Transkript

1 Hæmning af Saroplasmatisk/Endoplasmatisk Reticulum ATP-ase 2 ved hjælp af thapsigarginpromedikamenterne G202 og G114 med henblik på behandling af prostatakræft. Side 1 af 80 Gruppe 8

2 Abstrakt Formålet med dette review er at samle den viden, der findes om behandling af prostatakræft med thapsigargin-baserede medikamenter med henblik på at undersøge potentiale og status. Der er indsamlet data vedrørende forskning, som har haft til formål dels at finde en effektiv metode til at fremkalde apoptose i tumerøst væv, dels at sikre at rask væv ikke bliver ramt. Den nyeste udgivelse, vi har baseret en del af reviewet på, er fra ultimo november i Thapsigargin i sin grundform er en yderst effektiv inhibitor af SERCA-pumperne i cellerne, og virkningen kan bibeholdes til trods for, at det er nødvendigt at ændre på thapsigargins molekylstruktur for at kunne danne et promedikament, som kun er selektivt toksisk. Ved at påsætte peptidkæder på thapsigargin-analogerne kan man målrette disse mod bestemte hydrolaser, PSA eller PSMA, og derved forsøge at sikre, at cytotoksinet kun frigives i eller lige omkring prostatatumoren. In vivo-forsøg på mus har vist en antitumoral effekt, som synes at overstige den traditionelle kemoterapeutiske, når der blev givet doser, der medførte en dødelighed blandt musene på under 10 %. Der er lavet fase 1-forsøg på mennesker med henblik på at finde den maksimalt tålte dosis, og næste trin vil være at teste virkningen af denne dosis på kræftramte forsøgspersoner. Der er således belæg for yderligere forskning herunder forsøg samt en forsigtig optimisme. Abstract The purpose of this review is to gather the information currently available regarding treatment of prostate cancer with thapsigargin-based drugs. This is done in order to examine the potential of the prodrug and the status of its development. Parts of the review are based on articles published in the end of November Thapsigargin as it is found in nature is an effective inhibitor of SERCA pumps in cells, and the effect can be maintained despite the fact that it is necessary to change the molecular structure of thapsigargin in order to form a prodrug, which is only selectively toxic. By attaching peptide chains onto thapsigargin analogs these can be designed to target specific hydrolases, such as PSA or PSMA, thus ensuring that the cytotoxin is released only in or closely around the prostate tumor. In vivo experiments on mice have shown a tumor regressive effect, which seems to exceed that of the traditional chemotherapeutic treatments when doses were administered that resulted in a mortality rate not exceeding 10 %. Phase 1 dose escalation trials on humans have been done in Side 2 af 80

3 order to establish the maximum dose tolerated. Next phase is to determine the effectiveness of this dose on patients with cancer. There are therefore incitements for further research - including trials and reasons for a cautious optimism. Side 3 af 80

4 Indhold Abstrakt... 2 Abstract... 2 Indledning og motivation... 6 Problemformulering... 7 Underspørgsmål... 7 Semesterbinding... 7 Projektbeskrivelse... 7 Målgruppe... 7 Formål... 8 Afgrænsning... 8 Forventninger / hypotese... 8 Fremgangsmåde og metoder... 9 Introduktion til teoretisk redegørelse Kræft Apoptose Kræfts opståen Prostata Prostatahypertrofi og symptomer på prostatakræft Prostatakræft Aktiviteten af androgen Regulering af androgenreceptoren i prostata Diagnose og behandling Thapsigargin-analoger Om Thapsia garcanica kort fortalt Intro til thapsigargin-promedikamenterne Thapsigargin i sin grundform Et promedikament Tilstedeværelse af PSMA Prostata-Specific Membrane Antigen Thapsigargin inde i cellen SERCA (Sarco/Endoplasmatisk Reticulum Ca 2+ -ATPase) Thapsigargins hæmning af SERCA Forskning i thapsigargin G202 og G G Side 4 af 80

5 G Thapsigargin-analogernes virkning Forsøg med thapsigargin- promedikamenter Intro In vitro vs. in vivo Forsøg med G114-promedikamentet i In vivo In vitro Forsøgsresultater Forsøgsresultater for G202 udgivet i Antitumoral virkning Bivirkninger Diskussion Virkninger Bivirkninger Konklusion Perspektivering G202 s potentiale i forhold til andre kræfttyper References Appendix Cellesignalering Signalering og kommunikation mellem celler Transmembranprotein Celledeling/mitose Side 5 af 80

6 Indledning og motivation Vi vil i dette projekt sætte fokus på prostatakræft og en ny og muligvis mere effektiv behandling af sygdommen. Kræft i prostata eller blærehalskræft, som lidelsen også kaldes - er en særdeles udbredt sygdom. I løbet af de seneste 15 år har prostatakræft udviklet sig til at være den hyppigst forekommende kræftform, der rammer mænd i Europa, når man ser bort fra hudkræft. Forekomsten er størst i de baltiske og skandinaviske lande (Bray et al., 2010). Prostatakræft er også i Danmark den næsthyppigst forekommende kræftform blandt mænd (Sundhedsstyrelsen A, 2011), og idet 4,5 % af alle dødsfald hos mænd i 2010 skyldtes prostatakræft, ligger cancerformen på en andenplads over hyppigste dødårsager forårsaget af cancer hos mænd. Kun hyppigheden af dødsfald forårsaget af lungekræft er højere (Sundhedsstyrelsen B, 2011). Antallet af mænd, der diagnosticeres med prostatakræft er stigende. I perioden var den gennemsnitlige, årlige hyppighed af prostatakræft 79 tilfælde pr danske mænd, hvilket er steget til et gennemsnit på 154 tilfælde pr danske mænd om året i tidsrummet Stigningen kan forklares med, at man oftere undersøger mænd for prostatakræft sammenholdt med den ændrede alderssammensætning i befolkningen, idet prostatakræft primært rammer mænd, der er over 60 år (Sundhedsstyrelsen A, 2011). Prostatakræft er en kræftform, der i de fleste tilfælde udvikler sig langsomt. Mange kan leve lang tid med ingen eller få symptomer. I en del tilfælde finder man først canceren ved obduktion, og den har således som oftest ikke været dødsårsagen. I de tidligere stadier af prostatakræft, hvor kræften er begrænset til selve prostata, oplever man som regel ikke symptomer. Når tumoren har vokset sig tilstrækkelig stor, oplever den ramte symptomer, hvor vandladningsbesvær er det dominerende. Af andre symptomer herunder symptomer, der skyldes metastaser kan følgende gener nævnes: blodig urin, stærkt invaliderende smerter, impotens, inkontinens og ophør af urinproduktion (Mommsen, 2001). Ved beslutning om mulig behandlingsforløb balanceres symptomerne i dag mod bivirkningerne ved de nuværende medicinske og kirurgiske behandlinger, hvilket medfører, at hovedparten af patienterne grundet kræftens langsomme udvikling ikke behandles, men i stedet sættes under observation (Adolfsen, 2001). Side 6 af 80

7 Nye lægemidler indeholdende stoffet thapsigargin kan vise sig at åbne nye behandlingsmuligheder for mange prostatakræftramte mænd. Thapsigargin kan, hvis de medicinske forsøg viser sig at være en succes, give en kræftbehandling, som giver færre gener og er mere effektiv end de traditionelle behandlinger. Dette har ansporet os til at undersøge potentialerne ved og perspektiverne i behandling med thapsigargin, hvilket leder os frem til følgende problemformulering: Problemformulering Hvilket grundlag er der på nuværende tidspunkt for at gå videre med forskningen i thapsigargin med henblik på behandling af prostatakræft? Underspørgsmål - Hvad er et thapsigargin-medikament, og hvordan virker det? - Hvilke bivirkninger er der ved brugen af thapsigargin-medikamenter, og kan man afhjælpe disse? Semesterbinding Som nævnt får mere end 4000 danske mænd hvert år diagnosen prostatakræft. Forekomsten af sygdommen har gennem en årrække været stigende danske mænd dør årligt af prostatakræft (Sundhedsstyrelsen B, 2011). I verden er tallet opgjort til (Minner et al., 2011). Den ændrede befolkningssammensætning og den øgede diagnosticering betyder, at vi i de kommende år vil se langt flere tilfælde af prostatakræft i den danske befolkning end hidtil (Sundhedsstyrelsen - Cancerregisteret 2009, 2010). Den store forekomst og konstante dødelighed forårsaget af prostatakræft (Sundhedsstyrelsen B, 2011) gør sygdommen til et problem i samfundet, som naturvidenskaben potentielt kan løse her ved forskning i medikamenter på basis af thapsigargin med henblik på et medikament til behandling af prostatakræft. Projektbeskrivelse Målgruppe Målgruppen er elever, der modtager undervisning i biologi og kemi på B-niveau. Det bevirker, at vi vil uddybe og forklare mere eksplicit end ved et traditionelt review. Side 7 af 80

8 Formål Formålet med dette review er at samle den viden, der på nuværende tidspunkt er om lægemidler baseret på thapsigargin samt at give en vurdering af thapsigargins potentiale som fremtidig behandlingsmedikament mod prostatakræft. Vi sigter også efter at give en vurdering af, hvilken medicinudviklingsmæssig strategi, der er mest hensigtsmæssig i forbindelse med udviklingen af thapsigargin-baserede promedikamenter. Derudover forventer vi at vores review vil tjene til god oplysning af den interesserede læser. Afgrænsning Når det gælder behandling af prostatakræft er der en hel række af relevante og interessante emner at fordybe sig i herunder forebyggelse af kræft eller systematiske undersøgelser af prostatakræft på samme måde, som alle kvinder tilbydes screening for bryst- og livmoderhalskræft i Danmark i dag. Vores review koncentrerer sig om medicinsk behandling ved hjælp af promedikamenter baseret på thapsigargin. Forskningen har hidtil været lovende, og i sommeren 2012 blev et promedikament baseret på thapsigargin godkendt til kliniske forsøg på patienter med kræft (Denmeade et al., 2012). Vores review tager udgangspunkt i to promedikamenter, hvoraf det ene, G-202, blev godkendt til kliniske forsøg. To andre emner, der i sig selv kunne udgøre en hel semesteropgave, og som vi derfor stort set ikke vil berøre, er syntetiseringen af thapsigargin og de forsøg, som forskere lige nu udfører med genmodificeret mos for at imødekomme den forventede stigning i efterspørgslen på thapsigargin. En stigning, som vi ske, hvis de nuværende forsøg med thapsigargin viser sig at have en lovende effekt (Simonsen, 2011). Forventninger / hypotese Vi forventer at få bekræftet, at analoger af stoffet thapsigargin kan kurere prostatakræft, da cytotoksinet fra planten Thapsia garganica medfører apoptose i mange celletyper. Det sker ved, at stoffet blokerer en calciumpumpe kaldet Sarcoplasmatisk/Endoplasmatisk Reticulum Calcium AT- Pase (SERCA) i cellernes endoplasmatiske reticulum (ER), så cellens calciumbalance ikke kan opretholdes. Desværre ødelægger cytotoksinet i sin grundform også raske celler, hvorfor der er forsket i metoder, som kan eliminere denne bivirkning (Denmeade et al., 2012). Vi forventer, at forsknin- Side 8 af 80

9 gen er langt i forhold til at designe og syntetisere et cytotoksin, som udelukkende forårsager apoptose i kræftceller. Fremgangsmåde og metoder Vi skriver et review, hvilket indebærer, at vi indsamler viden og sammenfatter den til en samlet rapport. Vores review er baseret på videnskabelige artikler for at gøre det relevant og dybdegående. For at kunne redegøre for thapsisgargin-baserede medikamenter, der er målrettet mod prostatakræft, er det nødvendigt at beskrive, hvad kræft er, og hvordan prostatakræft adskiller sig fra andre typer kræft. I reviewet vil vi også beskrive behandlingsmetoder, som læger i dag bruger til behandling af patienter med prostatakræft. Medikamenter baseret på thapsigargin har vist sig at have en gavnlig effekt på prostatakræft. Vi vil i vores review redegøre for, hvad thapsigargin er, og hvilke forskelle, der er på de forskellige analoger og promedikamenter med fokus på nedbrydning af promedikamentet i prostatacellens membran. Derudover vil vi se på, hvilke muligheder, der er for behandling med stoffet, og hvilke perspektiver, der kan være i det. Side 9 af 80

10 Introduktion til teoretisk redegørelse Indledningsvis redegøres for, hvad kræft er, og hvordan det opstår. Dernæst fokuseres der på prostatakræft. Herefter vil vores hovedvægt ligge på at redegøre for, hvad stoffet thapsigargin er og hvilke forskelle, der er på de forskellige analoger og promedikamenter med fokus på nedbrydning af promedikamentet i prostatacellens membran. Kræft Apoptose Det særlige ved kræftceller, er, at de kan undgå apoptose. Det er vigtig at forstå apoptose og dens funktion for at forstå, hvordan det kan være muligt for kræftceller at undgå den. En anden betegnelse for apoptose er programmeret celledød eller celleselvmord. Hvis der opstår fejl i cellens DNA, sørger et protein, kaldet p53, for at rette fejlen. Proteinet koder for en bestemt transkriptionsfaktor, der fremmer produktionen af proteiner, som hæmmer celledelingen. Disse proteiner betegnes p21 og bevirker, at celledelingen bliver langsommere, så cellen kan nå at reparere fejlen. Hvis det ikke er muligt at reparere fejlen, sørger p53 for at sende en besked til cellen om at begå selvmord, så fejlen ikke spredes. p53 er det, man betegner som et kræftundertrykkende gen. Figur 1: Apoptose. Figuren viser, hvordan et dødssignalmolekyle gør Ced-9 inaktivt. Herved aktiveres Ced-4 og Ced-3. Disse aktiveringer leder til produktion af proteaser og nukleaser, der klipper cellen i stykker, så den krymper og buler. Modificeret efter Reece et al., Side 10 af 80

11 Der er mange forskellige processer, der kan føre til apoptose. Hvilken proces, der sættes i gang, afhænger af cellen og det bestemte signal, der giver besked om, at apoptose er nødvendigt. Én proces finder sted i mitokondrierne, hvor der dannes mitokondrielle proteiner. De mitokondrielle proteiner danner porer i mitokondriets ydre membran, som på den måde tillader proteiner at slippe ud. Disse proteiner aktiverer caspaser, hvis funktion er at klippe cellens indhold i stykker og derved inducere apoptose. I mitokondriets ydre membran sidder et protein kaldet cell death abnormal-9 (Ced-9). Så længe dette protein er aktivt, forhindres apoptose. En celle kan modtage et dødssignal, som gør Ced-9 inaktivt (se figur 1). Det sker, når en dødssignalligase binder sig til en overfladereceptor på cellen. Når Ced-9 er inaktivt, dannes der caspaser og andre enzymer, der får cellen til at begå apoptose. Proteaser og nukleaser klipper DNA et, organeller og andre cytoplasmatiske komponenter i stykker, hvilket får cellen til at krympe og bule. De nedbrudte dele optages i vesikler, som optages af specielle celler, der fordøjer dem. Signal om, at cellen skal begå programmeret celledød, kan komme både inde og ude fra cellen (Reece et al., 2011). Kræfts opståen Kræft opstår, når en celles regulering af cellecyklus ikke længere fungerer korrekt. Cellen har mistet kontrollen over celledelingen og væksten, og cellen deler sig derfor uhæmmet (se appendix vedrørende celledeling). På den måde deler kræftceller sig til flere kræftceller, som vil tage pladsen fra de raske celler, og derved dannes en svulst, der kan være farlig for vitale organer (Bennetzen, 2007). Forskning i cancer har vist, at der er gener i bestemte vira kaldet oncogener, som kan være årsag til kræft. Den normale gentype kaldes proto-oncogener og koder for proteiner, der fører til normal celledeling og vækst. Er der en fejl i proto-oncogenet, kalder man det for et oncogen. Fejlen kan skyldes, at DNA et i genet har flyttet sig, at proto-oncogenet bliver forstærket, eller at der sker en mutation i selve proto-oncogenet (Reece et al., 2011). I kroppen findes et inaktivt proto-oncogen kaldet Rat Sarcoma (Ras). Når cellen modtager et signal fra en vækstreceptor om at den skal dele sig, aktiveres Ras-genet. Det fører til aktivering af en række proteinkinaser (se appendix vedrørende cellesignalering), som stimulerer celledeling (Reece et al., 2011). Ved stimuleringen dannes proteinet Cathepsin D (CD), der sammen med Cyklin- Side 11 af 80

12 afhængige kinaser (CDK) frigiver transkriptionsfaktoren fra restinoblastoma-proteinet (RB), et tumorundertrykkende gen, hvis funktion er at kontrollere celledelingen (se figur 2). Figur 2: Restinoblastomas funktion. Når transkriptionsfaktoren er bundet til Rb, vil cellen ikke deles. Derimod vil der ved et vækstsignal produceres CD og CDK proteiner, som tilsammen frigiver transkriptionsfaktoren, så celledeling kan påbegyndes. Modificeret efter Bennetzen, Transkriptionsfaktoren vil nu aflæse DNA et, som indeholder koderne for, hvordan celledelingsproteinerne skal laves, og påbegynde delingsprocessen. Mutationer i Ras-genet kan føre til en konstant aktivering af Ras, hvilket bevirker, at CD og CDK produceres uafbrudt, til trods for at Ras ikke har modtaget noget vækstsignal. Det fører til ukontrolleret cellevækst, ligesom fejl i CD og RB tilsvarende kan føre til uhæmmet celledeling. Det er vigtigt, at celledelingen udføres korrekt, da denne fejl ellers videreføres i fremtidige celledelinger. Sker der en fejl i celledelingen, vil proteinet p53 almindeligvis rette fejlen og sende signal til cellen om at udføre apoptose, der også kaldes programmeret celledød. Hvis der er fejl i proteinet p53, eller hvis det helt mangler, er cellen ikke i stand til at rette fejlen, og den vil ligeledes ikke begå apoptose. Der skal mange DNA-ændringer til, for at en celle bliver til en kræftcelle. Ofte skal der minimum et aktivt oncogen til eller mutationer i de kræftundertrykkende gener såsom p53 og RB. Disse kriterier er ikke alene nok til at kræft kan opstå, idet cellen også skal være i stand til at producere telomerase og undgå apoptose (Bennetzen, 2007). Telomerase Hvert DNA-molekyle har en telomer-ende, som ikke i sig selv koder for noget. Når et DNA molekyle kopieres, er det ikke muligt at replikere helt til enderne af strengen. Fordelen ved de telomere Side 12 af 80

13 ender er derfor, at der ved replikereing af DNA ikke vil gå informationer tabt. For hver celledeling bliver de telomere ender kortere. Når molekylet er replikeret et tilstrækkeligt antal gange, giver p53 besked om, at cellen skal begå selvmord, så DNA et ikke kopieres yderligere. Telomerenderne siges derfor at være cellens livsstreng og bliver kortere, for hver gang de kopieres. I kræftceller samt nogle normale celletyper finder man ofte et protein kaldet telomerase, hvis funktion er at binde de telomere ender fast på DNA-molekylet efter hver kopiering. På denne måde undgår kræftcellen, at DNA-strengen forkortes efter delingen, hvorved den forlænger sin levetid (Bennetzen, 2007). Celleselvmord Som nævnt er det sidste krav, der skal være opfyldt, for at en kræftcelle kan opstå, at den skal kunne undgå apoptose. Kræftceller producerer et protein, der hedder B-celle lymfom 2 (Bcl-2), som i tilstrækkelig mængde forhindrer caspaserne i at blive aktive. På den måde undgår kræftcellen apoptose. Der skal altså disse fejl til, for at en rask celle bliver en kræftcelle: At celledelingsproteiner er overaktive, at DNA-reperationsproteiner og delingsundertrykkende proteiner er skadede, at telomerase produceres, og at Bcl-2 produceres (Bennetzen, 2007). Prostata Prostata findes kun hos mænd og er placeret mellem urinblærens bund og bækkenbunden, mere specifikt ved urinrørets udspring fra blæren (se figur 3). Prostata producerer hovedbestanddelen af den flydende del af mandens sæd, og prostataens muskulatur er med til at føre sæden ud ved ejakulation (Nielsen and Bojsen-Møller, 2012). Prostataen hos en 70 årig mand vejer normalvis omkring gram. Prostata består af kirtelvæv, glatte muskler og en kapsel af bindevæv. I prostataens kirtelvæv produceres der sekret, som blandes med sæden (Nielsen and Bojsen-Møller, 2012). Kirtelvævet er fordelt på fire zoner. Den perifære, den centrale, trasititions og den periuretrale zone. For dette review er den perifære og transitionszonen de vigtigste, da tumorer hovedsageligt er at finde der med en forekomst på henholdsvis 70 % i den perifære zone og % i trasitionszonen (Fenger and Baandrup, 2002). Side 13 af 80

14 Figur 3: En normal prostata og dennes placering ved bunden af blæren. Det ses, hvorledes urinrøret løber gennem prostata (Rasmussen, 2006). Prostatahypertrofi og symptomer på prostatakræft Et typisk aldringstegn hos mænd er amalign prostatahypertrofi - en godartet vækst af prostata. Væksten i prostata forårsager en indsnævring af urinrøret (se figur 4), og symptomerne er hyppige vandladninger, startbesvær ved vandladning og i få tilfælde blod i urinen symptomer som er meget lig symptomer for prostatakræft. Symptomerne på prostatakræft er foruden symptomerne for prostatahypertrofi: slap urinstråle, efterdryp, fornemmelse af, at blæren ikke bliver helt tømt, at trangen til at tisse melder sig hurtigt og kraftigt, blod i sæden, nedsat sædmængde og smerter mellem pungen og endetarmsåbningen (Hansen and Kjems, 2011). Ligheden i symptomer er potentielt problematisk, da det indebærer en risiko for, at der kan fejldiagnosticeres, hvis man udelukkende forholder sig til patientens symptomer (Rasmussen, 2006). Figur 4: En forstørret prostata (prostatahypertrofi). På figuren ses, hvordan prostata klemmer om urinrøret (Rasmussen, 2006). Side 14 af 80

15 Prostatakræft Hvordan prostatakræft egentlig opstår, har man endnu ikke detaljeret viden om. Det, man er sikker på er, at prostatakræft ofte findes hos ældre mænd. Man mener også, at der er større risiko for at få prostatakræft, hvis et familiemedlem har eller har haft sygdommen (American Cancer Society, 2012). Man er dog afklaret med, at faktorer, som spiller en væsentlig rolle i udviklingen af andre kræftformer, også er blandt de faktorer, som forventes at være essentielle for udviklingen af prostatakræft. Heriblandt overaktivering af vækstsignaler, ignorering af antivækstsignaler samt kræftcellens apoptose-undvigelse, som fører til dens ubegrænsede celledelingspotentiale (Gioeli, 2005). Aktiviteten af androgen Udviklingen af prostatakræft er afhængig af androgener, som er en samlet betegnelse for mandlige kønshormoner, der blandt andet har indflydelse på vækst, udvikling og reproduktion (Reece et al., 2011). Det hyppigst forekommende androgen er testosteron, men i prostatakræft er det centrale androgen dehydrotestosteron (DHT). DHT fungerer som en receptor på prostataceller og kaldes androgenreceptoren (AR) (Balk and Knudsen, 2008). Regulering af androgenreceptoren i prostata (Se appendix vedrørende cellesignalering). AR-receptoren fungerer som en ligand-afhængig transkriptionsfaktor. En ligand er betegnelsen for et molekyle, som binder sig til et ofte større molekyle. Det betyder, at AR kun aktiveres, når en ligand bindes til receptoren. I dette tilfælde vil liganden være et signalmolekyle. Førend at et ligandmolekyle binder sig til receptoren, vil den holdes inaktiv ved hjælp af proteiner. Når receptoren aktiveres, frigives proteiner, og AR transporteres ind i kernen. Her binder DNA sig til AR, som derved bliver i stand til at regulere områder på de gener, signalet er mål for, hvorved signalet besvares. Den resulterende AR-receptor er derfor i stand til at regulere aktiviteten af gener, som kan svare på androgener. Der er fundet mindst 85 forskellige mutationer i AR, som man forbinder med prostatakræft. Størstedelen af mutationerne udvikles gennem livet, og er således ikke arvelige (Genetics Home Reference, 2012). Da prostatatumorers eksistens siges at være afhængig af androgener, vil hæmning af androgenets funktion udløse celledød, standse kræftcellens delingscyklus og derved understøtte formindskelse af tumoren. Fjernelse af androgenet i prostata kunne derfor være et væsentligt mål for behand- Side 15 af 80

16 ling, men problemet ved det er, at mange af AR s målgener endnu ikke er defineret. Koncentrationen af et bestemt antigen, kaldet prostataspecfikt antigen (PSA) bruges ofte som diagnostisk værktøj, og sammenligning mellem værdier over et sygdomsforløb kan give et billede af sygdommens udvikling. Hvis man aktivt forsøger at fjerne androgenet, falder niveauet af målbar PSA tilsvarende. Faldet er dog ofte forbigående, da tumoren som regel genopstår. Denne observation er et af de tidligste beviser for, at udvikling af tumorer kan sættes i forbindelse med, at AR genopbygges til trods for fjernelsen af androgenet. For at tumoren skal genopstå, skal AR altså genaktiveres. Det kan blandt andet ske ved AR-mutation eller ligand-uafhængig AR-aktivering. Denne type prostatakræft, hvor en tumor genopstår, siges at være androgen-uafhængig, men til gengæld er den dybt afhængig af funktionen af AR, da denne er bestemmende for udviklingen af prostatakræft (Balk and Knudsen, 2008). Mitogen signalering og cellecyklus Proteiner tilhørende gruppen af cykliner er essentielle for celledeling af prostataceller. Betegnelsen cyklin bruges om proteiner, der aktiverer bestemte processer under celledelingen. Faseovergange i cellecyklussen sker ved aktivering af CDK. Cyklin fungerer altså som en katalysator, der binder sig til CDK, som derved aktiveres. Hvis cyklin ikke er bundet til CDK, vil denne være inaktiv. Kinasernes aktivitet falder og stiger uafbrudt i takt med cellens udvikling (Alberts et al., 2008). Når cellen modtager et signal om, at den skal dele sig, vil CDK aktiveres. Så længe cellen ikke modtager et signal om, at den skal dele sig, holdes CDK i G0 fasen (se appendix vedrørende celledeling) af RB (Balk and Knudsen, 2008). G1-fasen I G1-fasen er CDK s væsentligste funktion at aktivere en gruppe genregulerende proteiner, som kaldes E2-promoter binding factor proteiner (E2F). E2F binder sig til en bred gruppe af gener, hvis funktioner er nødvendige for, at overgangen fra G1- til S-fasen kan finde sted. Det er blandt andet G1/S-cyklin og S-cyklin og proteiner, som fremmer DNA-syntese og kopiering af kromosomer. Hvis der ikke er signaler om, at cellen skal dele sig, vil E2F proteinerne aktivere RB og derved forhindre cellen i at påbegynde S-fasen (Alberts et al., 2008). RB s funktion reguleres altså gennem aktivering af cyklin-cdk komplekser (Balk and Knudsen, 2008). Mange celledelingssignaler kan udløse en ophobning af cyklin D (enten D1, D2 eller D3), som kan binde og aktivere G1-kinaserne CDK4 og CDK6, som inaktiverer RB ved fosforlyering. Efterfølgende Side 16 af 80

17 fuldender CDK2-kinasen fosforyleringen af RB og fjerner derved helt dens undertrykkende funktion (se figur 5), og cellen kan nu påbegynde sin udvikling i S-fasen. Ved antivækstsignaler vil RB derimod aktiveres og derved bremse cellecyklussen (Balk and Knudsen, 2008). Figur 5: AR og cellecyklus. Eksempel på cellecyklus, hvor AR aktiveres, og D1 ophobes ved hjælp af proteinet mtor. Når D1 ophobes, aktiveres CDK4 eller CDK6. Når CDK4 eller CDK6 samt CDK2 er aktive, hæmmes funktionen af RB ved fosforylering. Når RB inaktiveres, kan cyklin A aktiveres og fuldføre overgangen fra G1 til S-fasen. I G2-fasen aktiveres CDK1, hvilket bevirker overførsel fra G2 til M fasen. Modificeret efter Balk and Knudsen, G2-fasen I G2 fasen stiger niveauet af cyklin, og når niveauet rammer sit maksimum, begynder celledelingen. Aktiviteten af cyklin øges gennem de tidlige stadier af celledelingen indtil anafasen (se appendix: mitose), hvor cyklin nedbrydes, og celledelingens sidste stadier påbegyndes. Overgangen fra G2 til M fasen er drevet af aktivering CDK1-kinasen (se figur 5). Undersøgelser har vist, at androgenet regulerer overgangen fra G1 til S-fasen. Prostatakræftceller, som mangler dette androgen, taber cyklin D1 og D3, hvilket inaktiverer CDK4. Herved aktiveres RB, der bremser udviklingen af kræftceller, så cellen forbliver i G1-fasen. Det påpeges samtidig, at androgenet får cyklin D til at udtrykkes ved hjælp af et enzym kaldet mammalian target of rapamycin (mtor) (se figur 5). Ved tab af androgenet reduceres cyklin og dermed også CDK2 (Balk and Knudsen, 2008). Side 17 af 80

18 Diagnose og behandling Diagnosticering af prostatakræft Der benyttes forskellige diagnosticeringsværktøjer til at stille diagnosen prostatakræft, hvoraf de to mest anvendte er rektal palpering af prostata, hvilket betyder, at lægen gennem endetarmsåbningen føler på prostata, og PSA-test. Har man symptomer, der kunne indikere forstørrelse af prostata, vil lægen indledningsvis foretage den rektale undersøgelse. Er prostata forstørret, kan det både være symptom på prostatahypertrofi og prostatakræft. Skal der undersøges yderligere for at stille en præcis diagnose, foretages en PSA-test, og for endeligt at be- eller afkræftelse af tilstedeværelsen af prostatacancer udføres en prostatabiopsi, en udtagelse af vævsprøve fra prostata. PSA-testens formål er at måle koncentrationen af PSA i blodet, da en høj koncentration kan være en indikator for en prostatatumor. Der er ingen specifikt beskrevet referenceværdi for niveauet af PSA, men koncentrationer på 4,0 ng/ml eller herunder opfattes generelt som værende normale. Selvom en øget PSA-koncentration kan skyldes andre sygdomme, for eksempel prostatahypertrofi og betændelse i prostata, er PSA-testen stadig den bedste metode til at bestemme, om der er risiko for, at der er en prostatatumor til stede uden at foretage indgreb. Skærpes mistanken som følge af PSA-testens resultat, vil der blive udført en prostatabiopsi, som enten tages gennem rektum eller huden mellem pungen og anus. Sidstnævnte undgås dog helst, da det kan forårsage ubehagelige gener såsom smerter og infektioner at få foretaget denne type biopsi. Ved PSA-test findes hovedsageligt kun tegn på den langsomt progresserende kræfttype, hvor det ikke altid vil være fordelagtigt at behandle. Derudover er der også risiko for, at PSA-testen kan give resultater, der er falsk positive eller negative. En falsk positiv er defineret ved et forhøjet PSAniveau uden tilstedeværelsen af en tumor. Denne kan skabe unødige bekymringer hos patienten og patientens familie. I modsætning hertil står et falsk negativt resultat, hvor der er tumortilstedeværelse trods et normalt PSA niveau. Efter behandling af prostatakræft, benyttes PSA-testen stadig til at overvåge, om der skulle ske tilbagefald (National Cancer Institute, 2012). Side 18 af 80

19 Stadieinddeling af prostatakræft TNM-systemet Kræft inddeles i forskellige stadier, alt afhængig af, hvor kræften har spredt sig til. Det system, der bruges til at vurdere, hvor udbredt kræften er, kaldes tumor-lymfeknude-metastase-systemet (TNM-systemet). T, N og M kategoriserer henholdsvis tumorens størrelse, spredning af kræften til lymfeknuder eller metastasering (se tabel 1, 2 og 3) (Ammundsen and Kjems, 2012). Stadie T0 T1 T2 T3 T4 Tumorens størrelse og udbredelse Tumorens spredning er så ubetydelig, at den ikke umiddelbart ikke kan vurderes. Tumoren kan kun ses i et mikroskop. Tumoren er begrænset til selve prostata, men den kan nu mærkes. Tumoren er vokset igennem prostata. Tumoren har spredt sig til naboorganer såsom blærehals, endetarm og muskler. Tabel 1: Stadieinddeling af prostatatumoren størrelse og spredning. I tabellen ses stadieinddelingen, som tager udgangspunkt i TNM-systemet. Heri beskrives kun kategorien T, som beskriver tumorens størrelse og udbredelse (Ammundsen and Kjems, 2012). Prostatakræft inddeles desuden efter, om der er en spredning til lymfeknuder. Stadie Spredning/Ingen spredning N0 Ingen spredning udenfor prostata. N1 Spredning til de nærmeste lymfeknuder. Tabel 2: Stadieinddeling af spredning af tumoren (Ammundsen and Kjems, 2012). Man undersøger yderligere, om der er metastaser. Stadie Ingen metastaser/metastaser M0 Ingen metastaser. M1 Metastaser i knogler eller andre organer. Tabel 3: Stadieinddeling ud fra tilstedeværelsen af metastaser (Ammundsen and Kjems, 2012). Gleason-score Gleason-score er et system, som bruges til vurdering af aggressiviteten af kræftens udvikling. Ud fra undersøgelsen af vævprøver udtaget fra patienten gives en karakter fra 2-10 på Gleasonskalaen baseret på kræftens vækstmønster. Jo højere karakter, desto højere er risikoen for en aggressiv udvikling af sygdommen. Foruden en karakter baseret på Gleason-systemet, vurderer man tillige sygdommens forløb og risikoen for spredning til andre organer ud fra pateintens alder, sta- Side 19 af 80

20 dieinddeling ud fra TNM-systemet samt PSA-indhold i kroppen. En samlet vurdering af patientens helbredstilstand danner grundlag for vurderingen af, hvilken behandling der er bedst egnet til den pågældende patient. I stadieinddelingen efter TNM-systemet deles stadierne yderligere op i T2a, T2b og T2c efter arealet af tumoren (se tabel 4) (Ammundsen and Kjems, 2012). Risiko PSA (ng/ml) Gleason score Stadie Areal Lav Mindre end T1, T2a Tumoren fylder mindre end den ene halvdel af prostata Mellem T2b Fylder mere end det halve af den ene side af prostata Høj Større end T2c Fylder begge sider af prostata Tabel 4: Vurdering af risiko for spredning af tumoren. Tabellen viser en sammenfattende vurdering af patientens helbredstilstand baseret på PSA-tal, Gleason-score og stadieinddeling. Her ses stadiet T2 yderligere inddeles i T2a, T2b og T2c. Modificeret efter Ammundsen and Kjems, Nuværende behandlingsmetoder Hvor mange og hvem får prostatakræft De seneste år er flere og flere danske mænd blevet diagnosticeret med prostatakræft, og 22 % af alle nye kræfttilfælde blandt mænd er prostatakræft. Den store udbredelse og den lange levetid efter, at sygdommen er opdaget, betyder, at der i 2007 var mere end danske mænd, der levede med sygdommen (Sundhedsstyrelsen, 2012). Tallet har i mange år været stigende. Prostatakræft er en sygdom, der typisk rammer sent i livet (se figur 6). De fleste nye sygdomstilfælde findes i aldersgruppen år. Kun få mænd under 60 år (under 500) får stillet diagnosen prostatakræft hvert år (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Side 20 af 80

21 Figur 6: Antal nye tilfælde af prostatakræft, absolutte tal, fordelt på 5-års aldersgrupper i 2007 (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Hvordan behandles prostatakræft og hvor mange er i behandling Når en patient diagnosticeres med prostatakræft, vælger man behandlingsformen ud fra kræftens udbredelse og de symptomer, patienten oplever. Diagnosen stilles, som tidligere nævnt, delvist ud fra målinger af PSA-niveau og biopsi af prostata. Alt afhængig af kræftens udbredelse stadieinddeles kræften, og lægerne kan vælge mellem en række forskellige behandlinger af sygdommen. De typiske behandlinger er: Aktiv overvågning, fjernelse af prostata og sædblærerne, brachyterapi, strålebehandling, endokrin terapi og kemoterapi. I 2007 var i alt danske mænd i behandling for sygdommen i. Behandling defineres som i kontakt med sundhedsvæsenet tallet er altså ikke et udtryk for behandling i form af operationer eller lægemiddelbehandling, men kan også omfatte patienter, som er i kontakt med sundhedsvæsenet i forbindelse med aktiv overvågning (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Aktiv overvågning Er patienten symptomfri, vil man som nævnt ofte holde øje med kræften uden aktivt at behandle den. Det kaldes aktiv overvågning og indbefatter kvartalsvise målinger af PSA-niveauet i blodet og senere i forløbet ofte sjældnere. 1-2 år efter at diagnosen er stillet, foretages en ny biopsi, og læger foretager beregning af PSA Doubling Time (PSADT). På baggrund af PSADT, rektal palpering og biopsier tages der stilling til, om man fortsat skal overvåge sygdommen, eller om man skal skride til aktiv behandling (Sundhedsstyrelsen, 2012). Side 21 af 80

22 Fjernelse af prostata og sædblærerne Har kræften ikke spredt sig, kan man vælge at udføre et indgreb, hvor prostata og sædblærerne fjernes operativt. Indgrebet kaldes radikal prostatektomi og udføres primært på patienter, der har en forventet restlevetid på over 10 år, og som har et PSA-niveau mindre end 20 ng/ml, hvilket typisk indikerer, at kræften ikke har spredt sig til omkringliggende væv eller lymfesystemet. I 2010 blev der udført 836 indgreb af denne type i Danmark. Radikal prostatektomi har ofte store bivirkninger, hvor inkontinens og erektil dysfunktion er de dominerende. De nyeste studier viser, at 7-12 % af patienterne et år efter operationen stadig oplever inkontinens (Dansk Urologisk Cancergruppe C, 2012). Brachyterapi Stråling ved hjælp af små, radioaktive korn, der operativt lægges ind i prostata, tilbydes nogle patienter. I udlandet tilbydes behandlingen i stigende omfang. i Danmark blev patienter tilbudt behandlingen i henholdsvis 2008, 2009 og Behandlingen er især effektiv ved mindre aggressive tumorer, og fordelen ved behandlingen er, at patienten i højere grad end ved andre invasive behandlinger bevarer sin vandladnings- og erektile funktion. Behandlingens effektivitet svarer til radikal prostatektomi og strålebehandling. Målinger af bivirkninger efter to år har vist, at urinvejs-, tarm- og erektionskomplikationer var de hyppigst forekommende (Dansk Urologisk Cancergruppe A, 2012). Strålebehandling Der findes i dag ikke randomiserede studier, der kan vejlede i valget mellem, om prostatakræft skal behandles med radikal prostatektomi, brachyterapi eller strålebehandling dog kan særlige forhold som svær overvægt gøre patienter mere egnede til strålebehandling end andre behandlingsformer (Sundhedsstyrelsen, 2012). Strålebehandling mod prostatakræft tilbydes både til patienter med lokaliseret prostatakræft og til patienter, hvor kræften har spredt sig til det omkringliggende væv. Patienten har typisk et PSAniveau på mindre end 70 ng/ml. Studier har vist, at strålebehandling medfører forlænget levetid hos patienten. Strålebehandling kan også gives til patienter, der har fået foretaget radikal prostatektomi for at bekæmpe kræft, der ikke er fjernet operativt. Side 22 af 80

23 Bivirkningerne ved strålebehandling afhænger i høj grad af den stråledosis, der er givet. Høj dosis og/eller mange gentagne behandlinger giver større risiko end lav dosis/få strålebehandlinger. Nye stråleteknikker har mindsket skaderne på endetarmen. Inkontinens og erektil dysfunktion er også bivirkninger ved strålebehandling, men de forekommer sjældnere end ved radikal prostatektomi (Dansk Urologisk Cancergruppe D, 2012). Endokrin terapi Hormoner spiller en nøglerolle for regulering af vækst i de fleste væv. Som beskrevet har de mandlige kønshormoner og AR indflydelse på udviklingen af prostatakræft. Det endokrine system er et system bestående af kirtler, der ved hjælp af hormoner sender signaler til andre af kroppens organer. Den endokrine behandling sigter på at ramme hormonsignaleringen, og når det gælder prostatakræft især AR. En af de endokrine behandlinger er rettet mod androgenerne, som er nødvendige for normal udvikling og funktion af prostata, og er en forudsætning for, at cancer kan opstå. Kan disse hæmmes, vil der ske apoptose i prostatacancervævet. Med behandlingen har man opnået positive resultater på 80 % af patienterne (Dansk Urologisk Cancergruppe B, 2012). En anden endokrin behandling er medicinsk kastration. Medicinen gives i pilleform eller som depotinjektioner. Formålet med den medicinske kastration er at sænke dannelsen af hormonet testosteron, hvilket har en gavnlig effekt på cancers udvikling. Bivirkninger ved hormonbehandlingerne er typisk brystdannelse, men også nedsat sexlyst, hedeture og knogleskørhed ses blandt bivirkningerne (Sundhedsstyrelsen, 2012) mænd var i 2007 i behandling med hormonregulerende medicin (se tabel 5) (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Kemoterapi Man er i stigende grad begyndt at bruge kemoterapi i de første stadier af prostatakræft, men kemoterapi er sjældent den foretrukne behandlingsform, med mindre kræften har spredt sig til andre organer eller knogler. De officielle, danske retningslinjer for behandling af prostatakræft foreskriver samtidigt, at kemobehandling først sker ved prostatakræft, der er metastatisk og kastrationsresistent altså at kræften igen er begyndt at vokse eller ikke længere reagerer på endokrine behandlinger. Vil man bruge kemoterapi tidligere i sygdomsforløbet, sker det oftest som eksperimentel behandling. Side 23 af 80

24 Bivirkningerne ved kemoterapi er kendte og omfatter blandt andet vægttab, madlede, hårtab, kvalme og opkast. I 2007 var 252 mænd i cytostatisk behandling for prostatakræft. Cytostatisk behandling omfatter blandt andet kemoterapi (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). I tabel 5 kan man se antallet af mænd i behandling fordelt på behandlingstype i Behandlingsform Antal mænd i behandling Operative indgreb 704 Strålebehandling 1547 Hormonel behandling 3439 Cytostatisk behandling 252 Tabel 5: Antallet af danske mænd i udvalgte former for medicinsk behandling for prostatakræft i Modificeret efter Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , Overlevelse Prostatakræft som tidligere nævnt en sygdom, man i højere grad lever med end dør af. Når man skal se på den relative overlevelse, der er et mål for patienternes sandsynlighed for at overleve en given tid, er det meningsløst at forholde sig til den relative overlevelse for hver enkelt behandlingsform. Som beskrevet vil man typisk begynde med en strategi om aktiv overvågning og i et senere stadie af sygdommens udviklingsforløb skride til for eksempel operation eller hormonel behandling. Den relative overlevelse vil altså være forholdsvis god i sygdommens første stadier, men relativt dårlig, når man først er skredet til eksempelvis kemobehandling, som jo først anvendes ved spredning, eller når andre behandlinger ikke længere har effekt. Den seneste opgørelse over den relative overlevelse efter diagnosen prostatakræft viser, at der er en stigning i den relative overlevelse. For den relative 1-årige overlevelse er stigningen 6 procentpoint (se figur 7) i perioden , og nu er 86 % af patienterne i live et år efter, diagnosen er stillet. Også for 3-års og 5-års overlevelse er stigningen målbar. Sundhedsstyrelsen konkluderer, at stigninger i overlevelsen skal ses i lyset af, at der blandt andet grundet stigende brug af PSA-målinger opdages flere tilfælde af prostatakræft end tidligere, og at tilfældene opdages i et tidligere stadie, hvilket er med til at sikre bedre muligheder for overlevelse (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Side 24 af 80

25 Figur 7: Relativ overlevelse (1, 3, 5 og 10 år) i procent for mænd med prostatakræft opdelt på diagnoseår og år efter diagnose, hele landet, Kun stigningen i 1-års og 3-års overlevelse er med sikkerhed statistisk signifikant (Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil , 2009). Side 25 af 80

26 Thapsigargin-analoger Om Thapsia garcanica kort fortalt Planten T. garganica tilhører slægten Thapsia, som er en lille familie af skærmplanter, der vokser i Middelhavsområdet. T. garganica - også kendt som deadly carrot eller dødbringende gulerod - har fået sit navn, fordi den har vist sig giftig for visse pattedyr - især kameler, som har en forkærlighed for planten. Til trods for, at man kendte til plantens dødbringende effekt, har man benyttet sig af saft fra planten som lægemiddel mod diverse sygdomme. Det er blandt andet brugt som middel til udrensning af kroppen ved forøgelse af urinering, afføring samt opkast, men også som et smertestillende stof, som kunne forkorte sårhelingsprocessen, hvis det blev brugt i bandager på såret (Pujadas-Salvà and Plaza-Arregui, 2003). Intro til thapsigargin-promedikamenterne Thapsigargin i sin grundform Thapsigargin (se figur 8) er et cytotoksin, der vil angribe både sunde og maligne celler (Denmeade et al., 2012). Figur 8: Thapsigargin i sin grundform (Andrews et al., 2007). Stoffet udvindes af et ekstrakt af rødderne fra planten Thapsia garganica (Treiman et al., 1998). Inde i cellens cytoplasma er der normalt et niveau af Calcium Ca 2+ -ioner på omkring nm (nano-molær) (Berridge et al., 2000). Når cellen bliver udsat for thapsigargin, stiger koncentrationen af Ca 2+ i cytoplasmaet til mikromolære niveauer hvilket kan medføre apoptose. Side 26 af 80

27 Traditionel kemoterapi består af cellegifte, der hæmmer celledeling, og da kræftceller normalt er karakteriseret ved meget hurtig celledeling, er kemoterapien en relativt effektiv behandling (Tandrup and Kjems, 2011). Celledelingen foregår oftest langsomt i prostatatumorer (Schmid et al., 1993) og virkningen af traditionel kemoterapi er derfor begrænset, hvilket er årsagen til, at kemoterapeutisk behandling typisk tilbydes patienter med metastaser det vil sige patienter i så fremskredent et stadie, at kræften har spredt sig til andre dele af kroppen (Lewinsky, 2009). Thapsigargin fremkalder apoptose både i celler, der deler sig så hurtigt, at vævet samlet set vokser i omfang hvilket er tilfældet for de fleste tumorer og i celler, der deler sig med normal hastighed, hvilket bevirker, at selv langsomt-voksende typer af prostatakræft også rammes. Selv nanomolære koncentrationer af thapsigargin er stærkt giftige for alle organismer, så der påkræves en metode til at målrette cellegiften mod de celler, man ønsker at fremkalde apoptose i. Her får man brug for et promedikament (Denmeade et al., 2012). Et promedikament Når en cellegift, der vil ødelægge calciumbalancen i celler over hele kroppen, injiceres, er det nødvendigt at finde en måde at holde denne cellegift inaktiv på, til den når til det sted her prostatakræftepitelvævet der skal slås ihjel. Det vil med andre ord sige, at der er behov for et promedikament (Christensen et al., 2009). Et promedikament er et stof, der som udgangspunkt er inaktivt, men som, når det kløves af enzymer eller andre kemikalier, bliver et virksomt lægemiddel (The American Heritage Medical Dictionary, 2007). Christensen et al. sammenfatter i 2009 kravet til et promedikament, der i dette tilfælde skal anvendes til behandling af prostatakræft: Der skal hæftes et radikale på det aktive giftstof, der medfører, at det bliver farmakologisk inaktivt, således at giftstoffet ikke angriber steder, der ikke er hensigtsmæssige. Når det påhæftede radikale kløves af i kroppen, skal giftstoffet atter være aktivt. Der skal kunne opnås høj nok koncentration i cellerne til, at der opnås en effektiv virkning. Giftstoffet skal forblive i cellerne eller nedbrydes så hurtigt, at der ikke sker uhensigtsmæssig skade på andet end målet. Det radikale, der hæftes på, skal være uskadeligt eller nedbrydes hurtigt, når det kløves af. Side 27 af 80

28 For at kunne målrette promedikamentet skal man derfor finde et stof, der i størst muligt omfang kommer til udtryk udelukkende i prostatakræftvæv. Her kommer katalysatoren Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) i fokus (Denmeade et al., 2012). Tilstedeværelse af PSMA Trods navnet er PSMA dog ikke udelukkende til stede i prostatavæv. En del studier har haft som mål at bestemme, hvor og i hvor høj grad PSMA er til stede i både sundt væv og kræftvæv idet der har været anvendt flere forskellige, og med tiden stadigt mere avancerede, analysemetoder. Silver et al. fandt i 1997, at PSMA var til stede i 33 ud af 35 prostatatumorer. De analyserede ligeledes et antal prøver af forskellige typer rask væv og fandt også små mængder PSMA i nyrer, rask prostataepitel, tolvfingertarmen og tyktarmen. Mhaka et al. fandt i 2004, at PSMA var massivt til stede i både maligne og normale prostataepitelceller. Derudover fandtes der også PSMA-proteiner hos mange andre typer af tumorers neovaskulatur dvs. cellerne i de blodkar, som er dannet netop på grund af disse tumorer (The American Heritage Medical Dictionary, 2007). De fandt dog ikke tilstedeværelse af PSMA i endotelet det vil sige det lag af pladeepitel, der dækker en del væskefyldte hulrum (Rasmussen and Sloth, 2005) i normalt væv. Haffner et al. fandt i 2009, at PSMA er til stede i 85 % af de undersøgte vævsprøver fra kolorektale tumorer, dvs. kræft i tyktarm, herunder blindtarm, og endetarm (Schulze et al., 2012). De fandt ligeledes, at 66 % af de undersøgte vævsprøver af mavecancer havde tilstedeværelse af PSMA. I 2011 analyserede Minner et al prøver af prostatacancervæv, der var bortopereret fra patienter ved radikal prostatektomi samt 612 prøver fra 76 fra forskellige andre typer normalt, raskt væv. De fandt udelukkende PSMA i prostataepitel, og det var langt stærkest repræsenteret i cancercellerne i forhold til rask prostataepitel % af de 1700 prøver af prostatacancer havde PSMA til stede. Samplaski et al. fandt i 2011 PSMA i 100 % af de undersøgte blærecanceres vaskulatur. Denmeade et al. fik i 2012 de resultater, som er vist i figur 9. Side 28 af 80

29 Figur 9: Resultaterne af Denmeade et al s undersøgelse fra 2012 af tilstedeværelsen af PSMA i forskellige typer sundt væv og kræftvæv. n angiver antallet af undersøgte vævsprøver pr. vævstype. PSMA er til stede i vævet ved kræft i: leverens hepatocytter (HCC), kræft i mesothelium (Mes), kræft i æggestokkene (OC), nyrekræft (RCC), brystkræft (BrC), modermærkekræft (Mel) og kræft i blæren (BC). I de undersøgte prøver af sundt væv fra lever (NL), nyre (NK), bryst (NBr) og blære (NB) fandtes der ingen tilstedeværelse af PSMA (Denmeade et al., 2012). Det er tydeligt, at der ikke er noget samstemmende billede af, i hvor høj grad PSMA er til stede i de forskellige typer sygt og rask væv, men der er dog en tydelig tendens i undersøgelserne til, at PSMA i høj grad er til stede i prostatakræftvæv, i mindre grad i rask prostatavæv og i varierende grad i andre typer kræftvæv. Prostata-Specific Membrane Antigen PSMA er et transmembran-glycoprotein (Denmeade et al., 2012) det vil sige et protein, der er bundet til en eller flere kulhydratgrupper ved hjælp af kovalente bindinger og går hele vejen gennem cellevæggen (Rasmussen and Sloth, 2005). Man har endnu ikke fuldt ud forstået dets rolle i raskt og kræftsygt prostatavæv (Minner et al., 2011), men PSMA betegnes funktionelt som en såkaldt glutamat carboxypeptidase (Mhaka et al., 2004). For at kunne forklare, hvad betegnelsen glutamat carboxypetidase betyder, kan man se nærmere på de ord, der indgår i navnet: Et peptid er en kort kæde af aminosyrer, som sidder sammen ved en bestemt type kovalente bindinger såkaldte peptidbindinger. Der indgår polypeptider det vil sige mange aminosyrer bun- Side 29 af 80

30 det sammen med peptidbindinger i proteiner. Glutamat er en aminosyre, man ofte vil se i peptiderne i proteinerne. Glutamat i proteinerne bliver substrat for carboxypeptidaserne, som overordnet set er en betegnelse for enzymer, som nedbryder peptider til frie aminosyrer og i dette specifikke tilfælde er den frie aminosyre glutaminsyre (Rasmussen and Sloth, 2005). PSMA har unikke enzymatiske egenskaber, herunder hydrolytiske og det er disse, man ønsker at anvende til behandling af prostatakræft med promedikamentet G202. Det indebærer, at man lader G202 angribe der, hvor der er PSMA til stede (se figur 14) (Denmeade et al., 2012). Anvendelse af PSMA s katalytiske egenskaber I forbindelse med behandling af prostatakræft med det ene promedikament (G202) søger man at anvende tilstedeværelse af PSMA i en stor del af de kræftsyge cellers endotelvæv til at frigive en analog af thapsigargin i tumorens mikromiljø dvs. i væsken omkring tumoren. Som nævnt er PSMA et transmembran-protein og ekstracellulært har den specifikke katalytiske egenskaber (Denmeade et al., 2012). Udfordringen er altså at finde et peptid-substrat, der er så specifikt, at kun PSMA kan kløve det ved hydrolyse (Mhaka et al., 2004), og som kan sættes sammen med en anvendelig og tilstrækkelig effektiv analog af thapsigargin. Ved fraspaltning af den valgte analog af thapsigargin ekstracellulært i tumorens mikromiljø, vil der være stor sandsynlighed for, at også de celler i tumoren, som ikke har tilstedeværelse af PSMA vil blive ramt (Denmeade et al., 2012). Der er lavet forskellige forsøg for at bestemme et PSMA-specifikt substrat. For eksempel forsøgte Mhaka et al. i 2004 at lave peptid-substrater ud fra et bestemt aktivt stof, som er det virksomme stof i en række forskellige lægemidler (The American Heritage Medical Dictionary, 2007). Det andet promedikament G114 skal ikke hydrolyseres af PSMA men af det nævnte PSA. Thapsigargin inde i cellen For at kunne forstå, hvordan en given thapsigargin-analog fremkalder apoptose i kræftceller, er det vigtigt at forstå den såkaldte SERCA-pumpes funktion i celler. SERCA (Sarco/Endoplasmatisk Reticulum Ca 2+ -ATPase) SERCA er proteinpumper, der står for opretholdelsen af calciumniveauet i cellen og organellerne. Uden for cellen og i organellerene er der en højere koncentration af Ca 2+ (se figur 10) i forhold til cytoplasmaet. Fokus i dette review lægges på SERCA-pumpen i ER. Side 30 af 80

31 Figur 10: En muskelcelle samt Ca 2+ -pumperne. Det ses, at der er en lav koncentration i cytoplasmaen og en høj koncentration i ER. Omdannelsen af ATP til ADP ses ligeledes. Modificeret efter Reece et al., Pumpen fungerer ved aktiv transport, hvilket vil sige, at der pumpes stof mod koncentrationsgradienten altså fra væske med lav koncentration til væske med høj koncentration af stoffet. Ved den aktive transport sker der en hydrolyse af ATP, så et fosformolekyle fra ATP binder sig til pumpen. Det forårsager en ændring i strukturen af denne, som bevirker, at pumpen åbner sig imod lumen (hulrummet) i ER, hvor der er en højere koncentration, og afgiver de Ca 2+ -ioner, den overfører fra cytoplasma. SERCA har to stadier kaldet E1 og E2. E1 er stadiet, hvor åbningen vender mod cytoplasmaet for at optage to Ca 2+ -ioner. Når fosfor fra ATP et bindes til pumpen, vil denne overgå til E2. E2 er således stadiet, hvor pumpen afgiver 2 Ca 2+ -ioner ind i ER imod koncentrationsgradienten. Herefter afgives fosfor ved hydrolyse, og åbningen vendes igen mod cytoplasma. Dette er en fuld cyklus, og pumpen har nået E1 igen (se figur 11). Side 31 af 80

32 Figur 11: De forskellige stadier af Ca 2+ transport gennem SERCA. Man kan se, hvordan den i E1 fasen optager 2 Ca 2+, hvorefter SERCA hydrolyseres og vender tilbage til sin originale tilstand E1 (Wuytack et al., 2002). Forstyrrelser i Ca2+-balancen forårsager stress i ER, og hvis dette vedholdes, vil cellen begå apoptose. Dette gøres for at skåne det omkringliggende væv mod skader. Der eksisterer to hypoteser om, hvad der forårsager apoptose, når det endoplasmatiske reticulum udsættes for stress. Den ene hypotese er, at apoptosen er forårsaget af et fald i Ca2+ i det endoplasmatiske lumen, hvor den anden hypotese argumenterer for, at apoptose skyldes en stigning af Ca2+-koncentrationen i cytoplasma (Wuytack et al., 2002). Nyere forskning med thapsigargin viser, at når SERCA blokeres, tømmes Ca2+-ioner langsomt ud i cytoplasma, hvilket forårsager apoptose (Sjøgren, 2012). Thapsigargins hæmning af SERCA Som nævnt har SERCA to stadier, E1 og E2. Thapsigargin binder sig til SERCA, når den er i E2 stadiet (se figur 12), og hæmmer den i at vende tilbage til sit E1 stadie. Figur 12: Thapsigargin-påvirket SERCA-pumpe. Thapsigargin binder sig til fosfatet i E2 konfigurationen. Modificeret efter Dode et al., Side 32 af 80

33 Som det ses af figur 12, er SERCA yderst afhængig af at kunne vende tilbage til sit E1-stadie for at kunne fungere og forhindre apoptose forårsaget af for høj calciumkoncentration i cytoplasmaet. Thapsigargin binder sig til fosfatet på E2-stadiet og hindrer herved, at SERCA kan vende tilbage til sit E1-stadie. Thapsigargin kan danne en hydrogenbinding til SERCA s fosfatmolekyler i E2-stadiet, da hydrogenatomet har en høj bindingsevne til fosfatets negativt ladede oxygen-atom (se figur 13). Thapsigargin binder sig ved koncentrationer mellem 100 nm til 1000 nm kun til SERCA1, og det udnytter forskerne bag promedikamenterne, da en høj bindingsevne betyder, at der ikke behøves en lige så høj koncentration af den cytotoksiske del af promedikamentet for at hæmme SERCA1, og derved forårsage programmeret celledød (Michelangeli and East, 2011). Figur 13: Opbygning af ATP. Man kan se de fire negative O - -atomer, der udøver en tiltrækkende kraft på thapsigarginens hydrogenatomer. Modificeret efter Reece et al., Forskning i thapsigargin Siden 1990 erne har forskere kendt til thapsigargins potentielle evne til at hæmme SERCA (Sagara and Inesi, 1991), og i 2003 blev det første promedikament Mu-HSSKLQ//L12ADT (G114) brugt i forsøg, der havde til formål at finde et middel, der effektivt kunne udløse apoptose i prostatakræfttumorer, først i in vitro og derefter i in vivo (se afsnittet in vitro vs. in vivo). Formålet med forskningen i G114 var at skabe et promedikament, der kunne sprøjtes direkte ind i prostatakræfttumore og hydrolyseres af PSA i tumorens blodbaner og derefter trænge ind i tumoren (Denmeade et al., 2003;Dunn and Dawson, 2011). Med udgangspunkt i samme strategi blev promedi- Side 33 af 80

34 kamentet 12ADT-Asp//EEEE (G202) senere udviklet med samme formål, men de to promedikamenter er dog som nævnt målrettet spaltning ved to forskellige enzymer (se figur 14) (Denmeade et al., 2003;Denmeade et al., 2012). Denmeade et al. konkluderede i 2003, at G114 kun var egnet til direkte injektion i tumoren. G202 bliver som nævnt hydrolyseret af PSMA, der blandt andet udtrykkes i prostatakræftcellernes membran men som sagt også i andre kræftceller (Dunn and Dawson, 2011). Det bevirker, at G202 kan gives intravenøst eller ved infusion og effektivt blive hydrolyseret af de PSMA-udtrykkende celler og derved også medføre apoptose i metastaser, da G202 vil brede sig ud i hele kroppen i blodårerne (Mhaka et al., 2004;Denmeade et al., 2012). Firmaet Genspera har patent på G202 og G114 (Genspera B, 2011). Figur 14: Stiliseret illustration af promedikamenternes virkemåde modificeret efter Genspera E, G202 og G114 Da G202 og G114 har to helt forskellige mål (PSMA og PSA), har de fået påsat to forskellige peptidkæder, der udnytter den specialisering, der er i hver af disse. G114 skal hydrolyseres af PSA (Denmeade et al., 2003), en protease, der hydrolyserer serin-holdige proteiner. G202 skal hydrolyseres af PSMA (Denmeade et al., 2012), et transmembran-protein, der indeholder glucose, altså et glycoprotein, hvor en protease spalter peptidkæden fra. Begge promedikamenter er opbygget med det samme cytotoksiske molekyle, thapsigargin, som den vigtigste byggesten (se figur 15). Side 34 af 80

35 Figur 15: Thapsigargin i sin grundform. Se bort fra, at nogle af de kovalente bindinger illustreres med trekanter. Disse fortæller noget om molekylets rumlige struktur og forståelsen af den er ikke vigtigt i forhold til resten af reviewet. Modificeret efter Denmeade et al., Et peptid består af to eller flere aminosyrer, der kobles sammen ved hjælp af kondensationsreaktioner (Reece et al., 2011). For at kunne tilkoble et peptid, skal der kunne dannes en peptidbinding (se figur 16). Side 35 af 80

36 Figur 16: Dannelse af peptidbindelser, som det sker ved dannelse af thapsigargin-promedikamenter. Som det ses af figuren, dannes peptidbindingen ved, at den allerede eksisterende peptidkædes OH-gruppe kobles af samtidig med, at H-gruppen på aminogruppens hovedkæde også kobles af. Der dannes derved en kovalent binding mellem amingruppen (NH) og carbonylgruppen (C=O) og vand (H 2 O). Modificeret efter Reece et al., For at dette kan ske, er man nødt til at modificere thapsigargin, så det kan danne netop en peptidbinding. Molekyleformlen for det modificerede thapsigargin ses på figur 17. Der kobles en octan-8- amin - markeret med en hvid boks - idet amingruppen (-NH 2 ) sidst på kæden gør det muligt for den modificerede form af thapsigargin at lave peptidbindinger (Denmeade et al., 2003;Dunn and Dawson, 2011;Denmeade et al., 2012). Side 36 af 80

37 Figur 17: Thapsigargin med en 12ADT-kæde. Efter denne modifikation kan der nu dannes peptidkæder, og derved kan thapsigargin 12ADT målrettes (Denmeade et al., 2012). G114 Som nævnt var hensigten med udviklingen af G114 at producere et promedikament, der kan hydrolyseres af PSA, og da PSA findes i blodet, skal promedikamentet derfor injiceres direkte i tumorens blodkar (Denmeade et al., 2003;Dunn and Dawson, 2011). I 1997 fandt Denmeade et al. forskellige peptidkæder, der kunne hydrolyseres af PSA, og her viste de, at peptidkæden HSSKLQ (se figur 18) var den mest effektive (Denmeade et al., 1997). Figur 18: Mu-HSSKLQ. Mellemrummet mellem de forskellige farver angiver stedet, hvor de indbyrdes peptidbindinger dannes. Beskyttelsesliganden Mu er en gruppe, der skal sørge for, at der ved videre peptidbindinger kun bindes til glutamin og ikke histidin. Modificeret efter Denmeade et al., For at teste PSA s hydrolyseringseffektivitet koblede Denmeade et al i 1998 Mu-HSSKLQ på doxorubicin (dox), som er et andet cytotoksin. PSA s evne til at hydrolysere Mu-HSSKLQ//dox blev Side 37 af 80

38 testet, og det viste sig, at PSA s evne til at hydrolysere koblingen var stærkt nedsat i forhold til de tidligere forsøg med Mu-HSSKLQ på grund af det tilkoblede cytotiske radikale (dox). Man forsøgte så at koble leucin på dox og sætte det sammen med peptidkæden og fandt ud af, at denne kobling blev hydrolyseret mere effektivt af PSA end koblingen, hvori der ikke indgik leucin. Det viste, at der, for at kunne koble Mu-HSSKLQ på et cytotoxin, der effektivt hydrolyseres af PSA, skal indgå leucin i peptidbindingen mellem den cytotoksiske del og den PSA-hydrolyserede peptidkæde (Denmeade et al., 1998;Khan and Denmeade, 2000). Disse resultater førte til promedikamentet G114, der hydrolyseres af PSA (se figur 19) (Denmeade et al., 2003). Figur 19: Strukturformel for promedikamentet G114. Det blå område, der udpeges med en pil, indikerer, hvor PSA hydrolyserer G114. Modificeret efter Dunn and Dawson, Denne kobling til Mu-HSSKLQ har også den fordel, at L12ADT-thapsigargin i sig selv er hydrofobt, og derfor ikke kan opløses i vand eller blod. Ved at tilkoble Mu-HSSKLQ-peptidkæden bliver promedikamentet hydrofilt, og kan derved sprøjtes ind i tumoren og herfra opløses i blodet uden de store vanskeligheder (Denmeade et al., 2003;Reece et al., 2011). Efter at PSA har hydrolyseret G114, efterlades et aktivt medikament, der ses i figur 20. Figur 20: L12ADT-thapsigargin. Aktivt thapsigargin-baseret medikament. Modificeret efter Denmeade et al., Side 38 af 80

39 Som nævnt har G114 til formål, at det skal medføre apoptose i tumoren, når det injiceres direkte ind i den. For at den apoptosefremkaldende del af G114 (se figur 20) kan trænge ind i cellens SER- CA-pumper, skal det være lipofilt, da det ellers ikke vil kunne diffundere over cellemembranen, der primært består lipider. Lipofiliteten opnås, når peptidkæden fraspaltes ved hydrolyse (Denmeade et al., 2003;Reece et al., 2011). Figur 21: G114 s virkning i tumoren. Modificeret efter Genspera G, Det aktive medikament med thapsigargins cytotoksiske egenskaber trænger ind i cellen, som det ses på figur 21, hvor SERCA blokeres (Denmeade et al., 2003). Der forskes ikke yderligere i G114, da det har vist sig, at et andet promedikament, G115, er mere effektivt (se figur 22) (Dunn and Dawson, 2011). Side 39 af 80

40 Figur 22: G114 og G115 i CWHR22-H-cellelinjen. Antitumoreffekten blev testet på en cellelinje, der i høj grad udtrykker PSA (CWR22-H, se afsnittet cellelinjer). Begge promedikamenter blev givet i doser på omkring 0,7 mg/kg/ dag i ti sammenhængende dage. Da det er en ratio sammenligning, er der ikke angivet enheder. Modificeret efter Dunn and Dawson, Selvom G115 vil være det promedikament Genspera og forskere vil arbejde videre med, tager reviewet udgangspunkt i G114 på grund af manglende data for G115. Desuden rammer begge promedikamenter samme mekanisme, og de bruger begge en peptidkæde, der hydrolyseres af PSA, og vi mener, at man ud fra forsøgsdataene for G114 stadig vil kunne estimere promedikamenternes potentiale (Dunn and Dawson, 2011). G202 Idet G202 skal hydrolyseres af PSMA, skal der anvendes en helt anden peptidkæde i dette promedikament, men der arbejdes stadig med udgangspunkt i thapsigargin-12adt. Mhaka et al. havde i 2004 fundet en sammenhæng mellem PSMA og peptidkæder med asparaginsyre og glutaminsyre. Denmeade et al. offentliggjorde i 2012 forsøgsresultater, hvor de havde testet forskellige koblinger med asparaginsyre og glutaminsyre. De søgte at finde den mest effektivt PSMA-hydrolyserede peptidkæde, der kunne sikre et promedikament med den største cytoksisitet og den laveste hy- Side 40 af 80

41 drolyseringsgrad ved celler, der ikke udtrykker PSMA. Der skulle altså findes en aminosyre, der kunne kobles til 12ADT-delen på thapsigargin for at forhindre, at 12ADT-delen blev fejlhydrolyseret af celler, der ikke udtrykker PSMA, hvorved den cytotoksiske del vil slippe ud i kroppen. Derfor lavede Denmeade et al. i 2012 forsøg, hvor effektiviteten af tre koblinger mellem 12ADT og henholdsvis asparaginsyre og glutaminsyre blev testet i forhold til thapsigargins. Det gjorde de ved at bestemme den koncentration af det pågældende cytotoksin, der var påkrævet for at halvere SER- CA s effektivitet i celler (IC 50 ), der ikke udtrykte PSMA (her brugte man TSU-celler til tests (se afsnit: Cellelinjer)), og i celler der udtrykker PSMA (her blev LNCaP-celler anvendt). Forsøgsresultaterne kan ses i figur 23. Ud fra dette forsøg kunne Denmeade et al. konkludere, hvilken kombination af aminosyrer koblet til 12ADT, der var mest effektiv i hæmningen af SERCA. Figur 23: Thapsigargin og tre aktive medikamentanalogers efter 72-timers inkubation. IC 50 bruges som et udtryk for, hvor stor en koncentration af et bestemt medikament, der skal til for at halvere effektiviteten af en bestemt biologisk proces i in vitro-forsøg. Modificeret efter Denmeade et al., Af figur 23 ses det, at glutaminsyre og asparaginsyre synes mest egnede til at kobles til 12ADT med henblik på at skabe et medikament, der hæmmer SERCA næsten udelukkende i PSMAudtrykkende celler (Denmeade et al., 2012). Mhaka et al. fandt i 2004, at peptidkæder, der indeholder fem sure aminosyrer effektivt hydrolyseres af PSMA, og antallet af syregrupper er tilstrækkeligt til at gøre et thapsigarginpromedikament hydrofilt og forhindre promedikamentet i at krydse cellemembranen. Da aspargin- og glutaminsyre fungerer godt og disse findes naturligt, benyttedes disse. Man fandt samtidig i forsøget ud af, at glutaminsyreres koblinger til hinanden er ustabile i blodet. Forskellige koblinger mellem asparaginsyre og glutaminsyre blev afprøvet, og der blev fundet en peptidkæde, der både forblev stabil i plasma, og hvis aktive medikament effektivt hæmmede SERCA (se figur 24) (Denmeade et al., 2012). Side 41 af 80

42 Figur 24: 12ADT-Asp s hæmning af SERCA, målt ud fra koncentrationen af calcium i cellens cytosol over 1200 sekunder. Modificeret efter Denmeade et al., Et promedikament med Asp-Glu-Glu-Glu-Asp, hvis aktive medikament er thapsigargin-12adt-asp, havde dog den ulempe, at den ikke blev hydrolyseret effektivt nok af PSMA - den var for stabil. Derfor fjernede Denmeade et al. (2012) den sidste asparaginsyre og koblede en glutaminsyre på i stedet og sammenlignede derefter de to promedikamenters specialisering i forhold til PSMAudtrykkende celler (se figur 25). Figur 25: De to peptidkæders hæmning af celledelingen for celler der ikke udtrykker PSMA, og celler der udtrykker PSMA. Modificeret efter Denmeade et al., Resultatet var til fordel for Asp-Glu-Glu-Glu-Glu, og da dets aktive medikament også er 12ADT-asp, blev denne peptidkæde koblet på det modificerede thapsigargin via en peptidbinding (se figur 26). Side 42 af 80

43 Figur 26: G202 s molekylestruktur. Der er på figuren angivet de steder, hvor PSMA-hydrolysen foregår. Modificeret efter Denmeade et al., Det samme princip med det hydrofile promedikament og hydrofobe medikament, der gælder G114, gælder også for G202. Når PSMA har hydrolyseret G202, efterlades 12ADT koblet til asparaginsyre (Dunn and Dawson, 2011;Denmeade et al., 2012). 12ADT-Asp har samme cytotoksiske egenskaber som L12ADT, men udløses et andet sted (Denmeade et al., 2003;Denmeade et al., 2012). Figur 27 viser en stilisering af G202 s funktion. Figur 27: G202 s virkemåde. Modificeret efter Genspera F, Thapsigargin-analogernes virkning Den primære betydning af radikalerne tilkoblet analogerne er deres evne til at blive fraspaltet af PSMA eller PSA uden at miste det cytotoksiske radikale, der bevirker, at promedikamentet kan binde sig til SERCA-pumpen og sætte den ud af funktion (Mhaka et al., 2004). En anden vigtig rolle er også, at de skal medvirke til at gøre promedikamentet hydrofilt, så det kan opløses i blodet samtidig med, at det forhindrer promedikamentet i at krydse lipid-membranen i raske celler (Reece et al., 2011;Dunn and Dawson, 2011;Denmeade et al., 2012). I cytoplasmaet spiller aminosyren, Side 43 af 80

44 der forbliver hæftet på det cytotoksiske radikale efter hydrolysen ikke nogen stor rolle (se figur 28), da thapsigargin i meget små koncentrationer ( nm, altså i det nanomolære spektrum) kun specifikt rammer SERCA-pumpen (Michelangeli and East, 2011). Figur 28: Sammenligning af 12ADT-Asp og L12ADT s hæmning af SERCA, samt PSMA og PSA s hydrolysering af G202 og G114. Man kan ud fra figuren få en fornemmelse af aminosyrens effekt i cytosolet, der, som det ses ud fra figuren, ikke har en større betydning. Modificeret efter Denmeade et al., 2003;Denmeade et al., Forsøg med thapsigargin- promedikamenter Intro In vitro vs. in vivo For at få et nyt medikament på markedet, skal man have det testet for bivirkninger, sundhedsskadelighed og for, om det fungerer optimalt. Det kan man gøre ved at udføre forskellige eksperimenter: Man kan lave in vitro-forsøg, som betyder forsøg i glas på latin, eller man kan lave in vivoforsøg, som betyder forsøg i liv på latin. Forskellen mellem disse eksperimenter er, at der ved in vitro-forskning generelt er tale om manipulation af organer, væv, celler og biomolekyler i et kontrolleret kunstigt miljø. Det vil sige, at in vitro-forsøg er eksperimenter eller observationer udført på for eksempel væv uden for den levende organisme i reagensglas eller i petriskåle. In vivo-forsøg er eksperimenter inde i levende organismer og bruges, hvis der klinisk skal afprøves et nyt lægemiddel. Her får individet, for det meste rotter, mus eller kaniner, implanteret for eksempel cancer, og lægemidlet afprøves. Forsøgsdyret får medicinen i en vis periode, og der bliver observeret for resultater eller bivirkninger (Hakim Nasr, 2012). Side 44 af 80

45 Forsøg med G114-promedikamentet i 2003 I 2003 lavede Denmeade et al. forsøg med G114 (også kaldet Mu-HSSKLQ//L12ADT) på mus, da det på daværende tidspunkt ansås som det mest prostatacancer-specifikke promedikament. Formålet med forsøgene var at udvikle et promedikament, der bestod af en primær amin-holdig thapsigargin-analog koblet til det PSA-specifikke peptid HSSKLQ, således at PSA kunne spalte peptidbindingen. I udviklingsfasen af G114 skabte man et fluorescerende peptid-substrat, der kunne bekræfte, at den ekstracellulære væske omkring prostatacancer indeholdt høje koncentrationer af enzymatisk aktivt PSA, som er i stand til at hydrolysere dette substrat. Promedikamentet testedes ved in vitro-forsøg med blærekræftceller (TSU), som ikke producerer PSA, og ved in vivo-forsøg på 6 uger gamle nøgne mus med prostatacancerxenografter for at undersøge, om promedikamentet havde effekt på cancertumoren, og om det var stabilt nok i blodet (Denmeade et al., 2003). Forsøget udførtes som nævnt på nøgne mus, som er mus fra en stamme med genetisk mutation. Denne mutation bevirker, at de enten mangler brisselkirtlen, eller at den ikke fungerer normalt, hvilket resulterer i et undertrykt immunforsvar, som gør det muligt at dyrke menneskelige tumorer i musene (Dyreforsøgstilsynet, 2012). In vivo Musene fik injiceret tumorceller (LNCaP), der begyndte at dele sig og angribe de raske celler, hvilket medførte tumordannelse. Når tumorcellerne opnåede en volumen på 0,1-0,2 cm 3, blev musene adskilt i to grupper, således at den gennemsnitlige tumorvolumen var ens i de to grupper. Der blev lavet to forskellige forsøg med de tumorbærende mus. I den ene gruppe blev G114 givet som intravenøs injektion, og den anden gruppe fik kontinuerlig infusion. Ved intravenøs injektion blev G114 injiceret i en vene med kanyle. Musene fik en daglig dosis G114 på 7 mg/kg. Musene blev behandlet en gang om dagen, fem dage om ugen i tre behandlingscyklusser på dag 1-5, og Ved kontinuerlig infusion med G114 fik de tumorbærende mus indopereret doseringspumper, også kaldet osmotiske minipumper, i fedtvævet ved hoften hvilket sikrede præcis dosering. Doseringspumperne injicerede promedikamentet med en hastighed på 0,5 µl/time i cirka 14 dage med en gennemsnitlig daglig dosis på 7 mg/kg. Eksperimentet varede 28 dage. Udover disse forsøg udførte man forsøg med TSU-celler, som ikke producerer PSA for at undersøge, om promedikamentet også havde en effekt på disse. Disse forsøg varede i 14 dage, og prome- Side 45 af 80

46 dikamentet blev indført via kontinuerlig infusion. Hver mus blev vejet to gange om ugen under behandlingen, og tumorerne blev målt. I slutningen af forsøget blev musende aflivet og tumorerne høstet og vejet (Denmeade et al., 2003). In vitro For at afklare, hvorvidt promedikamentet G114 virkede optimalt, blev der også udført et in vitroforsøg med TSU, der ikke producerer PSA. Disse blærekræftceller blev udsat for promedikamentet G114 ved 10 µm. Ved denne dosis blev der ikke målt nogen mærkbar stigning af Ca 2+ i cytosolet. Omvendt blev der målt markante stigninger af Ca 2+ ved en 40 gange lavere dosis af L12ADT. Forsøgsresultater Ved in vivo-forsøgene målte man maksimumkoncentrationerne af promedikamentet fem minutter efter injektion, og de maksimale værdier, der her blev fundet, lå i intervallet mellem 14,3-16,5 µm. Halveringstiden for promedikamentet var på 2,78-2,82 timer. Man målte derudover koncentrationerne af det fejlhydroliserede L12ADT 12 timer efter injektion, og her viste maksimumkoncentrationen sig at være 8,3-12,3 nm. Derudover blev L12ADT målt i blodet 12 timer efter til en maksimumkoncentration på 8,3-12,3 nm. Det vil sige, at promedikamentet var relativt stabilt i blodet, og at der kun var op til 0,5 % af promedikamentet der blev hydrolyseret til L12ADT, som befandt sig i blodplasmaet og kunne ramme andre celler. Figur 2: Tumorvolumen ved behandling. Her ses nogle af de forsøgsresultater, man fandt frem til ved forsøgene med mus. Grafen viser relativ tumorvolumen pr. dag. Sammenligner man figur A og B ser man effekten af at give dosis ved injektion (A) eller kontinuerlig infusion (B). Af figur C ser man den relative udvikling for ikke PSA-producerende nyrekræftceller (SN-12C) (Denmeade et al., 2003). Side 46 af 80

47 På figur 29 ses forskellige forsøgsresultater fra in vivo-forsøgene udført på mus. Figur 29A og 29B viser den relative tumorvolumen pr. dag for mus med LNCaP-xenografter behandlet ved henholdsvis injektioner eller kontinuerlige infusioner, og man ser, at måden at give medicinen på i varierende grad medfører forskelligt resultat i løbet af selve behandlingsperioden. Ændringen i den relative tumorvolumen beregnes ved at dividere den nuværende tumorvolumen med den oprindelige tumorvolumen for hver enkelt mus. Af figur 29C ses, at promedikamentet ikke fremkalder regression i SN-12C nyrecancercellerne, der, som nævnt, ikke producerer PSA. Figur 30: Promedikamenters indvirkning på TSU-celler. På figuren ses en graf over måling af koncentration af frit Ca 2+ i TSU-celler, der blev udsat for enten thapsigargin (TG), L12ADT eller G114 (Mu-HSSKLQ//L12ADT) (Denmeade et al., 2003). Ved in vitro-forsøgene undersøgte man, hvorvidt promedikamentet forårsagede apoptose i kræftceller. På figur 30 ses grafer over koncentrationen af frit Ca 2+ i TSU-celler, der blev udsat for 250 nm thapsigargin, 250 nm L12ADT eller 10 µm G114. Det kan ses af graferne, at der i de blærekræftceller, der blev behandlet med G114, ikke skete en stigning i de indre mængder af Ca 2+ -ioner. I de celler, der blev udsat for ren thapsigargin og analogen L12ADT skete der en markant stigning i det intracellulære calcium-niveau (Denmeade et al., 2003). Side 47 af 80

48 Forsøgsresultater for G202 udgivet i 2012 Antitumoral virkning Denmeade et al. offentliggjorde i sommeren 2012 de første forsøg med promedikamentet G202. I løbet af forsøgsforløbet var nogle af hovedfokusområderne at udvikle det bedst egnede promedikament, dokumentere effekten af det samt at finde den rette dosis. Forsøgene var såkaldt prækliniske det vil sige, at de blev udført in vitro og på forsøgsdyr og dannede baggrund for en godkendelse til de første kliniske medicinforsøg udført på mennesker et såkaldt fase-1-forsøg. Efter udviklingen af G202 in vitro havde første stadie af dyreforsøgene til formål at bestemme den rette dosis i de efterfølgende in vivo forsøg. Der blev brugt raske mus til formålet, og man fandt, at musene maksimalt kunne tåle en dosis på 112 mg/kg. Man fandt ligeledes, at hvis man injicerede 56 mg/kg dagligt i tre på hinanden følgende dage medførte det, at under 10 % af musene døde. Sidstnævnte dosis blev udgangspunkt for yderligere in vivo-forsøg. Som tidligere nævnt brugte man prostatakræftxenografter fra tre forskellige cellelinjer, LNCaP, MDS-PCa2b samt CWR22R-H. Sidstnævnte blev implanteret i kastrerede mus. G202 havde en målbar effekt på de prostatiske tumorer. Over en periode på 30 dage efter første injicering mindskedes tumorens størrelse cirka 50 % hos forsøgsmusene med xenografter af LNCaP (se figur 31). Hos de to andre typer cellelinjer havde G202 også en betydelig antitumoral virkning (se figurerne 32 og 33). Histologiske undersøgelser af MDS-PCa2b udtaget 4 dage efter sidste indsprøjtning med G202 viste, at en stor del af tumoren var nekrotisk. For at sammenligne effekten af G202 med en form for traditionel behandling behandlede Denmeade et al. forsøgsmus med xenografter af LNCaP med docetaxel, der er et kemoterapeutisk lægemiddel, der ofte anvendes til en række forskellige cancerformer såsom prostatakræft, brystkræft, lungekræft, kræft i blæren og kræft i æggestokkene (Denmeade et al., 2012). G202 viste sig at have en større effekt på tumorens størrelse end docetexal. 80 % af tumorerne behandlet med G202 viste en formindskelse på mindst 50 % efter 21 dage for behandling med docetaxel var det kun 14 % af musene, der havde en tumorformindskelse på mindst 50 % (se figur 31). Side 48 af 80

49 Figur 31: Udvikling i tumorens størrelse på LNCaP-xenografter in vivo (mus). Sammenligning i udviklingen af tumorvolumen for kontrolgruppen (rød), tumorer behandlet med det kemoterapeutiske docetaxel (grøn) og G202 (blå) de to sidstnævnte givet i maksimalt tolereret dosis til tidspunkterne markeret med pile (røde pile: docetaxel, sorte pile: G202) (Denmeade et al., 2012). Figur 3: Udviklingen i tumorvolumen ved in vivo-xenografter af MDA-PCa2b-cellelinjen i mus efter en periode på 30 dage - for henholdsvis ubehandlede mus (rød kurve) og mus behandlet med den maksimale dosis af G202 (blå) (Denmeade et al., 2012). Side 49 af 80

50 Figur 4: Udviklingen i tumorvolumen ved in-vivo-xenografter af CWR22R-H-cellelinjen i kastrede mus efter en periode på 30 dage - for henholdsvis ubehandlede mus (rød kurve) og mus behandlet med den maksimale dosis af G202 (blå) (Denmeade et al., 2012). Bivirkninger Toksikologisk undersøgelser ved in vivo-forsøg på mus En af de traditionelle bivirkninger ved behandling med kemoterapi, vægttab, syntes mindre ved brug af G202 end ved brug af docetexal. I forsøgene med mus med implanterede xenografter af LNCaP tabte musene sig 15 % ved behandling med G202, men vægten var atter normaliseret efter 21 dage. Ved brug af Docetaxel var vægttabet 30 % efter 21 dage. Denmeade et al. sammenlignede også ændringen i vægt mellem ubehandlede og behandlede mus med implanterede tumorer af cellelinjen CWR22R-H. Her viste det sig, at selvom musene tabte sig næsten 20 procent efter de tre indsprøjtninger med G202, endte musenes vægt efter en ca. 30 dages periode over vægten af de ubehandlede mus (se figur 34). Side 50 af 80

51 Figur 5: Den relative vægtændring for mus med tumorer af linjen CWR22R-H i løbet af 37 dage. Den røde linje viser vægtændringen for ubehandlede mus og den blå linje vægtændringen for mus behandlet med G202 (Denmeade et al., 2012). Toksikologiske undersøgelser ved in vivo-forsøg på aber og rotter For at få godkendt G202 til fase 1-forsøg udførte Denmeade et al. toksikologiske undersøgelser på aber og rotter med tre forskellige doser (1 mg/kg/dag, 5 mg/kg/dag og 10 mg/kg/dag). De mest signifikante bivirkninger, der blev observeret, var reversibel nyresvigt og formindskelse af brisselkirtlen, samt at lymfeknuder og milt fik formindsket deres indhold af lymfevæv. Aberne blev givet G202 intravenøst i en time dagligt i tre på hinanden følgende dage. Herefter holdtes en pause på 28 dage inden den næste behandlingscyklus. Uanset dosis kunne Denmeade et al. måle giftige virkninger på nyrerne, og på baggrund af de kliniske og patologiske undersøgelser efter forsøget, blev den giftige virkning bedømt til at være minimal til mild ved den laveste dosis og reversibel. G202 havde en mere alvorlig, giftig virkning på forsøgsdyrene, der fik de to højeste doser. En abe fik nyresvigt, og i andre forsøgsdyr så Denmeade et al. bevis på forskellige nyreskader. Ved slutningen af den fire uger lange pauseperiode var nyreskaderne dog blevet mindre i alle forsøgsdyr uanset den dosis G202, de fik. Som en del af forsøget blev G202 s effekt på lymfesystemet og milten målt (Denmeade et al., 2012). Effekten på disse er interessant, da lymfesystemet er nødvendigt for udviklingen af hvide blodlegemer, og milten fjerner gamle blodceller fra blodet og nedbryder dem. Desuden nedbryder milten bakterier i blodet (Shier et al., 2012). Side 51 af 80

52 PSMA findes også i hjernen (Denmeade et al., 2012), og i forsøget undersøgtes G202 s virkning på hjernen. Ved obduktionen af aberne blev hjernerne bedømt som værende normale ved patologiske undersøgelser - dette selvom, at aberne havde fået den højeste dosis G202. Samme resultater sås i hjernerne på rotter. Denmeade et al. (2012) konkluderede på baggrund af forsøgene, at den optimale, virksomme dosis for aberne derfor var mere end 1 mg/kg pr. infusion men mindre end 5 mg/kg pr. infusion. For brug på mennesker arbejdede man med en dosis på 1,5 mg/m 2 (Denmeade et al., 2012). Toksikologiske undersøgelser ved in vivo-forsøg på mennesker. På baggrund af de fundne resultater påbegyndtes derfor i 2010 et forsøg i USA, hvor G202 testedes på mennesker et såkaldt fase-1-forsøg med henblik på at bestemme den maksimalt tålte dosis. 44 frivillige personer med fremskredet metastatisk cancer blev optaget i forsøget. Disse personer havde en række forskellige primærtumorer: Blære: 1 person Galdekanalen: 1 person Kolorektal: 14 personer Livmoderen: 1 person Spiserør: 1 person Hoved og nakke: 1 person Lever: 6 personer Lunge: 2 personer Skjoldbruskirtlen: 3 personer Prostata: 9 personer Nyrer: 1 person Urothel: 1 person Ukendt: 1 person I forsøget var der en overvægt af mænd (81%), og 62,5 % var af kaukasisk afstamning. De sidste 37,5 % var latinoer. Der var tale om et forsøg, hvor alle personer vidste, hvilken medicin, de fik, og der blev ikke brugt en kontrolgruppe, der fik placebo-præperater. Side 52 af 80

53 28 af disse personer deltog i den såkaldte dose escalation, der udgør første trin i at finde og anslå den maksimalt tolererede dosis af lægemidlet. Ud fra de data, man fik fra doseeskaleringsdelen af forsøget, konkluderede man, at den maksimalt tolererede dosis var 40 mg/m 2 på dag 1, 66,8 mg/m 2 på henholdsvis dag 2 og 3. Behandlingen foregik i cykli med 28 dages pause efter tre dage med behandling med G202. Denne cyklus blev 16 personer efterfølgende udsat for (Mahalingam et al., 2012). For at forstå, hvordan man sætter grænserne for den maksimalt tålte dosis, er en forståelse for den måde, man graduerer bivirkninger på, nødvendig. Bivirkninger gradueres i fem grader, hvor grad 1 dækker over milde bivirkninger, grad 2 over moderate bivirkninger, grad 3 over alvorlige bivirkninger, grad 4 over invaliderende eller livstruende bivirkninger og grad 5 over dødsfald, der kan henføres til indtagelsen af det medikament, der testes. For hver enkelt bivirkning, man nogensinde har kendt til, er der oprettet klassificering af disse bivirkninger og deres alvorlighed. Feber kategoriseres i grad 1, hvis temperaturen er mellem 38 og 39 grader, i grad 2, hvis temperaturen er mellem 39 og 40 grader, i grad 3, hvis feberen overstiger 40 grader i maksimalt et døgn, i grad 4, hvis temperaturen er over 40 grader i mere end et døgn og i grad 5, hvis feber udløst af medicinen forårsager dødsfald (National Cancer Institute, 2009). Dosiseskaleringen blev udført således: Man begyndte med at give et lille antal forsøgspersoner 1,2 mg/m 2 i tre dage efterfulgt af 28 dages pause, hvorunder man observerede bivirkningerne. Herefter gav man nye forsøgspersoner den fordoblede dosis på 2,5 mg/m 2. Man fortsatte med at fordoble dosis hos forsøgspersoner, indtil man observerede mindst to bivirkninger, der kunne klassificeres som grad 2. Herefter blev dosis kun øget med 33 % i næste trin, indtil man fandt den maksimalt tolererede dosis. I dette forsøg blev kriteriet for Dose Limiting Toxicity (DLT), der som navnet antyder, er den grad af giftighed, forsøgspersonerne oplever, og som medfører at dosis ikke øges yderligere, i store træk defineret således: hæmatologiske bivirkninger, det vil sige sygdomme relateret til blodet og de blodproducerende organer, herunder knoglemarv, lymfeknuder og milt, må ikke overstige grad 3 i mere end 5 dage. Ikke-hæmatologiske bivirkninger må ikke overstige grad 2 i mere end 5 dage. Konklusionen på doseeskaleringsdelen af forsøget blev som nævnt, at man gik videre med et behandlingsregime på 40/66,8/66,8 mg/m 2 /dag i tre på hinanden følgende dage efterfulgt af 28 dages pause. Side 53 af 80

54 De mest almindelige bivirkninger var udslæt (32 %), træthed/udmattelse (29 %), øget kreatininindhold i blodet (23 %), svimmelhed og/eller kvalme (18 %), reaktioner på infusionen (16 %), mindsket appetit (14 %), feber (11 %) og opkast (11 %). Under selve forsøget oplevede en del patienter bivirkninger, som blev karakteriseret som alvorlige se tabel 6 (Mahalingam et al., 2012). Antal patienter Grad 1 Grad 2 Grad 3 Grad 4 For få elektrolytter 1 Forhøjet kaliumkoncentration i blodet 1 1 Akut nyresvigt 1 Kvalme/svimmelhed 1 Opkast 1 Reaktion på infusionen 2 2 Lavt blodtryk 1 Forhøjet blodtryk 1 Sænket niveau af blodplader 1 1 Udslæt 1 Akut nyreskade 1 1 Forhøjet kreatininindhold i blodet 1 Tabel 6: Oversigt over de alvorlige bivirkninger, forsøgsdeltagerne oplevede - fordelt på type og grad. Modificeret efter Mahalingam et al., Mahalingam et al. konkluderede på baggrund af fase 1-forsøgene, at idet G202 generelt syntes at tåles i den fundne dosis, at man bør teste promedikamentet i et fase 2-forsøg (se perspektivering). Tilladelse til fase 2-forsøg med G202 blev givet i slutningen af november 2012 (U.S. National Institutes of Health, 2012). Side 54 af 80

55 Diskussion Virkninger G202 er kun testet på terminale kræftpatienter. Der er ikke kommet tal fra forsøg på mennesker med G202, men alle forsøg på dyr indikerer, at det relativt effektivt kan hæmme vækst ikke kun i primærtumoren, men også i metastaserede tumorer. Hvis en tumor er metastaseret, vil man konventionelt behandle den med kemoterapi, da en specifik behandling af hver enkelt tumor og metastase næsten er umulig og yderst omfattende og på nuværende tidspunkt ikke vil kunne kurere metastaserende kræft. G202 angriber mere specifikt kræftceller, som udtrykker PSMA, og dens effektivitet forventes derfor at være bedre end kemoterapi, der er mere uspecifikt, da det rammer alle celler, der deler sig og derved også raske celler. Kemoterapis uspecificitet bevirker, at der er større sandsynlighed for, at normale celler dør. Der vil, ifølge nuværende data fra dyreforsøg, være et mindre antal af raske celler, der rammes ved behandling med G202. Idet G202 kun hæmmer tumorvækst og til en vis grad formindsker tumorer ved den maksimalt tålte dosis, kan man overveje, hvordan promedikamentet kan bruges i praksis. Ved at modtage livslang behandling med G202 og leve med de bivirkninger, der potentielt vil være, vil man muligvis kunne hindre yderligere tumorvækst. Man kender dog ikke langtidsvirkningerne ved behandling med G202, så det kan vise sig at have for mange bivirkninger. Det synes på nuværende tidspunkt som om, at regressionen ved behandling med G202 ikke er tilstrækkelig som kur. Man kunne håbe, at en kombination af G202 og operationer ville resultere i kurering. Tanken er, at metastaserne fjernes og tumoren formindskes ved behandling med G202, således der ikke skal fjernes store mængder væv ved operationen. Dette strider imod det oprindelige formål, der var at skabe et promedikament, der medførte, at operationer var unødvendige. Man kunne også forestille sig, at en behandling, der kombinere anvendelsen af G202 og G115 potentielt kunne kurere metastaserede tumorer. Ved først at behandle med G202 kunne tumorens domæne indskrænkes, og ved herefter at behandle primærtumoren med G115 ville man potentielt kunne behandle terminale kræftpatienter uden brug af operationer. Der skal ved en behandling med begge stoffer tages højde for, at der kan være en forhøjet risiko for bivirkninger grundet fejlhydrolysering af begge promedikamenter. Indtil videre er der kun data om mængden af aktivt medikament i blodet for G114. 0,5 % af den oprindeligt injiceret dosis sås i blodet efter 24 timer. Der er endnu ikke kommet tal for de to andre medikamenter. Da G115 er mere potent men ligner G114, kan man forestille sig, at procentdelen Side 55 af 80

56 af frit aktivt medikament i blodet efter en behandling med G115 ligger på højde med G114. Det er ret væsentligt, da en kombineret behandling med de to promedikamenter teoretisk set vil efterlade en samlet højere koncentration i blodet, og derved vil der være en risiko for kraftigere bivirkninger. Fordelene ved behandling med G115 i forhold til kemoterapi er, at udover promedikamentet er målrettet grundet peptidkæden, injiceres den direkte i tumoren. Derfor vil den formodentlig fungere bedre end kemoterapi. Selvom der indtil videre er positive resultater fra forsøg med de nuværende thapsigargin-baserede promedikamenter, er man altså ikke sikker på, om disse er bedre end konventionelle behandlinger. De er ikke testet i tilstrækkeligt omfang, og man ved endnu ikke nok om deres farmakokinetiske egenskaber, altså selve reaktionen, der forløber i menneskekroppen, ulig de konventionelle behandlinger. Der er derfor ikke et tilstrækkeligt stort sammenligningsgrundlag. Promedikamenternes behandlingseffektivitet hænger direkte sammen med deres evne til at inhibere SERCA. Promedikamenternes cytotoksitet vil sandsynligvis aldrig blive ligeså stor som thapsigargins (Michelangeli and East, 2011), men de to, der primært er taget udgangspunkt i i reviewet, er næsten lige så effektive som thapsigargin (se figur 28). G202 er en smule mindre effektivt i hæmningen af SERCA i forhold til G114, men disse promedikamenter har to helt forskellige funktioner. Da G114 injiceres direkte i tumoren, er der ikke i lige så høj grad brug for en specificering, som der er for G202, der føres rundt af blodet. Der er i undersøgelser vedrørende G115 set en tumorregression i 33 % af de testede dyr og ikke kun en hæmning af vækst. Det skyldes, at G115 er næsten dobbelt så effektivt som G114 i hæmning af SERCA. G115 når ikke kun at hæmme celledelingen, men også at forårsage apoptose i eksisterende prostatakræftceller, hvilket er en klar fordel (Denmeade et al., 2003;Dunn and Dawson, 2011). Bivirkninger Den forskning, der til dato er foretaget i thapsigargin, viser, at stoffet og ikke mindst promedikamentet G202 har potentiale til at blive et yderst potent lægemiddel i fremtidig kræftbehandling, hvor man målrettet går efter cellernes SERCA-pumpe for at fremkalde apoptose som led i behandlingen af kræft. Denmeade et al. (2003) giver selv, at thapsigargin er en omnipotent SERCAinhibitor, idet at celleantallet fra alle de cellelinjer (både syge og raske), de testede in vitro med thapsigargin i sin grundform på, faldt med % ved en dosis på 100 nm i fem dage i øvrigt Side 56 af 80

57 uagtet, om cellerne havde AR. Selvom det er et godt argument for, at thapsigarginanaloger har en særdeles anvendelig cytotoksisk virkning, understreger det også, at der er behov for, at et promedikament har en høj specificitet. De første forsøg på primater og mennesker har haft til formål at finde den rette, ikke-giftige dosis af promedikamenterne (Denmeade et al., 2012). De nyeste resultater viser, at det formentlig er lykkes at finde en dosis (Mahalingam et al., 2012) dog udestår det stadig at bevise G202 s antitumorale effekt på cancer i mennesker. Det skal netop de nyligt godkendte fase 2-forsøg afklare. Det er altså stadig for tidligt at udråbe promedikamentet G202 som det nye, succesfulde lægemiddel mod prostatakræft. Årsagerne til de bivirkninger, der opstår ved brug af enten det ene eller det andet promedikament, må for hver enkelt kunne tolkes på to måder: Enten sker der en kløvning af det analog-bærende peptid et andet sted i kroppen end det tiltænkte (dvs. ved PSA/PSMA), eller også er der tilstrækkeligt af den hydrolase, promedikamentet er rettet mod i noget af det raske væv. For G114 bestemmer Denmeade et al. (2003), at 0,5 % af den oprindeligt givne dosis af det aktive L12ADT var til stede i blodet efter 12 timer. Den direkte konsekvens af denne tilstedeværelse kendes ikke, men må givetvis give bivirkninger i en eller anden grad. For musene, der fik givet den dosis G114, der fremkaldte den antitumorale effekt vist i figur 29, giver Denmeade et al. (2003), at der ikke sås nævneværdige bivirkninger. Der var ikke nogen dødsfald blandt forsøgsmusene, og vægttabet oversteg ikke 15 %. Ved forsøget med G202 oplevede man som nævnt dødsfald blandt forsøgsmusene samt et vægttab, som dog var forbigående. Aberne fik derimod som beskrevet nedsat nyrefunktion, en enkelt ligefrem nyresvigt, reduktion af lymfevævet i lymfeknuder og milt samt en formindskelse af brisselkirtlen (Denmeade et al., 2012). De første dose-eskaleringsforsøg med G202 har givet et bud på de typiske bivirkninger, men antallet af forsøgspersoner er stadig langt fra stort nok til at kunne lave en endelig konklusion på, hvilke bivirkninger, der vil opleves. Samtidig skal det bemærkes, at dose-eskaleringsforsøget er foretaget på patienter med metastatisk kræft; en sygdomstilstand som i sig selv medfører fysiske gener. Gives promedikamentet i et tidligere stadie, vil bivirkningerne måske vise sig anderledes. Man må sammenfatte, at der vil være tale om en kropslig svækkelse samt nedsat immunforsvar. Denmeade et al. (2012) opfatter den nævnte svækkede nyrefunktion som et resultat af tilstede- Side 57 af 80

58 værelse af PSMA, idet tidligere forsøg (Silver et al., 1997) har påvist tilstedeværelse af PSMA i rask nyrevæv, endskønt deres egne undersøgelser ikke efterviste denne tilstedeværelse. Atter kan man opstille to hypoteser, hvoraf den ene understøtter teorien om tilstedeværelse af PSMA i nyren, og den anden ville være, at G202 alligevel ikke er tilstrækkeligt specifik. Det er ydermere værd at bemærke, at Denmeade et al. (2012) giver, at der ikke sket nogen skade på forsøgsabernes hjerner uden dog nærmere at specificere, hvordan de er kommet til den konklusion til trods for, at aberne fik givet den højeste dosis nemlig 10 mg/kg. Der er ikke god basis for sammenligning af de respektive bivirkninger fremkaldt af promedikamenterne G202 hhv. G114, da G114 blev givet i en dosis, som ikke fremkaldte en reduktion af tumorens volumen, men som samtidigt ikke gav nogen dødsfald blandt forsøgsmusene (Denmeade et al., 2003). For G202 blev dosis givet, så der opstod en dødelighed på op til 10 %, men den givne dosis havde dog også en tydeligt mere effektiv antitumoral virkning. Der er intet sammenligningsgrundlag for primater. Eftersom man i første omgang har valgt at arbejde videre med det PSMA-aktiverede G202, må en rimelig antagelse være, at de involverede forskere har spået det bedst chancer. Det må ligeledes være en plausibel tanke, at bivirkningerne ved det promedikamentet i en dosis, som har fremkaldt en nævneværdig effekt, må være tålelige, idet fase-1-forsøget er mundet ud i, at der nu rekrutteres deltagere til fase-2-forsøg (U.S. National Institutes of Health, 2012). Der mangler generelt også flere forsøgsdata for at kunne foretage gode sammenligninger af bivirkninger i forhold til de traditionelle behandlingsmetoder af prostatakræft, idet bivirkningerne synes meget forskelligartede. Konklusion Ud fra de data, vi har samlet i dette review, kan vi konkludere, at der er et godt grundlag for at gå videre med forskningen i thapsigargin-baserede promedikamenter og i særdeleshed med forsøg på mennesker med G202. Vi har set en bred og god dokumentation for, at thapsigargin i sin grundform samt de medikamenter, der er bygget på thapsigargin, relativt effektiv inhiberer SERCApumpens funktion, hvilket forårsager ubalance i cellerne calciumkoncentrationer og fremkalder apoptose. Side 58 af 80

59 Med nuværende viden og teknik er man i stand til at specialisere thapsigargin-promedikamenter til stort set udelukkende at hydrolyseres ved PSA/PSMA, hvilket betyder, at man relativt selektivt kan frigive thapsigargin-analogen i prostatatumorers mikromiljø. Om kravet til graden af specificitet er opfyldt, kan vi endnu ikke konkludere sikkert, idet der på mennesker kun er foretaget forsøg med henblik på bestemme den maksimalt tolererede dosis ud fra de oplevede bivirkninger. Der er ingen sikker viden om, hvorvidt man ved de tålte dosis kan fremkalde en nævneværdig tumorregression. Skulle dette ikke være tilfældet, skal der forskes yderligere i udformningen af de påhæftede peptidkæder med henblik på at skabe en endnu bedre specificitet og evt. målrette promedikamentet et helt andet enzym. Sammenligningsgrundlaget mellem effektiviteten af traditionel behandling og behandling med G202 mod prostatakræft er yderst spinkelt, idet der kun er foretaget et komparativt forsøg med et enkelt kemoterapeutisk medikament på en enkelt cellelinje på mus hvor G202 dog viste tydeligt bedre resultater. Side 59 af 80

60 Perspektivering Planten T. garganica vokser kun i et lille geografisk område. Selvom planten er en ukrudtsplante, spreder den sig ikke synderligt hurtigt. Man er ikke i stand til at dyrke planten i så stor stil, at man vil kunne udvindende tilstrækkelige mængder thapsigargin (Pujadas-Salvà and Plaza-Arregui, 2003). Planten ville derfor umiddelbart udryddes, hvis den skulle bruges i medicinalindustrien. Noget lignende så man i forbindelse med stoffet taxol. Taxol er et stof brugt til kemoterapi mod en lang række forskellige kræfttyper. Taxol er et stof udvundet fra stammen hos et langsomtvoksende træ, som kun findes ved den nordvestlige kyst af Amerika. Da man ikke var i stand til at dyrke træet, var det nødvendigt at finde nye måder at udvinde stoffet på. Man fandt, at man kunne udvinde et inaktivt stof fra træets nåle, som ved syntese kunne gøres aktivt (Spyros, 2009). Da både thapsigargin og taxol stammer fra planter, der begge ville blive udryddet, har man lært fra tidligere. Derfor arbejdes der på metoder, hvorpå man kan producere stoffet thapsigargin uden at høste planten. Det er dog et felt, hvor man endnu ikke er nået særlig langt. Man mener at kende 1-2 trin i plantens egenproduktion af toxinet brugt til thapsigargin-analoger, og man estimerer, at planten gennemgår trin for at producere stoffet. Da en industriel produktion af thapsigargin i sin grundform endnu ikke er mulig, vil dette bidrage til en forlængelse af tidshorisonten for indførelse af et færdigt promedikament (Simonsen, 2011). For at bringe et nyt stof på markedet tager det cirka 15 år og forsøgspersoner. Man begynder med 3-5 års forsøg på celler og mus, hvor stoffets skadelige og gavnlige effekter betragtes. Herefter begynder fire fase-forsøg, som udføres på mennesker. Fase 1 benyttes til at bestemme den maksimale tolererede dosis af stof. Fase 1 omfatter mellem 50 og 150 personer, som for hvert hold af nye forsøgspersoner får en øget dosis, mens bivirkninger observeres. Denne fase tager normalt 1-1,5 år. Fase 2 bruges til at observere medikamentets effekt blandt andet på forskellige etniciteter og over længere tid. I denne fase bruges der 2-3 år og patienter. Disse patienter er fra forskellige steder i verden, da dette giver et overblik over, hvordan stoffet virker på tværs af etnisk oprindelse. Fase 3 er den mest omfattende af de fire faser. Den er klart den største med mellem 2000 og 4000 udvalgte deltagere. Fasen tager omkring 3-4 år at færdiggøre. Her sammenlignes det nye stofs resultater med de resultater, man observerer hos patienter, der udsættes for placebo-medicin og den almene behandlingsmetode (Hoffmann, 2011). Side 60 af 80

61 Da G202 fase 1-forsøget næsten er færdigt, og man er begyndt at rekruttere til fase 2, kan man forvente, at l der inden for de næste 6-8 år vil kunne forventes et thapsigargin baseret promedikament på markedet, hvis alt går vel. G202 s potentiale i forhold til andre kræfttyper G202 er som nævnt målrettet PSMA-katalyse, og idet der er fundet PSMA i andre typer kræftvæv, kunne dette promedikament forventes at have en gavnlig effekt på en del andre kræfttyper. Af tabel 7 kan man se, at man ved forskellige givne doser kan fremkalde over 50 % regression i en betydelig del af de behandlede tumorer det gælder for prostata-, bryst- og nyrekræft. For blærekræft ses regressionen i alle tilfælde at være under 50 % (ikke nærmere specificeret) (Denmeade et al., 2012). Cancercellelinje Kræftvævets oprindelse Antal daglige doser Antal behandlingscyklusser Antal tumorer Antal med regression 50 % LNCaP Prostata % MDA-PCa2b Prostata % CWR22R-H Prostata % MCF-7 Bryst % SN12C Nyre % TSU Blære % Tabel 7: Ovenstående tabel viser tumorregressionen for varierende typer af cancer efter forskellige antal daglige doser og behandlinger (Denmeade et al., 2012). De uhomogene analyseresultater for tilstedeværelsen af PSMA medfører dog, at man må forvente, at der stadig skal en stor mængde forskning til med henblik på at fastslå tilstedeværelsen af PSMA. Heterogeniteten henviser primært til forskellige undersøgelsers forskelle i analyseresultater af PSMA s tilstedeværelse i blærecancer samt rask væv (Silver et al., 1997;Mhaka et al., 2004;Haffner et al., 2009;Minner et al., 2011;Denmeade et al., 2012). Denmeade et al. har med deres forsøg i 2012 givet en god basis for forskning i behandling med G202 mod andre kræftformer, idet de har analyseret andre typer væv for tilstedeværelse af PSMA (se figur 9) og testet virkningen af G202 på andre typer kræftvæv. Der er i 2012 givet tilladelse til fase 2-forsøg, der skal måle effekten af G202 på prostatiske tumorer. Rekrutteringen er netop gået i gang (U.S. National Institutes of Health, 2012). 1. november samme år blev der i Texas givet tilladelse til fase-2-forsøg med behandling af leverkræft med G202 på baggrund af de første succesfulde Side 61 af 80

62 fase-1-forsøg samt Denmeade et al. s (2012) undersøgelser, som har påvist PSMA-tilstedeværelse i hepatocellulært cancervæv (Genspera A, 2012). Toksikologisk er der stærkt begrænsede konklusioner på påkrævede dosis i forhold til irreversibel skade. Baserer man vurderingen af graden af giftighed på vægttab og efterfølgende vægtforøgelse, ses der umiddelbart fordele i behandling med G202 i forhold til kemoterapimedikamenter. Side 62 af 80

63 References Adolfsen, J. (2001). Behandling af lokaliseret prostatakræft forskellige alternativer. March, Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. (2008). Molecular Biology of The Cell, pp New York: Garland Science. Balk, S. P. and Knudsen, K. E. (2008). AR, the cell cycle, and prostate cancer. NURSA 6, Berridge, M. J., Lipp, P. and Bootman, M. D. (2000). The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, Bray, F., Lortet-Tieulent, J., Ferlay, J., Forman, D. and Auvinen, A. (2010). Prostate cancer incidence and mortality trends in 37 European countries: An overview. Eur. J. Cancer 46, Christensen, S. B., Skytte, D. M., Denmeade, S. R., Dionne, C., Moller, J. V., Nissen, P. and Isaacs, J. T. (2009). A Trojan Horse in Drug Development: Targeting of Thapsigargins Towards Prostate Cancer Cells. Anti. Canc. Agents. Med. Chem. 9, Denmeade, S. R., Jakobsen, C. M., Janssen, S., Khan, S. R., Garrett, E. S., Lilja, H., Christensen, S. B. and Isaacs, J. T. (2003). Prostate-specific antigen-activated thapsigargin prodrug as targeted therapy for prostate cancer. J. Natl. Cancer Inst. 95, Denmeade, S. R., Lou, W., Lovgren, J., Malm, J., Lilja, H. and Isaacs, J. T. (1997). Specific and efficient peptide substrates for assaying the proteolytic activity of prostate-specific antigen. Cancer Res. 57, Side 63 af 80

64 Denmeade, S. R., Mhaka, A. M., Rosen, D. M., Brennen, W. N., Dalrymple, S., Dach, I., Olesen, C., Gurel, B., DeMarzo, A. M., Wilding, G. et al. (2012). Engineering a Prostate-Specific Membrane Antigen-Activated Tumor Endothelial Cell Prodrug for Cancer Therapy. Sci. Transl. Med., 4, Denmeade, S. R., Nagy, A., Gao, J., Lilja, H., Schally, A. V. and Isaacs, J. T. (1998). Enzymatic activation of a doxorubicin-peptide prodrug by prostate-specific antigen. Cancer Res. 58, Dode, L., Andersen, J. P., Leslie, N., Dhitavat, J., Vilsen, B. and Hovnanian, A. (2003). Dissection of the functional differences between sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) 1 and 2 isoforms and characterization of Darier disease (SERCA2) mutants by steady-state and transient kinetic analyses. J. Biol. Chem. 278, Dunn, S. and Dawson, W. (2011). Genspera, Inc. (GNSZ) - Initiation Report. 14/ , 24. Fenger, C. and Baandrup, U. (2002). Klinisk Patologi, pp København, DK: FADL. Gioeli, D. (2005). Signal transduction in prostate cancer production. Clinical Science 108, Haffner, M. C., Kronberger, I. E., Ross, J. S., Sheehan, C. E., Zitt, M., Muehlmann, G., Oefner, D., Zelger, B., Ensinger, C., Yang, X. J. et al. (2009). Prostate-specific membrane antigen expression in the neovasculature of gastric and colorectal cancers. Hum. Pathol. 40, Khan, S. R. and Denmeade, S. R. (2000). In vivo activity of a PSA-activated doxorubicin prodrug against PSA-producing human prostate cancer xenografts. Prostate 45, Side 64 af 80

65 Mhaka, A., Gady, A. M. and Rosen, D. M. (2004). Use of Methotrexate-Based Peptide Substrates to Characterize the Substrate Specificity of Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA). Cancer. Biol. Ther. 3, Michelangeli, F. and East, J. M. (2011). A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39, Michelangeli, F. and East, J. M. (2011). A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39, Minner, S., Wittmer, C., Graefen, M., Salomon, G., Steuber, T., Haese, A., Huland, H., Bokemeyer, C., Yekebas, E., Dierlamm, J. et al. (2011). High Level PSMA Expression Is Associated With Early PSA Recurrence in Surgically Treated Prostate Cancer. The Prostate 71, Mommsen, S. (2001). Prostatacancer - diagnostik og behandling. May, 4-6. Nielsen, O. F. and Bojsen-Møller, M. J. (2012). Anatomi og fysiologi., pp København, DK: Munksgaard. Pujadas-Salvà, A. J. and Plaza-Arregui, L. (2003). Studies on Thapsia (Apiaceae) from northwestern Africa: a forgotten and a new species. Bot. J. Linn. Soc. 143, Rasmussen, O. and Sloth, N. (2005). Håndbog i biologiske fagtermer, pp København, DK: Gads Forlag. Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. and Jackson, R. B. (2011). Campbell Biology, pp San Francisco, USA: Pearson. Side 65 af 80

66 Sagara, Y. and Inesi, G. (1991). Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca 2+ -transport ATPase by thapsigargin at subnanomolar concentrations. J. Biol. Chem. 266, Samplaski, M. K., Heston, W., Elson, P., Magi-Galluzzi, C. and Hansel, D. E. (2011). Folate hydrolase (prostate-specific antigen) 1 expression in bladder cancer subtypes and associated tumor neovasculature. Modern Pathology 24, Schmid, H. P., McNeal, J. E. and Stamey, T. A. (1993). Clinical observations on the doubling time of prostate cancer. The use of serial prostate-specific antigen in patients with untreated disease as a meassure of increasing cancer volume. Cancer 71, Shier, D., Butler, J. and Lewis, R. (2012). Hole's Essentials of Human Anatomy & Physiology, pp New York, USA: McGraw Hill. Silver, D. A., Pellicer, I., Fair, W. R., Heston, W. D. W. and CordonCardo, C. (1997). Prostatespecific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clin. Cancer Res. 3, Treiman, M., Caspersen, C. and Christensen, S. B. (1998). A tool coming of age: thapsigargin as an inhibitor of sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol. Sci. 19, Wuytack, F., Raeymaekers, L. and Missiaen, L. (2002). Molecular physiology of the SERCA and SPCA pumps. Cell Calcium 32, American Cancer Society. (2012). What causes prostate cancer? 9/ Side 66 af 80

67 Ammundsen, I., N. and Kjems, E. (2012). Diagnose og stadieinddeling af prostatakræft /. 17/ Bennetzen, M. (2007). Kræft - en celledelingssygdom. 2/ Dansk Urologisk Cancergruppe A. (2012). Brachyterapi 4/ Dansk Urologisk Cancergruppe B. (2012). Endokrin terapi 5/ Dansk Urologisk Cancergruppe C. (2012). Radikal prostatektomi. 4/ Dansk Urologisk Cancergruppe D. (2012). Strålebehandling 5/ Dyreforsøgstilsynet. (2012). Behandling af heterotransplanterede tumorer i nøgne mus med kinase hæmstoffer KD-E9. 1/ Genetics Home Reference. (2012). AR. Genetics Home Reference 04/ Side 67 af 80

68 Genspera A. (2012). Genspera and the statewide clinical trials network of texas to conduct phase II study of G-202 in patients with hepatocellular carcinoma. 18/ Genspera B. (2011). Patents 16/ Genspera E. (2011). How it works 16/ Genspera F. (2011). Technology Blood Supply 17/ Genspera G. (2011). Technology direct 16/ Hakim Nasr, A. (2012). In vivo and in vitro 16/ Hansen, M. T. and Kjems, E. (2011). Symptomer på prostatakræft. Kræftens Bekæmpelse 2/ Hoffmann, T. (2011). Sådan laver man ny medicin. Videnskab. dk 18/ Lewinsky, C. (2009). Kemoterapi. 4/ Side 68 af 80

69 Mahalingam, D., Wilding, G., Denmeade, S., Sarantopoulos, J., Cosgrove, D., Cetnar, J., Azad, N., Bruce, J., Kurman, M. and Carducci, M. (2012). A First-in-Human, Phase I Clinical Study of the Safety, Tolerability and Pharmacokinetics (PK) of G-202, a Thapsigargin-Based PSMA-Activated Prodrug, in Patients with Advanved Solid Tumors poster_EORTC_AACR_NCI_Nov_2012_FINAL.pdf. 19/ National Cancer Institute. (2012). Prostate-Specific Antigen (PSA) Test 3/ Rasmussen, J. F. (2006). Prostataforstørrelse (Prostatahypertrofi). National Cancer Institute. (2009). Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) - Version / %28prostatahypertrofi%29/. 6/ Schulze, S., Rørth, M. and Kjeldsen, H. (2012). Kolorektal kræft. 1/ Simonsen, H. T. (2011). Mos kan lave kræftmedicin. 27/ Side 69 af 80

70 Sjøgren, K. (2012). Danskere på vej mod revolutionerende kræftmedicin /11- Spyros, D. G., A Theodoropoulos:. (2009). Enclypedia of Cancer 8&rfr_id=info:sid/summon.serialssolutions.com&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:bookitem&rft.ti tle=encyclopedia+of+cancer&rft.atitle=taxol&rft.date= &rft.pub=Springer&rft.isbn= &rft.volume=4&rft.spage=2908&rft.epage=2910&r ft.externaldocid= / Sundhedsstyrelsen A. (2011). Cancerregisteret / Sundhedsstyrelsen B. (2011). Dødårsagsregisteret / Sundhedsstyrelsen. (2012). Pakkeforløb for prostatakræft 2011, ver / Sundhedsstyrelsen - Cancerregisteret (2010). Cancerregisteret / Sundhedsstyrelsen - Kræftprofil (2009). Kræftprofil: Prostatakræft , ver. 1.0 Side 70 af 80

71 27/ Tandrup, M. and Kjems, E. (2011). Kemoterapi. 24/ The American Heritage Medical Dictionary. (2007). Vascularization. 29/ U.S. National Institutes of Health. (2012). Phase 2 Study of G-202 in Patients With Chemotherapy-Naïve Metastatic Castrate-Resistant Prostate Cancer 19/ Side 71 af 80

72 Appendix Cellesignalering Signalering og kommunikation mellem celler Signalering til celler består af tre processer: 1. Modtagelse 2. Transduktion 3. Svar Modtagelse Et fundamentalt karaktertræk for en levende celle er, at den opretholder et konstant indre miljø. En betingelse for dette er, at den opfatter og besvarer de signaler, der modtages fra det omkringliggende miljø eller fra andre celler. Et kemisk signal er modtaget, når et signalmolekyle har bundet sig til et receptorprotein, som enten er indlejret i cellens overflade, på cellemembranen eller i cytoplasmaet inde i cellen. Når et signal udsendes fra et omkringliggende miljø til en række celler, er det langt fra alle celler, der har mulighed for at besvare signalet. Når et signal, kaldet a, udsendes i en gærcelle høres signalet kun af celler med dens korresponderende receptor - en celle med receptorproteinet α. På samme måde ville kun celler med et receptorprotein β reagere, hvis signalet b udsendtes. I multicellulære organismer vil alle celler altså kunne modtage et signal fra omgivelserne, mens kun de celler, som besidder de nødvendige receptorer, vil være i stand til at høre og besvare signalet, som de resterende celler blot vil ignorere. Det signalerende molekyle opfører sig som et ligand, hvilket er betegnelsen for et molekyle, som binder sig specifikt til et andet og ofte større molekyle. Ligand-bindingen bevirker en ændring i receptorproteinets form, som enten kan medføre, at receptoren aktiveres og kan reagere med andre molekyler, eller forårsage ophobning af to eller flere molekyler. Når man taler om modtagelse, skelner man mellem receptorer i plasmamembranen og intracellulære receptorer, som enten er placeret i cytoplasma eller i nukleus. De to former for receptorer tiltrækker da også forskellige kemiske signaler. Hydrofile kemiske signaler vil oftest binde sig til receptorerne på cellens overflade, mens de hydrofobe eller meget små signalmolekyler vil binde Side 72 af 80

73 sig til receptorerne inde i cellen, da de kan trænge igennem dens dobbelte lipidlag (Reece et al., 2011). Transduktion Transduktion betyder konvertering af et signal udenfor cellen til en funktionel ændring inde i cellen. Dette stadie af signaleringen er en proces bestående af flere trin, som består af en række molekylære interaktioner, der munder ud i et svar inde i cellen. Bindingen af et signalmolekyle til et specifikt receptorprotein, som derved aktiveres, er det første trin i processen. Herefter aktiverer receptorproteinet et andet molekyle, som aktiverer et tredje molekyle. Lidt ligesom en dominoeffekt fortsætter aktiveringen af molekyler, indtil et protein, som kan give det endelige svar til signalet, er aktiveret. Receptoren, der i første omgang modtager signalet, går altså ikke fysisk igennem cellen for at levere signalet til det specifikke molekyle, som er i stand til at besvare det. I stedet videregives informationerne gennem andre molekyler, som oftest er proteiner. Når et protein aktiveres af et signal, ændrer det form. Dette sker som oftest ved en fosforylering. Fosforylering beskriver processen, hvor en fosfatgruppe ved hjælp af energi fra ATP overføres til et protein, som derved aktiveres. Når et signal har bundet sig til og aktiveret et receptorprotein, sker der en række fosforyleringer af forskellige proteiner ved hjælp af proteinkinaser, inden signalet kan besvares af et specifikt molekyle. En proteinkinase er et enzym, der er i stand til at overføre en fosfatgruppe fra ATP. Abnorm aktivitet i proteinkinaser kan føre til unormal cellevækst, som kan medvirke til udviklingen af kræft (Reece et al., 2011). Side 73 af 80

74 Figur 1: Fosforyleringskaskade. Et eksempel på, hvordan et signal modtages af receptoren, og hvordan det sendes videre gennem cellen, inden det besvares af et specifikt protein (Reece et al., 2011). Ligesom fosforyleringen aktiverer proteinet, vil en defosforyleringen inaktivere proteinet ved fraspaltning af en fosfatgruppe. Det sker, når signalet ikke længere befinder sig i pågældende protein. Inaktivering af proteiner er mindst ligeså betydningsfuldt for processen som fosforyleringen, da defosforyleringen muliggør genbrug af selv samme protein i andre processer (se figur 1). Komponenterne i processen består ikke udelukkende af proteiner, men kan tillige være mindre vandopløselige molekyler, hvoraf de to mest kendte er cyclic AMP og Ca 2+. En fællesbetegnelse for disse er second messengers. En forøgelse af Ca 2+ -ioner i cytosolen kan være årsag til flere forskellige svar på signaler, som eksempelvis udskillelsen af bestemte kemiske stoffer, kontraktion i muskelceller og celledeling. Selvom enhver celle indeholder calcium, kan Ca 2+ -ioner fungere som second messengers, fordi koncentrationen af calcium i cellens cytosol er væsentligt lavere end i den ekstracellulære væske og i det endoplasmatiske reticulum. Den lave koncentration af calcium skyldes den aktive transport af Ca 2+ -ioner gennem proteinpumper (for eksempel SERCA) fra cytosolen og ud gennem plasmamembranen og fra cytosolen og ind i ER. For at Ca 2+ -ioner kan udløses i cytosolen, må de have hjælp fra andre second messengers (Reece et al., 2011). Side 74 af 80

75 Svar Svaret på et signal findes enten i cytoplasmaet eller i nukleus, og vil som regel resultere i en regulering af den cellulære aktivitet eller af proteinsyntesen. Molekylet besvarer signalet ved at til - eller afkoble gener i nukleus, og vil derfor fungere som en transkriptionsfaktor, som kopierer DNA til RNA og derved regulerer proteinsyntesen. Svaret til cellevækst er syntesen af mrna, som vil omformes til et specifikt protein i cytoplasmaet. Foruden regulering i proteinsyntesen kan proteinernes aktivitet påvirkes direkte for eksempel ved at åbne eller lukke kanalproteiner. De molekylære budbringere, som fører til celledeling, involverer blandt andet vækstfaktorer og dyre- og plante hormoner (Reece et al., 2011). Finjustering af signaler Processen fra signal til svar har som en proces med flere trin to væsentlige fordele. Fordelene er, at de mange proteiner, signalet skal gå igennem, vil forstærke det. Idet der er tale om en proces bestående af flere trin, vil det samtidig give mulighed for, at svaret kan reguleres igennem de forskellige punkter undervejs. Proteinerne, hvis opgave er at videregive signalet, forbliver aktive længe nok til at videregive signalet til mere end ét aktivt protein, inden det inaktiveres. Da flere proteiner vil bære signalet videre, vil der altid være flere aktiverede proteiner i næste trin i proteinkinasen, hvilket vil føre til flere forskellige svar på samme signal (Reece et al., 2011). Transmembranprotein Et transmembranprotein er et protein, der forbinder cytosolet med ydersiden af cellen, dvs. at den laver en direkte rute gennem membranen. Et transmembrant protein sørger for, at opløsninger, der normalt ikke ville kunne komme gennem den hydrofobe membran, kan komme igennem. Transmembranproteiner er specialiserede og lader kun visse opløsninger komme igennem (Reece et al., 2011). Celledeling/mitose Mitose er det, vi betegner almindelig celledeling, og den medfører, at vi får to fuldstændig identiske celler. Cellen kan umiddelbart før modtagelsen af et celledelingssignal befinde sig i G 0 fasen, en slags hvilefase, hvor cellen ikke er i cyklus og derfor ikke formerer sig. Side 75 af 80

76 Delingen af en almindelig celle begynder med interfasen, som kan opdeles i yderligere tre underfaser: I G 1 -fasen (se figur 2) vokser cellerne, så antallet af proteiner og organeller stiger. I S-fasen fortsætter cellen med at vokse, og kromosomerne kopieres, og i den sidste underfase, G 2 -fasen, vokser cellen yderligere og gøres klar til deling. Der sker blandt andet ved, at centrosomet duplikeres. Nu kan cellen begynde den mitotiske deling kaldet M-fasen. Figur 2: G1-, S- og G2-fasen. På figuren ses interfasen bestående af G 1, S og G 2 fasen. Efter G 2 begynder den mitotiske fase (M), som består af mitose efterfulgt af cytokinese (Reece et al., 2011). Første trin i denne fase er det, man kalder profasen (se figur 2). Her samles de kromatinfibre, der ligger inde i cellen, til kromosomer. Hvert af de duplikerede kromosomer er to ens (søster)kromatider, der holdes sammen ved centromererne. Nu forsvinder kernen, og det mitotiske spindelvæv bestående af tentråde dannes ved, at centrosomerne bevæger sig væk fra hinanden ved hjælp af netop disse tentråde. Side 76 af 80