, idet stoffet er nået længst på pladen. Tilsvarende må der gælde, at chlorophyl b er bånd 2, idet den polære CHO- gruppe medfører at stoffet ikke kan bevæge sig helt så langt på pladen. Delopgave 3 Fotosyntesen forløber i to separate afdelinger kaldet hhv. lysreaktioner og Calvins cyklus. De to afdelinger forbindes af ATP og NADPH. Den første del af fotosyntesen er lysreaktionerne. Lysreaktionerne kan kun foregå, når der er ilt. Lysreaktionerne omhandler de trin, der omdanner solens energi til kemisk energi (ATP og NADPH, og som producerer ilt (O! ) som affaldsprodukt. Under reaktionen, bliver solens energi udnyttet med henblik på at drive overførslen af elektroner fra et vandmolekyle til NADP!. Overordnet set, består lysreaktionerne af to fotosystemer og to elektrontransportkæder, som sidder i thylakoidmembranen. Med hjælp fra lysenergi oxideres vand til dioygen samtidig med at NADP! reduceres til NADPH. I fotosystem II absorberes lysenergien af de to pigmenter chlorophyl og caroten, hvormed der dannes dioxygen. Det sker således (ved hjælp af 8 fotoner): 2 H! O 4 H! + 4e! + O! eller 2 H! O + 2 NADP! 2 NADPH + 2H! + O! Det fremgår heraf, at en elektron fra pigmentet sammen med en foton, vil exicteres (dvs. komme op på et højere energiniveau). Dette energioverskud kan overføres til en anden elektron, eller kan overføres til et andet chlorophylmolekyle. Pigmenterne henter elektronerne fra H! O, som selv også oxideres til O!. De overskydne hydroner ophobes i thylakoiderne. Herfra løber elektronerne fra den exciterede tilstand i fotosystem II til enzymkomplekset cytochrom vha. et upolært stof ved navn plastoquinon. I enzymkomplekses cyctochrom bliver der bumpet hydroner ind i thylakoidets indre mod en gradient, hvilket kaldes aktiv transport. Elektronerne føres nu videre til fotosytem I vha. plastocyanin, som indeholder kobberioner. Her exciteres fotonerne endnu en gang af en foton, og endelig reduceres elektronbæreren NADP! til NADPH. En reduktion defineres som et fald i oxidationstal.

13 Der anvendes 2,6- dichlorphenolindophenol (DCPIP) som erstatning for coenzymet NADP! i lysreaktionerne. DCPIP kan erstatte NAP! eftersom funktionen af NADP! er at fungere som elektrontransportør. Jeg indsætter reaktionsskemaet herunder: Det fremgår at N NH og at dobbeltbindingen i ketonen t.v. brydes og i stedet bliver til en OH- gruppe. Det betyder, at ketonen bliver til en sekundær alkohol, idet OH- gruppen er bundet til et C- atom som er bundet til præcis to andre C- atomer. Til at vise denne reduktion, bruger jeg, at en reduktion betyder et fald i oxidationstal. Derfor, bestemmer jeg OT af hhv. ketonen C = O: og alkoholen CHO: OT C + OT O = 0 OT C + 2 = 0 OT C = 2 OT C + OT O + OT H = 0 OT C = 0 OT C = 1 Det vil sige, at der er optaget en elektron fra ketonen og derfor er C- atomet reduceret. På baggrund af at DCPIP kan bruges til et reducere stoffet t.v. til stoffet t.h., må der gælde, at DCPIP besidder samme egenskaber som NADP!, hvorfor DCPIP kan bruges som substitut for NADP! i lysprocessen.

14 Delopgave 4 Eleverne undersøgte om lys og kogning af spinatekstratet påvirker fotosystensen, hvorfor de fremstillede tre forskellige prøver. Prøve 1, 2 og 3 blev belyst med en kraftig lampe. Prøve 1 var i direkte lys, prøve 2 blev kogt og prøve 3 blev kogt og omsluttet med stanniol, hvorfor prøven kan siges at have været i mørke. Jeg skal analysere resultaterne vist i figur 5, hvoraf absorbans af DCPIP målt ved 635 nm ses. Jeg opstiller disse data grafisk i LoggerPro, med henblik på at danne overblik.

15 Det fremgår, at absorbansen er mere eller mindre ens ved forsøgets udgangspunkt, dvs. t = 0 (hhv. 0,65, 0,64 og 0,66). For prøve 1, som udelukkende indeholdt spinatekstratet, faldt absorbansen allerede drastisk ( A = 0,65 0,44 = 0,21) efter 5 minutter, blev yderligere halveret efter 10 minutter ( A = 0,44 0,22 = 0,22) og var 0,05 15 minutter. Dette viser, at det blå farvestof omdannes til den farveløse form, og er en indikation af, at lys påvirker fotosyntesen. Desto mere lys der skinner ind på prøv 1, desto mere falder absorbansen, og til sidst er prøve 1 stort set farveløs. Derimod forblev absorbansen stabil i prøve 1 og 2. Det fremgår, at efter 15 minutter var absorbansen hhv. 0,63 for prøve 2, som indeholdt kogt spinatekstrat, og 0,62 for prøve 3, som indeholdt spinatekstrakt, og som blev omviklet med tætsluttende stanniol. Det betyder, at der var stort set ingen ændring i absorbans af det blå farvestof DCPIP over tid. For prøve 2 gælder der, at spinatekstratet er kogt. Det betyder, at tilstedeværende proteiner og enzymer er blevet inaktiveret. Fotosyntesen foregår i kloroplaster, som er omgivet af to membraner. Membranerne omslutter det indre rum hvor fotosyntesen foregår. Membranen indeholder thylakoider, dvs. flade membransække og vesikler. Disse thylakoid- membraner indeholder fotosyntesepigmenter og enzymkomplekser, hvor lysreaktioneren foregår. Derfor vil en kogning af spinatekstratet altså medføre en iniaktivering af fotosyntesepigmenterne og enzymkomplekser. Dette betyder så, at fotosyntesen ikke kan forløbe, og er årsagen til at vil absorbansen er forblevet det samme i prøve 2. Det blå farvestof er ikke omdannet til en farveløs form, men er i stedet forblevet blå. For prøve 3 gælder der, at spinatekstratet er både kogt og omsluttet stanniol. Tilsvarende prøve 2, må der gælde, at fotosyntesepigmenterne og enzymkomplekserne, som ellers indgår i lysreaktionen, er blevet deaktiveret. Årsagen til at absorbansen er aftaget en anelse, skyldes at fotosyntesens anden del foregår i mørke. Denne proces kaldes Calvin Cyklus, og foregår i kloroplasternes stroma. Altså, er det lykkedes nogle af fotosyntesepigmenterne at omdanne det blå farvestof til en klar vækse. Dog, eftersom også dette ekstrakt er blevet kogt, er absorbansen ikke aftaget mere end (0,66 0,62 =) 0,04. På baggrund af de tre prøver, som målte ændringen i absorbans af det blå farvestof DCPIP over tid, kan eleverne vurdere, at lys og kogning af spinatekstrakt påvirker fotosyntesen. Delopgave 5 For at udforme et forsøg, der kan vise, hvordan fotosyntesen afhænger af enten lysintensitet eller temperatur, kan man:

16 1. Lysintensitet: Lambert Beers lov lyder: A = ε! A I, og siger, at absorbansen er proportional med koncentrationen af det farvede stof og den vejlængde, lyset skal tilbagelægge gennem opløsningen. Vi holder alle parametre ens, med henblik på udelukkende at undersøge hvordan fotosyntesen evt. afhænger af lysintensiteten. Der udføres et forsøg med 5 (+) reagensglas. Forsøget forløber på tid. Det ene reagensglas har ingen ting i, og skal bruges med henblik på, at undersøge om måleudstyret måler absorbansen korrekt. Et andet reagensglas indeholder blot det blå farvestof i (som tilfældet ved prøve 1 i ovenstående forsøg), med henblik på at måle hvor hurtigt det blå farvestof omsættes ved en intensitet på x. Herefter vil der i 4 andre reagensglas udføres målinger med andre intensiteter. Alt afhængig af hvor forskellene i hastigheden hvormed det blå farvestof omsættes, vil det være muligt at vurdere om fotosyntesen afhænger af lysintensiteten. 2. Temperatur: Der udføres et forsøg med 5 (+) reagensglas. Forsøget forløber på tid. Alle reagensglas udsættes for forskellige temperatursvingninger. Man kan udføre forsøget ved forskellige temperaturer, og se hvordan det påvirker absorbansen. Såfremt absorbansen falder, når temperaturen stiger, må det være muligt, at kunne bestemme enzymernes optimum. Ved en øget temperatur vil den kinetiske energi af substrat- og enzymmolekylerne øges, og enzym- substratkomplekserne kan lettere dannes. Hastighedskonstanten stiger eksponentielt med stigende temperatur. Enzymkatalyserede processers hastighed har et temperatur- optimum, hvorefter aktiviteten falder. Dette skyldes at enzymets proteindel denaturer, og derfor aftager koncentrationen af aktivt enzym. Herved falder den samlede enzymaktivitet ved temperaturer som overstiger optimum. Ved denatureringen brydes bindingerne, som er ansvarlige for proteinets kvarternær- /tertiær- og sekundærstruktur. Ødelæggelsen af den rummelige struktur er irreversibel. Alt afhængig af hvor forskellene i hastigheden hvormed det blå farvestof omsættes, vil det være muligt at vurdere om fotosyntesen er temperaturafhængig.