Detektion af carbapenemaser

Detektion af carbapenemaser Med særligt henblik på Coris BioConcept OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT Figur 1: http://www.corisbio.com/products/human-field/oxa-48.php Bachelorprojekt, Bioanalytikeruddannelsen, Professionshøjskolen Metropol Forfatter: Tina Louise Rønnebek Fødselsdag: 10.10.82 Studienummer: 60080524 Anslag uden mellemrum: 61.619 Projektperiode: 29/4 9/6 2016 Vejledere: Linda Schjerlund, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital Minna Fyhn Lykke Llado, Lektor v. Professionshøjskolen Metropol

Forkortelser: SSI: Statens Serum Institut KMA HvH: Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing NORDICAST: Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ECDC: European Center for Disease Prevention and Control CPE: Carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae DSKM: Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi KPC+MBL: Carbapenemasepåvisning med KPC + MBL diagnostiske tabletter + temocillin MHT: Modified Hodge Test DANMAP: The Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme 1

Resumé På grund af stigningen af carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae (CPE), er der brug for simple og hurtige metoder, til detektion for at kontrollere spredningen. Nuværende metoder til detektion af CPE er på Klinisk Mikrobiologisk afdeling Hvidovre hospital, Modified Hodge Test og carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter. Disse tests er tidskrævende og kræver en vis erfaring at aflæse. OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT er hurtige tests, der er baseret på immunokromatografi og er i stand til at detektere OXA-48 typer og KPC typer inden for 15 minutter. Formålet med denne undersøgelse er, at undersøge sensitiviteten og specificiteten for OXA-48 K- SeT og KPC K-SeT, i forhold til de nuværende metoder. Derudover er det interessant at undersøge om og hvorledes de to nye metoder kan implementeres i rutinelaboratoriet. Undersøgelsen er udført med 80 genotypet Enterobacteriaceae stammer. 52 af stammerne er carbapenemaseproducerende. De resterende er positive for andre beta-lactamaser eller fuldt negative. Der udføres MHT, KPC+MBL, OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. Derudover laves der følsomhedsbestemmelse, med henblik på mulig screenings mekanisme og mulig behandling med amikacin. Sensitiviteten og specificiteten for OXA-48 K-SeT blev beregnet til hhv. 92,59 % og 100 %. Sensitiviteten og specificiteten for KPC K-SeT er begge beregnet til 100 %. Sensitiviteten og specificiteten for MHT er beregnet til hhv. 90,38 % og 89,29 % i forhold til at detektere alle carbapenemasetyper. Sensitiviteten for KPC+MBL i forhold til at detektere OXA-48 og KPC, er på 100 %. Hvor specificiteten er beregnet til hhv. 84,91 % og 94, 37 %. I forhold til at screene for OXA-48 ved agardiffusion, vil en kombination af meropenem, temocillin og piperacillin + tazobactam, kunne påvise 25/27 OXA-48 producerende Enterobacteriaceae. Dog detekteres yderligere 12 CPE som ikke er OXA-48 positive. Undersøgelsen viste gode resultater ved påvisning af OXA-48 og KPC. Dog er ulempen ved disse tests at de blot detekterer OXA-48 og KPC, i modsætning til de nuværende fænotypiske tests. Dette giver udfordringer i forhold til implementeringen af testene. 2

Forord Udførelsen af den praktiske del af dette projekt, er foregået på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Hvidovre hospital. Den er udført i perioden d. 29/3 til d. 15/4 2016, i samarbejde med min medstuderende, Sarah Bauer. En stor tak for godt samarbejde, skal lyde til Sarah. Jeg vil også takke mine vejledere, Linda Schjerlund og Minna Fyhn Lykke Llado, for støtte og opbakning gennem hele perioden. Desuden vil jeg sige tak til personalet på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Hvidovre hospital. Alle billeder, undtagen forsiden, er taget af undertegnede og Sarah Bauer 3

Indhold Indhold... 4 1. Introduktion... 6 1.1 Problembaggrund... 6 1.2 Formål og mål... 7 1.3 Problemformulering... 8 2. Teori... 8 2.1 Enterobacteriaceae... 8 2.2 Carbapenemaser og deres klassifikation... 9 2.3 Behandling af carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae... 10 2.3.3 Carbapenemer... 11 2.4 Identifikation af CPE den nuværende metode på KMA, HvH... 12 2.4.1 Analyseprincip Følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion... 13 2.4.2 Analyseprincip Modified Hodge Test (MHT)... 14 2.4.3 Analyseprincip Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, samt temocillin (KPC+MBL)... 15 2.5 Ny metode OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT, Coris BioConcept... 16 2.5.1 Analyseprincip... 16 3. Metodevalg og afgrænsning... 18 3.1 Metodeovervejelser i forhold til prøvemateriale og udførelse... 18 3.2 Metodeovervejelser i forhold til følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion... 19 3.3 Valg af kontroller... 21 3.4 Ekstra tests... 21 3.5 Beregninger.... 21 4. Materialer og Metode... 23 4.1 Prøvemateriale og materiale... 23 4.2 Fremgangsmåde... 27 4.2.1 Forberedelse af stammerne første udsåning og isolering... 27 4.2.2 Udførelse af metoderne... 28 4.3 Ekstra tests... 29 5. Resultater... 31 5.1 Resultater - OXA-48 K-SeT... 31 5.2 Resultater KPC K-SeT... 34 5.3 Resultater Modified Hodge Test... 34 4

5.4 Resultater Carbapenemase påvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter... 35 5.4.1 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter Detektion af OXA-48... 35 5.4.2 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter Detektion af KPC... 36 5.5 Resultater Dispenser A (screening)... 38 5.5.1 Screening med meropenem 10 µg... 38 5.5.2 Screening med temocillin 30 µg... 39 5.5.3 Screening med piperacillin + Tazobactam 36 µg... 39 5.5.4 Kombination af antibiotika til screening for OXA-48... 40 5.6 Resultater Dispenser B (behandling)... 41 5.6.1 Amikacin 30 µg... 41 5.6.2 Gentamicin 10 µg... 41 5.7 Resultater Kontrolstammer... 42 5.8 Ekstra tests med OXA-48 K-SeT... 43 6. Diskussion... 44 6.1 Modified Hodge Test... 44 6.2 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, med fokus på OXA-48 og KPC... 46 6.3 Identifikation med OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT... 48 6.4 Screening med meropenem, temocillin og piperacillin + tazobactam, i forhold til OXA-48... 51 6.5 Behandling af CPE med amikacin... 52 6.6 Kontrolstammen E8 E. coli OXA-48 positiv... 53 7. Konklusion... 54 8. Perspektivering... 55 9. Litteratur... 56 10. Bilag... 60 10.1 Bilag 1... 60 10.2 Bilag 2.... 62 10.3 Bilag 3.... 65 10.4 Bilag 4... 68 10.5 Bilag 5... 69 10.6 Bilag 6... 70 5

1. Introduktion 1.1 Problembaggrund Enterobacteriaceae er en del af normalfloraen i menneskets tarme og er de mest almindelige patogene bakterier bl.a. i forbindelse med urinvejsinfektioner. De spredes hurtigt, både i samfundet og på hospitalerne, og de har en evne til at erhverve sig resistensgener gennem horisontalspredning med både plasmider og transposoner (1). Derfor er den stigende forekomst af CPE bekymrende, da det kan betyde langvarige og komplicerede behandlingsforløb samt risiko for højere dødelighed. Bekymringen forstærkes yderligere, da man har set spredning i blandt patienter på hospitaler. Derudover er der også observeret spredning imellem bakteriearter i samme patient. Det kan have store sundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser, i forhold til mortaliteten og de hygiejnemæssige procedure der skal implementeres, i forbindelse med at kontrollere spredningen (2). Siden årtusindskiftet er der rapporteret en spredning i ESBL producerende Enterobacteriaceae, hvilket har gjort carbapenemer som det beta-lactam antibiotika der benyttes til behandling. Disse er særdeles bredspektret og er aktive mod de fleste beta-lactamaser (1). Beta-lactamaser er enzymer som kan nedbryde flere forskellige beta-lactamantibiotika, herunder forskellige penicilliner og cefalosporiner. De er derfor svære at behandle og der behandles ofte med carbapenemer (3). Ifølge en rapport udarbejdet af DANMAP, er der i 2014 identificeret 35 carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae (CPE) hos 29 patienter i Danmark. 22 af dem var af OXA-48 typen, 12 var af NDM typen og én var af KPC typen. Det er en stigning fra 19 fund i 2013 og blot 20 fund fra 2008 2012. I 2014 var de fleste CPE fund ikke associeret med udlandsrejser, men havde ukendt oprindelse eller stammede fra spredning mellem patienter. Fundene fra de tidligere år stammede mest fra udlandsophold (4). På Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital, er der i perioden marts 2014 februar 2016 fundet 64 carbapenemaseproducerende bakterier (5). ECDC har i 2016 udgivet en risikovurderingsrapport af CPE. I den slår de fast, at for at kunne kontrollere spredningen af CPE, er det nødvendigt med en pålidelig og hurtig identifikation på de mikrobiologiske laboratorier. Dog findes der ikke én hurtig metode til at identificere alle 6

carbapenemasetyper. Derudover skal en screeningmetode også defineres, da omstændigheder som prævalensen af de forskellige typer spiller ind, samt laboratoriernes kapacitet og tilgængelige resurser. Det kan derfor være vanskeligt at definere retningslinjer der kan gælde for alle (6). Hurtig identifikation fører til hurtigere isolering af patienter på hospitalerne. Dermed mindskes risikoen for spredning til andre patienter, som muligvis kan være indlagt med alvorlige sygdomme og i forvejen har svækket helbred. Særligt identifikationen af OXA-48 typer vanskeliggøres pga. deres svage hydrolyseaktivitet og det faktum, at de ikke hæmmes af de sædvanlige enzymhæmmere man benytter til klinisk brug. Derfor mener Bakthavatchalam et al. at den eneste sikre måde at identificere dem, er ved molekylær genotypning, men her er prisen af analysen en stor hæmsko for mange laboratorier (7). Derfor kan tests som OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT måske være en hensigtsmæssig analyse for mange laboratorier i områder med høj prævalens af OXA-48 og KPC. Det undersøges her, ved at beregne sensitiviteten og specificiteten for de to kits, på 80 Enterobacteriaceae stammer i forhold til den nuværende metode til påvisning af carbapenemaser. 1.2 Formål og mål Formålet med denne undersøgelse er først og fremmest at undersøge metoderne, OXA-48 K-SeT og KPC K-SeTs sensitivitet og specificitet i forhold til de nuværende metoder på KMA, HvH. Målet er at afdække muligheden for at implementere OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT, i den daglige rutine på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital til påvisning af carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae. Dette har til formål at afhjælpe personalet i en mere effektiv påvisning af CPE, men også med henblik på hurtigere behandling og isolation af patienter. Der sættes især fokus på påvisningen af OXA-48 typer, da disse viser sig at være vanskelige at påvise med de nuværende metoder og de har en forholdsvis høj prævalens i Danmark (4). 7

1.3 Problemformulering Hvorledes er Coris BioConcept OXA-48 K-set og KPC-K-sets diagnostiske sensitivitet og specificitet testet på genotypet Enterobacteriaceae, i forhold til den nuværende metode* til påvisning af carbapenemaserne OXA-48 og KPC på KMA HvH**? *Metoden er baseret på MHT og carbapenemase påvisning med KPC + MBL diagnostiske tabletter, som er en del af rutinen til at påvise carbapenemase producerende bakterier, på klinisk mikrobiologisk afdeling på Hvidovre hospital **Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital 2. Teori 2.1 Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae familien består af gram negative stave, som har beskedne vækstkrav og dyrkes ofte på blå plader og blod plader. E. coli og Klebsiella pneumoniae er nogle af de typiske patogene slægter inden for Enterobacteriaceae familien. E. coli findes som normalflora i tyktarmen og er en af de hyppigste årsager til urinvejsinfektion. Klebsiella pneumoniae findes som normalflora hos ca. 5 % af befolkningen i fordøjelseskanalen og luftvejene. Den kan i nogle tilfælde forårsage urinvejsinfektion, men den er mest kendt for at forårsage pneumoni. Klebsiella pneumoniae besidder en polysakkarid kapsel, som giver den karakteristiske mucoide kolonier ved dyrkning. Derudover fungerer kapslen anti-fagocytotisk. Klebsiella pneumoniae behandles ofte med cefalosporiner og aminoglykosider. E. coli kan derimod behandles med flere, f.eks. sulfonamider, trimetoprim, cefalosporiner, kinoloner, og ampicillin (8). E. coli og Klebsiella pneumoniae er ofte sat i forbindelse med carbapenemase resistensmekanisme og er af særlig bekymring. Disse er ofte identificeret i nosokomielle sammenhæng, hvilke giver større risiko for infektion med disse resistente bakterier hos svage og alvorligt syge patienter (4). 8

2.2 Carbapenemaser og deres klassifikation Udviklingen af carbapenemaser er sket pga. af det øget forbrug af carbapenemer til behandling af alvorlige infektioner med resistente Enterobacteriaceae. Resistensmekanismerne imod carbapenemer, hos gramnegative stave, inkluderer produktionen af beta-laktamaser og efflukspumper samt porintab, både alene, men også i kombination. Carbapenemaserne adskiller sig fra andre beta-lactamaser, ved at de har evnen til at hydrolysere carbapenemer (9). De fleste carbapenemaser er plasmidbåren og spredes hurtigt ved hjælp af den horisontale spredning (10). Plasmider er cirkulære dobbeltstrenget DNA-molekyler som har evnen til at overføre sit DNA til nye værtsceller vha. konjugation, celle-til-celle-kontakt, gennem en proteintunnel. Konjugationen sker hurtigt i en bakteriepopulation og det kan ske på tværs af bakteriearter (11). Fælles for alle carbapenemaser er at de kan hydrolysere carbapenemer. Carbapenemaser er klassificeret i beta-lactamase ambler klasserne A, B og D og inddeles, på baggrund af deres funktionelle og molekylære egenskaber. Klasse A og D besidder serin som deres aktive site, og klasse B, de såkaldte metallo-beta-lactamaser (MBL), besidder zink som deres aktive site (12). Bakterier der producerer klasse A carbapenemaser kan bl.a. underinddeles i typerne KPC (Klebsiellapneumoniae-carbapenemase) og IMI. De kan alle hydrolysere carbapenemer, cefalosporiner, penicilliner og aztreonam. Enzymerne hæmmes af clavulansyre, borsyre og tazobactam (12). KPC er plasmidbåren og typer som IMI er lokaliseret på kromosomer, hvilket gør dem mere sjældne end KPC. KPC er det mest almindelige enzym i denne gruppe. Den blev først identificeret i USA i 1996 og har på bare få år spredt sig til resten af verden. KPC er ofte identificeret i Klebsiella pneumoniae og i mindre grad E. coli. Bakterier der producerer enzymet KPC er ofte multiresistente og er af den grund særligt svære at behandle (2). Klasse B carbapenemaser, de såkaldte metallo-beta-lactamaser (MBL), kendetegnes ved at de kan hydrolysere carbapenemer, cefalosporiner og penicilliner. De kan ikke hydrolysere aztreonam. Hydrolysen foregår ved hjælp af zinkioner på enzymets aktive site. MBL kan bl.a. inddeles i undertyperne NDM, VIM og IMP (12). 9

Disse enzymer kan, pga. deres zinkioner, hæmmes af EDTA og dipokolinsyre. De er ofte identificeret hos Klebsiella pneumoniae og infektioner er ofte erhvervet på hospitaler (2). NDM(New-delhi-Metallo-beta-lactamase) hos Enterobacteriaceae er på nuværende tidspunkt identificeret på de fleste kontinenter. Plasmider med NDM gener er ofte associeret med andre carbapenemaser og er derfor ofte multiresistente. Udover at være identificeret i nosokomielle sammenhæng hos Klebsiella pneumoniae og E. coli, er den også detekteret i miljøet, særligt i Indien, hvor den, i første omgang, stammer fra (2). Med henblik på identifikation af de to føromtalte klasser, er det muligt at benytte synergitests med brug af enzymhæmmere, hhv. borsyre og dipokolinsyre, til at identificere og differentiere mellem klasserne, men det er mere vanskeligt at identificere typer af carbapenem hydrolyserende klasse D oxacillinaserne, især OXA-48, da de ikke hæmmes af de sædvanlige kliniske enzymhæmmere (7). OXA-48 typerne er plasmidbåren og associeret med hurtig spredning. Derudover ses den ofte i Klebsiella pneumoniae, særligt i nosokomielle sammenhæng, men efterhånden også i samfundsmæssige sammenhæng. Dens aktivitet mod carbapenemer og cefalosporiner, er meget lav, og derfor er den særligt svær at detektere. Dette gør desuden at dens prævalens er svære at vurdere (7). KPC, NDM, VIM og OXA-48 er blandt de hyppigste forekommende carbapenemaser i Europa (13). Ambler klasse Enzymer Hæmmer Plasmid/kromosom A KPC, IMI Clavulansyre, Borsyre Begge B NDM, VIM, IMP EDTA, dipokolinsyre Begge D OXA-48 Ingen Begge Tabel 1: Oversigt over udvalgte carbapenemaser. Kun dem der indgår i dette projekt, er nævnt. Af andre beta-lactamaser, som indgår i dette projekt, finder vi ESBL enzymer som CTX-M, SHV, TEM og LEN. De er alle klassificeret i ambler klasse A. Derudover er der AmpC enzymet CMY som er klassificeret i ambler klasse C. 2.3 Behandling af carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae Behandlingsmulighederne af CPE er begrænsede. Antibiotika som colistin, tigecyclin og fosfomycin, viser god aktivitet mod CPE in vitro, men data fra kliniske studier mangler stadig i forhold til 10

behandling af CPE. Dog ses en tendens til at kombinationsterapi har den bedste effekt, i modsætning til monoterapi. Især colistin anvendes til behandling, men der er risiko for udvikling af colistin resistens i disse patienter (6). Mortaliteten spænder fra 30 % - 75 % med alvorlige CPE infektioner. Især hos sepsispatienter er mortaliteten høj. Dette hænger formentlig sammen med mangel på behandlingsmuligheder (6). Ifølge anbefalinger fra DSKM, bør CPE i første omgang behandles med kombinationsterapi bestående af et carbapenem og et aminoglykosid, hvis bakterien viser følsomhed over for begge. Alternativt anbefales carbapenem i kombination med colistin (14). Aminoglykosider har en hurtig baktericid effekt og virker ved at hæmme bakteriecellens proteinsyntese. Det kan ofte give en synergistisk effekt at kombinerer dem med et antibiotika som virker på cellevægge. Gentamicin og amikacin er eksempler på aminoglykosider. Forskellen mellem effektiv og toksisk koncentration af aminoglykosider er meget lille, hvilket godt kan udgøre et problem ved behandlingen. Bivirkninger kan bl.a. være nefrotoksicitet, da aminoglykosider kan op koncentrerer sig i nyretubuli, hvilket øger faren for nyreskade (8). 2.3.3 Carbapenemer Beta-lactamer er den største gruppe af antibiotika som står for det meste af det globale antibiotikaforbrug. Beta-lactamer kan inddeles i penicilliner, cefalosporiner, monobactamer og carbapenemer. Fælles for dem alle sammen, er at de hæmmer enzymer i bakteriens cellevæg som er med til at danne peptidoglykan. Derudover indeholder deres kemiske struktur en betalactamring. Det er de kemiske sidegrupper som adskiller de forskellige grupper (8). Carbapenemer er som regel meget stabile over for beta-lactamaser. Derudover har de en god evne til at penetrere ydremembranen igennem poriner hos gram-negative bakterier (8). Her inaktiverer de enzymerne PBP (penicillin-bindende-protein) som er med til at katalysere formationen af peptidoglykan i cellevæggen. Carbapenemer kan derved hæmme dannelsen af cellevæggen og forårsage at cellen autolyserer, pga. det osmotiske tryk. Carbapenemer har en fordel ved at de kan binde sig til flere forskellige PBP typer (9). Carbapenemer besidder et bredt spektrum af aktivitet i mod både grampositive og gramnegative bakterier. Dette har betydet at man, de seneste år, har benyttet dem til behandling af alvorligt syge 11

patienter, hvor traditionel behandling ikke har været effektiv, pga. den stigende resistensudvikling. Desværre har dette resulteret i en øget resistensudvikling mod carbapenemer (9). 2.4 Identifikation af CPE den nuværende metode på KMA, HvH Til påvisning af CPE tages der udgangspunkt i meropenemdisken, som er en fast del af antibiotikasammensætningen ved følsomhedsbestemmelsen i på KMA, HvH (bilag 1). Er hæmningszonen målt til 26 mm, skal man følge flowdiagrammet for carbapenemasepåvisning ved Enterobacteriaceae illustreret i diagram 1. Ifølge diagram 1 skal man udføre de fænotypiske tests MHT og KPC+MBL, hvis meropenemzonen er <25 mm. Men hvis hæmningszonen omkring meropenem er <27 mm, men >25 mm, måles hæmningszonerne omkring piperacillin+tazbactam disken og amoxicillin+clavulan diskene. Er disse hhv. <17 mm og <19 mm laves ligeledes de fænotypiske tests. Meropenem <27 mm Ja Nej Meropenem <25 mm Ja Udfør MHT KPC+MBL Nej Ja PIP/TAZO <17 mm AMC <19 mm Nej Ingen øvrige tests Carbapenemase negativ. Ingen yderligere tests. Meropenem svares ud som følsom. Diagram 1: Flowet i rutinen ved carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae (15). Ved et positivt carbapenemasefund, sendes kolonimateriale til SSI til genotypning og overvågning. Det endelige svar på genotypen modtages senere på KMA HvH. Derudover fryses en del af prøven og opbevares på KMA, HvH (15). 12

Modified Hodge Test er en kvalitativ metode til at detektere tilstedeværelsen af carbapenemaser. Den diskriminerer ikke mellem carbapenemasetyperne. Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter er ligeledes kvalitativ metode, der detekterer visse carbapenemasetyper og AmpC enzymer. Metoden bygger på at nogle carbapenemaser kan hæmmes af visse midler. Da der ikke findes en specifik hæmmer af klasse D carbapenemaserne, benyttes temocillin 30 µg tablet, da OXA-typer ofte er resistente. 2.4.1 Analyseprincip Følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion Følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion benyttes til at bestemme bakteriers følsomhed over for bestemte antibiotika. På figur 2 ses et eksempel på hvordan en følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion kan se ud. Der er fremkommet en hæmningszone omkring nogle af diskene. Nogle af dem har ikke dannet en zone. Alt efter størrelsen (mm) på zonen, tolkes zonerne efter break points. Break points er mål for hvornår en bakterie er hhv. sensitiv (S), intermediær (I) eller resistent (R) over for det pågældende antibiotika, og afgør om det kan benyttes til behandling. På KMA, HvH benytter de break points fastsat af EUCAST (16). Hæmningszonens størrelse er afhængig af bakteriestammens følsomhed, koncentrationen af antibiotikadisken, antibiotikummets evne til at diffundere i agaren (størrelsen af molekylet) og bakteriens væksthastighed (11). Selve følsomhedsbestemmelse udføres på baggrund af nogle standardiserede retningslinjer fra EUCAST. Disse indeholder bl.a. retningslinjer vedrørende pladevalg, tilsåning af plade, inokulum og inkubation. Denne metode kan følges uden modifikationer for at Figur 2: Følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion opnå et pålidelige resultater (17). Følsomhedsbestemmelsen benyttes også til at screene. Ved at nogle bakterier udviser resistens, i henhold til EUCASTs break points, kan der differentieres mellem bakterier der besidder en bestemt 13

resistensmekanisme og bakterier uden den bestemte resistensmekanisme. I nogle tilfælde er det nok at påvise om en bakterie er resistent, i andre tilfælde har EUCAST fastsat en cut-off værdi som adskiller sig fra de sædvanlige break points (16,17). 2.4.2 Analyseprincip Modified Hodge Test (MHT) Modified hodge test er en fænotypisk metode til at fastlægge, om den pågældende bakterie er carbapenemaseproducerende. Den er ikke specifik, dvs. den fortæller intet om hvilket carbapenemaseenzym der er tale om. Man benytter diskene ertapenem 10 µg og meropenem 10 µg, når der er tale om Enterobacteriaceae. Endvidere benytter man en følsom stamme, ATCC 25922 E. coli. En suspension med den følsomme stamme spredes på en MH-A plade. De to disks placeres med ca. 3 cm mellemrum. Man placerer en streg fra hver disk ud til kanten af pladen fra alle fire sider. Den ene streg går fra disk til disk. Ved carbapenemaseproduktion, altså en positiv test, vil der fremkomme det karakteristiske kløverblad efter inkubation i varmeskab. Dette sker fordi teststammen, ved at producere carbapenemase enzymer, tillader at ATCC stammen kan vokse ind mod diskene, der hvor stregerne er sat. Ved en negativ test ses der ikke kløverblad, da der ingen carbapenemaseproduktion er (18). Se figur 3. Figur 3: Eksempel på resultat af MHT. Her de tre kontroller, ATCC 25922 (negativ), G4 Klebsiella pneumoniae (KPC) og E8 (OXA-48) 14

2.4.3 Analyseprincip Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, samt temocillin (KPC+MBL) I denne test udnytter man at nogle carbapenemaser hæmmes af bestemte midler. Man benytter 5 tabletter. Den ene indeholder kun meropenem 10 µg, og 3 tabletter indeholder meropenem 10 µg i kombination med enten borsyre, cloxacillin eller dipokolinsyre. Den sidste tablet indeholder temocillin 30 µg. Ved agardiffusion fremkommer hæmningszoner omkring tabletterne (figur 4) og forskellen mellem zonediameterne ved meropenem og meropenem i kombination med en enzymhæmmer, afgør hvilken carbapenemase der er tale om. Hæmningszonen omkring temocillin afgør om der kan være tale om OXA-48. Se eventuelt tabel 2 (19). Tablet synergi Fænotype MRP10 MR+BO KPC MRP10 MR+DP 5 mm MBL MRP10 MR+CL AmpC/Porintab TEM30 12 mm Evt. OXA-48 Tabel 2: Tolkning af carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter (19) Figur 4: Stamme F4 KPC+MBL - OXA-48 positiv 15

2.5 Ny metode OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT, Coris BioConcept OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT er to hurtige kvalitative diagnostiske tests til påvisning af OXA-48 og dens varianter (OXA-181, OXA-162, OXA-204, OXA-232 og OXA-244) og KPC carbapenemaser, fra carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae isolater. Det anbefales at benytte friskt kolonimateriale fra en af de validerede vækstmedier som er anbefalet af Coris BioConcept. Testene er beregnet til at detektere carbapenemaser ud fra en enkel koloni (20). 2.5.1 Analyseprincip Analyseprincippet bygger på immunokromatografi. Kassetten, hvori analysen udføres, indeholder en nitrocellulosemembran som indeholder antistoffer rettet mod et af epitoperne på OXA-48 og KPC enzymerne. Et andet antistof rettet mod en af de andre epitoper på enzymerne, er konjugeret med guldpartikler. Disse vandrer sammen med prøvematerialet i bufferen langs nitrocellulosemembranen. Hvis prøven er positiv, vil konjugat-oxa-48/kpc komplekset komme i kontakt med det andet antistof, hvorefter det giver et visuelt resultat. Aflæsningen skal ske efter 15 minutter. I kassettens kontrolfelt (C) vil en rødlig streg komme til syne. Dette indikerer at der ikke er sket nogle fejl i kassettens procedurer og at resultatet er validt. I kassettens testfelt (T) vil der ved et negativt resultat ikke komme nogen rødlig streg til syne. Ved en rødlig streg i kassettens testfelt, kan resultatet tolkes som positivt. Selv en svag streg skal betragtes som positiv (20). På figur 5 ses billede af de tre kontroller der er blevet benyttet. De viser hhv. 2 positive og en negativ test. 16

Figur 5: Repræsentativt billede af hvordan stregerne ser ud. Alle tre kontrolstammer testet på hhv. OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. 17

3. Metodevalg og afgrænsning 3.1 Metodeovervejelser i forhold til prøvemateriale og udførelse Til at vurdere den diagnostiske sensitivitet og specificitet af OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT, er der testet 80 Enterobacteriaceae stammer. Alle carbapenemaseproducerende stammer er genotypet hos SSI. ESBL stammerne er genotypet på KMA, HvH. Bakteriearten er kendt, men genotypen kendes først ved undersøgelsens afslutning og fungerer som den gyldne standard i denne undersøgelse. OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT er, ifølge producenten, kun valideret til Enterobacteriaceae (20). Vi har valgt at teste samtlige stammer på OXA-48 K-SeT. Da antallet af KPC typer er begrænset, testes blot 22 af stammerne på KPC K-SeT. Underviser på KMA, HvH, Linda Schjerlund, har udvalgt stammerne. Vi valgte at benytte blå plader til udsåning af bakteriematerialet, da de har gode vækst betingelser for Enterobacteriaceae. Derudover er de valideret til analysen, ifølge Coris BioConcept (20). For at få den bedst mulige vækst, valgte vi at udså alle stammerne to gange på blå plader. Stammerne udsås direkte fra frysebuillion og vi vurderede, at for at få den mest optimale vækst og mængde på pladerne, ville det være at foretrække at benytte en isolering til de videre tests. På baggrund af instruksen for carbapenemasepåvisning for Enterobacteriaceae (15), har vi valgt at udføre samme konfirmatoriske tests, Modified Hodge Test og Carbapenemasepåvisning med KPC + MBL diagnostiske tabletter (MHT og KPC+MBL), på samtlige stammer. Dette gør vi for at vurdere deres generelle performance samt deres sensitivitet og specificitet i forhold til OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. Udover at notere tolkninger af MHT og KPC+MBL, har vi valgt at notere om en positiv MHT er svag og størrelsen (mm) på zonerne i KPC+MBL testen. I aflæsningen er der ikke taget hensyn til produktion af AmpC og disse er derfor noteret som sande negative (SN) i resultaterne. Derudover er der, ifølge genotypebestemmelsen, fundet andre OXA typer end dem kittene er valideret til. Det drejer sig om OXA-1 og OXA-10. Disse er der heller ikke taget hensyn til i de konfirmatoriske tests. 18

I forhold til aflæsning af de to kits har vi valgt at notere intensiteten af den fremkomne streg, i tilfælde af at der kunne være en sammenhæng mellem det og nogle af de andre resultater. Det samme gælder for densiteten af bakteriesuspensionen, som vi også har noteret. Derudover er udseendet af bakteriekolonierne blevet noteret i forhold til om de var mucoide eller ej. Til denne vurdering har vi valgt tage udgangspunkt i kontrolstamme E8 som var mucoid (se figur 6). Densiteten af bakteriesuspensionen og om kolonierne var mucoide eller ej, er ikke behandlet yderligere i denne rapport. Figur 6: Kontrolstamme E8 - E. coli mucoid 3.2 Metodeovervejelser i forhold til følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion Vi valgte endvidere at sammensætte to dispensere med udvalgte antibiotikadisks. Med den ene dispenser (A), ville vi se på muligheden for at screene for bestemte carbapenemasetyper. Indholdet ses i tabel 3. Middel Forkortelse Middel Forkortelse Meropenem 10 µg MEM10 Cefpodoxin 10 µg CPD10 Temocillin 30 µg TEM30 Amoxicillin + clavulansyre 30 µg AMC30 Ceftazidim 10 µg CAZ10 Piperacillin + tazobactam 36 µg TZP36 Tabel 3: Indhold i dispenser A (screening) Meropenem benyttes normalt i rutinen til at screene for carbapenemaser. Temocillin benyttes ikke på KMA, HvH som disk, men kun i KPC+MBL metoden til påvisning af CPE, som tablet. Vi valgte at bestille den som disk, så vi kunne inkludere den i screeningsdispenseren, da den jo som tablet benyttes til at give en indikation om, at der er tale om OXA 48. Ceftazidim er inkluderet da carbapenemaser ofte er resistente overfor cefalosporiner. Cefpodoxin og amoxicillin er inkluderet, 19

da disse i kombination screener for ESBL. Piperacillin + tazobactam er inkluderet da carbapenemaser ofte er resistente (12, 21). Med hensyn til tolkningen af screenings resultaterne og behandlingen af dem i resultats afsnittet, benyttes 26 mm for meropenem som cut-off værdi. Den benyttes i laboratorierutinen (bilag 1). Der er ikke fast sat nogle screenings cut-off værdier for temocillin og piperacillin + tazobactam. Så her benyttes cut-off værdier som er afprøvet ved en undersøgelse foretaget af Huang et al (23). Cutoff værdierne er hhv. <12 mm og <16 mm. Den anden dispenser (B) er rettet mod behandling af CPE. På opfordring af læge Lillian Marie Søes medtog vi denne kombination af antibiotika (tabel 4), med særlig hensyn til amikacin. Middel Forkortelse Middel Forkortelse Sulfamethizol + Trimethoprim SXT25 Amikacin AK30 Aztreonam ATM30 Nalidixan NA30 Gentamicin CN10 Ciprofloxacin CIP5 Tabel 4: Indhold af dispenser B (behandling) Behandlingsdispenseren fungerer som en sideløbende undersøgelse, og resultaterne vil blive præsenteret kort og kun med hensyn til amikacin. I diskussionen vil det ligeledes kun diskuteres kort. Diskene i dispenseren tager udgangspunkt i den sædvanlige behandling af Enterobacteriaceae. Alle zoner er aflæst og fortolket i henhold til anbefalinger og break points fastsat af EUCAST (16,17). Zonerne er målt manuelt med lineal på sort baggrund. De er endvidere målt og fortolket i et samarbejde mellem min projekt partner, Sarah Bauer og jeg. Hvad angår temocillin, har EUCAST ikke fastsat nogle break points for. Break points er derfor fastsat på baggrund af anbefalinger af Vanstone G. et al. som ved et studie har påvist at break points på 12 mm, som nedre grænse og 20 mm som øvre grænse, kan benyttes med EUCASTs metoder(22). I forhold til eventuel kontaminering, har vi valgt at udføre Maldi-Tof, ved mistanke derom. Holdbarhedsdatoen for alle agarplader er tjekket. Derudover er alle lot numre på disks, kits og tabletter noteret. 20

3.3 Valg af kontroller Til at vurdere validiteten og stabiliteten af MHT, KPC+MBL og følsomhedsbestemmelserne med agardiffusion, har vi benyttet kontrolstammerne ATCC 25922 E. coli (carbapenemase negativ), G4 Klebsiellea pneumoniae (KPC positiv) og kontrolstamme E8 E. coli (OXA-48 positiv). De to første er godkendte ATCC stammer og benyttes normalt til MHT og KPC+MBL. Kontrolstamme E8 er en patientprøve udvalgt at underviseren på KMA, HvH. Kontrollerne er udsået samtidig med isoleringen af teststammerne. Vi har desuden valgt kun at teste kontrolstammerne på begge kits, én enkelt gang. Begge kits har et kontrolfelt og dette benyttes som kontrol af testen. Kontrolstammernes resultater på begge kits kan ses i figur 5 side 17. 3.4 Ekstra tests Vi valgte til slut at udføre nogle ekstra test med OXA-48 K-SeT. Baggrunden for dette var, for det første, at vi havde observeret 2 falske negative teststammer og kontrolstamme E8, viste sig nu ikke længere at være carbapenemase positiv i de fænotypiske tests. For det andet kunne vi godt tænke os at se hvordan mængden af kolonimateriale kunne påvirke testen, og hvordan udseendet af stregen eventuelt kunne ændre sig, hvis man aflæser den efter 30 minutter. 3.5 Beregninger. Sensitiviteten og specificiteten er udregnet for OXA-48 K-SeT, KPC K-SeT, Modified Hodge Test og carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, på baggrund af optælling af hhv. sande positive og falske negative samt sande negative og falske positive, ud fra resultaterne i bilag 2. Hensigten er at se hvordan metoderne fungerer i forhold til hinanden. Derudover er sensitiviteten og specificiteten udregnet for hvorledes meropenem kan screene for CPE. Ligeledes er sensitiviteten og specificiteten udregnet for hvorledes en kombination af meropenem, temocillin og piperacillin + tazobactam, kan screene for OXA-48. Denne kombination er lavet på baggrund af et studie udført af Huang et al (23). 21

Følgende ligninger er valgt til udregning: Sensitivitet = Specificitet = Antal sande positive antal sande positive + antal falske negative Antal sande negative antal sande negative + antal falske positive En høj sensitivitet betyder, at analysen er god til at detektere de positive. En høj specificitet betyder, at analysen er god til at detektere eller frikende de negative (24). Analyse Gylden Standard Sande positive Positiv Positiv Sande negative Negativ Negativ Falske positive Positiv Negativ Falske negative Negativ Positiv Tabel 5: Definitioner Gylden standard svarer til det resultat der er opnået ved genotypebestemmelsen. Analysen svarer til den pågældende analyse man ønsker at sammenligne med den gyldne standard. 22

4. Materialer og Metode 4.1 Prøvemateriale og materiale Til forsøget er der anvendt i alt 80 frysestammer, som er opbevaret i en fryser ved - 80 C på KMA, HvH. Alle stammer er Enterobacteriaceae. Desuden er alle CPE genotypet på SSI, dog var de blindet i denne undersøgelse indtil alle resultater var opnået. Af de 80 stammer er de 27 af dem OXA-48 positive, 9 af stammerne er KPC positive og 19 er andre carbapenemaser så som NDM, VIM, IMP og IMI. De resterende 25 er enten positive for andre beta-lactamaser eller negative for både carbapenemaser og beta-lactamaser. De fleste af stammerne er indsamlet på KMA, HvH over et længere stykke tid (50 stammer navngivet efter placering i fryser). 30 af stammerne er tilsendt af NORDICAST (navngivet fra 1 30) Se en oversigt over alle stammer i tabel 6. Som kontroller er der blevet anvendt ATCC 25922 E. Coli som negativ kontrol. G4 Klebsiella pneumoniae som er positiv for KPC. Disse kontroller anvendes dagligt i rutinen på KMA HvH. Som en OXA-48 kontrol anvendes en genotypet patientprøve, som har været nedfrosset (tabel 7). 23

Bakterieart Antal OXA-48 positive KPC Positive Andre carbapenemaser Negative eller ESBL/AmpC E. coli 27 10 0 5 12 Klebsiella 32 12 5 7 10 Pneumoniae Klebsiella oxytoca 3 2 0 0 1 Enterobacter 8 1 4 1 2 Cloacae Citrobacter 2 2 0 0 0 freundii Providencia 2 0 0 2 0 Sturatii Proteus mirabilis 3 0 0 2 1 Citrobacter 1 0 0 1 0 sedlakii Enterococcus 1 0 0 0 1 Aerogenes Providencia 1 0 0 0 1 Rettgeri I alt 80 27 9 18 28 Tabel 6: Oversigt over de 80 stammer som er inkluderet i forsøget. To af stammerne (hhv. D1 og 2) her i tabellen talt med 2 gange, da de er positive for OXA-48 og NDM. Kolonnen med Andre carba pos indeholder typerne NDM, VIM, IPM og IMI. Kolonnen med Negative eller ESBL/AmpC positive indeholder rent carbapenemase negative stammer, og ESBl/ AmpC positive stammer. ATCC 25922 E.coli G4 Klebsiella pneumoniae E8 E. coli Negativ KPC positiv OXA-48 positiv Tabel 7: Kontroller benyttet til undersøgelsen. Hhv. én carbapenemfølsom stamme samt én KPC positiv og én OXA-48 positiv. 24

Lot. Nr. Lot. Nr. skift Materialer Blå plader MH-A plader 1 µl øjepodenåle 10 µl øjepodenåle Vatpinde Plastrør Saltvand Apparatur Retro80 pladespreder Densicheck Inkubator 37 grader, atmosfærisk luft MaldiTof Anvendte kits OXA-48 K-SeT 34592L1518 Indhold: Kassette Plasticrør Ly-A buffer Dropper KPC K-SeT 34591L1517 Indhold: Kassette Plasticrør Ly-A buffer Dropper Anvendte antibiotikadisks - Dispenser A Meropenem 10 µg 1781911 1718555 fra 14 Temocillin 30 µg 1798830 Ceftazidim 10 µg 1646438 Cefpodoxin 10 µg 1721107 1786236 fra 11 25

Amoxicillin + clavulansyre 1772238 1749853 fra 15 30 µg Piperacillin + tazobactam 1789579 36 µg - Dispenser B Sulfamethizol + 1722227 1700703 fra 21 trimethoprim 25 µg Aztreonam 30 µg 1584721 Gentamicin 10 µg 1779379 Amikacin 30 µg 1806597 Nalidixan 30 µg 1760322 Ciproflaxacin 5 µg 1786670 Disks til MHT Ertapenem 10 µg 1675568 Meropenem 10 µg 1718555 KPC+MBL diagnostiske Meropenem 10 µg 1404-4. 1502-1 fra 15 tabletter Meropenem + Borsyre 1301-1 1501-2 fra 16 Meropenem + cloxacillin 1402-3 1501-2 fra 19 Meropenem + 1402-2 1501-1 fra 19 dipokolinsyre Temocillin 30 µg 1401-1 Tabel 8: Materialer 26

4.2 Fremgangsmåde Fremgangsmåden præsenteres her ud fra flowdiagrammet (figur 7). Nye stammer blev udsået hver dag i 8 dage. DAG 1 DAG 2 DAG 3 DAG 4 DAG 5 DAG 6 1. Udså Isolering Udføre tests Aflæsning og tolkning 1. Udså Isolering Udføre tests Aflæsning og tolkning 1. Udså Isolering Udføre tests Aflæsning og tolkning Figur 7: Flowdiagram over forsøgets gang. Diagrammet viser kun de første 3 udsåninger. 1. udså = udsåning direkte fra frys. Isolering = isolering fra første udsåning. Udføre tests = OXA-48 K-SeT/KPC K-SeT, fænotypiske tests og følsomhedsbestemmelse. 4.2.1 Forberedelse af stammerne første udsåning og isolering Frysestammerne udsås direkte på en blå plade vha. 10 µl øjepodenål ved en tretrinsspredning. Der udsås ca. 10 stammer pr. dag. Agarpladerne inkuberes ved 37 C til den følgende dag. Den følgende dag udføres en isolering af stammerne på nye blå plade direkte med 1 µl øjepodenål, ved at dyppe den forsigtigt 3 forskellige steder i kolonimaterialet og derefter lave en ny tretrinsspredning. Ved denne udsåning udsås ligeledes de tre kontroller. De nye plader inkuberes ved 37 C til den følgende dag, hvor der udføres OXA-48 K-SeT, KPC K-SeT, MHT, KPC+MBL og følsomhedsbestemmelse ved agardiffusion. På kontrollerne udføres kun MHT, KPC+MBL og følsomhedsbestemmelse. 27

4.2.2 Udførelse af metoderne 4.2.2.1 OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT Begge kits udføres på samme måde. 1. Kassetten pakkes ud 2. Prøvenummer noteres på kassetten 3. 10 dråber LY-A buffer tilføjes plasticrøret 4. Med en 10 µl øjepodenål, opsamles en smule kolonimateriale, ved at dyppe den forsigtigt i en koloni 5. Kolonimateriale afsættes i bufferen i røret og der røres grundigt til man opnår en homogen blanding 6. 3 dråber placeres i brønden på kassetten 7. Afvent 15 minutter 8. Aflæs resultat Aflæsningen er sket ved at konstatere om der er en synlig streg i kontrolfeltet og i testfeltet. Resultatet er noteret som positiv (synlig streg) eller negativ (ingen synlig streg). Det er noteret hvis stregen har været særlig stærk eller svag i testfeltet. 4.2.2.2 MHT 1. En MH-A plade tilsås med en 0,5 McFarland suspension af ATCC 25922 E. coli 2. Diskene ertapenem 10 µg og meropenem 10 µg placeres midt på pladen med ca. 3 cm mellemrum 3. Kolonimateriale fra prøvestammen opsamles med en 1 µl øjepodenål og sættes som en streg mellem de to disks 4. Pkt. 3 gentages, så der sættes streger fra de resterende tre sider af diskene ud til kanten af pladen. 5. Pladen inkuberes i 16-20 timer ved 37 C. 28

Resultatet er aflæst som positivt når der er dannet det karakteristiske kløverblad eller negativ når det intet kløverblad er dannet. Særligt svage positive resultater (når det er svært at vurdere om der er det karakteristiske kløverblad) er noteret som svag positiv. 4.2.2.3 KPC+MBL 1. MH-A plade tilsåes med en 0,5 McFarland suspension af prøvestammen (samme suspension benyttes til følsomhedsbestemmelsen) 2. Alle 5 tabletter placeres på pladen 3. Pladen inkuberes i 16 20 timer ved 37 C. Alle zoner er målt og tolket ud fra tabel 2. 4.2.2.4 Følsomhedsbestemmelse med agardiffusion 1. MH-A plade tilsåes med en 0,5 McFarland suspension af prøvestammen (samme suspension benyttes til KPC+MBL) 2. Diskene påsættes med en dispenser 3. Pladen inkuberes i 16 20 timer ved 37 C. Alle resultater er målt og tolket ud fra de samme break points som de benytter i rutinen (se evt. bilag 1). 4.3 Ekstra tests Alle tre stammer (D1, 23 og kontrolstamme E8) blev udsået direkte fra frysebuillion på blå plade og inkuberet til den efterfølgende dag hvordan der blev udført en isolering, før testen blev udført. Alle tre stammer blev testet på to OXA-48 K-SeT kits. Mængden af kolonimateriale blev varieret, ved at der i den ene blev tilsat hvad der svarede til et dyp i en koloni. I den anden fyldtes øjet i en 10 µl øjepodenål med materiale. Testene blev ellers udført som beskrevet nedenfor. 1. Kassetten pakkes ud 2. Prøvenummer noteres på kassetten 3. 10 dråber LY-A buffer tilføjes plasticrøret 29

4. Opsaml kolonimateriale med 10 µl øjepodenål (et dyp eller et fyldt øje) 5. Kolonimateriale afsættes i bufferen i røret og der røres grundigt, til man opnår en homogen blanding 6. 3 dråber placeres i brønden på kassetten 7. Afvent 15 minutter 8. Aflæs resultat 9. Afvent yderligere 15 minutter (i alt 30 minutter) 10. Aflæs resultat 30

5. Resultater En samlet oversigt over alle resultater er vist i bilag 2 og 3. Sand positiv (SP), sand negativ (SN), falsk positiv (FP) og falsk negativ (FN) er noteret for den pågældende fænotype. Bemærk at der i resultaterne for KPC+MBL metoden, godt kan forekomme mere end ét resultat, da testen er baseret på flere kombinationer af tabletterne samt zonen omkring temocillin. Dette betyder at nogle stammer f.eks. er positive for MBL samtidig med at zonen omkring temocillin påviser en mulig OXA- 48. Derudover er der en samlet oversigt over tolkningen (S-I-R) af stammernes følsomhedsbestemmelse med dispenser A og B i bilag 3. Alle optællinger i dette resultatafsnit er sket på baggrund af tabellerne i bilag 2 og bilag 3. Alle tabeller er forklaret undervejs. 5.1 Resultater - OXA-48 K-SeT Golden standard Positiv Negativ I alt OXA-48 K- SeT Positiv 25 0 25 Negativ 2 53 55 I alt 27 53 80 Tabel 9: n=80. Sammenhængen mellem OXA-48 K-SeT og genotypen. Genotypen er her gylden standard og altså den sande værdi. Tabellen viser sande positive (n=25), sande negative (n=53), falske negative (n=2), falske positive (n=0). Tabel 9 viser resultaterne opnået ved at teste alle stammer på OXA-48 K-SeT. 2 stammer (D1 og 23) viste sig som falske negative. Der er tale om hhv. Klebsiella pneumoniae og E. coli. Der blev ikke observeret nogle falske positive. 31

I nogle af de udførte tests fremkom en særlig svag eller stærk streg. Tabel 10 viser en oversigt over hvilke stammer, der viste særligt svage eller stærke streger i OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT sammen med bakterieart og genotype. Det er især hos Klebsiella pneumoniae at man ser en tendens til svage resultater. Figur 7 viser billeder af hhv. stærk og svag streg. Figur 8 viser billede af en svag streg. Stamme Stærk/svag Bakterieart Genotype B2 Svag Klebsiella OXA-48 pneumoniae B3 Stærk Enterobacter OXA-48 cloacae B6 Svag Klebsiella OXA-48 Oxytoca B7 Stærk E. Coli OXA-48 + TEM F4 Stærk Enterobacter KPC-2 + CTX-M-15 cloacae F5 Svag Enterobacter KPC-2 cloacae 1 Svag Klebsiella OXA-48+CTX-M-15 +SHV pneumoniae 2 Meget svag Klebsiella NDM-1 + OXA-181 pneumoniae 6 Svag Klebsiella OXA-48 + LEN-16 pneumoniae 14 Svag Klebsiella pneumoniae OXA-48 + SHV-11 Tabel 10: Oversigt over stammer som enten har vist en særlig stærk eller svag streg. 32

Figur 8: B2 og B3 illustrerer hhv. en svag og en stærk streg Klebsiella pneumoniae Figur 9: Stamme 2 illustrerer en svag streg Klebsiella pneumoniae 33

5.2 Resultater KPC K-SeT Golden standard Positiv Negativ I alt KPC K-SeT Positiv 6 0 6 Negativ 0 16 16 I alt 6 16 22 Tabel 11: n = 22. Sammenhængen mellem KPC K-SeT og genotypen som er golden standard og den sande værdi. Tabellen viser sande positive (n=6), sande negative (n=16), falske negative (n=0), falske positive (n=0). Bemærk: Blot 22 stammer er testet. Tabel 11 viser resultater opnået ved at teste 22 stammer på KPC K-SeT. Hverken falske positive eller falske negative blev påvist i denne test. 5.3 Resultater Modified Hodge Test Golden standard Positiv Negativ I alt MHT Positiv 47 3 50 Negativ 5 25 30 I alt 52 28 80 Tabel 12: n = 80. Sammenhængen mellem Modified Hodge Test og genotypen som er den sande værdi, for samtlige carbapenemaseproducerende stammer. Tabellen viser sande positive (n=47), Sande negative (n=25), falske negative (n=5), falske positive (n=3). Tabel 12 viser resultater opnået ved at teste alle stammer med Modified Hodge Test. 5 falske negative stammer blev påvist (C9, D1, D6, D7 og 5). De er alle 5, ifølge genotypebestemmelsen, NDM positive. 3 stammer testede falsk positiv (16, 20 og 21) og blev fejlagtigt påvist som carbapenemaseproducerende. Alle 3 er, ifølge genotypebestemmelsen, negative. 34

5.4 Resultater Carbapenemase påvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter Golden standard Positiv Negativ I alt KPC+MBL Positiv 48 12 59 Negativ 5 25 30 I alt 52 37 90 Tabel 13: n = 90 aflæsninger Bemærk: 10 ekstra aflæsninger da testen kan give flere resultater. Desuden er D1 og 2 er både NDM og OXA positiv. Sammenhængen mellem KPC+MBL diagnostiske tabletter, og genotypen som den sande værdi, i forhold til at identificere samtlige carbapenemaseproducerende stammer. Sande positive (n=48), sande negative (n=25), falske negativ (n=5), falske positive (n=12). Alle negative, ESBL og AmpC er optalt som sande negative. Tabel 13 viser resultaterne opnået med carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter for samtlige carbapenemaseproducerende stammer. Metoden kan give mere end ét resultat pr. stamme, der er derfor 10 aflæsninger mere, end der er stammer. 5 stammer blev testet falsk negativ (A2, D1, D5, 8 og 9). De er alle, ifølge genotypebestemmelsen, af MBL typen (VIM eller NDM). Tolv stammer testede falsk positiv (B8, D6, F4, 5, 7, 12, 13, 19, 21, 22, 27 og 29). 8 af dem blev fejlagtigt påvist som OXA-48 og 4 af dem som KPC. 5.4.1 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter Detektion af OXA-48 Golden standard OXA-48 Positiv Negativ I alt KPC+MBL Positiv 27 8 35 Negativ 0 45 45 I alt 27 53 80 Tabel 14: n = 80, OXA-48 typer identificeret vha. KPC+MBL (nedsat ved temocillin). Tabellen viser sande positive (n=27), sande negative (n=46), falske negative (n=0), falske positive(n=8). Andre CPE fund samt CPE negative er her optalt som sande negative. Tabel 14 viser resultater opnået med carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter i forhold identificering af OXA-48. Ingen testede falsk negativ. De OXA-48 der er detekteret korrekt, er her angivet som sande positive (27). De falske positive (8) er de stammer som har en 35

hæmningszonen omkring temocillin på under 12 mm og fejlagtigt er blevet identificeret som OXA- 48 (B8, D6, F4, 5, 7, 19, 27 og 29). De sande negative (45) er alle de stammer som, ifølge genotypebestemmelsen, er OXA-48 negative og ikke har haft en temocillinzone på under 12 mm. Her er der kun taget hensyn til antallet af stammer og ikke antallet af aflæsninger, som i tabel 13. 5.4.2 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter Detektion af KPC KPC KPC+MBL Golden standard Positiv Negativ I alt Positiv 9 4 13 Negativ 0 67 67 I alt 9 71 80 Tabel 15: n = 80. KPC typer identificeret ved KPC+MBL metoden. Tabellen viser sande positive (n=9), sande negative (n=67), falske negative (n=0), falske positive (n=4). Andre CPE fund samt CPE negative er her optalt som sande negative. Tabel 15 viser resultaterne opnået med carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter i forhold til at identificere KPC typer. Ingen testede falsk negativ. De KPC stammer der er detekteret korrekt er angivet som sande positive (9). De falske positive (4) er de stammer som fejlagtigt er tolket som KPC (12, 13, 21 og 22). De sande negative (67) er de stammer som, ifølge genotypebestemmelsen, er KPC negative og ikke er blevet tolket som KPC i KPC+MBL testen. Her er der kun taget hensyn til antallet af stammer og ikke antallet af aflæsninger, som i tabel 13. 36

Tabel 16 viser en samlet oversigt over sensitivitet og specificitet, beregnet ud fra de tidligere tabeller. Test Sensitivitet Specificitet OXA-48 K-SeT 92,59 % 100 % KPC K-SeT 100 % 100 % MHT 90,38 % 89,29 % KPC+MBL 90,57 % 67,57 % KPC+MBL (OXA-48) 100 % 84,91 % KPC+MBL (KPC) 100 % 94,37 % Tabel 16: Sensitivitet og specificitet for samtlige tests udregnet på baggrund af tabellerne 9, 11, 12, 13, 14 og 15 37

5.5 Resultater Dispenser A (screening) Følgende disks bliver behandlet her: Meropenem, temocillin og piperacillin. Den valgte kombination og screenings cut-off værdier, tager udgangspunkt i et studie foretaget af Huang et al (23). 5.5.1 Screening med meropenem 10 µg Golden standard Positiv Negativ I alt Positiv 51 9 60 Meropenemzone 26 mm Negativ 1 19 20 I alt 52 28 80 Sensitivitet Specificitet 98,08 % 67,86 % Tabel 17: N=80. 2 stammer er både NDM og OXA positive, men er talt med som OXA-48. SP = Alle carbapenemasepositive med en zone på 26 mm eller under. SN = Alle carbapenemasenegative med en zone over 26 mm. FN = Alle carbapenemasepositive med en zone på over 26 mm. FP = Alle carbapenemasenegative med en zone på 26 mm eller under. Tabel 17 viser hvorledes en cut-off værdi på 26 mm for meropenem, kan detektere CPE i denne undersøgelse. Én viser sig at være falsk negativ (D1), dvs. den har en hæmningszone >26 mm og bliver altså ikke detekteret i screeningen. 9 stammer (B9, D3, 12, 13, 15, 18, 21, 22 og 30) er falske positive. Dvs. deres hæmningszone ligger under cut-off værdien og bliver fejlagtigt detekteret i screeningen. Meropenem benyttes til at screene for alle carbapenemasetyper, derfor er der ikke taget særligt hensyn til meropenems evne til alene, at kunne screene for OXA-48. Nedenstående tabeller viser dog hvorledes temocillin og piperacillin+tazobactam kan screene for OXA-48. 38

5.5.2 Screening med temocillin 30 µg Golden standard Positiv Negativ I alt Positiv 27 10 37 Temocillin < 12 mm Negativ 0 15 15 I alt 27 25 52 Sensitivitet Specificitet 100 % 60 % Tabel 18: Temocillins evne til at screene for OXA-48 i blandt andre carbapenemaseproducerende stammer. Tabel 18 viser hvorledes temocillin alene er i stand til at screene for OXA-48. Alle 27 OXA-48 stammer detekteres. 10 OXA-48 negative stammer er falske positive og bliver altså fejlagtigt detekteret. 5.5.3 Screening med piperacillin + Tazobactam 36 µg Golden standard Positiv Negativ I alt Piperacillin + tazobactam <16 mm Positiv 27 22 49 Negativ 0 3 3 I alt 27 25 52 Sensitivitet Specificitet 100 % 12 % Tabel 19: Piperacillin + tazobactams evne til at screene for OXA-48 Tabel 19 viser hvorledes piperacillin + tazobactam er i stand til at screene for OXA-48. Alle 27 OXA- 48 stammer blev detekteret, men det viser sig at specificiteten er ekstrem lav, da 22 ud af 25 CPE stammer, som producerer andre carbapenemaser, fejlagtigt bliver detekteret. 39

5.5.4 Kombination af antibiotika til screening for OXA-48 Golden standard Meropenemzone 26 mm Temocillin <12 mm Piperacillin + tazobactam <16 mm Positiv Negativ I alt Positiv 25 12 37 Negativ 2 13 15 I alt 27 25 52 Sensitivitet Specificitet 92,59 % 52 % Tabel 20: Kombination af MEM, TEM og TZP til screening for OXA-48. Alle CPE er medtaget. To stammer er både OXA-48 og NDM positive, disse er talt med under OXA-48. Tabel 20 viser kombinationen af 3 antibiotika til screening for OXA-48. For at være sand positiv kræver det at bakterien ligger under de anvendte cut-off værdier, ved alle tre disks. Stamme C2 og D1 er falske positive, da C2 er målt til 16 mm ved piperacillin + tazobactam disken og D1 er målt til 29 mm ved meropenem disken. Der er tale om 12 falske positive, altså de ville i dette tilfælde, blive fejlagtigt detekteret i en OXA-48 screening. 40

5.6 Resultater Dispenser B (behandling) Følgende 2 tabeller viser antallet af hhv. sensitive, intermediære og resistente stammer, for hver ambler klasse, aflæst ved amikacin og gentamicin diskene. 5.6.1 Amikacin 30 µg Klasse S I R I alt A 8 2 0 10 B 7 2 6 15 D 23 0 2 25 B + D* 1 0 1 2 Carba neg 27 0 1 28 I alt 66 4 10 80 Tabel 21: n = 80 aflæsninger Tabellen viser antallet af hhv. sensitive, intermediære og resistente for hver carbapenemase klasse, samt ved carbapenemase negative, stammer, aflæst ved AK30 disken. *Stamme D1 og 2 er både NDM og OXA-48 positive. 5.6.2 Gentamicin 10 µg Klasse S I R I alt A 5 2 3 10 B 8 2 5 15 D 11 1 13 25 B + D* 1 0 1 2 Carba neg 16 1 11 28 I alt 41 6 33 80 Tabel 22: n = 80 aflæsninger. Tabellen viser antallet af hhv. sensitive, intermediære og resistente for hver carbapenemase klasse, samt ved carbapenemase negative, stammer, aflæst ved CN10 disken. *Stamme D1 og 2 er både NDM og OXA-48 positive. Stamme D1 og 2 var både, ifølge genotypebestemmelsen, positiv for NDM og OXA-48 og altså både ambler klasse B og D. D1 er sensitiv for amikacin og gentamicin. Stamme 2 er resistent for amikacin og gentamicin. 41

5.7 Resultater Kontrolstammer KPC G4 OXA-48 E8 NEG ATCC 25922 E. coli MHT KPC + MBL 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP FN SP SP SP SP SP SP FN FN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN SN Tabel 23: Resultater fra de 8 gange kontrolstammerne blev udsået Kontrolstammerne viser overordnet en stabil tendens i Modified Hodge Test og carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter. Dog afviger E8 kontrolstammen de sidste to dage. 42

5.8 Ekstra tests med OXA-48 K-SeT Efterfølgende er der lavet yderligere bestemmelser med OXA-48 K-SeT. I et lille forsøg med stammerne D1, 23 og kontrolstammen E8, blev der udført 2 bestemmelser med OXA-48 K-SeT, for hver stamme. Det skulle påvise om mængden af kolonimateriale, har indflydelse på resultatet. Derudover ville det være interessant at se om stammerne, D1 og 23, endnu engang faldt ud som positive. Pga. kontrolstammen E8 og dens pludselige ændring i de fænotypiske tests og følsomhedsbestemmelse, blev den medtaget her, for at vurdere om den også ville falde ud som negativ som det havde gjort i de fænotypiske tests. 1 dyp* Øjepodenål* 15 min 30 min 15 min 30 min E8 kontrol - - - - D1 - - - - 23 + + Svag + + Tabel 24: Tiden for aflæsning er hhv. 15 minutter og 30 minutter. Derudover var der en forskel i mængden af materiale. *1 dyp = en 10 µl øjepodenål dyppes i en koloni jvf. Indlægssedlen for OXA-48 K-SeT. Øjepodenål = øjet på øjepodenålen fyldes ud med kolonimateriale. Tabel 24 viser at kontrolstamme E8 nu er negativ. D1 er fortsat negativ og stamme 23 er nu positiv. Derudover ses der et svagt resultat aflæst efter 15 minutter med en kolonimateriale mængde svarende til 10 µl øjepodenål (figur 9). Figur 10: Stamme 23. Kassette 1.= 1 Dyp. Kassette 2.= 10 µl. Aflæst efter 15 minutter. 43

6. Diskussion I dette afsnit diskuteres resultaterne. Der lægges ud med resultaterne opnået med Modified Hodge Test og carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter. Derefter kommenteres resultaterne opnået ved OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. Endvidere diskuteres resultaterne fra følsomhedsbestemmelsen med dispenser A, med henblik på at screene for OXA-48 i de indledende følsomhedsbestemmelser som normalt finder sted i rutinen. Endelig kommenteres kort resultaterne opnået med dispenser B, med henblik på behandling med amikacin. Til slut kommenteres kontrolstamme E8, som ændrede adfærd til sidst under udførelsen. 6.1 Modified Hodge Test Alle 80 stammer er testet med MHT. På den baggrund er sensitiviteten udregnet til 90,38 % og specificiteten til 89,29 %. Disse resultater er beregnet på baggrund af MHTs evne til at påvise carbapenemase generelt, da metoden ikke diskriminerer mellem carbapenemasetyperne. Der blev fundet tre falske positive ved MHT (tabel 12 s. 34). Stamme 16, 20 og 21. Ifølge Miriague et al. og Carvalhaes et al. er der en tendens til falske positive ved brug af MHT og dette kan skyldes stammer som producerer CTX-M og porin tab (25, 26). Disse har nemlig også i nogle tilfælde været ansvarlige for resistens mod carbapenemer (26). Det er dog ikke tilfældet med de tre falske positive stammer i denne undersøgelse. De er fuldt negative ifølge genotypebestemmelsen. Det viser sig at stamme 20 er en Proteus mirabilis og her kan sværmen være årsag til ændret udseende og derved at den aflæses som positiv (figur 11). Rai et al. som har testet 102 Enterobacteriaceae stammer med MHT, nævner også dette problem ved aflæsning af Proteus sp (27). Figur 11: Stamme 20 falsk positiv. Proteus mirabilis med sværm. Negativ i PCR 44

I undersøgelsen her var der i alt 3 stammer som var Proteus mirabilis. Stamme D5 og 8 blev tolket som sande positive, men svage. De producerer begge NDM carbapenemaser. D5 er illustreret i figur 13. Der er ingen sværm at se. Af de sande MHT positive stammer (n=47), er 7 stammer vurderet som svage positive stammer. Én er OXA-48 positiv. 6 af dem er NDM positive. Miriague et al. påstår at MBL typerne kan give svage resultater og at det kunne forbedre testens sensitivitet at tilsætte zink sulfat til substratet, da disse metallo enzymer, benytter zinkioner til at hæmme beta-laktamerne. Tilsætning af zink vil derved øge aktiviteten af enzymerne (25). Figur 12 og 13 viser billeder af NDM positive stammer og deres svage MHT resultat. Figur 12: Stamme A2. E. coli. NDM. Svag sand positiv. Figur 13: Stamme D5.Proteus mirabilis. NDM. Svag sand positiv. Den subjektive tolkning af MHT spiller altså en stor rolle i hvorledes den er pålidelig. Ud over de svage positive resultater, skal det også nævnes at der blev fundet 5 falske negative, netop fordi de ikke havde de karakteristiske kløverblad. Følgende stammer gav et falsk negativt resultat i MHT: C9, D1, D6, D7 og 5. Figur 14 og 15 illustrere D7 og D6. Fælles for alle stammerne er at de er af MBL typen, nemlig NDM. Jeremiah et al. beskriver problemet med at identificere MBL typerne vha. MHT. Endvidere beskrives sensitiviteten for at påvise NDM til at være helt nede på 11 % og modifikationer, så som tilsætning af zink eller lave analysen i kombination med andre fænotypiske tests, bør overvejes. Men samtidig skriver de også at modifikationer til MHT aldrig vil kunne eliminere problemet med den subjektive tolkning. (28) 45

Figur 14: Stamme D7. Falsk negativ. Providencia Stuartii. Figur 15: Stamme D6 - Falsk negativ. E. coli. Alle OXA-48 samt KPC typer, blev detekteret i MHT metoden, på nær én stamme, D1. Dog blev omkring 10 % af alle CPE stammerne ikke tolket som sande positive, med en sensitivitet på 90,38 %. Det er tydeligt at aflæsningen af MHT potentielt kan give nogle problemer, både pga. den subjektive tolkning, men også det at nogle MBL typer har så svag aktivitet, at de slet ikke giver det karakteristiske kløverblad. I laboratorierutinen på KMA, HvH henvises man til at udføre en MHT ved mistanke om CPE sammen med carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter. MHT står altså aldrig alene (15). 6.2 Carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, med fokus på OXA-48 og KPC Ifølge tabel 14 side 33 er der detekteret 8 stammer som var falske positive for OXA-48, dvs. disse stammer har en zone omkring temocillin tabletten som er 12 mm. Stammerne var enten af MBL typen eller KPC typen, ifølge genotypebestemmelse. I forhold til KPC, blev der, ifølge tabel 15, fundet 4 falske positive. Dvs. at forskellen i zonestørrelsen mellem meropenem tabletten og meropenem + borsyre tabletten er 5 mm for disse stammer. Carbapenemase påvisning med KPC+MBL diagnostiske tabletter, identificerede dog alle OXA-48 og alle KPC typer, hvilket giver en sensitivitet for begge tests på 100 %. Men hvad ligger til grund for de falske positive OXA-48 og KPC? 46

Hvis man kigger nærmere på de stammer som er falske positive for OXA-48, så er 6/8 MBL positive og 2/8 er KPC positive. 7/8 er yderligere positive for andre beta-laktamaser så som CTX-M, CMY, SHV og LEN. 1/8 er udelukkende MBL positiv (NDM). Umiddelbart kunne det tyde på, at produktionen af andre beta-laktamaser er aktive mod temocillin. Ifølge Bakthavatchalam et al. er ESBL og AmpC enzymer stabile overfor temocillin, men der er observeret resistens hos nogle KPC og MBL typer (7). Det giver god mening i forhold til resultaterne i denne undersøgelse, da de stammer der var falsk positive for OXA-48, ifølge genotypebestemmelsen, er MBL og KPC typer. Dvs. at f.eks. CTX-M og CMY enzymer, højst sandsynligt ikke står bag. I et studie udført af Woodford et al. har de testet temocillin som en diagnostisk indikator. De fandt at de kunne udelukke alle OXA-48 typer når de benyttede en MIC værdi på 128 mg/l (svarer til en cut-off værdi på 12 mm), men en del andre carbapenemaseproducerende bakterier, og her nogle ESBL/AmpC producerende bakterier, viste også resistens for temocillin. Dvs. selvom OXA-48 kan udelukkes ved en zone på over 12 mm, kan man ikke udelukkende hævde at der er tale om OXA-48 når zonen er mindre end 12 mm (29). Alle stammer i denne undersøgelse, med en zone på over 12 mm i denne test, kunne udelukkes som OXA-48 typer. Alle OXA-48 blev identificeret med en zone under 12 mm (tabel 14 s. 35). Hartl et al. påstår, i modsætning til Bakthavatchalam et al. at AmpC og ESBL producerende bakterier kan efterligne OXA-48. De har også lavet et studie som skulle påvise temocillins evne til at detektere OXA-48 og fandt at OXA-48 kunne detekteres med en MIC værdi 128 mg/l, men også at andre carbapenemaseklasser havde en MIC 128 mg/l (30). Fælles for begge studier er at de foreslår at man bør kombinere temocillin med synergi tests, som meropenem + enzymhæmmere, for at diskriminere mellem OXA-48 og andre carbapenemaser og beta-lactamaser. Alt dette taget i betragtning, kan man ved at gennemse resultaterne for de OXA-48 falske positive stammer, påvise at 8/8 også er positive for deres respektive genotyper. 6 er af MBL typen og 2 er af KPC typen. Endvidere er 4 af dem co-producerende CTX-M og CMY typer. Stamme 7 er af VIM typen, men også OXA 1. Dvs. trods de falske positive resultater for OXA-48, blev deres genotyper korrekt identificeret. 47

Sensitiviteten i forhold til at identificere OXA-48 og KPC er 100 %. Dog skal man være opmærksom på, at ved en hæmningszone på <12 mm omkring temocillin tabletten, kan man ikke udelukke andre beta-lactamaser (inklusiv carbapenemaser). Som tidligere nævnt, tolkes MHT og KPC+MBL altid sammen. Men betyder det så, at dét den ene test ikke detektere, vil den anden detektere? D1 blev fundet falsk negativ i MHT og falsk negativ for NDM i KPC+MBL, men sand positiv for OXA-48. De andre stammer som blev fundet falsk negativ i den ene test, blev detekteret i den anden test. 6.3 Identifikation med OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT viser i denne undersøgelse begge en specificitet på 100 % og en sensitivitet på henholdsvis 92,59 % og 100 %. Wareham et al. har testet 82 Enterobacteriaceae stammer på OXA-48 K-SeT med en sensitivitet og specificitet på 100 % (31) og stemmer altså ikke helt overens med resultaterne i denne undersøgelse. Glupczynski et al. har desuden testet 92 Enterobacteriaceae stammer på OXA-48 K- SeT og KPC K-SeT, også med en sensitivitet og specificitet på 100 % (32). Her til skal det tages i betragtning at sidste nævnte kan have en interessekonflikt, da flere af forfatterne er ansat ved Coris BioConcept. Testene i denne undersøgelse er udført som beskrevet under afsnit 4.2, i henhold til den beskrevne fremgangsmåde i indlægssedlen fra OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT kittene. Ifølge den ekstra undersøgelse, der blev foretaget for stammerne D1, 23 og kontrolstamme E8, blev 23 tolket som positiv i anden omgang. Det vides ikke hvad der ligger til grund for at den i første omgang blev tolket som negativ. Det kunne bl.a. skyldes at der ikke, som antaget, har været kolonimateriale, på øjepodenålen eller det ikke er blevet afsat i bufferen. Derudover nævnes det i indlægssedlen, at man skal omrøre bufferen med kolonimaterialet omhyggeligt for at få en homogen blanding. Muligheden for at det ikke har været omhyggeligt nok, foreligger også. De ekstra tests der blev foretaget med OXA-48 K-SeT (tabel 24 s. 43) viser at D1 forsat er negativ og det kan spekuleres om det, at stammen også er NDM positiv, kan have indflydelse på hvordan OXA- 48

48 enzymerne er udtrykt på cellemembranen, og dermed hvorledes den opfanges af antistofferne i testen. Derudover er der generelt observeret en forskel i de fremkomne streger. Nogle er mere stærke og andre er mere svage. Ifølge Coris BioConcept (20), er den varierende intensitet i teststregen, helt naturlig i forhold til hvor mange antigener der er udtrykt på bakteriecellens overflade og hvilken OXA-48 eller KPC variant der er tale om. Af de streger der er vurderet som svage i denne undersøgelse, er der kun tale om OXA-48 og altså ikke en variant af OXA-48 (tabel 10 s. 32). Man kunne så spekulere om det, i så fald, er mængden af antigener på cellens overflade og om det, at der er andre beta-lactamaser tilstede, kan have en betydning. I tabel 10 side 32 ses det endvidere at alle OXA-48 varianter, som havde svage streger, er Klebsiella sp. Én OXA-48 variant opnår en stærk streg i testen og det er en Enterobacter cloacae. En KPC positiv stamme viste sig med en stærk streg og en med en svag streg. Begge er Enterobacter cloacae. Klebsiella sp. er karakteristisk ved at den danner en polysakkaridkapsel. Kapslen danner en syre som er det der gør kolonierne særligt mucoide på faste substrater (11). Da analysen er baseret på, at antistoffer binder sig til OXA-48 epitoper på bakteriecellens overflade, kan det hypoteseres at polysakkaridkapslen spiller en rolle. Enterobacter sp. kan også danne en polysakkaridkapsel, men det er ikke lige så udpræget som hos Klebsiella sp. (11). Stamme D1, som er negativ i både første og anden omgang, er også Klebsiella sp. Stamme 23, som viser sig at være positiv i anden omgang, er en E. coli. Da 23 blev testet igen viste den et rimelig svagt resultat efter 15 minutter (se tabel 24 s. 43), da der blev brugt meget kolonimateriale (10 µl). Mængden kan måske have indflydelse på hvorledes antistoffer og epitoper binder sig til hinanden. Ved en stor mængde kolonimateriale, vil de måske komme til at skygge for hinanden og de skal derfor bruge mere tid til finde hinanden, så at sige. Derudover er stregen i kontrolfeltet også meget svag. Efter 30 minutter var begge streger normale. Dvs. binding mellem antistof og epitop fik længere tid til at finde sted. B2 og B3 (figur 8 s. 33) viser hhv. en svag og stærk streg. De er begge, ifølge genotypebestemmelsen, alene OXA-48 positive. Er OXA-48 mekanismen udtrykt stærkere på B3 eller kan bakteriearten have 49

indflydelse på om hvor stærkt resultatet bliver udtrykt? Her er der tale om hhv. Klebsiella pneumoniae og Enterobacter cloacae. Stamme 2 er en Klebsiella pneumoniae og den er, ifølge genotypen positiv for både NDM og OXA- 181, en OXA-48 variant. OXA-181 er, ifølge kittet, muligt at påvise vha. OXA-48 K-SeT. Som sagt skal de svage streger tolkes som positive ifølge CorisBioconcept. Men det er overordnet Klebsiella pneumoniae, der giver disse svage streger. D1, som var falsk negativ, var også Klebsiella pneumoniae. Kan denne bakterie, pga. dens polysakkaridkapsel, være sværere at detektere i OXA- 48 K-SeT? KPC K-SeT viste, i denne undersøgelse, en sensitivitet samt specificitet på 100 %. Kun én af stammerne blev tolket med en svag streg. I dette tilfælde var der også tale om en Klebsiella pneumoniae og den var ifølge gentypebestemmelsen kun positiv for KPC. Hvornår i påvisningen af carbapenemaser, kunne det give særligt mening at bruge disse kits? Hverken Wareham et al. (31) eller Glupczynski et al. (32) nævner hvorledes OXA-48 K-SeT eller KPC K-SeT kunne implementeres i rutinesammenhæng, hvilket, ud over en god sensitivitet og specificitet, er meget relevant i forhold til om det giver mening at indføre. Ifølge ECDC er der behov for hurtig identifikation af CPE, i forhold til at minimere smitten i blandt patienter (6). I denne sammenhæng er der stor behov for hurtige analyser som OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. Spørgsmålet er, hvornår i identifikationsforløbet, giver det mening at indføre disse tests og er det overhovedet interessant for et rutinelaboratorie at kende carbapenemasetypen, fremfor blot at identificere tilstedeværelsen af carbapenemaser og identificere behandlingsmuligheder vha. følsomhedsbestemmelse? Begge kits kræver minimal tid for personalet og kræver desuden ingen specialisterfaringer, i forhold til metoder så som PCR, som kræver resurser, både økonomisk og personalemæssigt (31). Trods de gode resultater der er opnået med disse kits, vil ulempen dog være at de kun detekterer OXA-48 og KPC, i forhold til de nuværende metoder. 50

6.4 Screening med meropenem, temocillin og piperacillin + tazobactam, i forhold til OXA-48 I det følgende diskuteres muligheden for at screene specifikt for OXA-48, med henblik på at kunne benytte OXA-48 K-SeT, tidligt i identifikationsforløbet. NORDICAST har fastsat en screenings cut-off værdi for meropenem til <27 mm (Bilag 4). Denne værdi er ikke nævnt i EUCASTs egen version af disse brydningspunkter, dog henviser de til en publikation (Bilag 6) fra 2013, hvori de nævner at screenings cut-off værdien for meropenem bør være <25 mm, med undtagelse af lande med høj forekomst af OXA typer, hvor den bør hæves til <27 mm, på bekostning af specificiteten. Screenings cut-off værdien, der benyttes i laboratorierutinen på KMA, HvH, er sat til 26 mm. (Bilag 1) I denne undersøgelse blev alle carbapenemaser detekteret i screeningen (tabel 17 s. 38), undtagen én. Stamme D1, som både er OXA-48 og NDM positiv, havde en hæmningszone omkring meropenemdisken på 29 mm. Meropenem detekterer alle typer og kan ikke screene kun for OXA. Den kan tværtimod muligvis have svært ved det, pga. at OXA-48 har svag hydrolyseaktivitet. Ifølge NORDICAST, er OXA også resistent for piperacillin + tazobactam og amoxicillin + clavulansyre. Det forstås, ud fra NORDICASTs brydningspunkter (bilag 5), at temocillin, i den fænotypiske test, blot er en indikator og ikke med sikkerhed kan identificere OXA-48 og derfor kan piperacillin + tazobactam og amoxicillin + clavulansyre også give indikation om at det er en OXA type. Alle, på nær én, carbapenemaseproducerende stammer er, i denne undersøgelse, resistent for amoxicillin + clavulansyre (bilag 3). Ifølge Huang et al. der har testet 323 OXA-48 producerende stammer, bør cut-off værdien hæves til <29 mm, da det vil hæve sensitiviteten til 99,8 %. Dog vil det gå ud over specificiteten. Med en cutoff på <29 mm fangede han 322/323 OXA typer. De detekterede også alle NDM, VIM og KPC. Derfor er specificiteten ret lav. En stor del (80/323) af de OXA stammer han testede, blev ikke påvist med en cut-off værdi på <25 mm. Med en cut-off værdi for piperacillin + tazobactam <16 mm og temocillin <12 mm blev 315/323 OXA typer detekteret og blot 8/60 KPC, 26/32 VIM og 12/20 NDM detekteres (23). Dette kan i hvert fald differentiere mellem de fleste KPC/NDM og OXA typer. Dog er det sværere at differentiere mellem OXA og VIM typer. Alle klasse D OXA-48 typer har en hæmningszone under cut-off værdien forslået af Huang et al. for både temocillin og piperacillin + tazobactam. Hvis man kigger på de andre 25 51

carbapenemaseproducerende stammer, er 12 af dem også under cut-off værdien for både meropenem, temocillin og piperacillin + tazobactam. Så hvis man kombinerer meropenem 26 mm, temocillin <12 mm og piperacillin + tazobactam <16 mm, for at differentiere mellem klasse D OXA- 48 typer og andre carbapenemasetyper, vil man i denne undersøgelse få en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 51, 85 % (tabel 20 s. 40). Woodford et al. har ligeledes undersøgt muligheden for at benytte temocillin som screeningsmetode til detektion af OXA typer, men konkludere at det ikke er optimalt at benytte alene. Dog er den effektiv til at udelukke OXA typer eller andre carbapenemaser (29). Sensitiviteten var 92,59 % og specificiteten var 52 %. Vælger man at screene specifikt for OXA-48 med før omtalte kombination af disks, vil der altså stadig være stor usikkerhed, da næsten halvdelen af de andre CPE stammer også blev detekteret. Formålet var at benytte OXA-48 K-SeT efter screening, men spørgsmålet er om det giver mening. Vil der være for mange negative? 6.5 Behandling af CPE med amikacin Som tidligere nævnt, blev der, som en lille sideløbende undersøgelse, udført følsomhedsbestemmelse med en sammensætning af antibiotika, med henblik på behandling. Særligt for at påvise amikacins in vitro aktivitet. Haley et al. har forsøgt at samle det data, der på nuværende tidspunkt er tilgængeligt, i forhold til behandling af infektioner forårsaget af CPE, i et review. Om aminoglykosider, nævnes der at gentamicin oftest er den, der er mest aktiv over for Klebsiella pneumoniae og at amikacin er mest aktiv overfor alle andre carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae (33). Ifølge resultaterne opnået i denne undersøgelse (tabel 21 og 22 s. 41) ses det at 39/52 CPE stammer er følsomme over for amikacin (75 %). 25/52 CPE stammer viser følsomhed overfor gentamicin (48 %). Så overordnet er amikacin mere effektivt. Dog ses det at 3 stammer (B5, 4 og 29), der er intermediære for amikacin, er sensitive for gentamicin. Disse stammer er alle Klebsiella pneumoniae. 52

Flest stammer er følsomme overfor amikacin, hvilket kunne være en behandlingsmulighed. DSKM nævner, som sagt, også at et aminoglykosid kombineret med et carbapenem, bør benyttes som behandling (14). Haley et al. konkluderer at, på dette stadie er kombinationsterapi den bedste løsning i forbindelse med at sænke mortaliteten, men understreger også, at der et stort behov for yderligere studier. Dog er der problemer forbundet med dette, da det bl.a. kan føre til øget udvikling af resistensmekanismer pga. det høje selektionstryk, samt udvikling af infektioner med Clostridium difficile og nefrotoksicitet. Disse problemer menes dog at være sekundære og det primære er at komme CPE til livs (33). 6.6 Kontrolstammen E8 E. coli OXA-48 positiv Undervejs i denne undersøgelse blev stammerne ATCC 25922 E. coli (carbapenemase negativ), Klebsiella pneumoniae G4 (KPC positiv) samt kontrolstamme E8 E. coli (OXA-48 positiv), benyttet til at validere MHT og carbapenemasepåvisning med KPC+MBL diagnostistiske tabletter samt følsomhedsbestemmelsen ved agardiffussion. ATCC 25922 og G4 udviste samme adfærd ved alle udsåninger. Dog viste det sig at kontrolstammen E8 ændrede adfærd, ved anden sidste og sidste udsåning, da den pludselig blev påvist som falsk negativ (tabel 23 s. 42). Umiddelbart er resultaterne af teststammerne ikke påvirket og det kunne tyde på at carbapenemasen hos E8 ikke længere er aktiv ved de to sidste udsåninger. Bakterier har en evne til at tilpasse sig miljøet. De kan kontrollere genekspressionen på deres overflade, ved at blokere mrna transkriptionen som koder for specifikke proteiner hvis der er ændringer i miljøet f.eks. temperatur eller iltforhold (34). På baggrund af det, kunne det overvejes om det, at E8 er blevet genudsået fra blå plade som indeholder tilstrækkeligt med næring og ikke nogle ikke nogle antimikrobielle midler, gør at den har inaktiveret OXA-48 genet. Fordi resistensen sidder på plasmider som er mobile, kan resistensen godt forsvinde ind og ud af bakterierne. Men da bakterier oftest opholder sig i populationer, vil det ikke have større betydning. (35). 53

Selvom kontrol stammen E8 ændrede sig undervejs i undersøgelsen, har det ikke haft nogle konsekvenser for de resultater der er opnået. Dette er dog et tegn på at kontrolstammer jævnligt skal udså direkte fra frysebuillion, da man ellers kan risikere at de mister deres karakteristika, som f.eks. et gen som gør dem til en specifik positiv kontrol. 7. Konklusion Både OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT viste god sensitivitet og specificitet i forbindelse med at detektere OXA-48 og KPC carbapenemaser (hhv. 92,59 % og 100 %). Dog bør man muligvis være opmærksom på carbapenemaseproducerende Klebsiella Pneumoniae i forbindelse med tolkningen af teststregen og mulighed for falske negative. MHT og KPC+MBL, viste også god sensitivitet i forbindelse med OXA-48 og KPC (begge 100 %). Dog var specificiteten på hhv. 84,91 % og 94,37 %. KPC+MBL metoden havde fejlagtigt identificeret 8 falske OXA-48 og 4 falske KPC. Desuden gav den subjektive tolkning af MHT visse problemer. OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT er simple og hurtige metoder til detektering af OXA-48 og KPC typer, i forhold til den nuværende metode. Dog adskiller de sig fra den nuværende metode, da man aldrig vil kunne benytte dem alene, til detekteringen af samtlige carbapenemaser typer. Kombinationen af de to metoder, MHT og KPC+MBL, er velegnet til detektering af flere forskellige typer, dog tidskrævende. De er derfor svære at sammenligne og man vil ikke kunne erstatte den gamle metode med OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. I forhold til implementeringen af disse kits, vil de formentlig fungere godt som en konfirmatorisk test. Der bør dog være grundlag for at teste for disse specifikke carbapenemasetyper, f.eks. indikation af OXA-48 ved screening. 54

8. Perspektivering Det kan være svært at vurdere om og hvornår, disse tests kan benyttes i rutinen. Det er måske nemmere at spørge om, hvad der i virkeligheden er brug for i forbindelse med detektion af carbapenemaseproducerende bakterier. For giver det mening for sundhedspersonalet at kende carbapenemasetypen, fremfor blot at vide at der er tale om en carbapenemaseproducerende bakterie? I forbindelse med isolering og behandling af patienten er det så ikke nok at vide, at der er tale om en carbapenemaseproducerende bakterie? Behandlingen fastlægges som udgangspunkt ud fra følsomhedsbestemmelse. Bakterien sendes til SSI, hvor den bliver genotypet og svaret af genotypen er kun interessant i forhold til overvågning af forekomsten af de forskellige carbapenemaser. Én test der giver hurtig og pålideligt svar om der er tale om en carbapenemaseproducerende bakterie, ville bestemt være at foretrække, for at mindske risikoen for spredning og øge patienternes muligheder i forhold til hurtigere behandling. Flere anbefaler genotypning til hurtig og pålidelig identificering af carbapenemaser, men det kræver resurser både økonomisk og personalemæssigt, som ikke alle laboratorier har adgang til. Alle skal have lige muligheder til at detektere carbapenemaser, for at man kan skal kunne kontrollere det. CorisBioconcept er i færd med at udvikle en tilsvarende test, til detektering af NDM typer. Man kunne håbe at der med tiden blev mulighed for at udvikle en test som kunne opfange de mest almindelige carbapenemaser i én test. Slutteligt knyttes en kommentar til kontrolstregerne i disse kits. Under denne undersøgelse, blev der nemlig, i enkelte tilfælde, iagttaget svage kontrolstreger. Dette nævner CorisBioconcept ikke noget om, som de gør med de svage teststreger. Skal testen kasseres eller skal man også se bort fra dennes intensitet? Det kunne eventuelt fremgå af deres indlægsseddel. 55

9. Litteratur 1. Nordman P. et al. (2011), Global Spread of Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerging Infectious Diseases, vol. 17, no. 10 2. Statens Serum Institut. Smitteberedskab. Viden om Carbapenemaseproducerende Enterobakterier (set Maj 2016). Tilgængelig på: http://www.ssi.dk/smitteberedskab/om%20overvaagning/antibiotikaforbrug/viden%20om%20m ultiresistente%20bakterier/carbapenemase-producerende%20enterobakterier.aspx 3. Statens Serum Institut. Sygdomsleksikon. Viden om ESBL-producerende bakterier (set Maj 2016). Tilgængelig på: http://www.ssi.dk/service/sygdomsleksikon/e/esbl.aspx 4. DANMAP rapport 2014 - Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark (set Maj 2016). Tilgængelig på: http:k//www.danmap.org/downloads/reports.aspx 5. Optælling wwlab, KMA, HvH 6. ECDC, European Centre of Disease Prevention and Control Rapport: Rapid Risk Assessment: Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae 8. April 1016. Stockholm: ECDC; 2016 7. Bakthavatchalam Y. et al. (2016), Laboratory Detection and Clinical Implication of Oxacillinase-48 like Carbapenemase: The Hidden Threat. Journal of Global Diseases. 2016, Jan Mar; 8 (1): 41 50. 8. Degré et al. (2000), Medisinsk Mikrobiologi, 2. Udgave, Gyldendal Norsk Forlag AS 9. Papp-Wallace K. et al. (2011), Carbapenems: Past, Present, and Future. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 55, no. 11, p. 4943-4960. American Society for Microbiology. 10. Poirel L. et al. (2007), Carbapenemases: molecular diversity and clinical consequences. Future Microbiology, 2(5), 501-512. 11. Høiby N. et al. (1998), Basal og Klinisk Mikrobiologi, 2. Udgave, FADL s Forlag. 56

12. Queenan A. M., Bush K. (2007), Carbapenemases: the Versatile β-lactamases. Clinical Microbiolgy Reviews, p. 440-458, vol. 20, no.3, American Society for Microbiology. 13. Van Dijk K. et al. (2013), A disc diffusion assay for detection of class A, B and OXA-48 carbapenemases in Enterobacteriaceae using phenyl boronic acid, dipicolinic acid and temocillin, Clinical Microbiology and Infection, 2014; 20: 345-349 14. Justesen U. S. et al. (2015), Antibiotikabehandling af infektion med carbapenemaseproducerende Enterobacteriaceae, Dansk Selskab For Mikrobiologi, Version 1, 11. december 2015 Tilgængelig på: http://dskm.dk/onewebmedia/antibiotikabehandling%20ved%20cpe%20infektion_mw%2busj% 2BBJH2.pdf 15. Laboratorieinstruks: Carbapenemasepåvisning ved Enterobacteriaceae, Klinisk mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital 16. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Breakpoint tables for interpretation of MICs and Zonediameters, Version 6.0, 2016 Tilgængelig på: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ 17. Giske C. G. et al. (2013), EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistance of clinical and/or epidemiological importance, Version 1.0 Tilgængelig på: http://www.eucast.org/resistance_mechanisms/ 18. Laboratorieinstruks: Carbapenemase påvisning med Modified Hodge Test (MHT), Klinisk mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital 19. Laboratorieinstruks: Carbapenemase påvisning med KPC+ MBL diagnostiske tabletter (KPC+MBL), Klinisk mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital 20. Indlægsseddel: OXA-48 K-SeT og KPC K-SeT. Coris BioConcept 21. Laboratorieinstruks: Antibiotika aflæsningsskema urin, Klinisk mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital 57

22. Vanstone G. et al. (2013), Temocillin disc diffusion susceptibility-testing by EUCAST methodology, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Oxford University Press 23. Huang T. et al. (2013), Temocillin and piperacillin/tazobactam resistance by disc diffusion as antimicrobial surrogate markers for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in geographical areas with high prevalence of OXA-48 producers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. Oxford University Press. 24. Bendsen T. Noter i statistik. Set: Maj 2016. Tilgængelig på: http://statnoter.dk/index.php?pageid=56 25. Miriagou V. et al. (2010), Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterials pathogens: detection and surveillance issues, Clinical Microbiology and Infection 2010, 16: 112-122 26. Carvalhaes C. G. et al. (2009), Cloverleaf test (modified hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: beware of false positive results, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2010; 65: 249-251 27. Rai et al Rai et al. (2011) Zink-dependent carbapenemases in clinical isolates of family Enterobacteriaceae. 28. Jeremiah S. S. et al. (2014), A possible alternative to the error prone modified Hodge test to correctly identify the carbapenemase producing Gram-negative bacteria, Indian J Med Microbiology 2014;32:414-8 29. Woodford N. et al. (2013), In vitro activity of temocillin against multidrug-resistant clinical isolates of Escherichia coli, Klebsiella spp. And Enterobacter spp., and evaluation of high-level temocillin resistance as a diagnostic marker for OXA-48 carbapenemase. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. Sep. 2013. 30. Hartl R. et al. (2013), Temocillin and meropenem to discriminate resistance mechanisms leading to decreased carbapenem susceptibility with focus on OXA-48 in Enterobacteriaceae. Clinical Microbiology and Infection, vol. 19, no. 5. Maj 2013. 58

31. Wareham D. W. et al. (2015), Evaluation of an Immunochromatographic Lateral Flow Assay (OXA-48 K-SeT) for the Rapid Detection of OXA-48-like Carbapenemases in Enterobacteriaceae, Journal of Clinical Microbiology, Feb. 2016, vol. 54, no. 2 32. Glupczynski Y. et al. (2015), Evaluation of two new commercial immunochromatographic assays for the rapid detection of OXA-48 and KPC carbapenemases from cultures bacteria, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2016; 71: 1217-1222 33. Haley J. M. et al. (2015), Treatment Options for Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Infections, Open Forum Infectious Diseases, Oxford University Press. 34. Mims C. et al. (2004), Medical Microbiology, 3 rd edition, Elsevier Limited 35. Videnskab.dk. Kan antibiotikaresistens forsvinde? (set maj 2016) Tilgængelig på: http://videnskab.dk/sporg-videnskaben/kan-antibiotika-resistens-forsvinde 59

10. Bilag 10.1 Bilag 1 Uddrag fra antibiotika aflæsningsskema fra KMA, HvH. 60

61

10.2 Bilag 2. Tabeloversigt over samtlige stammer benyttet til undersøgelsen samt deres resultater. OVERBLIK Carba +/- Genotype Bakterieart MHT KPC+MBL OXA kit Stamme A1 - Neg Klebsiella pneumoniae SN SN SN SN A2 + NDM E. coli SP FN SN SN A3 + OXA-48 E. coli SP SP SP SN A4 - ESBL (+Campc) E. coli SN SN SN - A5 - ESBL + ampc E. coli SN SN SN SN A6 + OXA-48 E. coli SP SP SP - A7 + OXA-48 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - A8 + OXA-48 E. coli SP SP SP - A9 - Ampc E. coli SN SN SN - B1 - Neg E. coli SN SN SN SN B2 + OXA-48 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - B3 + OXA-48 Enterobacter cloacae SP SP SP SN B4 + OXA-48 Citrobacter freundii SP SP SP SN B5 + NDM Klebsiella pneumoniae SP SP SN - B6 + OXA-48 Klebsiella oxytoca SP SP SP SN B7 + OXA-48 + TEM E. coli SP SP SP - B8 + NDM-1, CTX-M, CMY2 Klebsiella pneumoniae SP SP MBL FP OXA SN - B9 - CTX-15, SHV-32, Klebsiella pneumoniae SN SN SN SN IMP C1 - CMY-2 E. coli SN SN SN - C2 + OXA-48 E. coli SP SP SP - C3 + KPC Klebsiella pneumoniae SP SP SN SP C4 + OXA-48 Klebsiella oxytoca SP SP SP - C5 - ESBL NEG, BETA E. coli SN SN SN SN POS C6 + OXA-48 Citrobacter freundii SP SP SP - C7 + OXA-48 E. coli SP SP SP - C8 + KPC Klebsiella pneumoniae SP SP SN SP KPC kit C9 + NDM-1, CTX-M, CMY2 Providencia stuartii FN SP SN - D1 + NDM+OXA-48 Klebsiella pneumoniae FN SP OXA FN NDM FN - D2 - NEG Klebsiella pneumoniae SN SN SN - D3 - CTX-M-15, SHV28 Klebsiella pneumoniae SN SN SN - 62

Stamme Carba +/- Genotype Bakterieart MHT KPC+MBL oxa kit KPC kit D4 - CTX-M-15, SHV11 Klebsiella pneumoniae SN SN SN - D5 + NDM Proteus mirabilis SP FN SN SN D6 + NDM E. coli FN SP NDM FP OXA SN - D7 + NDM Providencia stuartii FN SP SN SN D8 + KPC Klebsiella pneumoniae SP SP SN SP D9 - ESBL E. coli SN SN SN SN E1 - ESBL E. coli SN SN SN - E2 - ESBL (+Campc) E. coli SN SN SN - E3 - Ampc Enterobacter Cloacae SN SN SN SN E4 - CTX-M-14, SHV-12 Klebsiella pneumoniae SN SN SN - E5 + KPC + SHV-12 Klebsiella pneumoniae SP SP SN SP E6 + OXA181 (OXA-48) E. coli SP SP SP SN E7 + OXA181 (OXA-48) E. coli SP SP SP - E8 - NEG Klebsiella pneumoiae SN SN SN - E9 -?? Klebsiella oxytoca SN SN SN SN F1 - CTX-M-14, SHV-12 Klebsiella pneumoniae SN SN SN - F2 + OXA-48 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - F3 + OXA-48 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - F4 + KPC-2 CTX-M-15 Enterobacter Cloacae SP SP KPC FP OXA SN SP F5 + KPC-2 Enterobacter Cloacae SP SP SN SP 1 + OXA-48, CTX-M-15, Klebsiella pneumoniae SP SP SP - SHV-76, TEM-1B 2 + NDM-1 + OXA-181 Klebsiella pneumoniae SP SP for SP - begge 3 + IMI-9 Enterobacter Cloacae SP SN SN - 4 + KPC-2, SHV-11 Klebsiella pneumoniae SP SP SN - 5 + NDM-1, CMY-6, Klebsiella pneumoniae FN SP NDM SN - CTX-M-15, SHV-11, OXA-1 FP OXA 6 + OXA-48, LEN-16 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - 7 + VIM-29, OXA-1, CMY-4, CTX-M-15 E. coli SP SP VIM FP OXA SN - 8 + NDM-1, OXA-10, Proteus mirabilis SP FN SN - CMY-16 9 + NDM-5, SHV-12, E. coli SP FN SN - TEM,-1B 10 + OXA-48, LEN-16 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - 11 + NDM-1 Citrobacter Sedlakii SP SP SN - 12 - CTX-M GR. 1 Klebsiella pneumoniae SN FP KPC SN - 63

Stamme Carba +/- Genotype Bakterieart MHT KPC+MBL Ox a kit 13 - CMY E. coli SN FP KPC SN - 14 + OXA-48, SHV-11 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - 15 - CTX-M GR. 1 Klebsiella pneumoniae SN SN SN - 16 - NEG Enterobacter cloacae FP SN SN - 17 + OXA-48, CTX-M-24, E. coli SP SP OXA SP - TEM-1B 18 - CTX-M GR. 1 E. coli SN SN SN - 19 + KPC-2, CTX-M-15 Enterobacter cloacae SP SP KPC FP OXA SN - 20 - NEG Proteus mirabilis FP SN SN - 21 - NEG Enterobacter aerogenes FP FP KPC SN - 22 - NEG Providencia rettgeri SN FP KPC SN - 23 + OXA-181, OXA-1, E. coli SP SP FN - CMY-2, CTX-M-15, TEM-1B 24 + IMP-26 E. coli SP SP SN - 25 + OXA-48, LEN-16 Klebsiella pneumoniae SP SP SP - 26 + OXA-162, CTX-M- 15, SHV-28/-100, Klebsiella pneumoniae SP SP SP - TEM-1B 27 + VIM-1, SHV- 39/LEN11 Klebsiella pneumoniae SP SP VIM FP OXA SN - 28 + KPC-2 Enterobacter cloacae SP SP SN - 29 + VIM-27, SHV-11 Klebsiella pneumoniae SP SP VIM SN - FP OXA 30 - NEG E. coli SN SN SN - KPC kit 64

10.3 Bilag 3. Tabeloversigt over resultater fra dispenser A og B. Stamme MEM 10 TEM 30 SCREENING BEHANDLING CARBA * CAZ 10 CPD 10 AMC 30 TZP 36 STX 25 ATM 30 CN 10 AK 30 NA 30 CIP 5 Klasse A1 S S S S S S S S S S S S - A2 R I R R R R R R S S R S NDM B A3 R R R R R R S R R S R R OXA-48 D A4 S S S R S S S S S S R R - A5 S I R R R S S R S S R R - A6 S R S S R R S S S S R R OXA-48 D A7 R R R R R R R R R S R R OXA-48 D A8 S R S S R R S S S S S S OXA-48 D A9 S S R R R S R R S S S S - B1 S S S S S S S S S S S S - B2 R R R R R R R R R S R R OXA-48 D B3 I R S S R R S S S S S S OXA-48 D B4 I R R R R R R R R S R R OXA-48 D B5 R I R R R R R R S I S S NDM B B6 S R R R R R R R I S R R OXA-48 D B7 I R S R R R R S R S R R OXA-48 D B8 R R R R R R R R I S R S NDM B B9 I I R R R R R R R S R R - C1 S I R R R R S R R S R R - C2 S R S S R R R S R S S S OXA-48 D C3 R I R R R R R R S S R R KPC A C4 S R R R R R R R S S R R OXA-48 D C5 S S S S S S S S S S S S - C6 I R R R R R S R R S R R OXA-48 D C7 S R R R R R R S R S R S OXA-48 D C8 R R R R R R R R I S R R KPC A C9 R S R R R R R R S S R R NDM B D1 S R R R R R R R S S R R NDM + D+B OXA-48 D2 S S S S S S S S S S S S - D3 I I R R R R R R R S R R - D4 S S R R R I R R R S R I - D5 I S R R R R R S S S R R NDM B D6 R R R R R R R R R R R R NDM B D7 R S R R R R R R S S R R NDM B D8 I I R R R R R R I S R R KPC A D9 S I R R S S S R S S R R - 65

Stamme MEM 10 TEM 30 CAZ 10 CPD 10 AMC 30 TZP 36 SXT 25 E1 S S R R R R R R R S R R - E2 S S S R R S R S S S R R - E3 S S S R R S S S S S S S - E4 S S R R R I S R R R R R - E5 I I R R R R R R R I R R KPC A E6 I R R R R R R I S S R R OXA- D 181 E7 I R R R R R R I S S R R OXA- D 181 E8 S S S S S S S S I S S S - E9 S S S R R R S R S S S S - F1 S S R R R S R R R S S I - F2 S R R R R R S R R R R R OXA-48 D F3 R R R R R R S R R R R R OXA-48 D F4 R R R R R R R R R S R R KPC A F5 R I R R R R S R S S R R KPC A 1 I R R R R R R R R S R R OXA-48 D 2 R R R R R R S R R R R R NDM + D+B OXA-48 3 I S S R R S S S S S S S IMI-9 A 4 I I R R R R R R S I R R KPC A 5 R R R R R R R R R R R R NDM B 6 S R S S R R S S S S S S OXA-48 D 7 I R R R R R R R R R S S VIM B 8 I S R R R I S S I R R R NDM B 9 R I R R R R R R S S R S NDM B 10 I R S S R R S S S S S S OXA-48 D 11 R R R R R R R R R R R R NDM B 12 I I R R R R R R R S R R - 13 I I R R R R R R R S R R - 14 S R S S R R S S S S S S OXA-48 D 15 I I R R R R R R R S R R - 16 S I R R R R S R S S S S - 17 S R S R R R R R R S R S OXA-48 D 18 I I R R R I R R R S R R - 19 R R R R R R R R R S R R KPC A 20 S S S S S S S S S S S S - 21 I I R R R I R R S S R R - 22 I S R R R S R R S S S S - 23 S R R R R R R R R S R R OXA- D 181 24 I S R R S S R R R R S S IMP-26 B 25 S R S S R R S S S S S S OXA-48 D ATM 30 CN 10 AK 30 NA 30 CIP 5 66

Stamme MEM 10 TEM 30 CAZ 10 CPD 10 AMC 30 TZP 36 SXT 25 26 I R R R R R R R S S R R OXA- D 162 27 I R R R R R R R S S R R VIM B 28 I I R R R R S R S S R S KPC A 29 R R R R R R R S S I R R VIM B 30 I I R R R S S S S S S S - ATM 30 CN 10 AK 30 NA 30 CIP 5 67

10.4 Bilag 4 NORDICAST - Brytningspunkttabeller for tolkning av MIC-verdier og sonediametre Basert på EUCAST Version 6.0 NordicAST Versjon 6.0, 2016-01-01 - Screenprint 68

10.5 Bilag 5 NORDICAST - Brytningspunkttabeller for tolkning av MIC-verdier og sonediametre Basert på EUCAST Version 6.0 NordicAST Versjon 6.0, 2016-01-01 - Screenprint 69

10.6 Bilag 6 EUCAST - EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance Version 1.0 December 2013 Screenprint 70