Substitution af picrinsyre (CI 10305) med martius yellow (CI 10315), naphtol yellow S (CI 10316) og orange G (CI 16230) i Alcian Blue Van Gieson farvningen. Giftig Eksplosiv Periode: Februar juni 2009 Afleveret: 9 juni 2009 Udarbejdet af: Chaka Gram-Petersen Bojowski Side 1 af 69
02-04-84 Hovedvejleder: Inger Lindebo Holm, Bioanalytiker uddannelsen København. Bivejleder: Camilla Qvist og Heidi Johansen, Patologiafdeling, Bispebjerg Hospital. Anslag uden mellemrum: 56.960 Bioanalytikeruddannelsen København Professionshøjskolen Metropol Side 2 af 69
Forord: Chaka Gram-Petersen Bojowski Jeg ønsker at udtrykke min taknemmelighed for at få mulighed for at skrive bachelorprojekt indenfor patologi faget. Jeg vil i den anledning gerne takke patologiafdelingen, Bispebjerg hospital, for at gøre dette bachelorprojekt muligt. Yderligere tak til afdelingen for lån af laboratorium og laboratorieudstyr. For professionel rådgivning og vejledning tak til hovedvejleder lektor Inger Lindebo Holm og til bivejleder Camilla Qvist og Heidi Johansen samt lektor Henriette Lorenzen, bioanalytiker uddannelsen København. Tak til bioanalytikerunderviser Marianne Rasmussen, patologiafdelingen Rigshospitalet, for levering af en del af prøvemateriale. Tak til Heidi Johansen for at skære vævssnit af prøvematerialet og tak til overlæge Anders Glenthøj, patologi afdelingen Bispebjerg hospital, for at have vurderet og scoret en del af de opnåede farveresultater. Chaka Gram-Petersen Bojowski Bioanalytikerstuderende Side 3 af 69
Resumé: Problembaggrund og formål: Patologi afdeling Bispebjerg hospital benytter vådt picrinsyrepulver i Alcian Blue Van Gieson (ABVG) farvningen. Vådt picrinsyrepulver er giftigt samt eksplosivt ved udtørring. For at øge sikkerheden for personalet på afdelingen undersøges martius yellow, orange G og naphtol yellow S, som substituent for picrinsyre, idet de er mindre sundhedskadelige og ikke er eksplosive. Det et krav til substitutionen at bibeholde farveresultat i ABVG farvningen, at kollagene fibre farves røde og globulære proteiner e. Metode: Afprøver farvning med direkte substitution og ved ændret parametre som: molær koncentrations forhold mellem syrefuchsin (rød) og substituent (), farvetid, ved fler-bads-metode og solvent. Ændrer kun en parametre ad gangen. Prøvemateriale er lunge- og tarmvæv der er fikseret i 4 % buffed formalin, paraffin indstøbt og skåret på serie og slædemikrotom af snittykkelse på 2 m. Vurderer farveresultater, via eget scoresystem, ved lysmikroskopi. Afdelingens standard ABVG farvning benyttes som golden standard. Resultater: Forsøg med Martius yellow og orange G har ikke kunne differentiere mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e. Derimod har napthol yellow S kunne differentiere mellem disse vævskomponenter, som ønsket. Ved molær koncentations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin 15:1, blev kollagene fibre farvet svag/mindre kraftig røde med lidt skær af og globulære proteiner mindre kraftig e. Side 4 af 69
Overlæge Anders Glenthøj har scoret den nye substituerede ABVG farvning ved brug af napthol yellow S og bekræfter at denne er diagnostisk anvendelig. Konklusion: Afdelingen kan benytte naphtol yellow S i stedet for picrinsyre i ABVG farvningen og samtidig opnå en diagnostisk anvendelig farvning. Dog kan farvningen optimeres, således at kollagene fibre og globulære bliver mere intenst farvet. Side 5 af 69
Indholdsfortegnelse: Forord Resumé 1.0.0 Indledning: side 1 1.1.1 Problembaggrund side 1 1.1.2. Problemformulering side 2 1.1.3. Teori: side 4 1.1.4. Opbygning og farvning af globulære proteiner side 4 1.1.5. Opbygning - og farvning af kollagene fibre side 5 1.1.6. Van Gieson farvning side 6 1.1.7. Farvestoffer og substitution side 7 1.1.8. Farvetid side 7 1.1.9. Et-bads-metode side 8 1.1.10. Fler-bads-metode side 8 1.1.11. Solvent side 8 1.2.0. Metodevalg: side 9 1.2.1 Forsøgsdesign side 9 1.2.2. Valg af farveforskrift side 10 1.2.3. Valg af substituenter (farvestoffer) side 10 1.2.4. Prøvemateriale og kontroller side 11 1.2.5. Resultatsvurdering (score system) side 12 Side 6 af 69
Første forsøgsrunde: 1.2.6. Van Gieson farvning (forsøg 1) side 13 1.2.7. Direkte substitution (forsøg 2) side 14 1.2.8. Ændring af molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin (forsøg 3) side 14 1.2.9. Ændret farvetid (forsøg 4) side 14 1.2.10. Ændring til fler-bads-metode (forsøg 5) side 15 1.2.11. Ændret solvent (forsøg 6) side 15 Anden forsøgsrunde: 1.2.12. Yderligere ændret molær koncentrations forhold (forsøg 7) side 16 1.2.13. Yderligere ændret farvetid (forsøg 8) side 16 Tredje forsøgsrunde: 1.2.14. Ny substitueret Alcian Blue Van Gieson farvning (forsøg 9) side 17 2.0. Materiale og metoder: side 17 2.1. Apparatur side 17 2.2. Reagensliste side 17 2.3. Materiale side 17 2.4. Farveforskrift side 18 2.5. Fejlkilder side 19 3.0. Resultater: side 19 Side 7 af 69
3.1. Golden standard (med picrinsyre) side 19 3.2. Substitution af picrinsyre med martius yellow ved varierende parametre side 20 3.3. Substitution af picrinsyre med orange G ved varierende parametre side 20 3.4. Substitution af picrinsyre med naphtol yellow S ved varierende parametre side 21 3.5. Ny Alcian Blue Van Gieson farvning, med molær koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1 side 22 3.6. Overlæge Anders Glenthøj s, patologi afd. BBH, scoring side 22 4.0. Diskussion: side 23 4.1. Golden standard side 23 4.2. Martius yellow side 25 4.3. Orange G side 26 4.4. Naphtol yellow S side 30 4.5. Ny Alcian Blue Van Gieson farvning med molær koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1 side 33 4.6. Validitet og reliabilitet side 35 Side 8 af 69
5.0. Konklusion: side 36 6.0. Perspektivering: side 36 7.0. Litteraturliste: side 37 8.0. Bilag: Bilag 1: Reagensliste Bilag 2: Rådata for forsøg 1-9 Side 9 af 69
1.1.0. Indledning. Chaka Gram-Petersen Bojowski 1.1.1. Problembaggrund: På patologiafdelingen, Bispebjerg hospital, benyttes der blandt andet anion farvestoffet picrinsyre i Alcian Blue Van Gieson farvningen (ABVG). Afdelingen tilsætter mandag og onsdag ekstra vådt picrinsyrepulver til den 1,2 % w/v mættede vandige picrinsyre-opløsning, for at sikre at farveopløsningen er mættet med picrinsyre. (1) Uheldigvis er vådt picrinsyrepulver giftigt, og som tørt pulver eksplosivt, og er dermed er en sikkerhedsfare for personalet på afdelingen. (2) Alcian Blue Van Gieson farvningen udføres på mange vævsprøver, der ankommer til afdelingen og farvningen udføres flere gange dagligt. Alcian Blue Van Gieson er en farvning, hvorved sure kulhydrater (muciner) farves blå, globulære proteiner (muskler) farves e, kollagene fibre (bindevæv) farves røde og cellekerner farves brune. (3 s.48,s.59) Patologer på afdelingen har nytte af Van Gieson farvningen, idet de har behov for at differentiere mellem kollagene fibre og muskler til diagnosticering. Farvning af væv sker efter fysiske - og kemiske principper. Der er flere faktorer, der er afgørende for farveresultatet blandt andet; ph, solvent, koncentration af farvestoffer, makromolekylernes og farvestoffernes fysiske og kemiske egenskaber, samt bindingen mellem makromolekyle og farvestof. Yderligere har fysiske forhold i vævssnittet betydning for hvilket farvestof, der bindes til makromolekylerne. Forklaring på differential farvninger, specielt bindevævsfarvninger, er stadig spekulative, fordi hverken vævssnittets fysiske struktur eller farvestoffers individuelle egenskaber er fuldt klarlagte. (3 s.3,s.22,s.59) Problemstilling: at vådt picrinsyrepulver er giftigt og derved skaber sikkerhedsmæssige problemer, kan løses ved, at afdelingen benytter bindevævsfarvningen Gomori s trichrom eller Masson s Trichrom. Men ved brugen af disse gør, at kollagene fibre farves en anden farve end rød og globulære proteiner en anden farve end. Side 10 af 69
Patologiafdelingen, Bispebjerg hospital, ønsker at bibeholde farveresultatet ved Van Gieson farvningen, som er kollagene fibre røde og globulære proteiner e. Jeg substituerer picrinsyre med et andet anion farvestof af sikkerhedsmæssige årsager. Første kriterium for substituent er, at den skal være mindre sundhedsskadelig og ikke eksplosiv som picrinsyre. Bilag 1. En substitution er vanskelig, idet en substituent vil adskille sig fra picrinsyre på følgende områder: Molekyleopbygning og dermed bindingsmuligheder til væv. Molekylevægt og derved forskelligt diffusion i farveopløsningen. En substituent kan ikke være lig med picrinsyre i molekyleopbygning og vægt. Derfor er konkurrencen mellem substituent og syrefuchsin, i binding til væv, ikke længere den samme, som i Van Gieson farvningen med picrinsyre og syrefuchsin. (4, 5, 6) Man kan ikke forvente at en direkte substitution vil lykkedes uden at ændre på parametre som: farvetid, molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin, fra et- til fler-bads-metode og solvent. Formålet med dette projekt er at finde en substituent for picrinsyre i Van Gieson farvningen. Substituenten skal farve globulære proteiner e og kollagene fibre skal stadig farves røde af syrefuchsin. Substituenten skal yderligere ikke være eksplosivt og have mindre molekylevægt end syrefuchsin, idet farvestoffet med størst molekylevægt (syrefuchsin) typisk vil farve kollagene fibre. Hvis det ikke er muligt direkte at substituere picrinsyre med en substituent og opnå at kollagene fibre farves røde og globulære proteiner e, er det relevant at undersøge substituent med følgende ændret parametre: Farvetid, Molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin, Fra et- til fler-badsmetode, Side 11 af 69
Solvent 1.1.2. Problemformulering: Er det muligt at opnå en diagnostisk anvendelig farvning med differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e ved substitution af picrinsyre (CI 10305) med martius yellow (CI 10315) eller naphtol yellow S (CI 10316) eller orange G (CI 16230) i Alcian Blue Van Gieson farvning på formalin fikseret, paraffin indstøbt tarm- og lungevæv? Begrebsdefinition: En diagnostisk anvendelig farvning med differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner ses ved, at kollagene fibre er farvet kraftig/mindre kraftig/svag røde og globulære proteiner kraftig/mindre kraftig/svag -orange. Problem uddybning: For at belyse ovenstående problem ønsker jeg at afprøve farvning med følgende: Direkte substitution af picrinsyre med substituent i samme molær koncentration som ved Van Gieson farvningen. Substitution af picrinsyre ved forskellige molære koncentrationer af substituent. Substitution af picrinsyre med substituent ved varierende farvetider. Substitution af picrinsyre med substituent ved fler-bads-metode. Substitution af picrinsyre ved fler-bads-metode, første farvebad med substituent i ethanol. Afprøvning af den bedste substituent i Alcian Blue Van Gieson farvning. Fravalg: Alcien Blue er fravalgt i de indledende forsøg, indtil en mulig differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e er påvist ved en substitution af picrinsyre. Side 12 af 69
1.1.3. Teori: For forståelsen af de parametre, der er vigtige for en vellykket substitution i Van Gieson farvningen, bliver følgende uddybet: opbygning af - og farvning af globulære proteiner, opbygning af - og farvning af kollagene fibre, Van Gieson farvningen, farvestoffer og substitution samt farveparametre. 1.1.4. Opbygning af - og farvning af globulære proteiner: Alle proteiner består af aminosyre sammensat af peptidbindinger, kaldet primærstruktur. Aminosyresekvenser kan være arrangeret sådan, at de danner hydrogenbindinger imellem hinanden, og derved opstår enten en alfa-helix eller en beta-plade. Alfa-helix og beta-plade kaldes proteinets sekundærestruktur. De fleste proteiner udviser tertiærstruktur, hvor proteinet kan bestå både af alfa-helixer og beta-plader og en globulær struktur opstår. Forskellige typer sammenbindende kræfter medvirker til opretholdelsen af den globulære struktur, ion tiltrækninger, hydrogen og disulfid bindinger og Wan Der Waalske kræfter. (7 s.23-25) Proteiners aminosyrer, med upolære sidegrupper, prøver at undgå vand i omgivelserne ved at folde sig globulært og gemme sig i det indre af proteinet. De polære sidegrupper derimod, danner hydrogen bindinger eller iondipol bindinger til vandmolekylerne i solventet. Polære sidegrupper er væsentlige for proteinets foldning, idet disse sidegrupper fastholder dele af polypeptid-kæden, i proteinet, i kontakt med vandfasen. (7 s.25, 3 s.11,s13,s.18) Binding af farvestof til globulære proteiner, i vand, er især bestemt af hydrofob stabilisering. Hydrofob stabilisering er en samlet reaktion af ion tiltrækning og upolær binding mellem et farvestof og et protein, der er delvis udfoldet. Ved ph < 3 er globulære proteiners carboxylgrupper neutralt ladet, mens amino-grupper er maksimalt positivt ladet, og dermed frastøder amino-grupperne hinanden og proteinet udfoldes. Hermed vil upolære områder, i proteinet, blotlægges ud mod vandfasen. Når et farvestof diffunderer hen til proteinet, vil farvestoffet tiltrækkes af komplementære ladninger i proteinet. Farvestoffet vil danne upolære bindinger med de upolære områder i proteinet, samt en ladningsafmætning mellem farvestoffets og proteinets ladede grupper vil forekomme. Herved frigives Side 13 af 69
vandmolekylerne til solventet og proteinet folder sig sammen om farvestoffet. De upolære områder i proteinet vil på ny gemmes bort fra det omgivne vand. Hydrofob stabilisering er samlet en relativ stærk binding, der medfører, at bundet farvestof til globulære proteiner langsomt udskiftes i vand. (3 s.23-25,s.28s.39, 6 s.163) 1.1.5. Opbygning af - og farvning af kollagene fibre: Kollagene fibre er de hyppigst forekommende bindevævsfibre i kroppen. De er opbygget af lineære, parallelt forløbende proteinfilamenter. Disse er sammensat af tynde fibriller, der yderligere er sammensat af parallelle mikrofibriller. Mikrofibriller er opbygget af tropokollagen. Hvert tropokollagen molekyle består af tre polypeptid kæder, der er drejet omkring hinanden i en tripelhelix. (3 s.59, 7 s.212) Polypeptid kæderne har en aminosyresammensætning med glycin, prolin, hydroxyprolin. (7 s.213, 6 s.171) Upolære- og polære sidegrupper ligger samlet i korte sekvenser med upolære-sekvenser overfor upolær sekvenser og positive sidegrupper overfor negative sidegrupper. Kollagen fiberen er stabiliseret ved upolære-, hydrogen- og kovalente bindinger og positiv/negativ tiltrækning mellem tropokollagen molekylerne. (8 s.23, 3 s.21-23,s.28) På grund af kollagene fibres molekylære opbygning og udstrakte tripelhelix medfører det, at fibrene er ret upåvirkelige af fiksering og lavt ph. Dette medfører at de fleste interne bindinger i de native kollagene fibre er bevaret og kun et fåtal upolære og ladede grupper er tilgængelige for farvebinding. Binding af farvestof til kollagene fibre, ved hjælp af hydrofob stabilisering, er derved ikke muligt. Ved ph < 3 vil kollagene fibres carboxyl grupper overvejende være neutralt ladet og amino grupper være positive ladet. Amino gruppernes positive ladninger medfører en gensidig frastødning af hinanden (3 s.22-28,s.59, 9 s.39) og hermed kvælder kollagen fiberen, (6 s.171) og under farvning med anion farvestoffer kan disse farvestoffer dermed lejre sig mellem polypeptid-kæderne. (3 s.28) Side 14 af 69
Binding af farvestof til kollagene fibre er især bestemt af upolære og hydrogen bindinger. (3 s.21, 6 s.171) Store farvestofmolekyler kan til en vis grad overlappe både ladede - og upolære områder på kollagen fiberen. Herved kan farvestoffets aromatiske ringe bindes til upolære områder ved hjælp af upolære bindinger. Den samlede binding til kollagen fiberen, både for store og små anion farvestoffer, (3 s.28) er svag i forhold til binding ved hydrofob stabilisering. Den svage binding mellem kollagen fiberen og farvestoffet medfører, at farvestoffet meget let udskiftes med et andet farvestof. (3 s.39, 6 s.163) Yderligere har farvestoffets sidegrupper betydning for farvning af kollagene fibre, idet de skal passe til de bindende side-grupper i tropokollagen molekylerne. (3 s.28) 1.1.6. Van Gieson farvning: Formålet med denne farvning er at synliggøre og differentiere mellem kollagene fibre og globulære proteiner. Van Gieson farvningen er en bindevævsfarvning og foregår ved et-bads-metode med anion farvestofferne picrinsyre og syrefuchsin i fælles farvebad, solventet vand og ph 1,2-1,5. Yderligere er molær koncentration af picrinsyre størst, oftest 25-60 gange så høj som koncentration af syrefuchsin. I Van Gieson farvningen farves kollagene fibre røde af syrefuchsin og globulære proteiner e af picrinsyre. (3 s.37,s.59) Syrefuchsin og picrinsyre kan begge binde til kollagene fibre og globulære proteiner, (6 s.166, 10 s.152) og de konkurrerer i farveopløsningen om bindingssteder. (3 s.38) Fordi syrefuchsin og picrinsyre er i fælles farvebad, binder de selektivt til hver deres vævskomponent. Picrinsyre binder selektivt til globulære proteiner, ved hjælp af hydrofob stabilisering, på grund af at picrinsyre er til stede med en højere molær koncentration end syrefuchsin og samtidig diffunderer hurtigst til globulære proteiener. Binding af picrinsyre til globulære proteiner favoriseres også på baggrund af vævets steriske hindringer for større farvestoffer. (11 s.828, 3 s.37, 10 s.152, 6 s.172) Efter endt farvning har picrinsyre ikke bundet sig til kollagene fibre, idet picrinsyre fjernes let fra disse fibre under dehydrering, samt skubbes væk af syrefuchsin. (3 s.19) Syrefuchsin når ikke at binde til globulære proteiner, idet syrefuchsin er til stede i en lavere koncentration end picrinsyre og fordi syrefuchsin farver væv langsommere, da dets bindingsevne til solvent er højere end picrinsyre. (3 s.4) Side 15 af 69
Binding af farvestof til kollagene fibre, er som nævnt, især bestemt af upolære og hydrogen bindinger, (3 s.21) idet kollagene fibre er opbygget af parallelle fibre, organiseret således, at peptid-grupperne er tilgængelige for hydrogen bindinger til farvestoffer. (6 s.171) Syrefuchsin binder derved selektivt til kollagene fibre, idet syrefuchsins bindingsevne, med hensyn til upolære- og hydrogen bindinger, er større end picrinsyres (Se tabel 1 s.11), og derved kan skubbe evt. bundet picrinsyre bort fra de kollagene fibre. (3 s.38,s.59, 10 s.152) Det endelig farveresultat for Van Gieson farvningen er først og fremmest afhængig af koncentrationsforholdet mellem picrinsyre og syrefuchsin. Farvefordelingen er uafhængig af farvetiden, (3 s.38,s.59) dog med forbehold, idet farvefordelingen skal stabiliseres. (10 s.152) I Van Gieson farvningen benyttes kernefarvningen Weigert Jern-Hæmatien (W-JH), som er et metalkompleks-farvestof med ligandfarvestoffet hæmatein og jern-ioner. Hæmatein og jern-ioner er bundet til hinanden ved hjælp af kompleksbindinger. W-JH kan binde til cellekerner (nukleinsyrer) ved hjælp af hydrofob stabilisering eller kompleksbindinger. W-JH farver cellekerner blåsort til brunsort. W-JH benyttes i stedet for kernefarvningen Aluminium-Hæmatein, idet W-JH kompleksbinder stærkere til væv. Det er vigtigt at W-JH binder kraftigt til væv, fordi man ikke ønsker at trække W-JH ud af vævet i det efterfølgende farvebad med lavt ph, eller under dehydrering efter endt farvning. (3 s.34,s.36,s.58) 1.1.7. Farvestoffer og substitution: Farvestoffer er molekyler med både polære - og upolære grupper tilknyttet en eller flere aromatiske ringe. Aromatisk ringe og sidegrupperne er medvirkende til farvestoffets farveevne, vandopløselighed, ladning og bindingsmuligheder (3 s.18) Ved substitution er det nødvendigt at have kendskab til både picrinsyres - og substituents kemiske- og fysiske egenskab. Den kemiske egenskab har betydning for farvestoffets affinitet til væv, og den fysiske egenskab har betydning for diffusionshastigheden af farvestoffet i farve-opløsningen. (4 s.29, 11) Man skal vide, hvilken farve substituenten farver væv, idet man gerne vil opnå, at substituenten farver væv t som picrinsyre. Man skal have kendskab til substituentens faresymboler, idet substituenten skal være mindre farligt, ikke eksplosivt, end picrinsyre. Side 16 af 69
Ved substituion af picrinsyre er det dermed vigtigt, at substituenten ligner picrinsyre med hensyn til kemisk- og fysisk egenskab, da det ønskes at opnå, at substituenten skal farve globulære proteiner e. 1.1.8. Farvetid: Den mængde farvestof der bindes til væv afhænger af farvetiden. For de fleste farvninger er den maksimale farvning, 80-90 %, opnået efter en farvetid på 0,5-1 time. (3 s.3) Dog er farvefordelingen ved et-bads-metode uafhængig af tiden for differential farvning med to anion farvestoffer. Modsat er farveintensiteten afhængig af farvetiden. (3 s.59) Ved fler-bads-metode, med solvent ethanol eller vand, er farvetiden afgørende for farveresultatet. (6 s.172) 1.1.9. Et-bads-metode: Ved et-bads-metode er konkurrencen mellem to forskellige farvestoffer af betydning, idet de anvendes i fælles farvebad. (3 s.36) Det endelig farveresultat er først og fremmest afhængig af koncentrationforholdet mellem farvestofferne. (3 s.38, 6, s.167) 1.1.10. Fler-bads-metode: Ved fler-bads-metode er farveudskiftning af betydning for farveresultatet. (6 s.166) Ved fler-bads-metode anvendes to forskellige farvestoffer sekventielt, det vil sige adskilt i hver sit farvebad. Farvestoffet i første farvebad anvendes i høj koncentration for at sikre, at alle bindingssteder i globulære proteiner bliver besat, og man benytter det farvestof med størst molekylevægt i det sidste farvebad, idet man udnytter, at farvningen af globulære proteiner er mere stabil end farvning af kollagene fibre. (3 s.39,s.60) 1.1.11. Solvent: Side 17 af 69
I solventet vand sker binding af farvestof til væv blandt andet ved hydrofob stabilisering. Upolære - og hydrogen bindinger og ion-dipol bindinger forekommer i vand. Ion-ion tiltrækning har en mindre betydning og ion-binding forekommer sjældent, idet vands dielektricitetskonstant er på 80, dette skyldes at vandmolekylerne danner ion-dipol bindinger med ioner, og derved danner en maskering af ioners ladninger. (3 s.5,s.10-9,s.21,s.37) I solventet ethanol > 70 % vil hydrofob stabilisering ikke forekomme, mens ion tiltrækning og ion bytning har betydning. Dette skyldes, at ionkræfter er større i ethanol end i vand, (3 s.37, 6 s.172) idet ethanols dielektricitetskontant er på 23. (3 s.5) Selvom små farvestoffer gennemtrænger og binder væv hurtigere end større farvestoffer, vil større farvestoffer med mange ladninger tiltrækkes kraftigere til makromolekylerne ved solvent ethanol. Da hydrofob stabilisering ikke kan forekomme i ethanol, vil det større farvestof efterhånden fortrænge det lille, undtagen i meget tætte vævsstrukturer. Binding af farvestof til globulære proteiner i ethanol udviser samme tendens til hurtig udskiftning af farvestof, som farvning af kollagene fibre gør i både vand og ethanol. (3 s.37) 1.2.0. Metodevalg: 1.2.1. Forsøgsdesign: Først har jeg valgt hvilken farveforskrift, der skal anvendes, hvilke substituenter, der skal substituere picrinsyre, på hvilket prøvemateriale, der skal farves, og hvordan opnåede resultater skal vurderes. Dernæst har jeg valgt at afprøve en direkte substitution af picrinsyre med substituent, og med ændrede parametre som: molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin, farvetid, fra et- til fler-bads-metode og solvent. Disse forsøg udføres for at opnå, at substituent farver globulære proteiner e, og syrefuchsin farver kollagene fibre røde. Når ovennævnte forsøg er foretaget, vil en substituent vise sig at være vinder med hensyn til at farve globulære proteiner e. Denne substituent vælger jeg at afprøve med yderligere ændret parametre som: molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin og farvetid. Side 18 af 69
Til sidst vælger jeg at afprøve substituenten i Alcian Blue Van Gieson farvningen i rutinen. Overordnet forsøgsdesign angivet som flowdiagram se figur 1 nedenfor: Figur 1: Flowdiagram for overordnet forsøgsdesign. 1.2.2. Valg af farveforskrift: Jeg har valgt at benytte farveforskriften Alcian Blue Van Gieson patologi afd. BBH, idet denne benyttes af afdelingen til diagnosticering. farvemaskinen, fra Side 19 af 69
Farveforskriften anvendes som vejledende farveforskrift til alle forsøg. Dog vil jeg ændre i farveforskriften med hensyn til følgende; direkte substitution af picrinsyre med substituent, molære koncentrationer af substituent, farvetid, til fler-bads-metode og solvent. Alcian Blue undlades, idet farvestoffet farver sure kulhydrater, og dermed ikke har indflydelse på Van Gieson farveresultatet i forhold til en differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner. (3 s.59) Jeg har valgt at farve manuelt og kun med ét vævssnit per deløvelse. Jeg har ikke valgt at ændre på ph, da det anvendte ph område er det optimale for en bindevævsfarvning. Når det lykkedes at substituere picrinsyre, hvorved der er en differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e, vil Alcian Blue medtages i den nye substiturede farveforskrift. Jeg ønsker at afprøve reproducerbarheden, og hvordan denne nye substituerede farvning fungerer under forhold i rutinen. Der vil dermed blive farvet maskinelt ved hjælp af afdelingens farvemaskine Robert stainer, idet denne farvemaskine til dagligt farver alle Alcian Blue Van Gieson farvninger. Vævssnit vil farves på to forskellige dage for at få indsigt i intra og interserielle fejlkilder. 1.2.3. Valg af substituenter (farvestoffer): Jeg har ønsket at finde substituenter, anion farvestoffer, der farver væv /orange, og hvis molekylevægt er lavere end syrefuchsin. (4 s.29, 13) Jeg har ledt efter mulige substituenter i A Biological stain commission publication der ikke er eksplosive, Conn s Biological stains, 10 TH - A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. (14) Følgende anion farvestoffer har været oplagte valg, idet de opfylder mine ovenstående kriterier: Martius yellow (CI 10315), naphtol yellow S (CI 10316) og orange G (CI 16230). Yderligere kender jeg martius yellow fra Martius Scarlet Blue - og orange G fra papanicolaou farvningen, hvor de er i stand til at differentiere mellem forskellige proteintyper. Anvendt anion farvestoffer: Picrinsyre Martius yellow Naphtol Orange G Syrefuchsin Side 20 af 69
yellow S CI nummer: 10305 10315 10316 16230 42685 Molekyle-størrelse, 229 256 358 452 586 FW: Absorberer 354 420 336 475 546 Lys i vand, nm: Farve: Gul Gul Gul Orange Rød Nettoladning: -1-1 -2-2 -2 Hydrogen bindings 10 7 10 10 18 muligheder: Antal 1 2 2 3 3 aromatiske ringe: Molekyleopbygning: Tabel 1: Angiver CI nummer, molekylestørrelse, absorbans af lys i vand, farve, nettoladning, hydrogens bindings muligheder, antal aromatiske ringe og molekyleopbygning for picrinsyre, martius yellow, naphtol yellow S og syrefuchsin. (14 s.94,s.102-104,s.113-114,s.175-176, 15, 5 s.64-65,s.69) 1.2.4. Prøvemateriale og kontroller: I 1- og 2 forsøgsrunde har jeg valgt at farve på colon - og lungevæv, idet afdelingen dagligt modtager disse vævstyper. Colonvævet er fra patologi afd. BBH. Afdelingen modtager kun lungebiopsier, derfor er lungevævet anskaffet fra patologi afd. RH. Colon og lungevævet paraffinindstøbes i samme paraffinblok. Hermed opnås, at de to vævstyper er placeret næsten samme sted på objektglasset og bliver udsat for ens vilkår under skæring, afparaffinering, farvning og dehydrering. Vævet skæres på seriemikrotom af en erfaren bioanalytiker fra afdelingen. Valg af seriemikrotom og en erfaren bioanalytiker er for at undgå for stor variation i snittykkelsen. Dette er vigtigt at undgå, idet snittykkelsen har indflydelse på farveintensitet i farveresultaterne. Side 21 af 69
I 3 forsøgsrunde, med den nye substituerede Alcian Blue Van Gieson farvning, har jeg valgt at benytte yderligere tyndtarm og colonvæv samt bronkiebiopsi fra patologi afd. BBH. Disse vævstyper modtager afdelingen dagligt. Jeg har valgt, at vævstyperne bliver indstøbt i hver sin paraffinblok. På hver vævstype skæres der to snit på slæde og to snit på seriemikrotom, af en erfaren bioanalytiker fra afdelingen. Vævet skæres både på slæde og seriemikrotom, idet afdelingen får skåret væv ved begge typer mikrotomer. Alt prøvemateriale indeholder både kollagene fibre og globulære proteiner, der fungerer som interne kontroller. 1.2.5. Resultatsvurdering (score system): Ved hjælp af lysmikroskopi vil jeg vurdere de farvede snit med hensyn til, om det mellem kollagene fibre og globulære proteiner og samtidigt vurdere farveintensitet Jeg scorer farveresultater ud fra følgende: er muligt at differentiere for disse. Score: Definition: 3 Perfekt farvning eller så tæt på perfekt som muligt. Farveresultatet stemmer overens med forventede resultater; Kollagene fiber farves kraftig røde og globulære proteiner kraftig e/orange eller kollagene fiber farves kraftig røde og globulære proteiner mindre kraftig e/orange eller kollagene fiber farves mindre kraftig røde og globulære proteiner kraftig e/orange. 2 Acceptabel farvning for diagnostisk brug, men hvor det er muligt at optimere resultatet i forhold til forventede resultater; Kollagene fiber farves mindre kraftig røde og globulære proteiner mindre kraftig e/orange eller kollagene fiber farves mindre kraftig røde og globulære proteiner svag e/orange eller kollagene fiber farves svag røde og globulære proteiner mindre kraftig e/orange 1 Farvningen forekommer ikke acceptabel, da den ikke påviser den/de ønskede komponenter i tilstrækkelig grad; Kollagene fiber farves svag røde og globulære proteiner svag e/orange Side 22 af 69
eller kollagene fiber farves svag røde og globulære proteiner ikke farvet e/orange eller kollagene fiber ikke farvet røde og globulære proteiner farves svag e/orange. 0 Farvningen er insufficient, idet den/de ønskede komponenter ikke er påvist eller, at de ønskede komponenter er ens farvet; Kollagene fiber er ikke farvet røde og globulære proteiner er ikke farvet e/orange eller både kollagene fiber og globulære proteiner farves kraftig/mindre kraftig/svag røde eller både kollagene fiber og globulære proteiner farves kraftig/mindre kraftig/svag e/orange. Tabel 2: Angiver mit scoresystem. Scores et resultat til 3 er farvningen vellykket og substitution af picrinsyre er muligt. Scores et resultat til 2 er farvningen næsten vellykket. Hermed er der mulighed for substitution af picrinsyre, men hvis muligt bør farvningen optimeres. Scores et resultat til 1 eller 0 er en mulig substitution af picrinsyre er ikke påvist. Overlæge Anders Glenthøj, patologi afd. BBH, vurderer resultater for 3-forsøgsrunde ved hjælp af afdelingens scoresystem. Se tabel 3. Anders Glenthøj mikroskoperer dagligt vævssnit farvet med Alcian Blue Van Gieson farvninger i forbindelse med diagnostisk udredning. Ved hjælp af Anders Glenthøjs vurdering er det muligt at få af/bekræftet den diagnostiske værdi af den nye Alcian Blue Van Gieson farvning. Patologi afdelingens scoresystem: Score: Definition: 3 Optimal farvning og diagnostisk anvendelig, idet resultat stemmer overens med forventede. 2 Acceptabel farvning og diagnostisk anvendlig, men hvor det muligt at optimere farvningen i forhold til forventede resultat. 1 Borderline farvning og ikke diagnostisk anvendelig, idet de/den ønskede komponenter ikke påvises i tilstrækkelig Side 23 af 69
grad. Farvningen bør optimeres. 0 Ringe farvning og ikke diagnostisk anvendelig, idet de ønskede komponenter ikke påvises. Farvningen bør optimeres Tabel 3. Angiver patologi afdelingens, BBH, score system til kvalitetssikring af histokemiske farvninger. I første forsøgsrunde udføres følgende: 1.2.6. Van Gieson farvning (forsøg 1): I forbindelse med forsøgsrunderne udfører jeg en Van Gieson farvning. som golden standard, idet afdelingen benytter farvningen til standard sammenlignes med farveresultater opnået fra alle forsøg, da for det ønskede farveresultat, idet kollagene fibre farves røde (af syrefuchsin) Denne farvning fungerer diagnostik. Golden denne er repræsentativ og globulære proteiner e (af picrinsyre). 1.2.7. Direkte substitution (forsøg 2): Jeg afprøver en direkte substitution af picrinsyre med substituent, idet molekylevægt, nettoladning og hydrogen bindings muligheder er næsten lig med picrinsyres. Se tabel 1 s.11. (14 s.102-104,s.113, 4, 5) Substituents molære koncentration (0,0524 mol/l) er den samme som picrinsyre i Van Gieson farvningen. Hvis substituentens nettoladning er tæt på picrinsyres, vil tiltrækningen til komplementære ladninger næsten være ens. I følge Prentø er binding af farvestof til kollagene fibre især bestemt af hydrogen bindinger (3 s.21) og det største farvestof er det, der Side 24 af 69
binder til kollagene fibre. (4) I den forbindelse, at substituenten har mindre hydrogen bindings muligheder og molekylevægt end syrefuchsin, er der mulighed for, at syrefuchsin binder til kollagene fibre og substituent vil binde til globulære proteiner. Hvis det ikke er muligt at opnå det ønskede farveresultat ved direkte substition af picrinsyre, udføres følgende: 1.2.8. Ændring af molær koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin (forsøg 3): Jeg vælger at substituere picrinsyre med substituent og ændre på det molære koncentrations forhold mellem substituent og syrefuchsin til 62:1 og 15:1. I alle forsøg benytter jeg den samme molære koncentration af syrefuchsin (0,00171 mol/l). Prentø nævner, ved et-bads-metode er koncentration af to forskellige farvestoffer afgørende for det endelige farveresultat. (3 s.38) Det er herved interessant at undersøge om et større eller mindre molær koncentrationsforhold vil medføre, at kollagene fibre farves røde af syrefuchsin og globulære proteiner farves e af substituenten. Hvis en ændring af det molære koncentrationsforhold ikke medfører det ønskede farveresultat, udføres følgende: 1.2.9. Ændret farvetid (forsøg 4): Jeg vælger at substituere picrinsyre med substituent og ændre farvetiden til henholdsvis 5 sek., 1 min., 2 min. og 10 min. Disse tider er valgt, idet 5 sek. er den halve af standard farvetiden på 10 sek. og de andre tider er valgt, fordi jeg har kendskab til, at der farves ved 10 min. i andre Van Gieson farvninger. Jeg ændrer på farvetiden, fordi Prentø nævner, at for et-bads-metode, solvent vand, afgøres farvefordelingen uafhængigt af farvetid. (3 s.38,s.59) Det er interessant at undersøge, om dette også er gældende ved farvetid på 10 sek. i standard farveforskriften for Van Gieson farvningen. Hvis en Side 25 af 69
ændring af farvetid ikke medfører det ønskede farveresultat, udføres følgende: 1.2.10. Ændring til fler-bads-metode (forsøg 5): Jeg vælger at substituere picrinsyre med substituent og afprøve farvning ønsker både at afprøve farvning med substituent i første - og i andet Når der farves ved fler-bads-metode, vil de to forskellige farvestoffer konkurrence med hinanden, men i stedet forekommer en Prentø hævder, at det sidste farvebad med farvestof x er det, der binder globulære proteiner. (6 s.166, 3 s.39) Det er interessant at undersøge, om anvendt farvetid på 10 sek. Yderligere har jeg kendskab til, at i PAP- og muligt at opnå en differentiering mellem forskellige proteintyper ved ændring til fler-bads-metode ikke medfører det ønskede farveresultat, ved fler-bads-metode. Jeg farvebad. ikke længere være i farveudskiftning. (3 s.39) til kollagene fibre og farveudskiftning sker ved MSB farvningen er det fler-bads-metode. Hvis en udføres følgende: ved fler-bads-metode og 96 % ethanol, og afprøve farvning ved et- ikke kan ske, og dermed 1.2.11. Ændret solvent (forsøg 6): Jeg vælger at substituere picrinsyre med substituent og afprøve farvning med ændret solvent. Første farvebad er med substituent i solvent på 70 % - andet farvebad er med syrefuchsin i solvent vand. Jeg har valgt ikke at bads-metode med ændret solvent til ethanol, idet hydrofob stabilisering vil det største farvestof (syrefuchsin) vinde konkurrencen over det lille farvestof (substituent). (3 s.61, 6 s.172) Men ved fler-bads-metode, kun med ethanol i første farvebad med substituent, vil substituent muligvis i andet farvebad, med solvent vand, kunne danne hydrofob stabilisering med bundet globulære proteiner. (3 s.60-61) Jeg har kendskab til, at i PAP- og MSB farvningen er det muligt at opnå en differentiering mellem forskellige proteintyper ved fler-bads-metode og med solvent ethanol. Side 26 af 69
I anden forsøgsrunde udføres følgende: Chaka Gram-Petersen Bojowski En farvning med Van Gieson (golden standard). Jeg har valgt, at udføre forsøg 7, fordi forsøget (fra 1 forsøgsrunde) med det molære koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1, medførte at kollagene fibre blev farvet svagt/mindre kraftigt røde og globulære proteiner farvet mindre kraftigt e. Det ønskes med forsøg 7 at opnå en kraftigere rød farvning af de kollagene fibre. 1.2.12. Yderligere ændret molær koncentrations forhold (forsøg 7): Jeg har valgt at yderligere afprøve farvning med ændret molære koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin til 25:1, 15:1, 10:1, 7:1 og 15:2 (med dobbelt molær koncentration af syrefuchsin). Disse molære koncentra-tionsforhold ønskes afprøvet, idet de er omkring 15:1. Ændring af det molære koncentrations forhold er valgt, fordi Prentø hævder, at koncentration af farvestof er medbestemmende for den mængde af farvestof, der kan binde til væv, og at farvestof koncentrationen er afgørende for farvefordelingen ved differentiale farvninger. (6 s.163,s.173) Hvis en ændring af det molære koncentrationsforhold ikke medfører det ønskede farveresultat, udføres følgende: Jeg har valgt, at udføre forsøg 8, fordi forsøget (fra 1 forsøgsrunde) med substitution af picrinsyre med naphtol yellow S ved farvetiderne 5 sek, 10 sek., 1 min, 2 min og 10 min. medførte, at kollagene fibre blev farvet svagt røde med lidt skær af og globulære proteiner farvet mindre kraftig e. Med forsøg 8 ønskes det at opnå en kraftigere rød farvning af de kollagene fibre. 1.2.13. Yderligere ændret farvetid (forsøg 8): Side 27 af 69
Jeg har valgt at afprøve farvning med substitution af picrinsyre med naphtol yellow S med yderligere ændret farvetid til 7 min., 10 min., 15 min., 20 min. og 1 time. Disse tider er valgt, idet Prentø hævder, at den maximale eller næsten maximale farvning af kollagene fibre er opnået omkring en farvetid på 1 time. (6 s.166) Yderligere hævder Prentø, at ved de fleste farvninger er 80-90 % af den maksimale farvning opnået efter en farvetid på 0,5-1 time. (3 s.3) I tredje forsøgsrunde udføres følgende: En farvning med Alcian Blue Van Gieson (golden standard). 1.2.14. Ny substitueret Alcian Blue Van Gieson farvning (forsøg 9): Dette forsøg udfører jeg, fordi forsøget med det molære koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1 gav anledning til den bedst mulige differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner ud af alle udførte forsøg. Det er nødvendigt at afprøve den nye substituerede Alcian Blue Van Gieson farvning i rutinen, for at få indsigt i reproducerbarheden, og hvordan farvningen fungerer under rutineforhold som: farves med Alcian Blue, flere forskellige vævstyper, der er skåret på både slæde- og seriemikrotom og farves maskinelt på Robert stainer på to forskellige dage. 2.0. Materiale og metoder: 2.1. Apparatur: Robert stainer (Microm HMS 760) 2.2. Reagensliste: Se bilag 1 Side 28 af 69
2.3. Materiale: Tarm (tyndtarm og colonvæv) Lunge (lungevæv - og bronkiebiopsi med fibrose) Alt væv er fikseret i 4 % buffed formalin, paraffin indstøbt og skåret på serie og slædemikrotom ad snittykkelse på 2 m. 2.4. Farveforskrift: Nedenfor ses standard farveforskrift for Alcian Blue Van Gieson farvning (ABVG) fra patologi afd. BBH. * markerer, hvor der er foretaget ændringer i forbindelse med forsøg 1-9. ABVG farvning: Ændringer i forbindelse med forsøg 1-9: 1. Varmeskab + 80 C 30 min. I forsøg 1-8 er punkt 7 (skyl i rindende vand) og punkt 8 (Alcian Blue) undladt. 2. Tissue-Clear 10 min. 3. 99 % ethanol 2 min. 30 sek. I forsøg 2 er punkt 12 ændret til: Direkte substitution af picrinsyre med martius yellow/naphtol yellow S/orange G (0,0524 mol/l) 4. 99 % ethanol 2 min. I forsøg 3 er punkt 12 ændret til: Et molær koncentrations forhold mellem martius 30 sek. yellow/naphtol yellow S/orange G og syrefuchsin på 62:1 og 15:1. 5. 96 % ethanol 2 min. 30 sek. I forsøg 4 er punkt 12 ændret til: Substitution af picrinsyre med martius 6. 70 % ethanol 2 min. yellow/naphtol yellow S/orange G (0,0524 mol/l) og med farvetiderne 5 sek., *7. Rindende vand 2 min. 1 min., 2 min. og 10 min. * 8. Alcian Blue pyridin variant 5 min. I forsøg 5 er punkt 12 ændret til: fler-bads-metode. Side 29 af 69
9. Rindende vand 2 min. 12-a: Martius yellow/naphtol yellow S/orange G (0,0524 mol/l). 10. Weigert jernhæmatein 7 min 30 sek. 12-b: Syrefuchsin (0,00171 mol/l). Farvetid i hvert farvebad er 10 sek. Der afprøves både farvning med substituent i første farvebad og i andet farvebad. 11. Rindende vand 5 min * 12. farvebad med * 10 sek. I forsøg 6 er punkt 12 ændret til: fler-bads-metode med ændret solvent. 12-a: Martius yellow/naphtol yellow S/orange G (0,0524 mol/l) i solvent 70 % - picrinsyre & 96 % ethanol. (0,0524 mol/l) og 12-b: Syrefuchsin (0,00171 mol/l) i solvent vand. syrefuchsin Farvetid i hvert farvebad er 10 sek. (0,00171 mol/l) 13. 70 % ethanol 5 sek. I forsøg 7 er punkt 12 ændret til: Et molær koncentrations forhold mellem naphtol 14. 96 % ethanol 5 sek. yellow S og syrefuchsin på 25:1, 15.1, 10:1, 7:1 og 15:2 (dobbelt molær 15. 99 % ethanol 2 min. koncentration af syrefuchsin) 16. 99 % ethanol 2 min. 17. 99 % ethanol 2 min. I forsøg 8 er punkt 12 ændret til: Substitution af picrinsyre med naphtol yellow S 18. Tørring i stinkskab 20 min. (0,0524 mol/l) og med farvetiderne 7 min., 10 min., 15 min., 20 min. og 1 time. 19. Montering af dækglas med pertex I forsøg 9 er punkt 12 ændret til: Et molær koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1. Yderligere er punkt 7 (skyl i rindende vand) og punkt 8 (Alcian Blue) medtaget. Tabel 4: Angiver standard farveforskrift for ABVG farvning. Punkt 12 er med solventet deioniseret vand, ph 1.2-1.5, et-bads-metode og molære koncentrationsforhold mellem picrinsyre og syrefuchsin 31:1. (1) 2.5. Fejlkilder: I forsøg 9 (3 forsøgsrunde), på anden forsøgsdag, gik Robort stainer farvemaskinen i stykker med hensyn til apparaturets bærearm, der fører snit fra farvekar til farvekar. Der blev dog stadig farvet på farvemaskinen, men snit blev i stedet manuelt ført fra farvekar til farvekar. Side 30 af 69
3.0. Resultater: Chaka Gram-Petersen Bojowski Nedenfor ses de summerede farveresultater for golden standarder samt forsøg 2-9. Rådata for alle forsøg se bilag 2. 3.1. Golden standard (med picrinsyre): Van Gieson farvning udført manuelt (uden ekstra tilsat vådt picrinsyrepulver): Vævstype: Multiblok (med colon & lungevæv) I forbindelse med: Score Kollagene fibre Globulære proteiner 1. Forsøgsrunde (forsøg 2-6) 3* Kraftig rød Mindre kraftig 2. Forsøgsrunde (forsøg 7-8) 2* Kraftig rød Mindre kraftig med skær af rød * I lungevævet er kollagene fibre og globulære proteiner begge farvet røde. Alcian Blue Van Gieson farvning udført maskinelt (med ekstra tilsat vådt picrinsyrepulver ): Vævstype: Multiblok (med colon og lungevæv), colon, tyndtarm og bronkiebiopsi. I forbindelse med: Dag 1 Dag 2 Kollagene fibre Globulære proteiner Score Score 3.forsøgsrunde (forsøg 9) 2* 2* Kraftig rød Mindre kraftig med rød skær nogle steder * I lungevævet er kollagene fibre farvet røde, og globulære proteiner nogle steder farvet enten røde eller e. Side 31 af 69
3.2. Substitution af picrinsyre med martius yellow (MY) ved varierende parametre: Vævstype: Multiblok (med colon & lungevæv). 1. Forsøgsrunde: Ændret parameter Score Kollagene fibre Globulære proteiner Direkte substitution, molære konc. af syrefuchsin og Forsøg 2-6 MY, farvetid, fler-bads-metode og solvent 0 Begge farvet kraftig røde 3.3. Substitution af picrinsyre med Orange G (OG) ved varierende parametre: Vævstype: Multiblok (med colon & lungevæv). 1. Forsøgsrunde: Ændret parameter Score Kollagene fibre Forsøg 2-4 Direkte substitution, molære konc. af syrefuchsin og MY, farvetid Forsøg 5-a Fler-bads-metode, OG i første farvebad. Forsøg 5-b Fler-bads-metode, OG i andet farvebad. Forsøg 6 Solvent 0 Kraftig rød Globulære proteiner Kraftig Mindre kraftig 0 orange orange med skær af 0 Kraftig Mindre kraftig rød rød 0 Begge farvet mindre kraftig orange Mindre kraftig rød Side 32 af 69
3.4. Substitution af picrinsyre med Naphtol yellow S (NYS) ved varierende parametre: Vævstype: Multiblok (med colon & lungevæv). 1. Forsøgsrunde: Ændret parameter Score Kollagene fibre Globulære proteiner Forsøg 2 Direkte substitution af picrinsyre med NYS 1* svag rød med skær af Mindre kraftig Forsøg 3-a Molær konc.forhold mellem 1* Svag rød Svag syrefuchsin og NYS 62:1 med skær af Forsøg 3-b Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 15:1 2* Svag rød, nogle få steder Mindre kraftig Forsøg 4 Forsøg 5-a Forsøg 5-b Ændret farvetid til 5 sek., 1 min, 2 min og 10 min. Fler-bads-metode, NYS i første farvebad. Fler-bads-metode, mindre kraftig rød 1* Svag rød med lidt t skær Mindre kraftig 0 Kraftig rød Mindre kraftig rød 0 Begge farvet svag e NYS i andet farvebad Forsøg 6-a Ændret solvent til 70 % 0 Kraftig rød Mindre kraftig rød Forsøg 6-b Ændret solvent til 96 % 0 Begge farvet kraftig røde 2. Forsøgsrunde: Forsøg 7-a Forsøg 7-b Forsøg 7-c Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 25:1 Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 15:1 1* svag rød med skær af Svag rød, 2* nogle få steder mindre kraftig rød med lidt t skær Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 10:1 1** Kraftig rød Mindre kraftig Mindre kraftig Mindre kraftig med lidt skær af rød Side 33 af 69
Forsøg 7-d Forsøg 7-e Forsøg 8 Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 7:1 Molær konc.forhold mellem syrefuchsin og NYS 15:2, hvor den absolutte koncentration af syrefuchsin er fordoblet Yderligere ændret farvetid til 7 min., 10 min., 15 min., 20 min. og 1 time Chaka Gram-Petersen Bojowski 1** Kraftig rød Mindre kraftig med skær af rød 1** Kraftig rød Mindre kraftig med skær af rød 1* Svag rød med skær af Mindre kraftig Tekst i ovenstående skema, markeret med kursiv og fed skrift, angiver de forsøg, der har ført til den nye substituerede Alcian Blue Van Gieson farvning (forsøg 9). * I lungevævet er kollagene fibre farvet svag røde og globulære proteiner farvet svag e. ** I lungevævet er både kollagene fibre og globulære proteiner farvet røde. 3.5. Ny Alcian Blue Van Gieson farvning, med molær koncentrations forhold mellem naphtol yellow S (NYS) og syrefuchsin på 15:1: 3. Forsøgsrunde (Forsøg 9): Væv: Multiblok (med lunge & colon) Colon Ændret parameter: Molær konc. forhold mellem Dag 1 Score: Dag 2 Score: Kollagene fibre 2* 2* Svag rød, få steder mindre kraftig rød, lidt t skær her og der 2 2 Svag rød, få steder mindre kraftig rød, lidt t skær her og der Globulære proteiner Mindre kraftig Mindre kraftig Side 34 af 69
syrefuchsin 2 2 Svag rød, Mindre kraftig Tyndtarm og NYS 15:1 få steder mindre kraftig rød, lidt t skær her og der Bronkie biopsi 2 2 Mindre kraftig rød Svag orange * I lungevævet er kollagene fibre farvet røde, og globulære proteiner nogle steder farvet enten røde eller e. 3.6. Overlæge Anders Glenthøj s, Patologi afd. BBH, scoring: Ny ABVG farvning, med molær koncentrations forhold mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1 Standard ABVG farvning (golden standard) 3. Forsøgsrunde (Forsøg 9): Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag 2 Væv: Score: Score: Score: Score: Multiblok med lunge & colon 3 2 3 3 Colon 3 3 3 3 Tyndtarm 3 3 3 3 Bronkie biopsi 2 3 2 3 Side 35 af 69
4.0. Diskussion: Chaka Gram-Petersen Bojowski Jeg vil diskutere følgende; golden standard, opnåede farveresultater for forsøg med martius yellow, orange G og naphtol yellow S, nye substituerede Alcian Blue Van Gieson farvning, projektets validitet og reliabilitet: 4.1. Golden standard: Mine forventninger: Forventningerne til Alcian Blue Van Gieson farvningen (golden standard) patologi afd. BBH var, at denne farvning kunne differentiere mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e på både tarm- og lungevæv, fordi farvningen benyttes til diagnostik. Mine resultater blev som følgende: I forbindelse med 1- og 2 forsøgsrunde blev der udført to Van standard). Se mikroskopi-billede, figur 1. Begge Van Gieson farvninger var i stand til at differentiere mellem globulære proteiner e i colonvævet (multiblok). I den ene Van colonvævets globulære proteiner dog et rødt skær. I lungevævet (multiblok) blev både kollagene fibre og globulære Figur 1: Van Gieson farvning (golden standard) på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte, kollagene fibre (bindevæv) farvet røde og globulære proteiner (muskler) e. Gieson farvninger (golden kollagene fibre farvet røde og Gieson farvning havde proteiner farvet røde. I forbindelse med 3 forsøgsrunde blev der udført en Alcian Blue standard). Denne farvning er i stand til at differentiere mellem Side 36 af 69 Figur 2: Standard Alcian Blue Van Gieson farvning (golden standard) på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte, kollagene fibre (bindevæv) farvet røde og globulære proteiner (muskler) e og muciner farvet blå. Van Gieson farvning (golden kollagene fibre farvet røde og
globulære proteiner e i tarmvævet. Se mikroskopi-billede, figur 2. Men endnu en gang forekommer der i tarmvævets globulære proteiner et rødt skær. I lungevævet (multiblok) var der nogle steder differentiering og nogle steder ingen differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e. I alle udførte golden standard farvninger, blev globulære proteiner i tarmvævet generelt farvet mindre intenst e end kollagene fibre intenst røde. Analyse af resultater: Det røde skær, der forekommer i tarmvævets globulære proteiner, skyldes, at molær koncentrations forholdet mellem picrinsyre og syrefuchsin ikke er den mest optimale, idet der er for mange syrefuchsin-molekyler til stede i farveopløsningen, end der burde være. (6 s.167) Dette resulterer i, at ikke kun picrinsyre binder til globulære proteiner, men syrefuchsin også til dels gør det. Det, at der ingen differentiering forekommer i lungevævet (i multiblok), kan skyldes: Størrelsen af lungevævet er rimeligt stort og indikerer, at vævet er udtaget ved en obduktion. Og hermed kan det forventes, at vævet ikke er blevet fikseret i tide og er påbegyndt autolyse. At tarmvævets globulære proteiner bliver farvet mindre intenst i forhold til kollagene fibre skyldes muligvis, at picrinsyre ligner, med hensyn til opløselighed, et kationfarvestof. Dermed ekstraheres picrinsyre af ethanol ved dehydrering af vævet efter farvning. (3 s.19, 4 s.33, 5 s.56) Og/eller at picrinsyre lettere fjernes fra vævet, i første dehydrerings bad med 70 % ethanol, end syrefuchsin. Fordi picrinsyre har lavere bindingsmuligheder til væv end syrefuchsin. Se tabel 1 s.11. Delkonklusion: Side 37 af 69
Golden standard Alcian Blue Van Gieson farvningen (ABVG) er ikke den optimale farvning, idet globulære proteiner ikke er farvet kraftigt e, og der kan forekomme rødt skær i disse. Yderligere er farvningen ikke i stand til at differentiere mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e i lungevævet (mulitblok). Dette må skyldes, at lungevæv er et dårligt prøvemateriale, idet det formodes at præanalytiske forhold ikke har været optimale. Lungevævet (multiblok) er derfor taget ud af betragtning både i golden standard og i de andre forsøg. Selv om ABVG farvningen ikke er den bedste, benytter afdelingen dog stadig denne til diagnostiske udredninger. Farvningen burde dog optimeres, så der ikke forekommer rødt skær i globulære proteiner, og at disse bliver mere intenst farvet e. Jeg benytter afdelingens ABVG farvning som målestok for, hvordan farveresultater skal se ud, idet farvningen er diagnostisk anvendelig. Golden standard er interessant, fordi jeg ønsker, at min substituerede ABVG farvning skal være lige så anvendelig, som afdelingens nuværende ABVG farvning. 4.2. Martius yellow: Martius yellow benyttes i farvningen Martius Scarlet Blue (MSB). Denne farvning anvendes til at differentiere mellem kollagene fibre farvet blå og globulære proteiner røde, samt til at påvise ung, modent og gammel fibrin. I MSB farver martius yellow ung fibrin og erythrocytter e. (3 s.60) Mine forventninger: Martius yellow s molekyleopbygning og vægt er tættest på picrinsyres, i forhold til naphtol yellow S og orange G. Se tabel 1 s. 11. Martius yellow er dermed udset som favorit med hensyn til at binde til de globulære proteiner. Side 38 af 69
Fordi martius yellow har færre hydrogen bindings muligheder - og mindre molekylevægt end syrefuchsin, har jeg en formodning om, at syrefuchsin vil binde til kollagene fibre og martius yellow til globulære proteiner. Mine resultater blev som følgende: I alle forsøg med martiue yellow blev både kollagene fibre og kraftig røde. Se mikroskopi-billede, figur 3. globulære proteiner farvet Analyse af resultater: Mulig forklaring på at differentieringen mellem kollagene fibre og globulære proteiner er mislykkedes, er følgende: Martius yellow er farveløst ved ph < 2 og først ph > 2 (14 s.94) samt er neutralt ladet ved ph < 2, idet dets pks værdi er 2,12. (16 s.215) I alle forsøg farvede jeg ved ph 1,2-1,5. Ifølge ovenstående medfører dette, at alle martius yellow-molekyler er farveløse og neutralt ladet og kan ikke binde de ønskede vævskomponenter. I stedet har syrefuchsin kunne binde alle positivt ladet vævskomponenter uden konkurrence fra martius yellow. At martius yellow skulle være farveløst ved ph < 2 undrer mig, fordi i forsøg ved fler-bads-metode, med martius yellow alene i farvebadet, var farveopløsningen. Dette indikerer, at ikke alle martius yellow-molekylerne i farveopløsningen er farveløse og neutralt ladet ved ph 1,2-1,5, som jeg farver ved. Figur 3 Van Gieson farvning med direkte substitution af picrinsyre med martius yellow på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte og både kollagene fibre (bindevæv) og globulære proteiner (muskler) farvet røde. Delkonklusion: Side 39 af 69
Det har ikke været muligt at substituere picrinsyre med martius yellow og opnå en differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e. Dette skyldes den inkorrekte ph værdi i farveopløsningen, og dermed er martius yellow blevet udkonkurreret af syrefuchsin i binding til væv. Forklaringen, at martius yellow farver ung fibrin og erythrocytter e i MSB farvningen, er, at der blandt andet farves ved ph > 2. (3 s.60) 4.3. Orange G: Orange G benyttes i farvningen papanicolaou (PAP). Denne farvning anvendes som en oversigtsfarvning på cytologisk materiale, hvor pladeepithel cellers morfologi, modenhed og metabolisk aktivitet kan vurderes. I PAP farver orange G keratiniserede pladeepithelceller -orange. (18 s.6) Mine forventninger: Orange G er den substituent, der adskiller sig mest fra picrinsyre, hvad angår molekyleopbygning -og vægt, i forhold til naphtol yellow S og martius yellow. Se tabel 1 s.11. Idet orange G har færre hydrogen bindings muligheder og mindre molekylevægt end syrefuchsin, har jeg en formodning om, at syrefuchsin vil binde til kollagene fibre og orange G til globulære proteiner. Mine resultater blev som følgende: I forsøg med direkte substitution, ændrede molære koncentrations forhold mellem orange G og syrefuchsin samt farvetid blev både kollagene fibre og globulære proteiner farvet orange. Se mikroskopi-billede, figur 4. I forsøg med fler-bads-metode er det farvestoffet i sidste kollagene fibre og globulære proteiner. farvebad, der farver både Side 40 af 69
I forsøg med ændret solvent blev både kollagene fibre og globulære proteiner farvet røde. Analyse af resultater: Forklaringen på den mislykkede differentiering, ved direkte substitution, ændret molær koncentrations forhold og farvetid, er følgende: Prentø hævder, at jo flere hydrogen bindings muligheder et farvestoffet binde til kollagen fiberen. (3 s.28) Binding til favoriseres af syrefuchsin, idet farvestoffet har flere end orange G. Se tabel 1 s.11. Men da orange G og og - antal aromatiske ringe, samt at orange G er til stede i en farvevæsken end syrefuchsin, er det orange G, der binding til både de kollagene fibre og globulære proteiner. (3 s.28, 6 s.172) Figur 4: Van Gieson farvning med direkte substitution af picrinsyre med orange G på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte og både kollagene fibre (bindevæv) og globulære proteiner (muskler) farvet orange. farvestof har, des kraftigere vil kollagene fibre burde derved hydrogen bindings muligheder syrefuchsin har ens nettoladning større molær koncentration i udkonkurrerer syrefuchsin i Horobin og Flemming (1988) udfører forsøg med 44 forskellige anion farvestofs-par ved et-bads-metode og ændring af koncentration af farvestof og farvetid. Deres forsøg viste, at for at opnå en differentiering, mellem kollagene fibre og globulære proteiner, skal molekylestørrelses-forholdet mellem to anion farvestoffer, ved et-bads-metode, være > 200. (4) Hvis jeg godtager deres hypotese, kan mine resultater, den mislykkede differentiering, forklares ved, at molekylestørrelses-forholdet mellem orange G og syrefuchsin er 119,15 g/mol, (17) dermed < 200. Jeg forholder mig dog kritisk til Horobin og Flemmings hypotese, idet de angiver, at picrinsyre har 0 hydrogen bindings muligheder, og picrinsyre har faktisk 10 hydrogen bindings muligheder (se tabel 1, s.11). Yderligere er jeg kritisk, fordi Horobin og Flemmings opnåede resultater ikke angiver ved hvilke molær koncentrationsforhold farvestofferne anvendes. Side 41 af 69
Min forklaring på den mislykkede differentiering ved fler-bads-metode er, at der forekommer en farveudskiftning med farvestoffet i det sidste farvebad. Prentø (1993) udfører forsøg med fler-bads-metode med picrinsyre og syrefuchsin. Prentø finder også frem til, at der sker en farveudskiftning. Prentø s forsøg viste at indenfor 10 min. blev alle kollagene fibre farvet med farvestoffet i andet farvebad, mens globulære proteiner og erythrocytter kun blev lidt farvet med farvestoffet i andet farvebad. (6 s.166) Mine forsøg derimod viste at på 10 sek., blev både kollagene fibre og globulære proteiner farvet af farvestoffet i andet farvebad. Mulig forklaring på at alt væv blev farvet med farvestoffet i andet farvebad, i mine forsøg, kan være forskel i snittykkelsen. Prentø benytter 8 μm - og jeg benytter 2 μm i snittykkelse. Jeg havde forventet, at orange G ved fler-bads-metode havde farvet globulære proteiner e, som orange G gør i PAP farvningen. Men da jeg ikke har benyttet Phosphorwolframsyre (PTA), er dette måske forklaringen på mit farveresultat. (3 s.39) Årsagen til at PTA kan medføre et andet farveresultat er, at PTA er et stort farveløst fler-ladet anion-molekyle. PTA vil konkurrere om bindingssteder i vævet, hvis der anvendes et/flere anion farvestoffer i fælles farvebad med PTA. PTA kan binde til blandt andet overfladen af peptid-kæderne i globulære proteiner og dermed hindre fler-ladede kollagen-farvestoffer (f.eks. syrefuchsin) i at binde til disse. (3 s.38, s.61, 6 s.168, 11) Min forklaring på den mislykkedes differentiering ved ændret solvent er, at Orange G ved endt farvning ikke danner hydrofob stabilisering med bundet globulære proteiner, som martius yellow gør i MSB farvningen. (3 s.60) Syrefuchsin farver i stedet både kollagene fibre og globulære proteiner røde. Årsagen til, at orange G ikke har bundet globulære proteiner efter endt farvning, er muligvis, at jeg ikke har skyllet i vand forinden andet farvebad med syrefuchsin eller benyttet PTA i farvebadet med orange G. (3 s.61, 8) Hvis jeg havde foretaget et skyl, havde det muligvis medført, at orange G dannede hydrofob stabilisering med bundet globulære proteiner. Idet jeg i stedet har ført vævet direkte fra første til andet farvebad, er der hændt en farveudskiftning af orange G med syrefuchsin. Side 42 af 69
Delkonklusion: Det har ikke været muligt at substituere picrinsyre med orange G, og opnå en differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e. Dette må skyldes, at orange G og syrefuchsin har for ens bindingsmuligheder til væv (se tabel 1, s11) og samtidig, at orange G er til stede i farveopløsningen ved en højere molær koncentration end syrefuchsin. Forklaringen på, at orange G farver, på cytologisk materiale, keratiniserede pladeepithelceller -orange i PAP farvning er brug af PTA. (18) For at opnå en bedre differentiering, mellem kollagene fibre og globulære proteiner -orange (af substituent), vil orange II (CI 15510) have været et mere oplagt orange G. Dette skyldes, at orange II vejer mindre -, har færre farvet røde (af syrefuchsin) valg som substituent, end hydrogen bindingsmuligheder - og mindre nettoladning end orange G. se tabel 1, s.11 og tabel 5. (14 s.111) Yderligere er orange II mindre farligt og sundhedsskadeligt end picrinsyre, idet orange II er klassificeret som værende orange G. (23) Desværre opdagede jeg ikke eksistensen af orange II før alle Tabel 5: Angiver CI nummer, farve, nettoladning, molekylevægt, hydrogen bindingsmulighed samt molekyleopbygning for anion farvestoffet orange II. (14 s.111) lokalirriterende, lige som forsøg var afsluttet. Side 43 af 69
4.4. Naphtol yellow S: Mine forventninger: Naphtol yellow S er midt imellem martius yellow og orange G, hvad angår molekyleopbygning - og vægt, i forhold til picrinsyre. Se tabel 1 s.11. Idet Naphtol yellow S har færre hydrogen bindings muligheder - og lavere molekylevægt end syrefuchsin, har jeg en formodning om, at syrefuchsin vil binde til kollagene fibre, og naphtol yellow S til globulære proteiner. Mine resultater blev som følgende: I forsøg med direkte substitution og ved ændret farvetid, blev kollagene fibre farvet svagt røde med t skær, og globulære proteiner mindre kraftigt e. Forsøg med ændrede molære koncentrations forhold mellem napthol yellow S og syrefuchsin viste: Ved molær koncentrations forholdet 25:1, blev kollagene fibre farvet svagt røde med skær af t og globulære proteiner mindre kraftig e. Ved molær koncentrations forholdet 62:1, blev kollagene fibre farvet svagt røde med t skær, og globulære proteiner svagt e. Ved molær koncentrations forholdet 15:1, blev kollagene fibre farvet svagt/mindre kraftigt røde med skær, og globulære proteiner mindre kraftigt e. Ved molær koncentrations forholdet 10:1, 7:1 og 15:2 med dobbelt molær koncentration af syrefuchsin, blev kollagene fibre farvet kraftigt røde, mens globulære proteiner mindre kraftig e med skær af rødt. I forsøg med fler-bads-metode er det farvestoffet i sidste farvebad, der både farver kollagene fibre og globulære proteiner. Side 44 af 69
I forsøg med ændret solvent blev både kollagene fibre og globulære proteiner farvet røde. Analyse af resultater: Min forklaring på farve i kollagene fibre, ved direkte substitution, ændret molær koncentrations forhold 25:1 og ændret farvetid, er den højere koncentration af naphtol yellow S i forhold til syrefychsin. På grund af dette, vil Naphtol yellow S delvis kunne udkonkurrere syrefuchsin i binding til de kollagene fibre. Selv om, at farvetiden blev øget, var det ikke muligt at opnå en mere intens farvning af kollagene fibre og globulære proteiner. Jeg forventede intens farve, idet øget farvetid medfører længere tid, hvor farvestof kan binde til væv. Min forklaring på den manglende intensitet er, at der dehydreres i 70 % ethanol. 70 % ethanol er det første dehydreringsbad efter farvning, og badet vil komme til at indeholde en del ekstra vand, på grund af gentagne farveserier. I vand ekstraheres anion farvestoffer, og hermed vil naphtol yellow S og syrefuchsin ekstraheres fra vævet og en mulig opnået farveintensitet går tabt. (3 s.20) Min forklaring på den svage farvning af både kollagene fibre og globulære proteiner, ved 62:1, er den ekstra høje koncentration af naphtol yellow S i forhold til syrefuchsin. Dermed vil mange Naphtol yellow S-molekyler binde til kollagene fibre, og hindre en del af syrefuchsinmolekylerne i at binde til disse fibre. Under dehydrering, i 70 % ethanol, ekstraheres naphtol yellow S nemmere fra vævet, da dets hydrogen bindingsevne er lavere end syrefuchsin. Resultatet bliver dermed, at kollagene fibre farves svagt røde og globulære proteiner svagt e. (3 s.20,11 s.822) Min anden forklaring kan være snittykkelsen, idet snittykkelsen har afgørende betydning for farveresultatet. Muligvis er vævssnittet i netop dette forsøg tyndere end de andre vævsnit i projektet. (4 s.33) Side 45 af 69
Differentieringen bliver betydelig bedre ved 15:1, idet kollagene fibre farves en smule mere røde, dog stadig med t skær, og globulære proteiner mindre kraftig e. Dette resultat skyldes, at molær koncentrations forholdet mellem naphtol yellow S og syrefuchsin er tæt på optimalt. Ved 15:1 har der ikke været nær så mange naphtol yellow S molekyler, der har bundet til kollagene fibre, i stedet har flere syrefuchsin molekyler bundet sig hertil. Prentø (1993) udfører forsøg med picrinsyre og syrefuchsin og varierer koncentrationen af syrefuchsin. Han finder også frem til, at molær koncentrations forholdet mellem to anion farvestoffer, ved et-bads-metode, er afgørende for det endelig farveresultat. (6 s.167) Min forklaring på, at kollagene fibre bliver mere intenst farvet røde, mens globulære proteiner får mere rødt skær ved 10:1, 7:1 og 15:2 er, at molær koncentrations forholdet mellem picrinsyre og syrefuchsin er mindre end 62:1, 30:1 og 15:1. (6 s.167) Herved er syrefuchsin i stand til at konkurrere bedre med picrinsyre om bindingssteder i vævet. Hvis jeg godtager Horobin og Flemmings (1988) hypotese for opnåelse af en differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner, kan mine forsøg med lykket differentiering, forklares ved, at molekylestørrelses-forholdet mellem naphtol yellow S og syrefuchsin er 213,33 g/mol (14) og dermed > 200. (4) Jeg forholder mig dog kritisk til ovenstående hypotese. I Horobin og Flemmings forsøg med øget farvetid, ved et-bads-metode, medførte det tab af differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner. Mine forsøg, ved et-bads-metode, med øget farvetid, viste derimod ikke tab af differentiering mellem kollagene fibre (røde) og globulære proteiner (e). Prentø (1993) udfører forsøg med syrefuchsin og picrinsyre, ved et-bads-metode, og ændret farvetid fra 5 sek. 28 dage. Prentøs forsøg medførte heller ikke tab af differentiering mellem kollagene fibre og globulære proteiner. (6 s.165) Side 46 af 69
Min forklaring på, at differentieringen er lykkedes, med substituent naphtol yellow S, er følgende: Prentø hævder, at binding til kollagene fibre især er bestemt af hydrogen- og upolære bindinger. (3 s.21) Idet naphtol yellow S har én mindre nettoladning- og betydelig færre hydrogen og upolære bindings muligheder end syrefuchsin, er binding til kollagene fibre favoriseret af syrefuchsin. Selv om naphtol yellow S kan binde til kollagene fibre, er den samlede binding svagere end syrefuchsins samlede binding til kollagene fibre. (3 s.5) Syrefuchsin er dermed i stand til at skubbe naphtol yellow S væk fra de kollagene fibre. Naphtol yellow S farver globulære proteiner på grund af dets højere koncentration end syrefuchsin. (3 s.37, 10 s.152, 6 s.173) Ingen differentiering forekommer ved fler-bads-metode. Dette skyldes, at farvestoffet i sidste farvebad udfører en farveudskiftning med farvestoffet fra første farvebad. (6 s.166) Ingen differentiering forekommer ved ændret solvent. Dette skyldes, at naphtol yellow S ikke har dannet hydrofob stabilisering med bundet globulære proteiner, ved endt farvning, som det er tilfældet for martius yellow i MSB farvningen. (3 s.60) I stedet er der sket en farveudskiftning med syrefuchsin i andet farvebad. Syrefuchsin farver dermed både kollagene fibre og globulære proteiner røde. Resultatet kunne muligvis have været anderledes, hvis jeg, som nævnt tidligere, havde benyttet et skyl i vand, forinden første farvebad med syrefuchsin, eller benyttet PTA i farvebadet med naphtol yellow S. Delkonklusion: Naphtol yellow S er en mulig substituent for picrinsyre i Van Gieson farvningen. Den bedst opnåede differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e er ved molær koncentrations forholdet mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1. 4.5. Ny Alcian Blue Van Gieson (ABVG) farvning med molær koncentrations forholdet mellem naphtol yellow S og syrefuchsin på 15:1: Side 47 af 69
Mine forventninger: Jeg forventer: At den nye substituerede ABVG farvning kan differentiere mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e på alt prøvemateriale, også selv om farvningen foregår maskinelt på Robert stainer. At sure kulhydrater (muciner) farves blå af Alcian Blue. At farvningen er reproducerbar, idet der ikke vil være forskel på farveresultater fra dag til dag Mine resultater blev som følgende: Farvning med den nye substituerede ABVG farvning medførte, at i colon- og tyndtarmvæv blev kollagene fibre farvet svagt/mindre kraftigt røde. Yderligere forekom t skær nogle steder i de kollagene fibre. De globulære proteiner blev farvet mindre kraftigt e og sure kulhydrater blå. I lunge biopsierne blev de globulære proteiner dog farvet orange. Overlæge Anders Glenthøj har mikroskoperet vævssnittene farvet med den nye udgave af Alcian Blue Van Gieson. Anders Glenthøjs kommentar: Den nye ABVG farvning er diagnostisk brugbar, men kollagene fibre er svagere røde end ved golden standard. Skulle jeg vælge, mellem disse to udgaver af ABVG farvninger, ville jeg foretrække golden standard, idet den farver kollagene fibre kraftigere røde. (19) Se mikroskopi-billede af den nye ABVG farvning, figur 5 og standard ABVG farvningen, figur 6. Side 48 af 69
Figur 5: Nye Alcian Blue Van Gieson farvning på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte, kollagene fibre (bindevæv) farvet røde og globulære proteiner (muskler) e og muciner farvet blå. Figur 6: Standard Alcian Blue Van Gieson farvning (golden standard) på colon væv ved x 20 forstørrelse. Ovenstående billede illustrerer kerner farvet sorte, kollagene fibre (bindevæv) farvet røde og globulære proteiner (muskler) e og muciner farvet blå. Delkonklusion: Den nye substituerede ABVG farvning er reproducerbar, idet alle vævssnit udviste omtrent ens differentiering mellem kollagene fibre farvet røde og globulære proteiner e, samt den er diagnostisk anvendelig. Side 49 af 69