Til brug med LightCycler 2.0-instrumentet

TIL BRUG MED: LightCycler SeptiFast Test MG Til brug med LightCycler 2.0-instrumentet (serienummer 1415001 og højere) Til in vitro-diagnostik. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set REF : 04 705 220 001 TILSIGTET BRUG LightCycler SeptiFast Test MG er en in vitro-nukleinsyreamplifikationstest til detektion og identifikation af bakterier og svampe i DNA fra mikroorganismer, som angivet i SeptiFast Master List (SML) i humant K-EDTA-blod ved hjælp af LightCycler 2.0-instrumentet. Testen bruges sammen med det kliniske billede, fastlagte mikrobiologiske analyser og/eller andre laboratoriemarkører som hjælp i behandlingen af patienter med mistanke om sepsis og andre bakterie-/svampeinfektioner i blodstrømmen. OVERSIGT OG FORKLARING AF TESTEN Sepsis betragtes som en af hovedårsagerne til dødelighed og sygelighed på hospitaler, der oftest skyldes bakteræmi og/eller fungæmi. En korrekt behandling med antibiotika og en hurtig indsats er kritiske faktorer for at reducere den dødelighed og sygelighed, der er forbundet med sepsis. Den andel af patienter, der først i behandlingsforløbet modtager utilstrækkelig antibiotika på intensive behandlingssteder, er betydelig og varierer fra 11 % til 46 % (1,2,3). På hospitalerne tager det normalt mindst 48 timer at identificere bakterie-/svampepatogenerne og den associerede modtagelighed for medikamenter fra blodkulturer (1). En hurtig detektion af patogener med molekylære diagnosticeringsværktøjer kan gøre det lettere at stille en hurtig diagnose af bakteræmi/fungæmi og tidligere sætte ind med en korrekt behandling med antibiotika, hvilket samtidigt reducerer det uhensigtsmæssige overforbrug af bredspektret antibiotika (4,5). LightCycler SeptiFast Test MG er udviklet til at påvise mikroorganismer, der forårsager ca. 90 % af alle infektioner i blodstrømmen (1,6). Mens mikrobiologiske metoder kan påvise levedygtige mikroorganismer, kan denne test påvise både levedygtige og ikke-levedygtige mikroorganismer samt frit mikrobielt DNA. Target-arterne vises i SeptiFast Master List (SML) i tabel 1. Disse arter blev påvist som positive med LightCycler SeptiFast Test MG i interne undersøgelser og/eller kliniske forsøg. Nogle af disse arter er dem, der oftest behandles utilstrækkeligt: Enterococcus spp., E. coli, Candida spp., Klebsiella spp (6). For nogle af target-arterne på SML-listen er en tidlig identifikation desuden vigtig, idet de medfører nogle af de infektioner, der er sværest at behandle: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Der påvises muligvis mere end én art i en prøve. Real-time PCR-resultatet er således et ekstra værktøj, der gør det lettere at foretage en tidlig klinisk vurdering. Tabel 1: SeptiFast Master List (SML) Gram (-) Gram (+) Fungi Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Koagulasenegative Staphylococci (arter, der repræsenterer gruppen CoNS, vises i tabel 8). 2 Arter, der repræsenterer gruppen Streptococcus spp., vises i tabel 8. 3 Arter, der ofte kaldes A. calcoaceticus-a. baumannii (Acb complex), påvises ikke (8). 1

PRINCIPPER FOR PROCEDUREN LightCycler SeptiFast Test MG er baseret på 3 hovedprocesser: Prøveforberedelse med mekanisk lysis og oprensning af DNA Real-time PCR-amplifikation af target-dna i 3 parallelle reaktioner (gram-positive bakterier, gram-negative bakterier, fungi) og detektion med specifikke hybridiseringsprober Automatisk identifikation af arter og kontroller Forberedelse af prøver Den mekaniske lysis af prøverne udføres ved hjælp af SeptiFast Lys Kit MGog MagNA Lyser-instrumentet. Med SeptiFast Prep Kit MG inkuberes de lyserede prøver ved en forhøjet temperatur med en protease- og kaotropisk lysisbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter den frigivne DNA fra DNAser i blod. En defineret mængde intern kontrol (IC) tilsættes til hver prøve sammen med lysisreagenset. Den interne kontrol består af syntetiske dobbeltstrengede DNA-molekyler med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i targetsekvenserne. Den interne kontrol indeholder unikke H-probebindingsregioner, der gør det muligt at skelne den amplificerede interne kontrol fra det targetspecifikke amplikon. Efter tilsætning af en bindingsbuffer overføres blandingen til en centrifugeringskolonne med en filterindsats af glasfiber. Det humane genom og bakterie-/fungi-target-dna'et bindes til glasfiberets overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes i to vasketrin. Efter fuldførelse af vasketrinene elueres de adsorberede nukleinsyrer ved en forhøjet temperatur. Der udføres PCR-analyse på eluaterne. Real-time PCR-amplifikation og -detektion Valg af mål ITS-regionen (Internal Transcribed Spacer) er valgt som targetregion for differentieringen af bakterie- og svampearterne. Den har en højere analytisk sensitivitet end gener i enkeltkopier, idet der er flere operoner i bakterie- og svampegenomerne. ITS er derudover mere artsspecifik end ribosomale RNA'er og er derfor bedst egnet til artsdifferentiering. Den findes mellem de ribosomale DNA-sekvenser 16S og 23S i alle gram(+) og gram(-) bakterier samt mellem de ribosomale DNA-sekvenser 18S og 5,8S i alle svampearter. Amplifikation Før PCR-amplifikationen reduceres risikoen for amplikon-kontaminering ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzymet. Det registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. De behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen, der indeholder "kickstart" Taq-polymerase i LightCycler -kapillærrørene (100 µl) MG, hvori PCR-amplifikationen foregår. Hvert target for de specifikke arter amplificeres med generiske eller specifikke primere. Der amplificeres samtidig en blanding af targets i reagenskontrollerne (RC'erne). Real-time detektion af PCR-produkter med H-prober Amplikonet detekteres ved fluorescens ved hjælp af et specifikt H-probepar. Disse fluorescensmærkede H-prober hybridiseres til en intern sekvens af det amplificerede fragment under annealingfasen i amplifikationscyklussen. Den udsendte fluorescens måles af LightCycler 2.0-instrumentet i en af de fire forskellige detektionskanaler. Efter amplifikationen foretages en smeltekurveanalyse. Smeltetemperaturen T M er afhængig af længde, sekvens og graden af homologi mellem proben og target-dna. Proberne er udviklet til at skelne arterne efter deres T M, som detekteres i en kanal. Automatisk identifikation af arter og kontroller Smeltetemperaturerne (T M 'er) for prøverne og kontrollerne analyseres af særligt udviklet identifikationssoftware (SeptiFast Identification Software), og der genereres en rapport. Lave koncentrationer af koagulasenegative Staphylococci (CoNS) og Streptococci, som viser variationen af kontamineringer i arbejdsgangen, vises ikke som et resultat. Hvis resultatet er positivt for Staphylococcus aureus, bør det overvejes at foretage en efterfølgende meca-resistensanalyse. Yderligere oplysninger findes i pakningsindlægget til LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). REAGENSER SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 test LM (Lysis Matrix) 100 x mikropartikler af glas/keramik SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 test [1] LB (lysisbuffer) < 50 % guanidiniumthiocyanat 20 % Triton X-100 Sundhedsskadelig 20 x 1500 µl [2] PK (proteinase K) 2 % proteinase K Glycerol [3] BB (bindingsbuffer) < 50 % guanidiniumthiocyanat 20 % Triton X-100 [4] IRB (Inhibition Removal-buffer) < 50 % guanidinium-hcl < 40 % ethanol Sundhedsskadelig Sundhedsskadelig Sundhedsskadelig 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 10 x 1800 µl 2

SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 test [5] WB (vaskebuffer) < 0,2 % natriumklorid < 80 % ethanol Meget brandfarlig 10 x 1600 µl [6] EB (elueringsbuffer) 10 x 400 µl BET (Blood Extraction Tubes) 1 x 50 FC (Filter Columns) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 test [1a] RM 1a (reaktionsmix 1a) 3 U/µl FastStart Taq-polymerase 3 x 27 µl < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym [1b] RM 1b (reaktionsmix 1b) < 1% Brij < 0,1 % magnesiumopløsning < 0,1 % dntp [2] DM G+ (gram-positivt detektionsmix) < 0,001 % primer, prober til G+ < 1 % Brij [3] DM G- (gram-negativt detektionsmix) < 0,001 % primer, prober til G- < 1 % Brij [4] DM F (detektionsmix, fungi) < 0,001 % primer, prober til F < 1 % Brij [5] RC G+ (gram-positiv reagenskontrol) < 0,001 % DNA-kontrolskabelon til G+ EDTA [6] RC G-(gram-negativ reagenskontrol) < 0,001 % DNA-kontrolskabelon til G- EDTA [7] RC F (reagenskontrol, fungi) < 0,001 % DNA-kontrolskabelon til F EDTA [8] IC (intern kontrol) < 0,001 % DNA i behandlingskontrolskabelon til G+, G-, F EDTA [9] NC (negativ kontrol) < 35 % polyethylenglykol 10000 3 x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set v1.1 P/N: 04 705 220 001 1 x SeptiFast Identification Software v1.1 SeptiFast Macro v1.0 SeptiFast meca Macro v1.0 SeptiFast MCC Macro v1.0 SeptiFast Proof Files v1.1 3

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Generelle advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostik. Denne test er kun beregnet til brug med humant blod, der er indsamlet i K-EDTA. Brug ikke mundpipette. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend pulverfri engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. Reagenser fra forskellige lotnumre må ikke blandes. Reagenser fra forskellige kit må ikke blandes, bortset fra dem der kræves til Master Mix. Ubrugte reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (MSDS) hos Roche. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) og CLSI-dokument M29-A (9). Rengør og desinficer alle arbejdsflader og handsker grundigt med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ). Kontroller, at handskerne er resistente over for DNA-dekontamineringsreagenset. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med lysisbuffer (LB) og bindingsbuffer (BB). Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Ellers kan der opstå ætsninger. Hvis der spildes reagens, skal der fortyndes med vand, før det tørres op. Lysis- og bindingsbuffer (LB og BB) må ikke komme i kontakt med hypoklorit (blegemiddel). Denne blanding kan danne en meget giftig gas. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i præamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Præamplifikationsaktiviteter omfatter reagens- og prøveforberedelse. Forbrugsartikler og udstyr skal være specielt beregnet til præamplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i alle områder, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og forbrugsartikler, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til prøveeller kontrolforberedelsesaktiviteter eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre target-dna-kilder. Forbrugsartikler og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i post-amplifikationsområdet. Tilstedeværelsen af AmpErase-enzym i Master Mix reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra positive kontroller og positive prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. Specifikke advarsler og forholdsregler for brug af LightCycler SeptiFast Test MG DNA fra target-organismerne i LightCycler SeptiFast Test MG er til stede i miljøet. For at undgå falsk-positive resultater ved detektion af DNA fra det omgivende miljø (DNA-kontaminering), er det nødvendigt at etablere en arbejdsgang, der er fri for kontaminerende DNA. Især operatøren kan være kilde til DNA-kontaminering, idet den menneskelige hud og de øvre luftveje indeholder mikroorganismer, der er de samme target-organismer som dem i LightCycler SeptiFast Test MG [f.eks. Streptococci og koagulasenegative Staphylococci (CoNS)]. Følgende principper er anbefalinger for at undgå DNA-kontaminering. Reagenser og engangsmaterialer i LightCycler SeptiFast Test MG Reagenserne og engangsmaterialerne i LightCycler SeptiFast Test MG er af MG-kvalitet. MG-produkter er udviklet til meget følsom nukleinsyredetektion af bakterier og svampe. Der er udviklet proprietære fremstillingsprocesser for at eliminere DNA-kontaminering, der kan påvirke disse analyser. Undgå unødvendig åbning og lukning af reagensflasker. Beskyttelsestøj og handsker Anvend pulverfri handsker under hele arbejdsgangen. Undgå kontakt med huden, og bær handsker ud over laboratoriekitlens ærmer. Skift straks handsker, hvis de kontamineres, eller behandl dem med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008. Handskerne skal være resistente over for reagenset). Undgå at berøre handskernes håndflade og fingre, når de tages på. Vedligeholdelse af laminar flow-udstyr Rengør arbejdsfladerne på laminar flow-udstyret med DNA-dekontamineringsreagens efter hver prøveforberedelse. Bemærk! Kontroller, at udstyret er resistent over for DNA-dekontamineringsreagens. Rengør alle indvendige overflader i laminar flow-udstyret med jævne mellemrum (vægge, området under bundpladen, gulvpladen). Kontroller, at laminar flow-udstyret er DNA-frit, hvis det bruges af flere brugere. Tænd for UV-lampen i mindst 30 minutter, før arbejdet påbegyndes. Sluk for UV-lampen under arbejdet. Vedligeholdelse af PCR-arbejdsstation Rengør arbejdsfladerne på PCR-arbejdsstationen med DNA-dekontamineringsreagens efter hver PCR-opsætning. Rengør alle indvendige overflader på PCR-arbejdsstationen med jævne mellemrum. Tænd for UV-lampen i mindst 30 minutter, før arbejdet påbegyndes. Kontroller, at UV-lampen er slukket, mens der arbejdes. Bemærk! Udskift UV-lampen til laminar flow-udstyret og PCR-arbejdsstationen i overensstemmelse med producentens anvisninger. Håndtering af enheder og hjælpematerialer Lad så vidt muligt de specifikke hjælpematerialer og enheder, der bruges til LightCycler SeptiFast Test MG, blive i laminar flow-skabet. Belys alle elementer med UV-lampen i mindst 30 minutter, før arbejdet påbegyndes. Brug kun DNA-fri engangsmaterialer (f.eks. MG-kvalitet. Se afsnittet Nødvendige, men ikke medfølgende materialer). Brug dem kun én gang. Brug Capping Tool til lukning af kapillærrør (se brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet for at få oplysninger om håndtering). Se brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet (i kapitlet "Vedligeholdelse"), hvis der sker brud på kapillærrør. 4

Forholdsregler under pipettering Åbn kun reagensflasker samt æsker med pipettespidser og kapillærrør under laminar flow-udstyret. Undgå at bruge de samme pipettespidser og kapillærrør uden for laminar flow-udstyret. Undgå at berøre kanten eller gevindet på en åben flaske. Under pipettering skal flasken berøres under kanten. Undgå at berøre kanten på et åbent kapillærrør. Arranger alle de emner, der bruges til procedurerne under laminar flow-udstyret, i logisk rækkefølge (undgå pipettering på kryds og tværs). Hvis der spildes, færdiggøres den igangværende arbejdsopgave, og arbejdsområdet behandles straks efter med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ). KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING SeptiFast Lys Kit MG Opbevares ved 15 til 25 C. Flasker må kun åbnes én gang. De må ikke genbruges. Brug ikke materialer efter udløbsdatoen. SeptiFast Prep Kit MG Opbevares ved 15 til 25 C (må ikke nedfryses eller opbevares i køleskab). PK'et må højst åbnes 3 gange. De øvrige flasker må kun åbnes én gang. Kasser eventuelle ubrugte reagenser. Reagenser fra forskellige lot må ikke bruges i samme ekstraktionskørsel. Brug ikke materialer efter udløbsdatoen. LightCycler SeptiFast Kit MG Opbevares ved -15 til -25 C. Opbevares på et mørkt sted. Master Mix (blandinger af [1a], [1b] og [2] eller [3] eller [4]) opbevares ved 2 til 8 C i højst 3 dage. RC opbevares efter brug ved 2 til 8 ºC i op til 10 dage eller nedfryses straks ved -15 til -25 C efter hver brug. RC må højst åbnes 6 gange. De øvrige flasker må kun åbnes én gang. Kasser eventuelle ubrugte reagenser. Reagenser fra forskellige lot må ikke bruges i samme PCR-kørsel. Brug ikke materialer efter udløbsdatoen. MEDFØLGENDE MATERIALER SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 test SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 test LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 test SeptiFast Software Set v1.1 (medfølger én gang) P/N: 04 705 220 001 NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Kan købes hos Roche LightCycler 2.0-instrument og software 4.05.415 03 531 414 201 LightCycler -kapillærrør MG (100 µl) 03 612 066 001 LC Carousel Centrifuge 2.0 03 709 582 001 MagNA Lyser-instrument (230 V) 03 358 976 001 LightCycler Multicolor Compensation Set 04 484 355 001 SeptiFast-køleblok 04 555 864 001 Kan eventuelt købes hos andre producenter Centrifuge med swingout-rotor til 15 ml rør min. 4200 g (f.eks. Eppendorf) 1x centrifuge 5810 2 x adaptere (1 par) med elementer til 15 ml rør med konisk bund 1 x swingout-rotor min. 4200 x g Centrifuge (f.eks. Eppendorf) 1x MiniSpin 2 termomixere (f.eks. Eppendorf) 2 x Thermomixer Comfort inkl. 1 x termoblok til 24 x 2,0 ml flasker og 1 x termoblok til 8 x 15 ml flasker Rør-/flaske-rullemixer (f.eks. Stuart Scientific) 1 x rullemixer 1 x vortex-mixer VWR International 521-0076 521-0061 521-0044 VWR International 521-0012 VWR International 460-1112 460-1116 460-1120 VWR International 445-5210 444-1372 5

DNA-fri flasker og spidser (f.eks. MG-engangsmaterialer, greiner bio-one) 5 ml filterspidser MG 1 ml filterspids MG 100 µl filterspids MG 20 µl filterspids MG 1 ml serumpipette MG 1,5 ml rør MG DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. biodelta GmbH) LTK-008 -sæt Pipette, 1-5 ml (f.eks. Thermo Life Sciences) 1x Finnpette, 1-5 ml Pipette, 10-1000 µl (f.eks. Eppendorf) 2 x referencepipette, 100-1000 µl 2 x referencepipette, 10-100 µl 1 x referencepipette, 2-20 µl (kun til meca-analyse) Laminar flow-skab (f.eks. Cleanair) BioSafety Cabinet EF 4E PCR-arbejdsstation (f.eks. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Biocap Passive DNA PCR-kabinet Positiv kontrol-materiale Leveres af andre producenter eller forberedes i brugerens laboratorium (se afsnittet Forslag til forberedelse af positivt kontrol-materiale). greiner bio-one 940525MG 750289MG 772289MG 774289MG 700371MG 616202MG biodelta GmbH 200-000 VWR International 613-2541 VWR International 613-3650 613-3649 613-3647 VWR International 135-0055 VWR International 135-6576 INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. Indsamling af prøver LightCycler SeptiFast Test MG er kun beregnet til brug med K-EDTA-blodprøver. Blod skal indsamles i sterile rør med K-EDTA som antikoagulerende middel. Transport og opbevaring af prøver Transport af fuldblod skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer(10). Fuldblod skal transporteres/opbevares ved -15 til -25 C eller ved 2 til 8 C i op til 3 dage eller ved 15 til 25 C i op til 4 timer. Holdbarhed af eluater Brug de behandlede prøver straks efter DNA-oprensning. Én afmålt mængde kan om nødvendigt opbevares til forberedelse af en efterfølgende meca-analyse (se LightCycler SeptiFast meca Kit MG for at få yderligere oplysninger). Eluater kan opbevares ved -15 til -25 C i op til 30 dage eller ved 2 til 8 C i op til 8 dage eller ved 15 til 25 C i op til 4 timer. BRUGSVEJLEDNING Før start af prøve- og kontrolforberedelse Forberedelse af LightCycler 2.0-instrumentet og PCR-arbejdsstationen Farvekompensation: Brug LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001). Hvis farvekompensationsfilen er udløbet, forberedes en ny fil. Se pakningsindlægget til LightCycler Multicolor Compensation Set for at få yderligere oplysninger. Installation af SeptiFast Identification Software (SIS): Ved installation af opdateringer skal det kontrolleres, om der følger yderligere oplysninger med produktet. 1. Log på LightCycler -datastationen som administrator. 2. Indsæt SeptiFast Software Set-cd'en i cd-rom-drevet på LightCycler -datastationen. 3. Ved første installation: Hvis Microsoft.NET 1.1 Framework ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af SIS-installationen. Microsoft.NET 1.1 Framework skal være installeret. Ellers kan SIS ikke køre korrekt. 4. Klik på <OK> for at starte installationen af SIS. Følg instruktionerne i guiden. 5. Vælg <just me>, hvis der kun skal arbejde én bruger på LightCycler -datastationen, og vælg <everyone>, hvis flere brugere skal benytte LightCycler -datastationen. 6. Bekræft vinduet <Setup succeeded> ved at klikke på <OK> (SIS kan herefter startes fra skrivebordet ved at klikke på ikonet). 7. Datamappen til *.ixo-filer: <C:\Export to SIS> oprettes automatisk. Test af korrekt installation af SIS (test med LightCycler SeptiFast Test MG og LightCycler SeptiFast meca Kit MG: 1. Alle proof-filer kopieres automatisk fra SeptiFast Software Set-cd'en til mappen <C:\Export to SIS>. 2. Dobbeltklik på ikonet SIS på skrivebordet, og tryk på <Start>. 3. Vælg proof-filen fra <C:\Export to SIS> (hhv. SeptiFast Proof 1.0.ixo eller SeptiFast meca Proof 1.0). 4. Vælg "NO" til spørgsmålet, om LightCycler -rapporten skal vise markeringen <User Developed or Modified Test Method>. 5. Filen analyseres automatisk, og dataene vises. 6. Udskriv rapporten. 7. Åbn og udskriv de tilhørende pdf-filer (hhv. SeptiFast Proof v1.1.pdf eller SeptiFast meca Proof v1.1.pdf). 8. Den udskrevne rapport og den udskrevne proof.pdf skal stemme overens. Kontakt den lokale Roche-repræsentant, hvis dette ikke er tilfældet. 9. Udfør trin 3-8 med den anden proof-fil. 6

Afinstallation af SIS: 1. Log på LightCycler -datastationen som administrator. 2. Klik på <Start> på proceslinjen på LightCycler -datastationen. 3. Vælg <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs>. 4. Der vises en liste over de programmer, der er installeret i øjeblikket. Klik på <SIS>. 5. Vælg <Remove>, og bekræft med <Yes>. Installation af SeptiFast-makroer: 1. Installer makroerne fra SeptiFast Software Set-cd'en. 2. Se brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet ("til in vitro-diagnostik") for at få yderligere oplysninger om installation af makroer. Forberedelse af laminar flow-skab og PCR-arbejdsstation 1. Rengør og dekontaminer laminar flow-skabet og PCR-arbejdsstationen grundigt (f.eks. med LTK-008 ). 2. Tændes i mindst 30 minutter: UV-lampen og luftstrømmen i laminar flow-skabet, UV-lampen til PCR-arbejdsstationen. 3. Sluk for UV-lampen under arbejdet. 4. Åbn LightCycler SeptiFast Kit MG, og udtag følgende: 1 flaske IC og 1 flaske NC. Lad dem tø op ved 2 til 8 C i et rack til prøveforberedelse (medfølger ikke). 1 flaske RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F. Lad dem tø op i en SeptiFast-køleblok ved 2 til 8 C under prøveforberedelsen. 5. Tænd for: Termomixer 1 (til 15 ml rør), og juster den til 56 C, termomixer 2 (til 1,5 ml rør), og juster den til 70 C. 6. Anbring et tilstrækkeligt antal flasker med EB (1 flaske pr. prøve/nc) i termomixer 2 (70 C). 7. Anbring blodprøverørene eller prøveflaskerne i rullemixeren, og mix i 30 minutter. Prøverne behandles straks. Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Alle håndteringstrin skal udføres i laminar flow-skabet. Forslag til forberedelse af positiv kontrol-materiale Alle trin skal færdiggøres, når prøveforberedelsesproceduren er påbegyndt. Positiv kontrol-materiale kan købes hos andre producenter. Hvis materialet forberedes i brugerens laboratorium, bør der udvælges veldefinerede kliniske isolater i overensstemmelse med den lokale forekomst og kliniske virkning. Disse isolerede kolonier skal resuspenderes og beriges i negativt blod til en koncentration på ca. 300 CFU/ml. Som positiv kontrol kan ATCC-materiale 33592, der er en methicillinresistent S. aureus benyttes. Det giver også mulighed for at benytte eluatet som positiv kontrol for LightCycler SeptiFast Test MG og LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Strengen blev dyrket i 18-24 timer ved 28 til 37 C på blodagar (5 % blod fra får) og resuspenderes i buffer til 0,5 McFarland (~1,5 x 10 8 CFU/ml). Denne opløsning beriges i negativt blod til en slutkoncentration på 300 CFU/ml. Prælysis-procedure med SeptiFast Lys Kit MG Bemærk! Læs brugerhåndbogen til MagNA Lyser-instrumentet grundigt. 1. Brug 1 relevant mærkede flaske med LM til hver prøve eller negativ kontrol. 2. Åbn flasken, og overfør 1500 µl prøveblod eller negativ kontrol. 3. Luk røret omhyggeligt. Bemærk! Undgå at mærke rørene på toppen af låget. 4. Prøverne prælyseres i MagNA Lyser-instrumentet i 70 sekunder ved 7000 o/min. 5. Lad flaskerne stå uden for instrumentet i 10 minutter. De må ikke centrifugeres! Prøveforberedelse med SeptiFast Prep Kit MG Bemærk! Alle reagenser skal være klare opløsninger. Hvis der er dannet bundfald, skal opløsningen opvarmes (til maks. 37 C). Ryst forsigtigt, indtil bundfaldet opløses. 1. Tilsæt 150 µl PK i BET 1. 2. Tilsæt 1 ml prælyseret prøve eller NC til BET 1. Undgå at pipettere fast lysismatrix eller skum. 3. Sæt låg på rørene, og bland dem kortvarigt på vortex-mixer. 4. Tilsæt 10 µl IC. Brug en ny pipettespids til hver prøve eller NC. 5. Tilsæt indholdet fra 2 flasker LB, sæt låg på flaskerne, og bland straks grundigt på vortex-mixer. 6. Inkuber i 15 minutter ved 56 C, og bland forsigtigt (f.eks. ved 500 o/min. med Eppendorf-termomixer). Bemærk! Al væsken i BET 1 skal være dækket af inkubationsenheden. 7. Tilsæt indholdet fra 1 flaske BB, sæt låg på, og bland på vortex-mixer. 8. Anbring FC på BET 2. Undgå at røre ved indersiden eller tuden på FC. 9. Afpipetter halvdelen af prøveforberedelsesblandingen fra BET 1 på FC-filteret FC (ca. 2,7 ml). 10. Sæt låg på BET 2-FC-enheden, og centrifuger den i 1 minut ved 1900 x g. 11. Afpipetter den resterende prøveforberedelsesblanding fra BET 1 i FC-filteret FC (ca. 2,7 ml). Brug en ny pipettespids til hver prøve eller NC. 12. Sæt låg på BET 2-FC-enheden, og centrifuger den i 3 minutter ved 1900 x g. 13. Anbring FC på BET 3. Kasser BET 2 med gennemløb. 14. Tilsæt indholdet af én flaske IRB i FC-filteret i BET 3. 15. Sæt låg på BET 3-FC-enheden, og centrifuger den i 2 minutter ved 4200 x g. 16. Tilsæt indholdet af én flaske WB i FC-filteret i BET 3. 17. Sæt låg på BET 3-FC-enheden, og centrifuger den i 10 minutter ved 4200 x g. 18. Anbring FC på BET 4. Kasser BET 3 med gennemløb. 19. Centrifuger BET 4 i 1 minut ved 4200 x g. 20. Anbring FC på BET 5. Kasser BET 4. 21. Afpipetter 300 µl forvarmet EB (70 C) midt i FC. 22. Sæt låg på, og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. 23. Centrifuger i 2 minutter ved 4200 x g. 24. Kasser FC. Overfør eluatet i 1,5 ml flasker (f.eks. med serumpipetter fra greiner bio-one). Undgå kontakt med siderne af flaskerne. 7

Reagensforberedelse med LightCycler SeptiFast Kit MG Bemærk! Det anbefales at udføre alle håndteringstrin på PCR-arbejdsstationen et andet sted end prøveforberedelsen. 1. Fjern SeptiFast-køleblokken med reagensflasker fra køleskabet, dekontaminer med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ), og overfør den til PCR-arbejdsstationen. 2. Bland de optøede reagenser kortvarigt på vortex-mixer (bortset fra RM 1a), og centrifuger alle reagenser (hvis der er dannet bundfald, opvarmes opløsningen ved 37 C i 5 minutter og blandes forsigtigt, indtil bundfaldet er opløst). 3. Anbring flaskerne med de optøede reagenser og flaskerne med eluat på de angivne positioner i SeptiFast-køleblokken. 4. Åbn flaskerne RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- og DM F. 5. Afpipetter 600 µl RM 1b i RM 1a, og mix forsigtigt ved at pipettere op og ned. 6. Afpipetter 200 µl reaktionsmix fra 1a i hver flaske med DM G+, DM G- og DM F til fremstilling af Master Mix MM G(+), MM G(-) og MM F. Mix forsigtigt ved at pipettere op og ned. Forberedelse af PCR-reaktioner 1. Anbring det nødvendige antal kapillærrør i SeptiFast-køleblokken, 3 kapillærrør til RC'erne (position 1, 2, 3), 3 kapillærrør til NC-eluat (position 4, 5, 6), 3 kapillærrør for hver prøveeluat (position 7 og opefter). 2. Afpipetter 50 µl MM G(+) i hvert kapillærrør i øverste række. 3. Afpipetter 50 µl MM G(-) i hvert kapillærrør i midterste række. 4. Afpipetter 50 µl MM F i hvert kapillærrør i nederste række. 5. Åbn den første flaske med prøveeluat. Start med flasken i højre side af SeptiFast-køleblokken. 6. Afpipetter 50 µl prøveeluat i hvert af de tre øverste kapillærrør, der indeholder MM G(+), MM G(-) og MM F. Bemærk! Skift spids efter hvert pipetteringstrin. 7. Luk de tre kapillærrør med Capping Tool (en del af LightCycler 2.0-instrumentet. Se brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet for at få yderligere oplysninger). 8. Fortsæt med de resterende prøveeluater som beskrevet i trin 5-7. Afpipetter NC-eluatet sidst i kapillærrørene i position 4, 5 og 6. 9. Åbn RC G+. 10. Afpipetter 50 µl i kapillærrøret i position 1. 11. Luk kapillærrøret, og luk flasken med RC G+. 12. Afpipetter RC G- og RC F i kapillærrørene i hhv. position 2 og 3 som beskrevet i trin 9-11. 13. Overfør alle kapillærrør til LightCycler -prøvekarrusellen i henhold til deres nummer. 14. Centrifuger LightCycler -prøvekarrusellen med LC Carousel Centrifuge 2.0. 15. Anbring LightCycler -prøvekarrusellen i LightCycler 2.0-instrumentet. Opbevaring af resterende reagenser og eluater 1. Mærk de eventuelle ubrugte Master Mix-opløsninger, MM G(+), MM G(-) og MM F, med nummeret på de resterende reaktioner samt datoen. Anbring flaskerne i de tilsvarende positioner i SeptiFast-køleblokken. 2. Master Mix MM kan opbevares ved 2 til 8 C i op til 3 dage. Til næste kørsel kan det opbevarede Master Mix (MM) fyldes med frisk MM for at fremstille den nødvendige mængde arbejdsopløsning. Denne opløsning skal bruges straks. 3. Mærk prøve- og NC-eluaterne med kørselsnummer og dato, og opbevar dem som anbefalet. 4. Kasser de tomme reagensflasker. Indsættelse og betjening af LightCycler 2.0-instrumentet Bemærk! Det anbefales at udføre kørsler på LightCycler 2.0-instrumenter i et lokale, der er adskilt fra DNA-oprensning og forberedelse af arbejdsopløsninger. 1. Start SeptiFast-makroen "SeptiFast_1.0_04469046001" eller højere (se kapitlet "Kørsel af Roche-makroer" i brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet). Bemærk! Hvis brugeren er logget af, må kørslen ikke fortsættes. Start en ny kørsel med et nyt navn. Bemærk! Undgå at bruge feltet <assay lot number>. Hvis analyselotnummeret skal føjes til kørslen, skal oplysningerne indtastes i det respektive felt i prøveeditoren. 2. Gem kørslen med et navn, der giver mulighed for entydig identifikation (f.eks. brugernavn og dato). 3. Reducer antallet af prøver fra standardprøveindsættelseslisten, hvis der kræves mindre end 7 prøver. Slet alle 3 kapillærrør fra en prøve på listen, ikke kun 1 eller 2 af de 3 parallelle analyser. Undgå at tilføje kapillærrør, hvis der ved et uheld slettes for mange af dem, men start proceduren forfra. 4. Der kan indtastes patientspecifikke data i <parenteser> i stedet for at bruge standardindstillinger [f.eks. G(+) <Navn_01> i stedet for G(+) <prøve 1>]. Teksten skal være identisk inden for de 3 parallelle analyser på prøvelisten for at sikre, at prøverne genkendes korrekt af SIS. Som alternativ kan standardindstillingerne benyttes, og om nødvendigt kan <Run Note> bruges til at indtaste data. 5. Når alle de prøvespecifikke oplysninger er tilføjet, skal der fortsættes med kitguiden og kørslen på LightCycler 2.0-instrumentet. Bemærk! Undgå at ændre præfiks G(+), G(-) og F. Undgå at ændre navne på reagenskontroller [f.eks. G(+) #RC#] og negative kontroller [f.eks. G(+) #NC#]. 6. Når kørslen er fuldført, kontrolleres væskeniveauet i kapillærrørene (resultaterne for et kapillærrør er ugyldige, hvis mængden i kapillærrørene varierer). Detektion af top og automatisk identifikation af arter. Generel forklaring af analysemoduler Bemærk! Undgå at starte dataanalyse under kørsel på LightCycler 2.0 Instrument. Manuel T M calling kræver 12 T M calling-moduler (3 analyser, 4 kanaler). Modulerne Absolute Quantification kræver ikke manuel betjening. Manual T M calling kan udføres for op til 6 toppe ved hjælp af T M -søjler. T M -søjlerne i hvert analysemodul er prædefineret i SeptiFast-makroen. I smeltetopvinduet vises alle kurver i de valgte grafer. T M -søjler uden en markering kan vælges eller fravælges. 8

Baselines i hvert analysemodul er prædefineret i SeptiFast-makroen. Undgå at ændre eller fravælge baselines. Hvis de ved et uheld ændres, skal de korrekte værdier indtastes fra tabel 3: Baseline-værdier. Hvis mere end ét kapillærrør aktiveres, vises indstillingerne for det første kapillærrør i afkrydsningsfeltet. Ændringer af søjlerne påvirker alle de aktiverede kapillærrør. Bemærk! Undgå at ændre følgende indstillinger: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> og <Peak Width>. Indstillingen <Display - Peak Height> kan vælges. Toppe defineres som maksima over baseline. Fremspring er ikke toppe. RC G-, Channel 610 (f.eks. figur 1, graf 2) og 670 samt RC F, Channel 705 er undtagelser. I graf 1 er de to toppe til venstre maksima og skal markeres med skydere. I graf 2 er en af toppene (f.eks. den anden top) vist som et fremspring, men skal også markeres. I graf 3 og 4 mangler en af toppene. Der skal kun aktiveres to og ikke tre skydere. Figur 1: RC G-, CH 610 Graf1 Graf 2 Graf 3 Graf 4 T M -skyderne skal vælges i de gyldige T M -områder (se tabel 2). Tabel 2: T M -områder for gyldige toppe CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Lav T M [ C] Høj T M [ C] Lav T M [ C] Høj T M [ C] Lav T M [ C] Værdierne for baselines er prædefineret i henhold til nedenstående tabel og må ikke ændres. (Hvis de ændres ved et uheld, indtastes værdierne igen i henhold til tabellen, ellers markeres kørslen). Høj T M [ C] Justering af T M -søjlerne 1. Efter kørslen er fuldført, viser forsøgsguiden meddelelsen <Analyses have been created>. 2. Gå til nederste vindue (undgå at trykke på <Finish>). 3. Sørg for, at T M - og baseline-værdierne er synlige. 4. Klik på analysemodulet [f.eks T M Calling G(+) 610]. 5. Aktiver alle positioner i analysen for at få et overblik [f.eks. G(+)]. 6. Klik kun på positionen G(+) #RC#. 7. Juster T M -søjlerne til topmaksimum over baseline, og fokuser kun på de gyldige T M -områder (se tabel 2: T M -områder for gyldige toppe). Hvis der ikke er en top over baseline, skal T M -søjlen slettes (afkrydsningen slettes i det relevante felt). Ved slutningen af T M Calling for et bestemt kapillærrør må der kun være topmaksima med T M -søjler. I visse tilfælde kan lave koncentrationer af E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8-55,9) og C. albicans (F, CH 640, T M 53,4-57,5) vise sig som fremspring på de respektive IC-toppe (G+, CH 705, T M 45,5-49,6; F, CH 640, T M 44,8-48,0). Marker disse fremspring med T M -søjler ved T M 53,9 (G+, CH 705) og T M 55,5 (F, CH 640). 8. Aktiver næste position [f.eks. G(+) #NC#] sammen med G(+) #RC# for at få et overblik (den automatiske skalering vil justere efter den højeste top). 9. Aktiver kun den valgte position [f.eks. G(+) #NC#] (den automatiske skalering vil justere efter baggrundstoppene for NC. Baseline er muligvis ikke længere synlig). 10. Fortsæt med detektion af toppene som beskrevet i trin 5-7. 11. Efter fuldførelse af analysen af én test [f.eks. T M Calling G(+) 610] fortsættes med næste som beskrevet i trin 4-10. Fuldfør T M Calling 1. Skift forsøgsguide til midten af skærmen, og tryk på <Finish>. 2. Der genereres automatisk en rapport, som udskrives. 3. Kørslen gemmes automatisk. Lav T M [ C] Høj T M [ C] G(+) 48 53 49 64 49 59 45 65 G(-) 52 66 55 69 48 65 57 62 F 56 61 44 58 49 62 51 62 Tabel 3: Baseline-værdier CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G(-) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059 9

Bemærk! Hvis der foretages ændringer i de patientspecifikke data i området i parentes i LightCycler -softwaren, skal operatøren opdatere databasen ved at vælge og klikke på ikonerne "Abs Quant G(+) 610" og "Abs Quant G(+) 640". 4. Eksporter *.ixo-filen til <C:\Export to SIS>. 5. Kontroller rapporten for markeringer, og om <run state: complete> vises. 6. Hvis der vises markeringer eller andre meddelelser for kørselstilstanden, er kørslen ugyldig, og alle prøver skal analyseres igen. Automatisk identifikation af toppe med SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Dobbeltklik på ikonet SIS på skrivebordet, og tryk på <Start>. 2. Vælg kørslen fra mappen <C:\Export to SIS>, og indlæs *.ixo-filen. 3. Vælg "Yes" eller "No" for at beslutte, om LightCycler -rapporten skal vise markeringen <User Developed or Modified Test Method>. 4. *.ixo-filen analyseres automatisk, og dataene vises i en rapport. 5. Udskriv SIS-rapporten. RESULTATER Fortolkning af resultater FLAGS (markeringer) og COMMENTS (kommentarer) genereres af SeptiFast Identification Software (SIS) som RUN FLAGS, ASSAY FLAGS og FLAGS i feltet SPECIMEN (se nedenfor). Operatøren skal markere kørselsudskrifterne for FLAGS eller COMMENTS i alle felter. Figur 2: Feltet Specimen Specimen Assay Data Result Flags Comment G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <species> SeptiFast prøve 1 G(-) F Yderligere oplysninger findes i felterne COMMENT under RUN FLAGs og ASSAY FLAGs. Prøveresultater Navnene på <species> i feltet RESULT angiver, at prøven er positiv for den relevante mikroorganisme. Rå data for de relevante toppe vises i feltet DATA, herunder kanal (CH), smeltepunkt (T M ), tophøjde (P H ) og skæringspunkt (CP 1 ). Symbolet i feltet RESULT betyder, at der ikke blev påvist nogen analyt i det definerede kriterium for arterne. 1 CP vises kun for G(+), kanal 610 og 640. meca-test Hvis resultatet er positivt for Staphylococcus aureus, bør det overvejes at foretage en efterfølgende meca-resistensanalyse. Yderligere oplysninger findes i pakningsindlægget til LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Validering af kørsel Valideringen af kørslen foretages af SeptiFast Identification Software (SIS). Ugyldige kørsler vises automatisk og markeres med. Hele kørslen skal gentages. Kommentarerne til markeringerne og de tilhørende fortolkninger vises nedenfor. Tabel 4: Markeringer for validering af kørsel Comments 1 Fortolkning ASSAY FLAG NC: IC not detected Der blev ikke påvist target eller IC i NC. ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 2 >,< species > Der blev påvist en art i NC. ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Ekstra markering, hvis der blev påvist mere end 3 amplikoner i NC. ASSAY FLAG RC: No amplicon: <species> Et eller flere amplikoner i RC blev ikke påvist ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Ekstra markering, hvis mere end 3 amplikoner i RC ikke blev påvist. SPECIMEN FLAG IC not detected Intet target og ingen IC blev påvist. 1 Systemfejlene er angivet i afsnittet Fejlfinding. 2 Cp vises kun for G(+), kanal 610 og 640. KVALITETSKONTROL Der skal medtages én bestemmelse af den negative kontrol (NC) og én af hver af de 3 reagenskontroller (RC'er) i hver af de 3 parallelle analyser [G(+), G(-), F] for hver testkørsel. NC'erne og RC'erne skal placeres på de angivne positioner som beskrevet i afsnittet Forberedelse af PCR-reaktioner. Det anbefales at køre et Roche-materiale som positiv kontrol i hele arbejdsgangen (se afsnittet Nødvendige, men ikke medfølgende materialer). SIS-softwaren bestemmer resultatet af IC, NC og RC. Hvis kontrollerne ikke opfylder de angivne specifikationer, markeres alle prøveresultaterne under feltet SPECIMEN. Kontroller feltet SPECIMEN på kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er gyldig. Negativ kontrol (NC) Den negative kontrol skal være negativ, mens den interne kontrol skal være positiv. Hvis den negative kontrol ikke opfylder dette kriterium, markeres alle resultaterne for analysen. Hele kørslen skal gentages. Reagenskontroller (RC) Hver RC skal være positiv for amplikonmålene for RC. Hvis nogen RC ikke opfylder dette kriterium, markeres alle prøveresultaterne for analysen. Hele kørslen skal gentages. 10

Positiv kontrol Den positive kontrol skal være positiv. Hvis de positive materialer fra Roche eller de eksterne materialer ikke opfylder dette kriterium, er hele kørslen ugyldig. SIS-softwaren viser ingen markeringer. Intern kontrol (IC) Den interne kontrol skal være fundet positiv i alle de negative prøver samt den negative kontrol. Hvis den interne kontrol ikke opfylder dette kriterium, markeres prøveresultatet. Hvis der er ugyldige kontroller, gentages hele proceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion af alle 3 analyser). Hvis kontrollerne konstant er ugyldige, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. FEJLFINDING Tabel 5: Systemfejl vist som COMMENTS under RUN FLAGS og på SIS-udskriften Systemmeddelelse (vises i afsnittet med markeringer på SIS-udskriften) Mulig årsag Afhjælpning User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Kørslen er ugyldig. De mulige årsager er beskrevet i brugerhåndbogen til LightCycler 2.0-instrumentet. Standardindstillingerne for makroen (f.eks. baselines, kørselsprotokol osv.) skal muligvis ændres. Der er to eller flere forskellige aktive farvekompensationsfiler i et eller flere analysemoduler. Farvekompensationsobjektet er ældre end 6 måneder. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og kontroller baseline-værdierne i overensstemmelse med tabel 3. Gem og eksporter igen. Vælg den korrekte farvekompensation, og beregn igen. Opret et nyt farvekompensationsobjekt. Invalid Macro Der er anvendt en forkert makro. Kontroller den korrekte makro i LightCycler -softwaren og/eller SeptiFast Software Set. Invalid Baseline Baseline-værdierne er muligvis ændret ved et uheld. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og kontroller baseline-værdierne i overensstemmelse med tabel 3. Gem og eksporter igen. Invalid Control Tube En eller flere kontroller er navngivet forkert. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og kontroller indtastningen af kontrolnavne i prøveeditoren. Rediger navnene til standardnavne, gem og eksporter igen. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling Et eller flere prøvekapillærrør er navngivet forkert eller mangler. Der er anvendt en forkert version af LightCycler -softwaren til proceduren. Der er ikke udført manuel T M Calling (i prøver eller analysemoduler). Makroen er afsluttet uden analyse. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og kontroller indtastningen af prøvenavne i prøveeditoren. Rediger navnene til standardnavne, gem og eksporter igen. Åbn LightCycler -softwaren, og se efter det korrekte versionsnummer. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og udfør en manuel T M Calling. Gem og eksporter igen. + additional run flags Der er registreret mere end 5 kørselsmarkeringer. Prøv at afhjælpe de markeringer, der er specifikt beskrevet, og analyser kørslen igen med SIS-softwaren. Invalid CCC File Name Der er to eller flere forskellige aktive farvekompensationsfiler i et eller flere analysemoduler. Vælg den korrekte farvekompensationsfil, og beregn igen. Hvis der mangler en eller flere prøver på SIS-rapporten, skal det kontrolleres, om: 1) Et af de tre analysekapillærrør for en prøve er navngivet forkert, dvs. de analysespecifikke præfikser (G+, G-, F) er slettet ved et uheld, eller 2) Et eller flere prøvekapillærrør er navngivet forkert eller mangler. Åbn den originale *.ixo-fil i LightCycler -softwaren, og kontroller indtastningen af prøvenavne i prøveeditoren for at afhjælpe problemet. Rediger navnene til standardnavne, gem og eksporter igen. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE Denne test er kun valideret til brug med humant blod, der er indsamlet i det antikoagulerende middel K-EDTA. Test af andre prøvetyper kan resultere i ukorrekte resultater, falsk-negative eller falsk-positive resultater. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning, transport, opbevaring og behandling. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af LightCycler SeptiFast Test MG. Performance for LightCycler SeptiFast Test MG er fastlagt for blod med 1.000-30.000 WBC/µl. Den aktuelle taksomoni for mikroorganismer afhænger hovedsageligt af fænotypeklassificeringen (de biokemiske og fysiske egenskaber) og er muligvis ikke identisk med gentypebestemmelserne. I sjældne tilfælde kan prøver med store mængder target-dna af Streptococcus spp. give et falsk-negativt resultat. Selvom primere og prober er udformet efter de bedst konserverede regioner af ITS-regionen (Internal Transcribed Spacer), kan H-probernes targetspecifikke smeltetemperatur (T M ) påvirkes af variationen i vilkårlig rækkefølge, som findes i mikrobielle arter. 11

VURDERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE Interfererende stoffer Følgende stoffer påvirker ikke detektionen af bakterier og svampe i DNA med denne test. Tabel 6: Interfererende stoffer Nr. Handelsnavn Aktivt stof Producent 1x C max 3x C max enheder 1 Piperacillin Piperacillin Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Ceftazidim GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Imipenem/Cilastatin MSD Sharp & Dohme 0,27 0,67 mg/ml 4 Tazobac Piperacillin/Tazobactam Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Ciprofloxacin Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Vancomycin Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Gentamicin Merck 80,0 240,0 µg/ml 8 Zyvoxid Linezolid Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Clindamycin Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Metronidazol Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Fluconazol Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Caspofungin MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Amphotericin B Bristol-Myers Squibb 20,0 60,0 µg/ml 14 Novalgin Metamizol Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal Dexamethason Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Cytarabin cellpharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Norepinephrin (noradrenalin) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Glycerolnitrat Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium-5000- ratiopharm Heparin ratiopharm 0,83 2,5 IU/ml Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet for LightCycler SeptiFast Test MG blev analyseret ved hjælp af hit-rate-analyser af hver analyt i en fortyndingsserie på 100, 30 og 3 CFU/ml i EDTA-blod fra raske donorer (se tabel 7). Der blev opnået en minimumssensitivitet på 30 CFU/ml for alle arter, bortset fra Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae og Streptococcus mitis (100 CFU/ml). Tabel 7: Arter testet ved hjælp af hit-rate-analyse Target Antal positive/antal testet Target Antal positive/antal testet Koncentration [CFU/ml] Koncentration [CFU/ml] 100 30 3 100 30 3 Acinetobacter baumannii 8/8 12/12 11/20 Klebsiella pneumoniae 8/8 12/12 17/20 Aspergillus fumigatus 8/8 12/12 20/20 Proteus mirabilis 8/8 12/12 16/20 Candida albicans 8/8 12/12 12/20 Pseudomonas aeruginosa 8/8 12/12 5/20 Candida glabrata 8/8 12/12 10/20 Serratia marcescens 8/8 12/12 19/20 Candida krusei 8/8 12/12 8/20 Staphylococcus aureus 8/8 12/12 8/20 Candida parapsilosis 8/8 12/12 7/20 Staphylococcus epidermidis 1 8/8 1/12 0/20 Candida tropicalis 8/8 12/12 9/20 Staphylococcus haemolyticus 1 8/8 0/12 0/20 Enterobacter aerogenes 8/8 12/12 16/20 Stenotrophomonas maltophilia 8/8 12/12 18/20 Enterobacter cloacae 8/8 12/12 12/20 Streptococcus pneumoniae 8/8 7/12 1/20 Entercoccus faecalis 8/8 12/12 15/20 Streptococcus agalactiae 2 8/8 7/12 0/20 Entercoccus faecium 8/8 12/12 17/20 Streptococcus pyogenes 2 8/8 9/12 4/20 Escherichia coli 8/8 12/12 20/20 Streptococcus mitis 2 8/8 9/12 0/20 Klebsiella oxytoca 8/8 12/12 14/20 1 Arter, der repræsenterer gruppen CoNS fra SML i tabel 1. 2 Arter, der repræsenterer gruppen Streptococcus spp. fra SML i tabel 1. 12

Analytisk specificitet Inklusivitet For at påvise overensstemmelsen og homogeniteten i ITS-targetregionen blev der indsamlet kliniske isolater fra flere geografiske regioner i Europa (syd, midt og nord), Japan og i USA. I alt 1709 isolater blev karakteriseret ved hjælp af mikrobiologiske metoder og testet med LightCycler SeptiFast Test MG [se tabel 1 SeptiFast Master List (SML)]. Samlingen fra USA og Japan omfatter ikke Aspergillus fumigatus, Candida krusei og Staphylococcus haemolyticus. I gruppen af Streptococcus spp. og koagulasenegative Staphylococci (CoNS), blev arterne, der er afbildet i tabel 8, testet positive med LightCycler SeptiFast Test MG. Den japanske samling omfatter ikke Aspergillus fumigatus og Candida krusei. Tabel 8: Arter, der repræsenterer gruppen af hhv. Streptococcus spp. og koagulasenegative Staphylococci (CoNS), blev testet positive med LightCycler SeptiFast Test MG Streptococcus spp. Koagulasenegative Staphylococci (CoNS) S. agalactiae S. hominis subsp. novobiosepticus S. anginosus S. pasteuri S. bovis S. warneri S. constellatus S. cohnii subsp. urealyticum S. cristatus S. hominis subsp. hominis S. gordonii S. lugdunensis S. intermedius S. cohnii subsp. cohnii S. milleri S. capitis subsp. ureolyticus S. mitis S. capitis subsp. capitis S. mutans S. caprae S. oralis S. saprophyticus S. parasanguinis S. saprophyticus subsp. saprophyticus S. pneumoniae S. xylosus S. pyogenes S. epidermidis S. salivarius S. haemolyticus S. sanguinis S. thermophilus S. vestibularis S. viridans Der blev fundet afvigende resultater i mindre end 1,2 % af alle resultater. 6 af 143 Enterobacter (aerogenes/cloacae)-strenge var identiske med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i ITS-regionen og blev fortolket som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca). Citrobacter freundii og Salmonella enterica er muligvis identiske med hhv. Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) og E. coli i deres ITS-regioner og vil blive fortolket som hhv. Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) og E. coli. 14 af 160 de Streptococcus viridans-strenge var identiske med Streptococcus pneumoniae i ITS-regionen og vil blive fortolket som S. pneumoniae. I sjældne tilfælde påvises Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) muligvis ikke, hvis en mutation i targetsekvensen forårsager en ændring af smeltepunktet. 13

Eksklusivitet Tabel 9: Alle de testede arter var negative i hver analyse Actinobacillus actinomycetemcomitans Corynebacterium jeikeium Mycoplasma pneumoniae Aeromonas hydrophila Cryptococcus neoformans Neisseria meningitidis Bacillus cereus Gemella haemolysans Pantoea agglomerans Bacteroides fragilis Haemophilus influenzae Peptostreptococcus magnus Bartonella henselae Histoplasma capsulatum Porphyromonas gingivalis Bordetella pertussis Legionella pneumophila Prevotella denticola Borrelia burgdorferi Listeria monocytogenes Propionibacterium acnes Burkholderia cepacia Moraxella (Branhamella) catarrhalis Proteus vulgaris Campylobacter jejuni Morganella morganii Yersinia enterocolitica Cardiobacterium hominis Mycobacterium fortuitum Clostridium perfringens Mycobacterium tuberculosis 14

BEMÆRKNING TIL KØBER Købet af dette produkt giver brugeren ret til at bruge det til amplifikation og detektion af nukleinsyresekvenser i forbindelse med human in vitro-diagnostik. Der gives ingen generelle patent- eller andre licensrettigheder i forbindelse med købet, bortset fra brugsretten. REFERENCER 1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: 462-474. 2. Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): 2742-51. 3. Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: 60-66. 4. Suttorp N. Changing populations and future trends in the management of serious infections from: AIM website (www.infectionacademy.org). 5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: 902-5. 6. Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: 529-535. 7. Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p. 1472-1475. 8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 9. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 15

" Distributed by Produceret i Tyskland for: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247) Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F-38240 Meylan Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora C Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Tyskland, +49 621 7590 ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, MAGNALYSER, FASTSTART, HYBPROBE, SEPTIFAST og AMPERASE er varemærker tilhørende Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemærke, der tilhører Roche. Amphotericin B er et registreret varemærke, der tilhører Bristol-Myers Squibb Company. Aquo-Trinitrosan er et registreret varemærke, der tilhører Merck & Co., Inc. ARA-cell er et registreret varemærke, der tilhører cell pharma GmbH. Arterenol er et registreret varemærke, der tilhører Aventis Pharma Ltd. Cancidas er et registreret varemærke, der tilhører MSD Sharp & Dohme GmbH. Ciprobay er et registreret varemærke, der tilhører Bayer AG. Dexahexal er et registreret varemærke, der tilhører Hexal AG. Diflucan er et registreret varemærke, der tilhører Pfizer Inc. Fortum er et registreret varemærke, der tilhører GlaxoSmithKline. Heparin-Natrium-5000-ratiopharm er et registreret varemærke, der tilhører ratiopharm International. InfectoClont er et registreret varemærke, der tilhører Infectopharm GmbH. LTK-008 er et varemærke, der tilhører biodelta, ZTB GmbH. MiniSpin er et registreret varemærke, der tilhører Eppendorf. Novalgin er et registreret varemærke, der tilhører Aventis Pharma Ltd. Piperacillin er et registreret varemærke, der tilhører Hexal AG. Refobacin er et registreret varemærke, der tilhører Merck & Co., Inc. Sobelin er et registreret varemærke, der tilhører Pfizer Inc. Tazobac er et registreret varemærke, der tilhører Wyeth Pharmaceuticals AG. Vancomycin er et registreret varemærke, der tilhører Lilly Pharma Holding GmbH. Zienam er et registreret varemærke, der tilhører MSD Sharp & Dohme GmbH. Zyvoxid er et registreret varemærke, der tilhører Pfizer Inc. 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Alle rettigheder forbeholdes. 6/2007 (04623886001-03ENGL) 04802896001-03 16