Januar 2015 artus C. trachomatis TM PCR Kit Håndbog 24 (katalog nr. 4552163) 96 (katalog nr. 4552165) Kvantitativ in vitro diagnostik Til anvendelse med ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT Sequence Detection Systems Version 1 4552163, 4552165 1046950DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R3 1046950DA Sample & Assay Technologies
QIAGEN prøve- og analyse-teknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyse-teknologier Vor opgave er at bringe Dem i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information, se www.qiagen.com.
Indholdsfortegnelse 1. Indhold... 5 2. Opbevaring... 5 3. Nødvendige ekstra-materialer og instrumenter... 6 4. Almindelige sikkerhedsregler... 7 5. Information om smittefare... 7 6. Real-Time PCR princip... 8 7. Produktbeskrivelse... 8 8. Protokol... 9 8.1 Før analysen: Udtagning, opbevaring og transport af prøver... 9 8.2 DNA-isolering... 20 8.3 Intern Kontrol... 26 8.4 Kvantificering... 28 8.5 Forberedelse af PCR... 29 8.6 Programmering af ABI PRISM SDS... 34 9. Analyse... 45 10. Fejlkilder... 50 11. Specifikationer... 52 11.1 Analytisk sensitivitet... 52 11.2 Specificitet... 53 11.3 Præcision... 55 11.4 Robusthed... 57 11.5 Reproducerbarhed... 57 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 3
11.6 Diagnostisk evaluering... 57 12. Særlige anvisninger til brug af produktet... 58 13. Sikkerhedsinformationer... 59 14. Kvalitetskontrol... 59 15. Litteratur... 59 16. Symbolforklaring... 60 4 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
artus C. trachomatis TM PCR Kit Til anvendelse med ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT Sequence Detection Systems. Bemærk: artus C. trachomatis TM PCR Kit kan hverken bruges sammen med GeneAmp 5700 SDS eller med 384 er pladeformatet af ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Indhold Påskrift og indhold Art. Nr. 4552163 24 reaktioner Art. Nr. 4552165 96 reaktioner Blå C. trachomatis TM Master 2 x 12 reaktioner 8 x 12 reaktioner Rød Rød Rød Rød C. trachomatis TM QS 1 1 x 10 4 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl C. trachomatis TM QS 2 1 x 10 3 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl C. trachomatis TM QS 3 1 x 10 2 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl C. trachomatis TM QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Grøn C. trachomatis TM IC 1 x 1.000 µl 2 x 1.000 µl Hvid Water (PCR grade) 1 x 1.000 µl 1 x 1.000 µl QS = Kvantificeringsstandard IC = Intern Kontrol 2. Opbevaring artus C. trachomatis TM PCR Kit opbevares ved 30 til 15 C og er holdbart indtil datoen, der er angivet på etiketten. Gentagen optøning og nedfrysning (> 2 x) bør undgås, da sensitiviteten derved forringes. Ved uregelmæssig brug skal reagenserne derfor aliquoteres. Hvis det er nødvendigt at opbevare komponenterne ved +4 C, må dette tidsrum ikke vare længere end fem timer. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 5
3. Nødvendige ekstra-materialer og instrumenter Pudderfri engangs laboratoriehandsker DNA-isoleringskit (se 8.2 DNA-isolering) Pipetter (justerbare) Sterile pipettespidser med filter Vortex-mixer Bordcentrifuge med rotor til 2 ml-reaktionsbeholdere Centrifuge med rotor til mikrotiterplader (valgfri) 96-brønds reaktionsplade/reaktionsbeholdere til optiske målinger med tilhørende optiske lukkematerialer * (se 8.5 Forberedelse af PCR) 96-brønds todelt opbevaringsrack til anvendelse med optiske reaktionsbeholdere (96-Well Tray/Retainer Set, kat.-nr. 403 081, Applied Biosystems), se 8.5 Forberedelse af PCR Kompressionsmåtte til anvendelse med selvklæbende optiske folier (Optical Cover Compression Pads, kat.-nr. 4 312 639, Applied Biosystems), se 8.5 Forberedelse af PCR Applikator til lukning af reaktionspladerne ved anvendelse med selvklæbende optiske folier (Adhesive Seal Applicator Kit, kat.-nr. 4 333 183, Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 eller 7900HT SDS Bemærk: Inden instrumentet sættes igang kræves der en korrekt kalibrering af farvestofferne (Pure Spectra Component File) og baggrunden (Background Component File). * Anvendelsen af reaktionsbeholdere til optiske målinger med hvælvede låg er kun tilladt til ABI PRISM 7700 SDS og kræver en omstilling af belysningstiden (se 8.6.2 Programmering af ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Vigtige ekstraindstillinger). 6 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
4. Almindelige sikkerhedsregler Følgende anvisninger skal altid overholdes af brugeren: Brug sterile pipettespidser med filter. Positivt materiale (prøver, kontroller, amplifikater) skal opbevares, oprenses og tilsættes reaktionsblandingen i et separat rum, adskilt fra de øvrige reagenser. Optø alle komponenter ved stuetemperatur, inden testen startes. Bland komponenterne grundigt, og centrifugér kort. Der bør arbejdes hurtigt på is eller i køleblokken. 5. Information om smittefare Bakterier af slægten Chlamydia har verden over en stor epidemiologisk betydning. Chlamydia trachomatis (serovarer D - L) hører verden over til de hyppigste smitstoffer for seksuelt overførte sygdomme (STD - sexually transmitted diseases). De 16 serovarer af C. trachomatis udløser forskellige sygdomme: Serovarerne A, B, Ba og C forårsager trachoma, som er en i troperne udbredt kronisk recidiverende sygdom af bindehinden og hornhinden. Serovarerne D - K forårsager seksuelt overførbare urogenitale infektioner og øjeninfektioner, samt efter perinatal overførsel infektioner hos nyfødte. Serovarerne LGV I - III forårsager Lymphogranuloma venereum, en seksuelt overførbar sygdom, som overvejende forekommer i troperne. Trachoma optræder næsten udelukkende i tropiske lande under mangelfulde hygiejniske forhold. Trachoma er verden over den hyppigste øjnesygdom og er efter katarakt den næsthyppigste årsag til blindhed. Det antages, at cirka 150 millioner mennesker er inficerede. Hos cirka 6 millioner af dem har den medført blindhed. I industrilandene er chlamydia de hyppigste bakterielle smitstoffer af urogenitalinfektioner. I Tyskland skønnes antallet af genitale artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 7
nyinfektioner til at være cirka 300.000 om året. Incidens for Lymphogranuloma venereum (Lymphogranuloma inguinale, Durand- Nicolas-Favre-sygdom) aftager verden over. Denne seksuelt overførbare sygdom forekommer dog stadig endemisk i Asien, Afrika, Sydamerika og dele af Caribien. 6. Real-Time PCR princip Ved patogen diagnostik ved hjælp af polymerase kædereaktion (eng. Polymerase Chain Reaction = PCR) bliver specifikke områder af smitstofgenomet amplificeret. Detektionen foregår via Real-Time PCR ved hjælp af fluorescensfarver. Disse er som regel koblet til oligonukleotid-prober, som binder sig specifikt til PCR-amplifikatet. Detektionen af fluorescensintensiteterne i løbet af Real-Time PCR-kørslen gør det muligt at påvise og kvantificere produkterne, uden at skulle åbne prøverørene igen efter PCR-kørslen. (Mackay, 2004) 7. Produktbeskrivelse artus C. trachomatis TM PCR Kit er et brugsklart system til påvisning af C. trachomatis-dna ved hjælp af polymerase kædereaktion (PCR) i ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT Sequence Detection System. C. trachomatis TM Master indeholder reagenser og enzymer til den specifikke amplifikation af en 100 bp lang sekvens af C. trachomatis-genomet. Detektionen af amplifikatet foregår ved måling af FAM-fluorescensen i ABI PRISM SDS. Derudover indeholder artus C. trachomatis TM PCR Kit et andet heterologt amplifikationssystem, som bruges til påvisning af en eventuel PCR-inhibition. Denne bliver påvist som Intern Kontrol (IC) via måling af VICfluorescensen. Detektionsgrænsen for den analytiske C. trachomatis-pcr (se 11.1 Analytisk sensitivitet) bliver derved ikke reduceret. Der vedlægges eksterne positive kontroller (C. trachomatis TM QS 1-4), som bruges til 8 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
kvantificering af smitstoffet. Læs dertil afsnittet 8.4 Kvantificering. 8. Protokol 8.1 Før analysen: Udtagning, opbevaring og transport af prøver Bemærk: Alle prøver skal behandles som potentielt smittefarlige. Tilladt er kun følgende prøvematerialer, og hos dem skal de følgende regler og forskrifter til udtagning, opbevaring og transport i hvert tilfælde overholdes: 1. Urin (kvinder og mænd). 2. Øjen-, endocervikal- og uretral-podninger. 3. Sperma. For at sikre en høj prøvekvalitet skal prøvetransporten til undersøgelseslaboratoriet foregå så hurtig som mulig. Prøverne skal transporteres under de angivne temperaturbetingelser. 8.1.1 Udtagning af prøver 1. Urinprøver Patienten må ikke have urineret inden for de forudgående to timer. 10-30 ml morgenurin samles i en ren polypropylenbeholder uden konserveringsmiddel. Brug ikke urinprøver, som er samlet i beholdere med konserveringsmidler. Prøvebeholderne lukkes og skrives på. Følg forskrifterne til opbevaring og transport. 2. Podningsprøver Til udtagning af øjen-, endocervikal-, og uretral-podningsprøver anvendes følgende materialer: Brug kun podepinde med Dacron -, rayon- eller calciumalginat-spidser på skafter af kunststof. Brug ingen podepinde med træ- eller aluminiumskaft. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 9
Øjen-, endocervikal- og uretralpodnings-prøver kan samles og transporteres i 1-3 ml af de følgende medier: AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (egnet til aerobe og anaerobe), sterile transportrør til podninger (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Chlamydia-vatpinde (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) Lad vatpinden blive i kulturtransportmediet. Luk prøvebeholderen, og skriv på den. Følg opbevarings- og transportforskrifterne *. Brug en anbefalet fremgangsmåde til udtagning af cylinder- og pladeepithelceller efter fjernelsen af cervikalslim. 3. Spermaprøver Prøveudtagningen skal først gennemføres to til fire dage efter den sidste ejakulation. Spermaprøven skal udtages den samme dag, den sendes til laboratoriet. Ved anvendelse af rutinemæssige laboratoriemetoder kan spermaprøven udtages på følgende måder: via masturbation direkte ind i en steril, ren og tør prøvebeholder. Sørg for, at hele prøven kommer direkte ind i beholderen. Skulle dele af prøven gå tabt, skal dette nævnes i prøveudtagnings-protokollen. * Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. Referencer: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine (http://uuhsc.utah.edu/andrology/) 2) Andrology Institute of America (http://www.aia-zavos.com/). 10 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
via masturbation med anvendelse af et kondom. Fjern kondomet efter ejakulationen. Det er vigtigt, at kondomet lukkes med et gummibånd, for at holde på spermaprøven i kondomet. Læg derefter kondomet i en transportbeholder. Vigtigt: Benyt kun prøvebeholdere uden konserveringsmidler hhv. kondomer uden smøremiddel og uden kunstige ekstrastoffer (f.eks.: farvestoffer). Spermaprøven skal stilles et mørkt sted 30 til 45 minutter (f.eks. i en skuffe eller i et skab), indtil den er blevet flydende. Lige efter prøven er blevet flydende, skal den fryses ned i et kryorør ved -20 C eller koldere. 8.1.2 Opbevaring af prøver Testeffekten kan blive negativt påvirket af rutinemæssig nedfrysning eller længere opbevaring af prøverne. 1. Urinprøver Hvis testen af urinprøverne sker inden for 24 timer, kan prøverne lagres ved stuetemperatur (19-23 C). Ved en test inden for syv dage efter udtagningen skal prøverne opbevares i køleskabet ved 2-8 C. Urinprøver, som ikke forarbejdes inden for syv dage, kan opbevares op til 30 dage ved -20 C eller koldere. 2. Podningsprøver Prøverne opbevares ved 2-8 C. (Hvis podningsprøverne skal sendes til et undersøgelseslaboratorium, skal de forsendes så hurtigt som muligt i overensstemmelse med laboratorieforskrifterne vedrørende transport af chlamydiaprøver). Podningsprøver, som ikke testes lige efter indlevering til laboratoriet, skal opbevares ved 2-8 C og forarbejdes inden for syv dage. Podningsprøver, som ikke kan behandles inden for syv dage efter artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 11
udtagningen, skal opbevares ved -20 C eller koldere og testes inden for 30 dage efter udtagningsdatoen. 3. Spermaprøver Prøverne skal opbevares ved -20 C eller koldere. Spermaprøver som ikke testes direkte efter ankomsten i laboratoriet, skal opbevares ved -20 C eller koldere og testes inden for 30 dage efter udtagningsdatoen. 8.1.3 Transport af prøver 1. Urinprøver Urinprøver, der skal sendes, skal opbevares i køleskabet ved 2-8 C inden forsendelsen. Prøverne skal sendes efter de gældende lokale og statslige forskrifter for transport af sygdomsfremkaldende stoffer *. 2. Podningsprøver Podningsprøver skal transporteres kølet. Hvis podningsprøverne skal sendes til et laboratorium, skal de forsendes så hurtigt som muligt efter udtagningen i overensstemmelse med laboratorieforskrifterne vedrørende transport under køling. Prøverne skal forsendes efter de gældende lokale og statslige forskrifter for transport af sygdomsfremkaldende stoffer *. 3. Spermaprøver Hvis spermaprøverne skal sendes til et undersøgelseslaboratorium, skal de sendes den samme dag som de blev udtaget, i overenstemmelse med laboratorieforskrifterne for transporten af chlamydiaprøver. Derudover skal bemærkes, at spermaprøver skal forsendes i kølet tilstand. Prøverne skal forsendes efter de gældende lokale og statslige forskrifter for transport af sygdomsfremkaldende stoffer *. * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, 2000.704. 12 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.2 DNA-isolering DNA-isoleringskits tilbydes af forskellige producenter. Prøvevoluminer til DNAisoleringsproceduren afhænger af den benyttede protokol. Tilsæt den anbefalede prøvemængde til oprensningen. Følgende isoleringskits anbefales: Prøvemateriale Urin, podninge r Sperma, podninge r Oprensningskit QIAamp Viral RNA Mini Kit QIAamp (50) DNA Mini Kit (50) Katalognummer Producent Carrier-RNA 52 904 QIAGEN indeholdt 51 304 QIAGEN ikke indeholdt Anvendelsen af carrier-rna er af afgørende betydning for oprensningens effektivitet og dermed for DNA-/RNA-udbyttet. Hvis det anvendte isoleringskit ikke indeholder carrier-rna, anbefales der ved oprensningen af nukleinsyrer af cellefri kropsvæsker eller materialer med ringe DNA- /RNA-indhold (f.eks. CSF), en tilsætning af carrier-rna (RNAhomopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat.-nr. 27-4110-01). Følg så venligst den følgende fremgangsmåde: a) Hertil resuspenderes den lyophiliserede carrier-rna i elueringsbufferen (ikke i lysisbuffer) af isoleringskittet (f.eks. AE-buffer fra QIAamp DNA Mini Kit) og fremstilles en fortynding med en koncentration på 1 µg/µl. Lav derefter af carrier-rna-løsningen et for Deres egne krav passende antal aliquoter, som skal opbevares ved -20 C. Undgå gentagen optøning (>2 x) af carrier-rna-aliquoten. b) Per oprensning skal der tilsættes 1 µg carrier-rna per 100 µl lysisbuffer. Bestemmer ekstraktionsprotokollen f.eks. 200 µl per oprenset prøve, så tilsæt 2 µl af carrier-rna (1 µg/µl) direkte til lysisbufferen. Før begyndelsen af oprensningen skal blandingen af lysisbuffer og carrier- RNA (og i givent tilfælde Intern Kontrol, se 20 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.3 Intern Kontrol) fremstilles frisk efter det følgende pipetteringsskema. Antal prøver 1 12 Lysisbuffer Carrier-RNA (1 µg/µl) f.eks. 200 µl 2 µl f.eks. 2.400 µl 24 µl Samlet volumen 202 µl 2.424 µl Volumen for oprensningen 200 µl for hver 200 µl c) Den frisk fremstillede lysisbuffer skal tilsættes oprensningen med det samme. Det er ikke muligt at opbevare blandingen. Anvendelsen af carrier-rna er af afgørende betydning for oprensningens effektivitet og dermed for DNA-/RNA-udbyttet. For at få en højere stabilitet hos den i QIAamp Viral RNA Mini Kit vedlagte carrier-rna, anbefaler vi følgende fremgangsmåde, som afviger fra angivelserne i håndbogen til isoleringskittet: a. Resuspender den lyophiliserede carrier-rna før den første brug af isoleringskittet i 310 µl af elueringsbufferen, som er indeholdt i kittet (slutkoncentration 1 µg/µl, anvend ikke lysisbuffer), og lav af carrier- RNA-løsningen et for Deres egne krav passende antal aliquoter, som skal opbevares ved -20 C. Undgå gentagen optøning (>2 x) af carrier-rna-aliquoten. b. Før begyndelsen af enhver oprensning skal blandingen af lysisbuffer og carrier-rna (og i givent tilfælde Intern Kontrol, se 8.3 Intern Kontrol) fremstilles frisk efter det følgende pipetteringsskema. Antal prøver 1 12 Lysisbuffer AVL Carrier-RNA (1 µg/µl) 560 µl 5,6 µl 6.720 µl 67,2 µl Samlet volumen 565,6 µl 6.787,2 µl Volumen for oprensningen 560 µl for hver 560 µl c. Den frisk fremstillede lysisbuffer skal tilsættes til oprensningen med artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 21
det samme. Det er ikke muligt at opbevare blandingen. Der anbefales følgende system ud af området af den automatiserede oprensning: Prøvemateriale Urin, podninge r Oprensningssystem Oprensningskit Producent ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Ønskes der en liste over de brugte materialer og den validerede oprensningsprotokol, kontakt venligst vores teknisk service Applied Biosystems, Foster City, U.S.A. Bruger man en oprensningsprotokol med ethanolholdige vaskebuffere, anbefales det, at man udfører et ekstra centrifugeringstrin (tre minutter, 13.000 rpm) før elueringen for at fjerne ethanolrester. Dette forhindrer eventuelle PCR-inhibitioner. artus C. trachomatis TM PCR Kit er ikke egnet til oprensningsmetoder, som arbejder på basis af phenol. Vigtigt: Den Interne Kontrol til artus C. trachomatis TM PCR Kit kan anvendes direkte i oprensningen (se 8.3 Intern Kontrol). 8.2.1 Anbefalinger til oprensning af urin- og podningsprøver med QIAamp Viral RNA Mini Kit Den i QIAamp Viral RNA mini Kit indeholdte AVL-buffer blev specielt udviklet til inaktivering af de talrige inhibitorer, som forekommer i urin. Derfor anbefaler vi udtrykkeligt anvendelsen af QIAamp Viral RNA Mini Kit-protokollen til ekstraktionen af bakteriel eller viral DNA fra urin. Equilibrér prøverne ved stuetemperatur (19-23 C). Tit findes der kun få mængder bakterier i urinprøver. Derfor anbefaler vi en koncentrering af undersøgelsesmaterialet. Dette opnås, når urinprøverne, der skal undersøges (10-30 ml), bliver 22 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
centrifugeret ved 10.000 x g i 15-20 minutter (alternativt: 30 minutter ved 3.000 x g). Supernatanten hældes væk og pelletet bliver fuldstændig resuspenderet ved hjælp af interval-vortexen (15-30 sec.) i 300-900 µl 1 x PBS. Resuspenderings-volumenet er afhængig af udgangs-prøvemængden. Ved brug af tørre vatpinde skal disse rystes i minimum to timer ved stuetemperatur i 500 µl 1 x PBS. Podningsprøver, som opbevares i et transportmedium, skal blandes grundigt via vortexen. Fjern forsigtigt prøverørenes låg og hold øje med, at handskerne ikke kontamineres. Kontaminerede handsker skal udskiftes med et nyt par, før der begyndes med arbejdet på den næste prøve. Tryk vatpinden mod beholderens væg for at presse væsken ud. Udtag med vatpinden eventuelle slimrester i prøven. Tryk den resterende væske i slimen ud af vatpinden på beholderens væg. Fjern og bortskaf vatpinden med de eventuelle slimrester. Til DNA-isoleringen skal der bruges 140 µl af den således forbehandlede prøve. Følg anvisningerne i QIAamp Viral RNA Mini Spin-protokollen (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) fra trin 1. Sørg for, at det valgfrie trin for centrifugering 9a (13.000 rpm, tre minutter) i protokollen, til fjernelsen af ethanolrester, gennemføres. Der anbefales 60 µl elueringsvolumen. 8.2.2 Anbefalinger til oprensningen af podnings-og spermaprøver med QIAamp DNA Mini Kit Equilibrér prøverne ved stuetemperatur (19-23 C). Podningsprøver, som opbevares i et transportmedium, skal blandes grundigt via vortexen. Fjern forsigtigt prøverørenes låg og hold øje med at handskerne ikke kontamineres. Kontaminerede handsker skal udskiftes med et artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 23
nyt par, før der begyndes med arbejdet på den næste prøve. Tryk vatpinden mod beholderens væg for at presse væsken ud. Udtag med vatpinden eventuelle slimrester i prøven. Tryk den resterende væske i slimen ud af vattotten på beholderens væg. Fjern og bortskaf podepinden med de eventuelle slimrester. Pelletér bakterierne via centrifugering i 10 minutter ved 5.000 x g (7.500 rpm). Resuspender derefter bakteriepelletet i 180 µl ATL-buffer (QIAamp DNA Mini Kit). Podepindene overføres direkte i en 1,5 ml mikrocentrifuge-reaktionsbeholder og vortexes i 15 sekunder med 180 µl ATL-buffer. For DNA-ekstraktionen fra spermaprøver skal 60 µl af prøvematerialet fortyndes med 80 µl 1 x PBS i en 1,5 ml mikrocentrifuge-reaktionsbeholder. Pipettér, efter grundig vortexen 100 µl af det fortyndede prøvemateriale i 180 µl ATL-buffer. Bland derefter denne opsætning via interval-vortexen i 15-30 sekunder. Tilsæt 20 µl proteinase K til prøven. Bland dette via kort vortexen og inkubér den ved 56 C i 1-12 timer. Vortex prøven af og til under inkubationen for at blande den godt, eller stil den i en termoshaker. Sørg for, at der anvendes proteinase K. QIAGEN proteinasen har en reduceret aktivitet ved tilstedeværelse af ATLbuffer. Sørg for, ved anvendelse af tørre podepinde, at trykke podepinden ud på beholderens væg for at fjerne væsken. Fjern og bortskaf podepinden derefter. Følg nøje Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit og QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, fra side 34) fra trin 3. Sørg for, at det valgfrie centrifugeringstrin 7a (13.000 rpm, tre minutter) i protokollen til fjernelse af ethanolrester gennemføres. Der anbefales 50 µl AE-buffer elueringsvolumen. 24 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.2.3 Anbefalinger til oprensningen af lyophiliserede eller frysetørrede prøver med QIAamp DNA Mini Kit Equilibrer prøverne ved stuetemperatur (19-23 C). Resuspender den lyophiliserede eller frysetørrede prøve grundigt i 500 µl 1 x PBS ved at svinge den forsigtigt med hånden. Ryst derefter prøven i minimum 30 minutter ved stuetemperatur for at opløse den fuldstændig. Pipettér 200 µl af den opløste prøve i 360 µl ATL-buffer ind i en 1,5 ml mikrocentrifuge-reaktionsbeholder og bland dette grundigt via vortexen. Tilsæt 20 µl proteinase K til prøven. Bland opløsningen via kort vortexen og inkuber den ved 56 C i 1-12 timer. Vortex prøven af og til under inkubationen for at blande den godt, eller stil den i en termoshaker. Sørg for, at der anvendes proteinase K. QIAGEN proteinasens aktivitet reduceres ved tilstedeværelse af ATL-buffer. 1,5 ml-reaktionsbeholderne skal centrifugeres kort for at forhindre krydskontaminationer, som sker i indersiden af låget ved sprøjtning med prøvevæsken, når beholderne åbnes. Tilsæt 400 µl AL-buffer til prøven, bland den grundig via vortexen i 15 sekunder og inkuber prøven i 10 minutter ved 70 C. Tilsæt 400 µl ethanol ( 96-100 %) til prøven og bland dette igen via vortexen i 15 sekunder. Overfør denne blanding (inklusive præcipitat) forsigtigt - uden at fugte det øverste af randen til QIAamp søjlen. Luk låget og centrifuger i et minut ved 6.000 x g (8.000 rpm). Stil derefter QIAamp søjlen ind i en ren 2 ml Collection Tube (indeholdt i kittet) og bortskaf den benyttede Collection Tube sammen med filtratet. Gentag dette trin idet De overfører resten af prøveblandingen til søjlen. Følg nøje Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit og QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, side 35) fra trin 6. Sørg for, at det valgfrie centrifugeringstrin 7a (13.000 rpm, 3 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 25
minutter) i protokollen til fjernelse af ethanolrester gennemføres. Der anbefales 50 µl AE-buffer elueringsvolumen. 8.3 Intern Kontrol Der vedlægges en Intern Kontrol (C. trachomatis TM IC). Med denne har De muligheden, at kontrollere både oprensningen af DNA og en mulig inhibition af PCR (se Fig. 1). Til denne avendelse tilsættes den Interne Kontrol i et forhold, der svarer til 0,1 µl pr. 1 µl elueringsvolumen til oprensningen. Hvis De for eksempel anvender QIAamp DNA Mini Kit og eluerer DNA i 200 µl AE-buffer, skal der tilsættes 20 µl af den Interne Kontrol. Hvis De f.eks. eluerer i 100 µl, skal der tilsvarende tilsættes 10 µl. Mængden af den anvendte Interne Kontrol er kun afhængig af elueringsvolumenet. Den Interne Kontrol og carrier-rna (se 8.2 DNA-isolering) må kun tilsættes til blandingen af lysisbuffer og prøvemateriale eller direkte til lysisbufferen. Den Interne Kontrol må ikke direkte tilsættes prøvematerialet. Der skal sørges for, at blandingen af den Interne Kontrol og lysisbuffer/carrier-rna forberedes frisk og tilsættes med det samme (at opbevare blandingen ved stuetemperatur eller i køleskabet kan allerede efter få timer føre til fravær af den Interne Kontrol og til en reduceret oprensningseffektivitet). Pipettér den Interne Kontrol og carrier-rna ikke direkte i prøvematerialet. For at en oprensning kan vurderes som succes, skal Ct-værdien af den Interne Kontrol på ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT SDS ligge ved Ct = 22 ± 3 (threshold: 0,05). Spredningen på maximalt tre Ct-værdier betinges af en instrument- og oprensningsvarians. En højere afvigelse tyder på problemer med oprensningen. I dette tilfælde skal oprensningen kontrolleres og i givent tilfælde valideres igen. Hvis der yderligere skulle opstå spørgsmål eller problemer, bedes De at kontakte vores tekniske service. 26 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Alternativt kan den Interne Kontrol anvendes udelukkende til kontrol af en mulig PCR-inhibition (se Fig. 2). Til denne applikation tilsættes pr. testblanding 0,5 µl af den Interne Kontrol direkte til 15 µl C. trachomatis TM Master. Brug til hver PCR-reaktion 15 µl af den således fremstillede Master Mix *, og tilsæt derefter 10 µl af den oprensede prøve. Ved udførelsen af en kørsel med flere prøver er det nødvendigt at øge de krævede mængder af C. trachomatis TM Master og den Interne Kontrol svarende til prøvetallet (se 8.5 Forberedelse af PCR). * Volumenforhøjelsen, som opstår på grund af tilsætningen af den Interne Kontrol, er irrelevant. Sensitiviteten for detektionssystemet påvirkes ikke. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 27
8.4 Kvantificering De vedlagte Kvantificeringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) behandles som en allerede oprenset prøve og anvendes i samme volumen (10 µl). For at udarbejde en standardkurve i ABI PRISM Sequence Detection System, tilsættes alle fire vedlagte Kvantificeringsstandarder og definér disse som standarder under angivelse af de tilsvarende koncentrationer (se 8.6 Programmering af ABI PRISM SDS). Importen af standardkurver fra tidligere kørsler er med ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT SDS software ikke muligt. Bemærk: Kvantificeringsstandarderne er defineret som kopier/µl. Til omregningen af værdierne, der blev udarbejdet på baggrund af standardkurven i kopier/ml prøvemateriale, skal følgende formel anvendes: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/µl) x Elueringsvolumen (µl) Prøvevolumen (ml) Bemærk, at der principielt skal tilsættes det oprindelige prøvevolumen i den ovennævnte formel. Dette skal tages i betragtning, hvis prøvevolumenet blev forandret før nukleinsyre-oprensningen (f.eks. at den blev indsnævret ved centrifugering, eller forhøjet ved at den blev fyldt op på det volumen, som kræves for oprensningen). Vigtigt: For simplificering af den kvantitative analyse med artus-systemer på ABI PRISM 7000 SDS instrumentet, findes under www.qiagen.com/products/bylabfocus/mdx en vejledning (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). 28 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.5 Forberedelse af PCR Gør det nødvendige antal reaktionsbeholdere eller en 96-brønds reaktionsplade klar til de planlagte reaktioner. I den følgende tabel findes en liste over anbefalede materialer: Artikel 96-brønds optisk reaktionsplade Betegnelse 96-Well Optical Reaction Plate Katalognummer 4 306 737 Producent Applied Biosystems Opbevarings -rack * Kompressi onsmåtte nej - Selvklæben de optiske folier Optiske reaktionsbeholdere Optiske reaktionsbeholdere Optiske låg (flade) Optical Adhesive Covers ABI PRISM Optica l Tubes, 8 MicroAmp Tubes/Strip Optical Tubes ABI PRISM Optica l Caps, 8 Caps/Strip 4 311 971 4 316 567 N8010933 4 323 032 Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems - ja ja - ja - - nej Bemærk: Anvendelsen af reaktionsbeholdere til optiske målinger med hvælvede låg er kun tilladt til ABI PRISM 7700 SDS Instrumentet og kræver en omstilling af belysningstiden (se 8.6.2 Programmering af ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Vigtige ekstraindstillinger). Bemærk ved opstillingen af PCR, at hver PCR-kørsel medfører mindst en Kvantificeringsstandard samt en negativ kontrol (Water, PCR grade). Anvend til udarbejdelse af en standardkurve pr. PCR-kørsel alle vedlagte Kvantificeringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4). Alle reagenser skal, inden testen startes, optøs fuldstændigt ved stuetemperatur, blandes godt (gentagen pipettering eller kort vortexen) og centrifugeres derefter. * Det er nødvendigt at åbne reaktionsbeholderne når de sættes ind og tages ud af det todelte opbevaringsrack. Brug udelukkende den nederste del af rack et for at undgå kontaminationer i forbindelse med dette. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 29
For tilfældet, at De både vil kontrollere oprensningen af DNA og en eventuel inhibition af PCR, skal den Interne Kontrol tilsættes oprensningen i forvejen (se 8.3 Intern Kontrol). Brug dertil følgende pipetteringsskema (se endvidere skematisk oversigt i Fig. 1): Antal prøver 1 12 1. Opsætning af Master Mix C. trachomatis TM Master 15 µl 180 µl C. trachomatis TM IC 0 µl 0 µl Samlet volumen 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl for hver 15 µl 2. Opsætning af Prøve 10 µl for hver 10 µl PCR-reaktion Samlet volumen 25 µl for hver 25 µl Hvis De udelukkende vil anvende den Interne Kontrol til kontrol af en PCRinhibition, skal den tilsættes direkte til C. trachomatis TM Master. Brug i dette tilfælde følgende pipetteringsskema (se endvidere skematisk oversigt i Fig. 2): Antal prøver 1 12 1. Opsætning af Master Mix 2. Opsætning af PCR-reaktion C. trachomatis TM Master C. trachomatis TM IC 15 µl 0,5 µl 180 µl 6 µl Samlet volumen 15,5 µl * 186 µl * Master Mix 15 µl * for hver 15 µl * Prøve 10 µl for hver 10 µl Samlet volumen 25 µl for hver 25 µl Pipettér 15 µl af Master Mix i hver reaktionsbeholder hhv. i hver fordybning i 96-brønds-reaktionspladen. Derefter tilsættes 10 µl af eluatet fra DNAisoleringen. Sørg for, at begge opløsninger blandes godt igennem, ved at afpipettere og opsuge dem flere gange. Luk reaktionsbeholderne med de tilhørende låg, eller hvis der anvendes en 96-brønds-reaktionsplade ved hjælp af selvklæbende optiske folier (Optical Adhesive Covers). For at samle opsætningsvolumenet i rør- hhv. pladebunden, centrifugeres reaktionsbeholderne (i et til PCR-rør egnet opbevaringsrack) hhv. 96-brøndsreaktionspladen i en centrifuge med mikrotiterplade-rotor i cirka 30 sekunder * Volumenforhøjelsen, som opstår på grund af tilføjelsen af Intern Kontrol er irrelevant. Sensitiviteten for detektionssystemet påvirkes ikke. 30 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
ved 1.780 x g (4.000 rpm). Hvis De ikke har en sådan centrifuge, så sørg ved opsætningen af PCR-reaktionerne for at pipettere både Master Mix og prøvevolumenet på bunden af reaktionsbeholderne hhv. reaktionsenhederne (brønd). Opbevar reaktionsopsætningerne ved +4 C indtil ABI PRISM SDS instrumentet er programmeret (se 8.6 Programmering af ABI PRISM SDS) og overfør dem derefter til apparatet. Bemærk: Sæt ved brug af optiske reaktionsbeholdere sammen med optiske låg altid et opbevaringsrack ind (96-Well Tray/Retainer Set) i instrumentet (ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT SDS). Ved anvendelsen af det todelte opbevaringsrack er det nødvendigt at åbne reaktionsbeholderne ved indsætningen og udtagningen. Brug udelukkende den nederste del af rack et for at undgå kontaminationer i forbindelse med dette. Ved benyttelse af 96-brønds optiske reaktionsplader sammen med selvklæbende optiske folier er det nødvendigt, at der lægges en kompressionsmåtte på (Optical Cover Compression Pads). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 31
Tilsætning af Intern Kontrol til oprensningen oprensning blanding af lysisbuffer/ prøvemateriale + 0,1 µl IC* pr. 1 µl elueringsvolumen 10 µl oprenset prøve* 15 µl artus Master* optisk reaktionsplade/ optiske reaktionsbeholdere ABI PRISM SDS Fig. 1: Skematisk arbejdsforløb til kontrol af oprensningen og PCRinhibition. *Det er yderst vigtigt at sørge for, at de anvendte opløsninger er fuldstændigt optøet, blandet godt og centrifugeret kort. 32 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Tilsætning af Intern Kontrol til artus Master 0,5 µl IC* 15 µl artus Master* oprensning 15,5 µl Master Mix* 10 µl oprenset prøve* 15 µl Master Mix* optisk reaktionsplade/ optiske reaktionsbeholdere ABI PRISM SDS Fig. 2: Skematisk arbejdsforløb til kontrol af PCR-inhibition. *Det er yderst vigtigt at sørge for, at de anvendte opløsninger er fuldstændigt optøet, blandet godt og centrifugeret kort. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 33
8.6 Programmering af ABI PRISM SDS Softwaren til ABI PRISM 7000, 7700 og 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) kræver nogle ekstrainformationer, inden PCR-kørslen kan startes. Fordi fremgangsmåden ved programmeringen af de enkelte instrumenter er meget forskellig, behandles de i separate kapitler. 8.6.1 Programmering af ABI PRISM 7000 SDS Udarbejd til detektion af C. trachomatis-dna en profil på Deres ABI PRISM 7000 SDS efter de følgende seks arbejdstrin (8.6.1.1-8.6.1.6). Alle angivelser refererer til ABI PRISM 7000 SDS software version 1.0.1. Detaljer vedrørende programmeringen af ABI PRISM 7000 SDS findes i ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Af hensyn til overskueligheden er indstillingerne, der skal foretages, fremhævet med sorte rammer i figurerne. 8.6.1.1Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel Vælg på ABI PRISM 7000 SDS menupunktet New, som befinder sig under File, og indstil for det nye dokument følgende grundindstillinger (se Fig. 3). Et i forvejen gemt template (SDS Template [*.sdt]) findes i Template-listen eller ved hjælp af Browse-funktionen (se 8.6.1.5 Arkivering af PCR- kørslen). Bekræft indtastningerne (OK). Fig. 3: Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel (New Document). 34 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.6.1.2 Oprettelse/valg af detektorer Ved hjælp af den separate menu Detector Manager, som findes under Tools, tildeles dokumentet de tilsvarende detektorfarvestoffer. Til påvisning af C. trachomatis-dna såvel som den Interne Kontrol ved hjælp af artus C. trachomatis TM PCR Kit skal reporterne/quencherne, der er angivet i den følgende tabel, defineres: Påvisning Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Intern Kontrol (C. trachomatis TM IC) VIC none Vælg til udarbejdelse af disse detektorer i Detector Manager den forneden til venstre lokaliserede option File og derefter optionen New. Fig. 4: Udarbejdelse af den C. trachomatis-specifikke detektor (Detector Manager). Fig. 5: Udarbejdelse af den Interne Kontrol-specifikke detektor (Detector Manager). I vinduet som nu kommer frem defineres reporter/quencher-kombinationen FAM/TAMRA (tilsvarende Fig. 4 og Fig. 5) for at påvise C. trachomatis-dna. Vælg til påvisning af den Interne Kontrol, kombinationen VIC/none. Ved bekræftelsen af indtastningerne (OK) vender De tilbage til Detector Manager. Markér de netop oprettede detektorer, og transferer hvert udvalg ved at klikke på optionen Add to Plate Document til Well Inspector (se Fig. 6). Luk vinduet (Done). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 35
Fig. 6: Valg af detektorer (Detector Manager). 8.6.1.3 Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne Åbn optionen Well Inspector, som befinder sig under View, for at genfinde de detektorer De allerede har valgt under 8.6.1.2 (se Fig. 7). Fig. 7: Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne (Well Inspector). Markér de til detektion af C. trachomatis-dna belagte pladepositioner. Tildel de udvalgte detektorer til positionerne, og aktivér Use-optionen for begge detektorer. Der dukker et hak op. For at navngive de enkelte reaktionsopsætninger, vælg den tilhørende position på pladen og indtast navnet under Sample Name. Bemærk, at opsætninger med identisk Sample Name og identisk detektorvisning identificeres af softwaren som replikat og at der vedrørende deres kvantificerede smitstofbelastning beregnes en 36 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
middelværdi. Vælg dernæst den tilsvarende funktion (Task) for hver prøvetype ifølge den nedenstående tabel: Prøvetype Funktion (Task) Koncentration (Quantity) Reporter Quencher Prøve Unknown - FAM TAMRA Negativ kontrol NTC - FAM TAMRA Standard Standard se 1. Indhold FAM TAMRA Til udarbejdelsen af en standardkurve anvendes alle vedlagte Kvantificeringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) pr. PCR-kørsel. Indtast de tilhørende koncentrationer (se 1. Indhold) for hver enkelt standard i feltet Quantity. Bemærk, at ROX til en PCR-kørsel med artus C. trachomatis TM PCR Kit skal indstilles som passiv reference (Passive Reference). En jævn fordeling af ROX-farvestoffet på alle PCR-opsætninger af et lot ved en blanding af C. trachomatis TM Master, sikrer genkendelsen og beregningen af tube-to-tube variationer (fluorescensforskelle mellem forskellige PCRopsætninger) via Sequence Detection Software (normalisering). 8.6.1.4 Oprettelse af en temperaturprofil Skift i softwaren fra Setup-planen til Instrument-planen for at indtaste temperaturprofilen. Indtast nu, tilsvarende Fig. 8, den til detektion af C. trachomatis-dna gyldige temperaturprofil. For at fjerne det i forindstillingerne gemte 50 C-trin, markeres dette ved hjælp af venstre musetast mens Shift-tasten holdes nede, og slettes derefter med Backspacetasten. Kontrollér, at reaktionsvolumenet er indstillet til 25 µl. Optionen 9600 Emulation bør aktiveres. Forindstillingerne til Auto Increment forbliver uforandret (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 30 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Fig. 8: Oprettelse af en temperaturprofil. 8.6.1.5 Arkivering af PCR-kørslen Gem de indtastede indstillinger (Setup) som maske, så de kan benyttes ved senere anvendelser i ændret eller uændret form. Ved at arkivere indstillingerne som SDS Template (*.sdt) i mappen Template Directory (Local Disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, oprettet af Applied Biosystems) kan denne fil vælges direkte ud fra Template drop-down-listen i New Document-vinduet. Kopier, som er gemt i andre mapper, skal åbnes via Browse. Sørg altid for at gemme den aktuelt programmerede PCR-kørsel en gang til som SDS Document (*.sds), inden testen startes. Dermed sikres arkiveringen af de data, der har samlet sig under PCR-kørslen. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 31
8.6.1.6 Start af PCR-kørslen Start PCR-kørslen ved at vælge optionen Start under menupunktet Instrument eller feltet Start på Instrument-planen. 8.6.2 Programmering af ABI PRISM 7700 SDS Udarbejd til detektion af C. trachomatis-dna en profil på Deres ABI PRISM 7700 SDS efter de følgende syv arbejdstrin (8.6.2.1-8.6.2.7). Alle angivelser refererer til ABI PRISM 7700 SDS software version 1.9.1. Detaljer vedrørende programmering af ABI PRISM 7700 SDS findes i ABI PRISM 7700 SDS User's Manual. Af hensyn til overskueligheden er indstillingerne, der skal foretages, fremhævet med sorte rammer i figurerne. 8.6.2.1 Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel Vælg på ABI PRISM 7700 SDS menupunktet New Plate, som befinder sig under File, og indstil for det nye dokument følgende grundindstillinger (se Fig. 9). Bekræft indtastningerne (OK). Fig. 9: Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel (New Plate). 32 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
8.6.2.2 Valg af fluorescensfarvestoffer og tildeling af prøvetypen Ved hjælp af Sample Type Setup (Setup-planen: Sample Type/Sample Type Setup) tildeler De dokumentet de tilsvarende detektorfarvestoffer og den tilsvarende prøvetype. Til detektion af C. trachomatis-dna såvel som den Interne Kontrol ved hjælp af artus C. trachomatis TM PCR Kit skal reporterne/quencherne, som er angivet i den følgende tabel, defineres: Påvisning Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Intern Kontrol (C. trachomatis TM IC) VIC TAMRA Til målingen af C. trachomatis-dna ved hjælp af artus C. trachomatis TM PCR Kit skal der tilsvarende til tabellen vælges reporterfarvestoffet FAM. Dette gælder både for standarder (STND), prøver (UNKN) og negativ- kontroller (UNKN). Til målingen af den Interne Kontrol (IPC+) defineres VIC som reporter. Indstil TAMRA som quencher. Tildelingen af farvestofferne og prøvetyperne er vist i vinduet Sample Type Setup i Fig. 10. Fig. 10: Udvalg af fluorescensfarvestoffer og tildeling af prøvetypen (Sample Type Setup). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 33
Tildelingen af prøvetypen til en tilsvarende funktion (Acronym) foregår efter følgende tabel: Prøvetype Funktion Koncentration Reporter Quencher (Acronym) (Quantity) Prøve UNKN - FAM TAMRA Negativkontrol UNKN - FAM TAMRA Standard STND se 1. Indhold FAM TAMRA 8.6.2.3 Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne Vælg de tilsvarende felter for tildelingen af detektorerne og prøvetyperne til de enkelte pladepositioner. Åbn derefter dialogvinduet Dye Layer på Setup- planen, og tildel den tilhørende reporter. Ved at aktivere pop-up-menuen Sample Type, genfinder De i den fremkommende liste de i Sample Type Setup til reporteren tildelte prøvetyper (se Fig. 11). Vælg den passende prøvetype (se tabellen under 8.6.2.2) og bestem nu tildelingen af de øvrige pladepositioner ved hjælp af Dye Layers og Sample Type-menuen. I feltet Sample Name kan der tildeles navne til enhver prøve. Felter, som er defineret som Replicate (indtastning af navnet for referenceprøven i spalten Replicate), beregnes af softwaren vedrørende deres kvantificerede smitstofbelastning som middelværdi. Desuden beregnes standardafvigelsen. Fig. 11/12: Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne. 34 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Til udarbejdelse af en standardkurve anvendes alle vedlagte Kvantificeringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) pr. PCR-kørsel. Indtast de tilhørende koncentrationer (se 1. Indhold) for hver enkelt standard (Quantity, se Fig. 12). Dette er dog kun muligt, hvis de med standarder belagte positioner i forvejen bliver defineret som standarder ved hjælp af menuen Sample Type. 8.6.2.4 Oprettelse af en temperaturprofil Skift, for at indtaste temperaturprofilen, til Thermal Cycler Conditions-menuen på Setup-planen. Indtast nu, tilsvarende Fig. 13, den til detektion af C. trachomatis-dna gyldige temperaturprofil. Kontrollér, at reaktionsvolumenet er indstillet til 25 µl. Forindstillingerne for Ramp-tiderne og Auto Increment forbliver uforandret (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). Fig. 13: Oprettelse af en temperaturprofil. Endvidere befinder sig i Thermal Cycler Conditions-menuen optionen Show Data Collection. Ved valg af denne option kommer De til det i Fig. 14 viste artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 35
vindue. Hver Ramp- og hver Plateau-temperatur er forsynet med et symbol for datasamling (Data Collection Icon). Dette anskueliggør samlingen af data på det nuværende tidspunkt i kørslen. Fjern alle symboler ved at klikke på dem, undtagen det til tidspunktet for Annealing-Extension-trinnet (Stage2/Step2) for at undgå unødvendige fluorescensmålinger. På denne måde holdes den samlede kørselstid og datamængde så lav som mulig. Fig. 14: Datasamling (Data Collection). 8.6.2.5 Vigtige ekstraindstillinger Til indstillingen af belysningstiden (aktivering af fluorescensfarvestofferne) såvel som til udvalget af Pure Spectra/Background-filerne, skiftes fra Setupplanen til Analysis-planen. Vælg i menuen Instrument under Diagnostics det nu aktiverede underpunkt Advanced Options. Foretag indstillingerne tilsvarende til Fig. 15. Ved inaktivering af valgfunktionen Spectra Components (Analysis) benyttes ved en gentagen vurdering af allerede analyserede kørsler automatisk de på tidspunktet for genereringen (opsamlingen) af data i Spectra Components-mappen gemte aktuelle kalibreringsdata. For at få en analyse af gamle kørsler under anvendelse af ny indtastede Spectra Components, er det 36 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
nødvendigt at aktivere disse to felter. Læg mærke til, at ROX for en PCRkørsel med artus C. trachomatis TM PCR Kit skal indstilles som passiv reference (Reference). En jævn fordeling af ROX-farvestoffet på alle PCRopsætninger i et lot ved en blanding af C. trachomatis TM Master sikrer genkendelsen og beregningen af tube-to-tube variationer (fluorescensforskelle mellem forskellige PCR-opsætninger) via Sequence Detection Software (normalisering). Bemærk: Ved anvendelsen af 96-brønds reaktionsplader til optiske målinger i forbindelse med selvklæbende optiske folier (Optical Adhesive Covers) eller optiske reaktionsbeholdere med flade låg, skal belysningstiden (Exposure Time) vare ti millisekunder. Hvis De anvender optiske reaktionsbeholdere med hvælvede låg, skal tidsangivelsen indstilles til 25 millisekunder. Fig. 15: Vigtige ekstraindstillinger (Advanced Options). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 37
8.6.2.6 Arkivering af PCR-kørslen Her kan De gemme de indtastede indstillinger (Setup) som maske, så de kan benyttes i senere anvendelser i ændret eller uændret form. Hertil skal De gemme filen i Stationary File Format. Inden De starter den aktuelt programmerede PCR-kørsel er det nødvendigt at gemme den en gang til i Normal File Format. Dermed sikres arkiveringen af de data, der har samlet sig under PCR-kørslen. 8.6.2.7 Start af PCR-kørslen Start PCR-kørslen ved at vælge optionen Run under menupunktet Instrument eller feltet Run på Analysis-planen. 8.6.3 Programmering af ABI PRISM 7900HT SDS Udarbejd til detektionen af C. trachomatis-dna en profil på Deres ABI PRISM 7900HT SDS efter de følgende seks arbejdstrin (8.6.3.1-8.6.3.6). Alle angivelser refererer til ABI PRISM 7900HT SDS software version 2.1. Detaljer vedrørende programmeringen af ABI PRISM 7900HT SDS findes i ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Af hensyn til overskueligheden er indstillingerne, der skal foretages, fremhævet med sorte rammer i figurerne. 8.6.3.1 Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel Vælg på ABI PRISM 7900HT SDS menupunktet New, som befinder sig under File, og foretag for det nye dokument følgende grundindstillinger (se Fig. 16). Et i forvejen gemt template (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) findes i Template-listen eller ved hjælp af Browse-funktionen (se 8.6.3.5 Arkivering af PCR-kørslen). Bekræft indtastningerne (OK). Bemærk: artus C. trachomatis TM PCR Kit kan ikke anvendes i forbindelse med 384 er pladeformatet af ABI PRISM 7900HT SDS. 38 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Fig. 16: Forindstillinger ved oprettelsen af en ny PCR-kørsel (New Document). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 39
8.6.3.2 Oprettelse/valg af detektorer Ved hjælp af den separate menu Detector Manager, som befinder sig under Tools (alternativt: Vælg Setup-planen/Add Detector-funktion) tildeles dokumentet de tilsvarende detektorfarvestoffer. Til detektion af C. trachomatis-dna såvel som den Interne Kontrol ved hjælp af artus C. trachomatis TM PCR Kit skal reporterne/quencherne, der er angivet i den følgende tabel, defineres: Påvisning Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Intern Kontrol (C. trachomatis TM IC) VIC Non Flourescent Til oprettelse af disse detektorer vælger De i Detector Manager den forneden til venstre lokaliserede option New. Fig. 17: Udarbejdelse af den C. trachomatis -specifikke detektor (Detector Manager). Fig. 18: Udarbejdelse af den Intern Kontrol-specifikke detektor (Detector Manager). 40 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015
Definér i vinduet, som nu kommer frem, reporter/quencher-kombinationen FAM/TAMRA (tilsvarende Fig. 17 og Fig. 18) til detektion af C. trachomatis- DNA. Vælg til detektion af den Interne Kontrol kombinationen VIC/Non Fluorescent. Ved bekræftelse af indtastningerne (OK) vender De tilbage til Detector Manager. Markér de lige oprettede detektorer, og transferer hvert udvalg ved at klikke på optionen Copy to Plate Document til Setup-planen (se Fig. 19). Luk vinduet (Done). Fig. 19: Valg af detektorer (Detector Manager). 8.6.3.3 Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne Efter at de har lukket Detector Manager (Done) findes detektorerne, som De selv har udvalgt under 8.6.3.2 opstillet i tabelform (se Fig. 20) på Setup- planen (Well Inspector). Fig. 20: Tildeling af de nødvendige informationer til pladepositionerne. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 41
Markér de til detektion af C. trachomatis-dna belagte pladepositioner. Tildel de udvalgte detektorer til positionerne idet De aktiverer Use-optionen for begge detektorer ved at klikke på dem. Der dukker et kryds op. For at navngive de enkelte reaktionsopsætninger, vælger De den tilhørende position på pladen og indtaster navnet under Sample Name. Bemærk, at opsætninger med identisk Sample Name og identisk detektorvisning identificeres af softwaren som replikat, og at der vedrørende deres kvantificerede smitstofbelastning beregnes en middelværdi. Dernæst vælger De den tilsvarende funktion (Task) for hver prøvetype ifølge den nedenstående tabel: Prøvetype Funktion Koncentration (Task) (Quantity) Reporter Quencher Prøve Unknown - FAM TAMRA Negativ kontrol NTC - FAM TAMRA Standard Standard se 1. Indhold FAM TAMRA Til udarbejdelsen af en standardkurve anvendes alle vedlagte Kvantificeringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) pr. PCR-kørsel. Indtast de tilhørende koncentrationer (se 1. Indhold) for hver enkelt standard i feltet Quantity. Bemærk, at ROX for PCR-kørsler med artus C. trachomatis TM PCR Kit skal indstilles som passiv reference (Passive Reference). En jævn fordeling af ROX-farvestoffet på alle PCR-opsætninger af et lot ved en blanding af C. trachomatis TM Master sikrer genkendelsen og beregningen af tube-to-tube variationer (fluorescensforskelle mellem forskellige PCR-opsætninger) via Sequence Detection Software (normalisering). 8.6.3.4 Oprettelse af en temperaturprofil Skift, for at indtaste temperaturprofilen, i softwaren fra Setup-planen til Instrument-planen. Indtast, tilsvarende Fig. 21, den til detektion af C. trachomatis-dna gyldige temperaturprofil. Kontrollér, at reaktionsvolumenet er indstillet til 25 µl. Optionen 9600 Emulation skal aktiveres. Forindstillingerne for Ramp-tiden og Auto Increment forbliver 42 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015