Er udvikling af infektiøs mononukleose (kyssesyge) genetisk betinget?

Transkript

1 Er udvikling af infektiøs mononukleose (kyssesyge) genetisk betinget? Henrik Hjalgrim, Klaus Rostgaard, Bjarke Feenstra, Frank Geller og Mads Melbye, Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum, Artillerivej 5, DK-2300 København S. Henrik Ullum, Klinisk Immunologisk Afdeling, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, 2100 København Ø. Karen McAulay og Ruth Jarrett, Centre for Virus Research Institute of Infection, Immunity and Inflammation University of Glasgow Botham Building, 464 Bearsden Road, Glasgow G61 1QH, Scotland.

2 Sammenfatning Vi anmoder om tilladelse til at undersøge, om kyssesyge er en arveligt betinget sygdom ved at beskrive forekomsten af DNA markører hos personer hhv. med og uden kyssesyge i et såkaldt genome-wide association studie. Anmodning om dispensation fra kravet om indhentning af informeret samtykke Fordi undersøgelsen (1) kan gennemføres med udgangspunkt i allerede indsamlede blodprøver og eksisterende diagnoseoplysninger og derfor ikke indebærer fornyet prøvetagning og dermed forbundne risici for deltagere; (2) ikke vil kunne anvendes til individuel vejledning eller rådgivning af deltagerne eller deres pårørende, anmodes der om dispensation fra kravet om indhentning af informeret samtykke. Baggrund Infektion med Epstein-Barr virus (EBV) kan akut give kyssesyge Infektion med EBV er almindeligt forekommende i hele verden, og mere end 90 % af klodens voksne befolkning er inficeret med dette virus [1[. EBV overføres primært via spyt, og smitte finder hyppigst sted barndommen, om end den ikke sjældent først finder sted i ungdommen i vestlige, industrialiserede lande. Symptomerne ved primær smitte med EBV varierer med alder: Medens smitte i barndommen sjældent ledsages af akut sygdom, udvikler omkring 1/3 af senere smittede såkaldt infektiøs mononukleose (kyssesyge), der er kendetegnet ved halsbetændelse, hævede lymfeknuder, feber og udtalt træthed [1[. EBV inficerer B-lymfocytter livslangt og balanceres af immunresponset Sygdommen, der er selvlimiterende og forbigående og kun sjældent kræver behandling, skyldes først og fremmest den immunologiske reaktion på virusinfektionen [2[. Via svælget finder virus vej til og inficerer cirkulerende memory B-lymfocytter. Som udgangspunkt vil denne infektion være latent. Det vil sige, at virus ikke deler sig aktivt, og at det på forskellig vis unddrager sig immunforsvaret. I en vis andel af lymfocytterne er eller bliver infektionen dog aktiv, hvorved der produceres nye virus, som kan inficere andre memory B-lymfocytter. Til at begynde med forløber denne proces uhindret, og infektionen kan få et omfang, hvor halvdelen eller mere af alle cirkulerende memory B-lymfocytter huser virus. Fordi det aktive virus udtrykker en række stærke antigener, aktiveres der imidlertid et T-cellemedieret immunrespons, der efterhånden bliver i stand til at bremse den aktive infektion, hvorved der indstiller sig en ligevægt mellem latent/aktivt inficerede B-lymfocytter og immunforsvar. De kliniske manifestationer ved kyssesyge formodes at være forårsaget af denne primære immunreaktion, der kan være så udtalt, at EBV-specifikke T- lymfocytter udgør mere end halvdelen af alle cirkulerende lymfocytter [3[. EBV er sat i forbindelse med kræft og dissemineret sklerose Udover kyssesyge er EBV også sat i forbindelse med en række, mere alvorlige sygdomme som for eksempel Hodgkin lymfom (en form for lymfekræft) [4[og dissemineret sklerose [5[. Medens de molekylærbiologiske

3 mekanismer for sammenhængen med EBV åbenlyst ikke er de samme for de to sygdomme, er der holdepunkter for, at et unormalt immunrespons mod EBV spiller en afgørende rolle for udvikling af dem begge. Det er blandt andet vist, at der er sammenhæng mellem niveauer af antistoffer rettet mod EBV og risikoen for senere udvikling af såvel Hodgkin lymfom som dissemineret sklerose [6,7[. Kyssesyge, Hodgkin lymfom og dissemineret sklerose tre sider af samme sag? Det er uvist, hvad der ligger til grund for det unormale EBV immunrespons, der ses ved Hodgkin lymfom og dissemineret sklerose. Skønt den afvigende immunfunktion højst tænkeligt er delvist genetisk betinget, har dette hidtil været vanskeligt at studere. I den forbindelse er det interessant, at risikoen for såvel Hodgkin lymfom [8[ som dissemineret sklerose [9[ er forøget blandt personer med kyssesyge. Det er derfor en nærliggende tanke, at det enten kunne være den samme immunologiske defekt, der lå bag udvikling af kyssesyge og det unormale EBV immunrespons ved Hodgkin lymfom og dissemineret sklerose, eller at de tre sygdomme på anden vis havde fælles, genetiske karakteristika. Bortset fra sammenhængen med alder ved smitte med EBV, ved man stort set intet om risikofaktorer for kyssesyge. Man ved således heller ikke, hvad der ligger til grund for den kraftige immunreaktion, der forårsager sygdommen. Endnu ikke offentliggjorte statistiske analyser af data fra det danske Landspatientregister tyder dog på, at der kan være tale om en arveligt betinget tilbøjelighed, idet kyssesyge optræder hyppigere end forventet blandt både 1. og 2. gradsslægtninge til kyssesygepatienter. Tilsvarende er det fundet, at sammenfaldet af kyssesyge er højere blandt enæggede end blandt tveæggede tvillinger [10[. Hypotese Det er nærværende projekts underliggende hypotese, at tilbøjeligheden til at udvikle kyssesyge er genetisk betinget. Vi ønsker nu at teste denne hypotese i en såkaldt genome-wide association (GWA) undersøgelse.

4 Materialer og metoder Deltagere med kyssesyge Personer, der har haft kyssesyge, vil blive identificeret dels i Den danske mikrobiologidatabase (MiBa) og/eller i Landspatientregisteret, dels i Det Danske Bloddonorstudie, dels i en skotsk kohorteundersøgelse blandt universitetsstuderende. I MiBa identificeres op til 1500 personer født efter 1980, som siden MiBas blev etableret i 2011 er blevet registreret som akut smittet med EBV ved serologisk undersøgelse på en af landets klinisk mikrobiologiske afdelinger. I det mål at der ikke kan identificeres 1500 deltagere i MiBa, identificeres de resterende deltagere i Landspatientregisteret, dvs. personer, der er født efter 1980 og som har været indlagt med kyssesyge (ICD8 075; ICD10 DB27). For disse patienters vedkommende søges diagnosen kyssesyge bekræftet ved gennemgang af relevante hospitalsjournaler og/eller laboratoriedata. Der vil i udvælgelsen af patienter til undersøgelsen blive lagt særlig vægt på unge individer (aldersgruppen år), da det skønnes at patienter i denne aldersgruppe er mest repræsentative for sygdommen. Ved samkøring med CPR identificeres førstegradsslægtninge til patienterne, og ved samkøring med Landspatientregisteret identificeres tilfælde af kyssesyge blandt disse. Det sikres, at patienterne ikke står opført i Sundhedsstyrelsens Vævsanvendelsesregister. Det Danske Bloddonorstudie ( er en igangværende kohorteundersøgelse blandt danske bloddonorer godkendt af Videnskabsetisk Komité (M ) og Datatilsynet (j.nr ). Alle deltagere i undersøgelsen besvarer et spørgeskema, der blandt andet omhandler tidligere kyssesyge, og afgiver endvidere blodprøver til undersøgelsen med samtykke til, at den må anvendes i projekter, som det aktuelle. Blandt deltagerne udvælges 500 personer hhv. med og uden selvrapporteret kyssesyge til validering af genetiske sammenhænge observeret blandt deltagerne fra Landpatientregisteret. Den skotske undersøgelse af studerende ved Edinburgh Universitet har til formål at studere årsager til kyssesyge. Undersøgelsen omfatter mere end 500 personer, som ved serologisk undersøgelse af 2006 nyimmatrikulerede studerende i årene 1999 og 2000 blev fundet ikke at være smittet med EBV. De mange personer er siden fulgt aktivt med hensyn til udvikling af kyssesyge, som er blevet diagnosticeret hos 200 af disse. Både deltagere med og uden kyssesyge i den skotske undersøgelse vil indgå i nærværende projekt til validering af genetiske sammenhænge observeret blandt deltagerne fra Landpatientregisteret. Den skotske undersøgelse er godkendt af relevante videnskabsetiske organer (reference 07/S1102/51; the Lothian Research Ethics Committee).

5 Deltagere uden kyssesyge (kontrolpersoner) De patienter, der er identificeret i Landspatientregisteret, vil blive sammenlignet med personer, der har deltaget i tidligere GWA studier udført på Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum Institut, dvs. for hvem der allerede eksisterer genetiske data. Oplysninger om kyssesyge blandt disse kontrolpersoner fås ved samkøring med Landspatientregisteret. Biologisk materiale (DNA) oprettelse af forskningsbiobank og risici ved prøvetagning Patienter identificeret i MiBa/Landspatientregisteret er alle født efter 1980 og vil følgelig være omfattet af Den Neonatale Screeningsbiobank på Statens Serum Institut. Af hver deltagers PKU kort udstanses en 3 mm store cirkel, fra hvilken DNA oprenses og mangfoldiggøres. Dette foregår på Statens Serum Institut, hvor metoderne hertil er rutine. Deltagere fra Det Danske Bloddonorstudie. I forbindelse med indrullering i bloddonorstudiet har deltagerne alle afgivet en blodprøve, fra hvilken der er oprenset DNA. Deltagere i den skotske undersøgelse har alle afgivet en blodprøve, fra hvilken der er oprenset DNA. Kontrolpersoner: Af hensyn til validiteten af de statistiske analyser af resultaterne af de genetiske analyser vil DNA fra 300 deltagere i de tidligere GWA studier blive re-analyseret med samme teknik (chip) som deltagerne med kyssesyge. De ovenfor beskrevne DNA prøver udgør en forskningsbiobank, der vil blive huset i og af Den Nationale Biobank på Statens Serum Institut under iagttagelse af gældende love og regler (se Datasikkerhed nedenfor). Når projektet er afsluttet, vil eventuelt overskydende DNA enten blive returneret til de oprindelige projekter / Screeningsbiobanken eller blive destrueret, alt afhængig af mængde og kvalitet og de oprindelige projekters / Screeningsbiobankens ønsker. Projektbiobanken nedlægges med andre ord ved projektets afslutning. Det beskrevne projekt anvender allerede indsamlet biologisk materiale (DNA), hvorfor undersøgelsen ikke medfører risiko for deltagerne i forbindelse med fornyet prøvetagning. Genetiske analyser Patienter identificeret i Landspatientregisteret undersøges hver især for knap genetiske markører (såkaldte SNPs) spredt over hele genomet ved anvendelse af Illumina HumanCore BeadChip. De genetiske analyser ventes at finde sted på Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA , USA. Data fra den genetiske screening analyseres statistisk på Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum Institut, der har erfaring fra adskillige, lignende studier.

6 Statistiske analyser Data oprensning, kvalitetskontrol og case-kontrolanalyser De genotypiske data oprenses ved standardmetoder, som f.eks. filtrering basereret på udbytte per SNP og per individ, principalkomponentanalyse til undersøgelse af populationsstratifikation, tests af Hardy- Weinberg ligevægt og analyse af rå intensitetsdata per kromosom og per batch. Ligeledes sammenholdes genotyperne med tilgængelige oplysninger om deltagerne som for eksempel køn og slægtsskab for at kunne detektere eventuelle tilfælde, hvor to prøver er ombyttet. De statistiske analyser vil primært bestå af test for sammenhæng mellem genotype og case/kontrol status (kyssesyge vs. ikke kyssesyge). Efterfølgende analyser vil blive justeret eller stratificeret for variable med kendt betydning for kyssesyge, dvs. alder, køn, antal yngre og ældre søskende samt kyssesyge blandt 1. gradsslægtninge. Yderligere analyser vil undersøge specifikke genetiske modeller (dominant, recessiv) samt justere eller stratificere for flere variable. Vi vil anvende standardmetoder (Bonferroni korrektion; simulationsbaserede False Discovery Rate beregninger) til håndtering af multipel testning. Replikation af observerede sammenhænge Når de hypotesegenerende analyser er afsluttet, vil observerede statistiske associationer blive af- eller bekræftet ved SNP analyse af DNA fra deltagere i Det Danske Bloddonorstudie og den skotske kohorteundersøgelse. De genetiske analyser ventes at foregå på LGC Genomics (tidligere KBiosciences) i UK, og de statistiske analyser på Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum Institut. Sammenligning med GWA studier af Hodgkin lymfom og dissemineret sklerose Slutteligt vil resultaterne blive sammenlignet med tilsvarende data fra tidligere GWAS studier af hhv. dissemineret sklerose og Hodgkin lymfom mhp. identifikation af fælles risikomarkører. Dette vil blive undersøgt ved at udvælge en fællesmængde af SNPs (genetiske markører) kendetegnet ved at tilhøre TOP100-hits mht. til p-værdi for en eller flere af de tre sygdomme og være inkluderet i GWAS studier af alle tre sygdomme. For hver af disse SNPs udvælges et positivt mål, vi vil bruge abs(log(odds ratio)) og log(p). Man konstruerer så for hver sygdom en vektor af disse positive mål over fællesmængden af SNPs, og korrelationen mellem de sygdomsspecifikke vektorer (der per definition vil være ikke-negativ) vil da være et udtryk for, hvor meget sygdommene ligner hinanden i deres genetiske ophav. Vi vil bruge en ikke-centreret korrelation, dvs. ρjk =( i aij aik)/ ( i aij2 i aik2), hvora ij er et non-negativt mål på den i te SNP for sygdom j. De statistiske analyser vil foregå på Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum Institut.

7 Statistisk styrke Efter behørig Bonferroni-korrektion for multiple sammenligninger vil de skitserede statistiske analyser have mindst 80% styrke til at påvise odds ratioer, der er signifikante på 5% niveau, på hhv 1,4, for minor allelfrekvenser på 20%, 1,6 for minor allelfrekvenser på 10% og på 1,6 for minor allelfrekvenser på 5%. I praksis vil signifikansniveauer blive bestemt på baggrund af permutationsanalyser eller ved anvendelse af andre metoder, der tager korrelationer mellem de testede SNPs i betragtning. Konservativt vurderet (alene på det skotske valideringsmateriale) vil replikationsanalyserne have 80% styrke til at påvise en relativ risiko på 1,35 på 0,5 promille-niveau for en minor allelle frekvens på 20%. Tidsplan Maj - oktober 2014 Identifikation af patienter i MiBa og Landspatientregisteret; validering af diagnose; ekstraktion af DNA November oktober 2015 GW analyse og replikation November 2015 maj 2016 Statistiske analyser og afrapportering Initiativ og økonomiske forhold Initiativet til undersøgelsen er taget af overlæge Henrik Hjalgrim, Statens Serum Institut. De grundlæggende udgifter til projektet afholdes af Afdeling for Epidemiologisk Forskning, Statens Serum Institut (cvr ). Der søges løbende om støtte til projektet fra offentlige og private fonde, og Videnskabsetisk Komité vil blive orienteret om eventuelle bevillinger. Sponsorer vil ikke få indflydelse på projektets tilrettelæggelse, afvikling eller afrapportering. Etiske overvejelser Undersøgelsen vil komme til at omfatte godt 2200 patienter med kyssesyge og 800 kontrolpersoner foruden oplysninger om deltagere i tidligere GWA studier. Blandt deltagerne vil der også være personer under 18 år. Inklusionen af disse unge deltagere nødvendiggøres af sygdommens epidemiologi. De genetiske analyser fordrer ikke personlig kontakt til deltagerne. Der er ingen sundhedsmæssige risici for deltagerne ved det påtænkte projekt, og det er ikke sandsynligt, at de inkluderede patienter eller kontrolpersoner vil nyde gavn af undersøgelsens resultater. For patienternes vedkommende vil sygdommens udvikling såvel som eventuel behandling af denne allerede have fundet sted på tidspunktet for undersøgelsen. Det er sandsynligt, at analyserne vil kunne bestyrke mistanken om en arvelig disposition til kyssesyge, men dette vil umiddelbart ikke i sig selv kunne danne baggrund for rådgivning af patienter, kontrolpersoner eller deres pårørende, ej heller hvad angår risikoen for at udvikle Hodgkin lymfom eller dissemineret sklerose. Således formodes alle tre sygdomme at opstå i et komplekst og endnu ufuldstændigt belyst samspil mellem infektion, arv og miljø. Af disse årsager og fordi studiet kan gennemføres med

8 udgangspunkt i allerede eksisterende materiale, anmodes der om dispensation fra kravet om informeret samtykke. Projektet er anmeldt til Datatilsynet (journalnummer ). Undersøgelsens resultater (hvad enten positive, negative eller inkonklusive) vil blive offentliggjort. Datasikkerhed Statens Serum Institut og følgelig Afdeling for Epidemiologisk Forskning er som statsinstitution forpligtet til at implementere og overholde it-sikkerhedsforskrift DS484. Denne beskriver tekniske, politiske og organisatoriske forhold mhp. at fastholde og løbende forbedre datasikkerhed. I overensstemmelse med afdelingens rutiner vil alle data i det aktuelle projekt blive opbevaret på krypterede drev, hvortil alene dataadministrator (Klaus Rostgaard) har adgang. I forbindelse med indtastning af data fra patientjournaler vil der blive etableret en midlertidig database på et krypteret drev, hvortil kun dataadministrator og dataindsamler vil have adgang, indtil dataindsamlingen er afsluttet, og data kan overføres til dataadministrator. Herefter vil databasen blive slettet. Journaler, der modtages i kopi i forbindelse med samme del af projektet, vil blive opbevaret i aflåste arkivskabe, hvortil kun projektleder (Henrik Hjalgrim) og dataindsamlere har adgang. Journalerne vil blive destrueret, når alle journaldata er indsamlet. Biologiske prøver i projektet vil blive opbevaret i og af Den Nationale Biobank på Statens Serum Institut og i forbindelse med genetiske analyser på Keck School of Medicine, Los Angeles, USA og LGC Genomics, UK under iagttagelse af gældende love og regler på området. Det vil sige, at prøverne vil blive opbevaret i aflåste frysere i lokaler med adgangsbegrænsning, og at de vil være uden personhenførebare oplysninger, men mærket med løbenumre, der kan knyttes til personnumre med en datanøgle, der alene opbevares på krypterede drev med begrænset adgang (Klaus Rostgaard) på Statens Serum Institut.

9 Reference List 1. Hjalgrim H, Friborg J, Melbye M. The epidemiology of EBV and its association with malignant disease. In Arvin A, Campadelli-Fiume G, Mocarski E et al (eds): Human Herpesviruses - Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis, 1 edition. Cambridge: Cambridge University Press 2007; Cohen JI. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med 2000; 343: Hadinoto V, Shapiro M, Greenough TC et al. On the dynamics of acute EBV infection and the pathogenesis of infectious mononucleosis. Blood 2008; 111: Hjalgrim H, Engels EA. Infectious aetiology of Hodgkin and non-hodgkin lymphomas: a review of the epidemiological evidence. J Intern Med 2008; 264: Ascherio A, Munger KL. Epstein-barr virus infection and multiple sclerosis: a review. J Neuroimmune Pharmacol 2010; 5: Levin LI, Munger KL, Rubertone MV et al. Temporal relationship between elevation of epstein-barr virus antibody titers and initial onset of neurological symptoms in multiple sclerosis. JAMA 2005; 293: Levin LI, Chang ET, Ambinder RF et al. Atypical prediagnosis Epstein-Barr virus serology restricted to EBVpositive Hodgkin lymphoma. Blood 2012; 120: Hjalgrim H, Askling J, Sorensen P et al. Risk of Hodgkin's disease and other cancers after infectious mononucleosis. J Natl Cancer Inst 2000; 92: Nielsen TR, Rostgaard K, Nielsen NM et al. Multiple sclerosis after infectious mononucleosis. Arch Neurol 2007; 64: Hwang AE, Hamilton AS, Cockburn MG et al. Evidence of genetic susceptibility to infectious mononucleosis: a twin study. Epidemiol Infect 2012; 140: