Holdbarhed af leukocytter og erytrocytter i Cerebrospinalvæske Ved analysering på Sysmex XN-9000 Udarbejdet af: Larisa Holm Fødselsdato: 16.05.1966 Bachelorprojekt periode: 05.10.2015-06.01.2016 RH Klinisk vejleder: Sheila Perez Rovsing Koch PH Metropol vejleder: Charlotte Topsøe Voigt Uddannelsesretning og sted: Bioanalytikeruddannelsen, PH Metropol Antal anslag: 62 914 (1)
Forord Bachelorprojektet er en afsluttende opgave på bioanalytikeruddannelsen, PH Metropol, modul 14. Den praktiske del af projektet blev udført i samarbejde med Nessrin Talouzi og Dalal Hussain på Rigshospitalets Klinisk Biokemisk Afdeling 3011. Bachelorprojektet henvender sig til bioanalytikerstuderende, bioanalytikerundervisere, bioanalytikerne og andre, som har interesse for holdbarhedsundersøgelse af leukocytter og erytrocytter i cerebrospinalvæske. Jeg vil gerne sige stor tak til underviserne Charlotte Topsøe Voigt og Sheila Perez Rovsing Koch for deres kompetente vejledning og støtte under projektforløbet. Jeg vil ligeledes sige tak til Lone Sælsen og afdelingens personale for uundværlig hjælp til det praktiske del af projektet og tak til mine medstuderende Nessrin Talouzi og Dalal Hussain for gode samarbejdsevner og gåpåmod. Særlig tak til min kæreste Rene for opbakning og personlig støtte. Larisa Holm Dato: 6. januar 2016 i
Resumé Baggrund Klinikken på Rigshospitalet anvender forholdet 1:700 mellem kerneholdige celler og erytrocytter til at vurdere om de kerneholdige celler som findes, stammer fra en indstiksblødning under lumbalpunktur eller forholdet 1:100 når blodcellerne fandtes i forvejen i cerebrospinalvæske (CSV). Da blodcellernes stabilitet er begrænset i CSV, bør tælling af blodceller ske inden for 1 time efter lumbal punktur ifølge Klinisk Biokemisk Afdelingens 3011 s retningslinjer. Klinisk Biokemisk afdeling 3011 ønsker at komme med en mere præcis anbefaling af det kvantitative forhold mellem leukocytter og erytrocytter i CSV. Derfor undersøges holdbarheden af kerneholdige celler og erytrocytter, samt ændringer i forholdet, over tid, mellem leukocytter og erytrocytter for blodkontaminerede CSV og for CSV, hvor leukocytter har været der i forvejen. Metode og materialer Der blev anvendt cellefri CSV pool, hvor K2-EDTA veneblod blev tilsat i leukocytkoncentrationer på 5 x 10 6/ /L, 10 x 10 6/ /L, 20 x 10 6/ /L, 50 x 10 6/ /L og målt på Sysmex XN-9000-5A ved 0 tid, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min og 240 min. Der blev dels anvendt cellefri CSV, hvor buffy coat med neutrofile granulocytter tilsat og cellefri CSV, hvor buffy coat med lymfocytter tilsat. Cellefri CSV tilsat K2-EDTA veneblod med leukocytkoncentration på 20 x 10 6/ /L blandes med buffy coat med lymfocytter eller buffy coat med neutrofile granulocytter. Øvrige blandinger måles på Sysmex XN-9000-5A ved de relevante tider. Resultater Erytrocytter i CSV tilsat blod er lidt påvirket af henstand og stabile op til 4 timer i, hvorimod leukocytternes stabilitet i højere grad er begrænset. Lymfocytter viste i nogen grad højere stabilitets niveau end neutrofile granulocytter. Konklusion Der er en signifikant ændring i forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod over tid. Der er en mindre signifikant ændring i forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat buffy coat sammenlignet med CSV tilsat blod. ii
Indholdsfortegnelse Oversigt over samtlige forkortelser... 1 Introduktion... 2 Problembaggrund... 2 Problemformulering... 4 Målformuleringer... 4 Teori... 4 Cerebrospinalvæske... 4 Leukocytter... 5 Erytrocytter... 6 Faktorer, som påvirker blodcellernes stabilitet i CSV... 6 Analyseprincip for måling af leukocytter... 7 Analyseprincip for måling af erytrocytter... 9 Metodevalg... 10 Argumentation for valg af metodedesign... 10 Valg af prøvemateriale... 11 Valg af blodprøver/buffy coat... 12 Valg at tiden og temperatur for proceduren... 13 Valg af databehandling... 13 Etiske overvejelser... 13 Materialer og metode... 14 Materialer... 14 Apparaturer... 14 Reagenser... 14 Prøvemateriale... 14 Utensilier... 15 Metode 1. del... 15 Analysering af blandinger / blodprøver... 15 Oprensning af frosset CSV (cerebrospinalvæske) pool.... 15 Fremstilling af blandinger (blod + CSV)... 15 Metode 2. del... 17 Fremstilling af to blandinger (bfc. /LY+CSV) og (bfc. /NE+CSV)... 17 Fremstilling af blandingen (blod + CSV).... 17 Fremstilling af blandinger (Blod + CSV) + (bfc. /LY + CSV) og (Blod + CSV) + (bfc. /NE + CSV).. 18 iii
Resultater... 19 De relative analysesvar for leukocyt antalkoncentration i CSV tilsat blod i de 5 tilstræbte forhold som funktion af tiden... 20 De relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentration i CSV tilsat blod som funktion af tiden... 21 De tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500 og 1:700 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden... 23 Det tilstræbte forhold 1:800 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden.. 24 De tilstræbte forhold 1:500, 1:700 og 1:800 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat buffy coat som funktion af tiden... 24 De relative analysesvar for leukocyt antalkoncentration i CSV tilsat buffy coat som funktion af tiden.... 25 Diskussion... 26 Leukocyt antalkoncentration... 27 Erytrocyt antalkoncentration... 29 Middelværdi af leukocyt antalkoncentration og erytrocyt antalkoncentration.... 30 Forhold mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod... 32 Forhold mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat buffy coat... 34 Antalkoncentration af neutrofile granulocytter og lymfocytter... 36 Metodediskussion... 37 Konklusion... 38 Perspektivering... 39 Referencer... 42 Bilag 1... 45 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:200 uden buffy coat... 45 Bilag 2... 46 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:200 uden buffy coat... 46 Bilag 3... 47 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:400 uden buffy coat... 47 Bilag 4... 48 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:400 uden buffy coat... 48 iv
Bilag 5... 49 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:500 uden buffy coat... 49 Bilag 6... 50 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:500 uden buffy coat... 50 Bilag 7... 51 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:700 uden buffy coat... 51 Bilag 8... 52 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:700 uden buffy coat... 52 Bilag 9... 53 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:800 uden buffy coat... 53 Bilag 10... 54 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:800 uden buffy coat... 54 Bilag 11... 55 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:500 med buffy coat... 55 Bilag 12... 56 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:700 med buffy coat... 56 Bilag 13... 57 Rådata af måleresultater af kerneholdige celler og erytrocytter i CSV tilsat blod i det tilstræbte forhold 1:800 med buffy coat... 57 v
Oversigt over samtlige forkortelser ATP Adenosintrifosfat BF Body fluids CSV Cerebrospinalvæske DC Direct current K2-EDTA Di-kalium ethylen-diamin-tetra-acetic-acid KB-3011 Klinisk biokemisk afdeling 3011 LABKA Laboratoriets information- og produktions planlægningssystemet for rekvirering af analyser og prøvesvar MNC Mononukleære leukocytter (lymfocytter og monocytter) PMN Polymorfnukleære leukocytter (neutrofile granulocytter) RBC Red blood cell RH Rigshospitalet 1
Introduktion Problembaggrund På KB-3011 på RH udføres kvantitativ tælling af både kerneholdige celler (leukocytter) og erytrocytter i CSV på det fuldautomatiske analyseudstyr Sysmex XN-9000. Celletælling udføres ved hjælp af BF-mode, som ligeledes kan udføre en differentieltælling af kerneholdige celler, hvor en antalkoncentration af mononukleare celler (monocytter, lymfocytter ) og polymorfnukleære celler (polymorfe neutrofile granulocytter og eosinofile granulocytter) bestemmes (2). CSV har en begrænset holdbarhedsperiode, derfor bør antallet af celler og cellemorfologi undersøges indenfor 2 timer efter lumbalpunktur, helst indenfor 30 min. Dette skyldes et hurtigt cellulærtab in vitro, fordi cellerne, såvel erytrocytter som kerneholdige celler, undergår lysering og efterhånden går til grunde (3). CSV-prøver rekvireres af samtlige afdelinger på Rigshospitalet, hvor prøverne modtages fra indlagte patienter. KB-3011 har også erfaring med eksterne CSV-prøver, hvor prøverne leveres med taxatransport. På KB-3011 behandles CSV som akutte prøver og tælles normalt straks efter modtagelsen. Svar på CSV-prøver, som er celletalt efter mere end 1 time efter prøvetagning, frigives med forbehold. CSV som er mere end 3 timer gammel betragtes uegnet til analysering og får standardsvaret: for gammel (2). Ifølge analysevejledningen fra KB- 3011 fremgår det, at CSV opbevares ved stuetemperatur og analyseres indenfor 1 time, men maks. 3 timer efter prøvetagning. Klinikken anvender et kvantitativt forhold mellem kerneholdige celler og erytrocytter til at vurdere om de kerneholdige celler, som findes, stammer fra en indstiksblødning under lumbalpunktur eller om de i forvejen fandtes i CSV. Et forhold på 1:700 er karakteriseret ved en indstiksblødning, hvorimod et forhold på 1:100 betyder, at kerneholdige celler har været i CSV i forvejen (4). I øjeblikket udtages CSV-prøver fra patienter ikke på samme tid som blodprøver til hæmatologiske undersøgelser, disse ankommer ligeledes på forskellige tidspunkter. Derfor er der ikke muligt at foretage en præcis sammenligning af forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i patientens perifer blod med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i patientens CSV, som er kontamineret med perifer blod på grund af traumatisk lumbal punktur. 2
Dette kunne muligvis give værdifuld information til den optimale fortolkning af det kvantitative forhold mellem leukocytter og erytrocytter med det formål at estimere leukocyttal i blodkontaminerede CSV. Kvantitativ celletælling i CSV bruges som udgangspunkt til diagnosedifferentiering mellem bakteriel og viral meningitis, diagnostik af andre sygdomme i CNS såsom toksiske og inflammatoriske tilstande i hjernehinderne, maligne sygdomme i CNS samt hjerneblødning, og kan derfor give vigtig information om sygdomsbilledet (2) (5). Kontaminering af CSV med perifer blod opstår under traumatisk lumbalpunktur, når en spinal nål ved passage igennem subarachnoidalrummet rammer vaskulær epiduralrummet (6). Kontaminerede prøver med perifer blod vanskeliggør celletælling og kan ligeledes være en årsag til falske positive resultater, fordi antallet af leukocytter kan øges på grund af indstiksblødning (3). Et cellulærtab af leukocytter i cerebrospinalvæske efter 1 time, især i prøver med mildere form for pleocytose (5-15 x 10 6 /L), resulterer i, at prøverne bliver diagnosticeret som normalcellulære med falske negative resultater til følge (7). Logistiske problemer, såsom langvarig transport og forsinkelse af levering af prøver til afdelingen, bidrager til overskridelse af holdbarhedsperioden, og kan derfor være kilde til både præanalytiske fejl og ligeledes være årsag til at prøver bliver kasseret. Da en hurtig diagnosticering af patienter med akutte lidelser i CNS er afgørende for patientens fremtidige sygdomsprognose og behandlingsmuligheder, vil analysesvar, såvel falske positiver som falske negativer, give anledning til diagnoseusikkerhed. Rekvirering af en ny CSV prøve på grund af overskridelse af holdbarhedsperioden udmunder sig, for patienten, i forsinkelse af behandling, ubehag, samt en gentagen lumbalpunktur, som er en invasiv teknik og derfor kan være forbundet med risiko for en række komplikationer (8). KB 3011 ønsker at komme med en mere præcis anbefaling af det kvantitative forhold mellem leukocytter og erytrocytter i CSV. Derfor kan det være relevant at bestemme ændringer i forholdet, over tid, mellem leukocytter og erytrocytter for blodkontaminerede CSV og for CSV, hvor leukocytter har været der i forvejen. 3
Da forholdet mellem leukocytter og erytrocytter kan ændre sig med tiden, vil det ligeledes være relevant at undersøge om henstand af blodkontamineret CSV har betydning for analyseresultater af leukocyt og erytrocytkoncentrationen og hvornår dette bliver klinisk relevant. Problemformulering Hvilken betydning har henstand af cerebrospinalvæske tilsat blod ved stuetemperatur på måleresultaterne for CSV-Kerneholdige celler; antalkoncentration og CSV-Erytrocytter; antal koncentration, målt på Sysmex XN-9000? Målformuleringer Projektet består af flere delproblemer, hvor følgende undersøges: Holdbarheden af erytrocytter og leukocytter i CSV, tilsat blod, hvor forholdet mellem leukocytter og erytrocytter er på 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800, ved tiderne 0 min (den første analyseringstid), 30 min, 60 min, 120 min, 180 min og 240 min. Holdbarheden af neutrofile granulocytter og lymfocytter i CSV tilsat buffy coat Ændringer i forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod uden buffy coat og CSV tilsat blod med buffy coat. Om man, ud fra forholdet mellem leukocytter og erytrocytter, kan afgøre om der er tale om blodtilblanding, hvis man straks tæller celler i CSV og efter henstand. Teori Cerebrospinalvæske Cerebrospinalvæske liquer cerebrospinalis er en klar, farveløs væske, der cirkulerer i ventrikler, samt i cranial og spinal subarachnoidalrummet. CSV har en stødabsorberende funktion, dvs. beskytter hjernen mod stød, samt transporterer næringsstoffer til og nedbrydningsprodukter fra hjernevævet. Hos voksne er der normalt ca. 125-150 ml CSV, og ca. 500 ml af CSV udgør døgnproduktion hos en voksen person (8) (9). 80 % af CSV produceres i det laterale, tredje og fjerde ventrikel af det specialiserede epidymale epitel i plexus choroideus, og resten dannes af ventrikels ependym, arachnoidal membranen og selve hjernevævet (8) (9). Til at begynde med indledes sekretion af CSV passivt ved ultrafiltration af plasma fra den fenestredede kapillærnetværk ind i vævsstruma i plexus choroideus. Dernæst antages det, at CSV s 4
sekretion bliver til en aktiv transport, hvor Na + -ioner transporteres gennem ionkanaler fra plexus choroideus vævsstruma gennem dens epitelceller ind i ventriklens hulrum, der indeholder CSV. Dette resulterer i dannelse af en osmotisk gradient, hvor vandet trækkes ind i ventrikler. Fra ventrikelsystemet cirkulerer CSV i subarachnoidalrummet, hvor den efterfølgende drænes via de såkaldte villi arachnoidales, der er udposninger af subarachnoidalrummet, ind i den venøse cirkulation (8). Under normalle omstændigheder forekommer der kun få celler i CSV, for eksempelvis hvilende (ikke aktiverende) lymfocytter, monocytter og enkelte ependymceller (3). Erytrocytter findes normalt ikke i CSV (2). Referenceinterval for voksne og børn > 1 år for CSV-erytrocytter; antalkoncentration og CSVleukocytter antalkoncentration er < 5 x 10 6 /L ifølge LABKA metodelistedatablad (2). Figur 1. Skematisk tegning viser cirkulation af cerebrospinalvæske i hjernen (9). Leukocytter Leukocytter stammer fra de pluripotente stamceller i knoglemarven. Fra den myeloide stamcellelinje uddifferenceres monocytter, neutrofile -, eosinofile- og basofile-granulocytter, hvorimod den lymfoide cellelinje giver ophav til T- lymfocytter og B-lymfocytter (10). Leukocytter klassificeres ved lysmikroskopi i granulære leukocytter (neutrofile, eosinofile og basofile granulocytter) på baggrund af indholdet og farbarheden af cytoplasmatiske granula. De agranulære leukocytter er monocytter og lymfocytter. På basis af kernens form inddeles de i mononukleære og polymorfnukleære, hvis kernen er lapdelt (9). 5
Tabel 1. Oversigt over forskellige leukocytternes type levetid in vivo, dannelsessted og funktion (9) (10). Leukocytternes navn Neutrofile granulocytter Lymfocytter T-lymfocytter B-lymfocytter Levetid og dannelsessted Dannes i den røde knoglemarv, cirkulerer kun ca.10 timer i blodbanerne, lever få dage i bindevævene. Dannes i det primære lymfoidevæv: knoglemarv og thymus Modnes i thymus NaiveT- lymfocytter recirkulerer mellem blod (ophold ca. 30 min) og lymfoide organer 1-2 gange i døgnet. Hukommelses T-lymfocytter er langt levede celler, og kan leve lige så længe som et individ. Modnes i knoglemarv. Naive B-lymfocytter recirkulerer mellem blod og lymfoide væv og lymfer. Hvis de ikke møder deres specifikke antigen og bliver ikke aktiveret, dør de efter 4-8 ugers forløb. Hukommelses B-cellernes levetid er forskelige, nogle kan leve lige så længe som et individ. Funktion Fagocyterer og dræber mikroorganismer ved bekæmpelse af infektion. Formidler det humorale og det cellulære immunorespons. Fungerer som signal og regulatorceller, der kontakter og aktiverer de andre celler i immunresponset, samt i cytotoksiske reaktioner. Optræder som antigenpræsenterende celler som efter stimulering udvikler sig til plasmaceller, som producerer antistoffer. Erytrocytter Dannes i den røde knogle marv fra den myeloide stamcellelinje. Erytrocyt er ca.7,5 µm i diameter, kerneløs og har en bikonkav form, som opretholdes af cytoskelletets mikrofilamenter. Erytrocytternes hovedfunktion er at transportere ilt og kuldioxid, fordi de indeholder hæmoglobinmolekyler. Erytrocytter indeholder enzymet methemoglobinreduktase, som reducerer methemoglobin (Fe 3+ ) til ferrohæmoglobin (Fe 2+ ), der kan binde ilt, hvor energien til en enzymatisk proces produceres ved glykolysen (9). Faktorer, som påvirker blodcellernes stabilitet i CSV CSV har en anden kemisk sammensætning end blodplasma, hvor koncentration af K +, Mg 2+ og Ca 2+ ioner er lavere i CSV i sammenligning med blodplasmaet. Den organiske del af CSV i form af proteiner, kulhydrater varierer også i forhold til blodplasmaet. Total protein udgør ca. 0,5% af blodplasmaets protein i CSV og glukosekoncentration i CSV udgør 60-70% af glukosekoncentration i blodplasmaet (11). Dette bidrager til CSV s lavere osmolalitet, dvs. CSV er hypoton. 6
Når blodcellerne udtages fra den levende organisme til et reagens glas, vil blodcellerne undergå hydropisk degeneration på grund af væskeophobning. Hydropisk degeneration opstår, når cellernes regulering af ionkoncentrationerne i cytoplasma forstyrres som følge af en beskadiget Na + /K + -pumpe. Beskadigelse af Na + /K + -pumpen kan foregå enten på grund af fejl i selve pumpen eller mangel på ATP, som er pumpens energikilde. Beskadigelse af cellemembranen kan også medføre ophør af Na + /K + -pumpefunktion, der resulterer i at koncentration af Na + -ioner stiger i cellens cytoplasma. Da osmolalitet af cellens cytoplasma bliver højere på grund af ophobning af Na + -ioner, vil vandmolekyler på grund af osmose diffundere ind i cellen gennem cellens semipermeabel membran. Dette resulterer i at cellen svulmer op (12) (13). Alle disse ovennævnte processer fører til lysering af cellemembranen og cellernes død. Erytrocytter har osmolalitet, som er lig med blodplasmaet (0,30 M glukose; 0,15 M NaCl), dvs. osmolalitet er isotonisk både inden for cellen og uden for cellen. Når erytrocytter bliver placeret i hypoton opløsning, vil erytrocytterne optage vand, svulme op og bliver sfæriske. Strækningen påvirker erytrocytternes membran og gør den mindre stabile og utætte. Disse ovennævnte processer resulterer i hæmolyse (9) (13). Analyseprincip for måling af leukocytter Leukocytter bestemmes ved flowcytometri, hvor forskellige parametre måles på celler imens cellerne passerer igennem et måleområde i en væskestrøm. 55 µl af CSV aspireres fra et Sarstedt glas.1 ml reagens WDF-lysercell tilsættes med det formål at lysere erytrocytter og delvis lysere leukocytter. Dette medvirker til dannelsen af mikroporer på cellemembranen som gør at cellen mister sin form. Dette resulterer i at cellens indre strukturer bliver synlige. 20 µl fluorescerende polymetin farvestof (Fluorocell WDF) tilsættes, hvor det binder sig både til leukocytternes DNA og RNA. Derefter sendes 1 ml af fortyndet prøve i et forhold 1:20 fra reaktionskammeret til den optiske detektorblok og bliver hydrodynamisk fokuseret. 7
Halvlederlaser anvendes som lyskilde og belyser celler, når de enkeltvis passerer laseren. Når halvlederlaserens monokromatiske lys interagerer med cellen, vil noget af lyset spredes af cellen fremadrettet og give information om cellens størrelse (Forward Scattered Light, FSL) (10) (14). Noget af lyset vil spredes af cellen til siden (Side Scattered Light, SSC) og give information om cellens intracellulære struktur, for eksempel granula, kernestørrelse, celleorganeller. Det fluorescerende lys absorberes af cellernes organeller og udsendes dernæst med lavere energiniveau i alle retninger (Side Flourescence Light, SFL), vil give oplysninger om RNA/DNA indhold. De optiske signaler transformeres til elektriske signaler, som registreres og bearbejdes af et computersystem (14). Figur 2. Skitsering af måleprincippet ved flowcytometri med en halvleder laser som lyskilde, samt 3 forskellige typer af information for hver celle (15). Ud fra intensiteten af det spredte lys, (SSC) og fluorescerende lys (SFL) bliver leukocytter opdelt i populationer af monocytter, lymfocytter, eosinofilocytter og neutrofilocytter. Cellepopulationerne præsenteres i form af WDF-scattergrammet (14). Figur 3. Et histogram over forskellige leukocytpopulationer: MN(mononukleære) = LY lymfocytter + MO - monocytter, PMN(polymorfnukleære) = NE-neutrofile + EO eosinonofile granulocytter HF-high fluorescens celler. X-aksen viser intensitet af det spredte lys og intensitet af det fluorescerende lys vises ud af Y-aksen (2). 8
Analyseprincip for måling af erytrocytter Til tælling af erytrocytter i CSV anvendes DC-jævnstrømsprincippet. I DC-princippet udnytter cellernes evne til at yde større elektrisk modstand end en elektrolytopløsning (16). Cellerne i en elektrolytopløsning passerer enkeltvis igennem et lille hul i et glasrør. Elektrolytopløsningen befinder sig både udenfor og inde i røret. To elektroder er placeret på hver side af hullet, hvor der holdes en konstant strøm (16). Passagen af en erytrocytter gennem hullet bidrager til stigning af den elektriske modstand over hullet, fordi noget af elektrolytopløsningen vil fortrænges. Ifølge Ohms lov vil spændingen også stige: U (spænding) = R (modstand) x I (strømstyrke). Spændingsforskellen er afhængig af erytrocytternes størrelse. En stor celle fortrænger mere elektrolytopløsning end en lille celle og kan derfor bidrage til såvel stigning af modstanden som en større spændingsforskel (16). Erytrocytter i CSV tælles i RBC-kanalen. Under erytrocyttællingen kan fejlregistrering af celler opstå på grund af turbulens eller to små celler passerer samtidig gennem apparaturet hvorved de registreres som en stor celle i stedet for to små. For at undgå disse fejl anvendes en hydrodynamisk fokusering. Formålet med hydrodynamisk fokusering er at centrere vekselstrømmen med celler sådan, at de kun passerer gennem hullets midte, én celle ad gangen, hvor cellerne er omsluttet af en kraftig strømmende sheath reagens (16). Alle spændingsændringer og impulser fra målingerne registreres af computerens software, dernæst omsættes de til antal celler per liter CSV og et histogram optegnes over cellernes størrelsesfordeling. Figur 4. Skematisk tegning viser hydrodynamisk fokusering, hvor celler, som perle på en snor passerer midte af aperturet (16). 9
Figur 5. Skematisk tegning (venstre) viser CD-princip med jævnstrøm, hvor en celle passerer gennem aperturet. Tegning (højre) viser A- normal impuls, cellen passerer gennem midten af aperturet, B-abnormal impuls, cellen passerer ved kanten af aperturet, C-abnormal impuls, cellen passerer ikke gennem aperturet (16). Metodevalg Argumentation for valg af metodedesign. Forholdene 1:500 og 1:750 mellem leukocytter og erytrocytter blev udvalgt som udgangspunkt ud fra tre videnskabelige studier for at understøtte valget af forskellige kvantitative forhold mellem leukocytter og erytrocytter i CSV (6) (17) (18). I artiklen Mayefsky J.H. & Roghmann K.J (17) hævdes det, at mange læger, som en tommelfingerregel, anvender forholdet 1:500 og 1:750 til at estimere leukocyttal i CSV, der er kontamineret med blod. I studierne Mazor S.S et.al (6) og Bonsu B.K.& Harper M.B (18) blev der ligeledes refereret til samme forhold 1:500. Dette begrundes ud fra det normale forhold mellem leukocytter og erytrocytter i perifer blod. Forholdene mellem leukocytter og erytrocytter (1:500 & 1:700) blev udvalgt til projektet på baggrund af argumenter om, at dette er forholdet mellem leukocytter og erytrocytter hos en sund og rask person og RH klinikkens kriterier for fortolkning af resultater for CSV (4). Forholdene mellem leukocytter og erytrocytter (1:200, 1:400 & 1:800) blev udvalgt på baggrund af vores ønske om at inddrage flere forhold mellem leukocytter og erytrocytter i holdbarhedsundersøgelsen. Da projektet omhandler simulering af CSV med forskellige forhold mellem leukocytter og erytrocytter, skulle der fremstilles blandinger ud fra cellefri CSV, hvor der blev tilsat frisk K2-EDTA stabiliseret veneblod i såvel forskellige mængder som forskellige forhold mellem leukocytter og erytrocytter ved stuetemperatur og derefter målt på Sysmex XN-9000 på de udvalgte relevante tidspunkter. 10
Projektets praktiske del derfor blev inddelt i 2 dele. Formålet med den første del har været at simulere CSV med indstiksblødning, hvor leukocytter ikke har været der før lumbal punktur. Formålet med den anden del har været at simulere CSV, hvor leukocytter har været der før lumbal punktur. Af tidsmæssig årsager og en utilstrækkelig mængde buffy coat, med to forskellige leukocyttyper, til at kunne gennemføre undersøgelsen med simulering af indstiksblødning med celler i forvejen, blev de følgende forhold mellem leukocytter og erytrocytter 1:500, 1:700 og 1:800 udvalgt til den anden praktiske del af projektet. Studiet Chow G. et.al (19) redegør i sit metodedesign, at der bl.a. blev simuleret fremstilling af blodkontamineret CSV ved tilsætning af forskellige mængder af EDTA stabiliseret blod, opsamlet fra venepunktur i CSV uden pleocytose. Antallet af leukocytter og erytrocytter blev dernæst talt på specifikke tidsintervaller. Studiet hævder, at deres foreløbige undersøgelser påviste identiske resultater uafhængig af om der bliver brugt frisk blod eller EDTA stabiliseret blod til fremstilling af blodkontamineret CSV (19). Studiets metodedesign understøtter vores valg til at anvende EDTAstabiliseret veneblod til simulering af blodkontaminerede CSV. Valg af prøvemateriale Cerebrospinalvæske Der blev anvendt færdiganalyseret CSV til projektet, som blev indsamlet af KB 3011 s personale ved arbejdspladserne manuelhæmatologi og Cobas i perioden 07.2015-10.2015. Det færdige analyserede CSV blev indsamlet, i pool, i spidsglas og nedfrosset. Fordi vores mål har været at opnå cellefri CSV, er det derfor hensigtsmæssigt at anvende nedfrysning som en optimal metode til opbevaring af CSV (20). Guidelines for CSV rutineanalyser anbefaler nedfrysning af CSV ved -20 0 C over lang tid (3). På baggrund af anbefalingerne fra Guidelines for CSV blev temperaturen -20 0 C valgt til nedfrysning af CSV. Når CSV skulle optøs og klargøres, for at påbegynde den praktiske del af projektet, blev forholdene ved optøning, centrifugering og efterfølgende opbevaring overvejet. Studiet Hubel. A. et.al (20) anbefalede en hurtig optøning i vandbad ved 37 0 C, ved nedsænkning af en prøve i kontinuerligt omrørt vand. Optøet CSV blev centrifugeret med det formål at sedimentere cellerester og proteinmolekyler, med efterfølgende afpipettering af supernatanten. 11
Efter KB-3011 s standard centrifugeringsprocedure blev centrifugeringstiden fastsat til 3117 g i 10 min ved 20 0 C for at sikre, at de tre trin i centrifugeringen (fri sedimentation, hæmmet sedimentation og sammenpresning af bundfaldet) bliver gennemført (21). For at kontrollere, at poolen med CSV ikke indeholdt celler (erytrocytter og leukocytter), blev der foretaget en analysering på Sysmex med BF-mode programmet. CSV blev anvendt straks efter oprensning til fremstilling af blandinger af CSV tilsat blod. Overskydende CSV blev opbevaret højst 1 døgn efter oprensning ved +4 0 C. Valg af blodprøver/buffy coat Færdig analyserede blodprøver fra rutine blev udvalgt med følgende forhold mellem leukocytter og erytrocytter: 1:200, 1: 400, 1:500, 1:700 og 1:800. Der bliver fremover defineret følgende to begreber: det tilstræbte forhold og det faktiske forhold. Det tilstræbte forhold beskriver et ønsket eller fastsat forhold mellem leukocytter og erytrocytter, hvorimod det faktiske forhold beskriver det reelle forhold mellem cellerne i blodprøve. Da det faktiske forhold kan afvige fra det tilstræbte forhold, vil der blive accepteret en afvigelse på max ± 30 for hvert celleforhold. Det blev tilstræbt at udvælge blodprøver, som havde et leukocyttal 5 x 10 9 /L, 6 x 10 9 /L, 8 x 10 9 /L, 10 x10 9 /L, 20 x 10 9 /L og et erytrocyttal, som lå på 4 x 10 12 /L. Til fremstilling af buffy coat blev 2 blodprøver udvalgt: en blodprøve med neutrofil granulocyt antalkoncentration mellem 27 x 10 9 /L og 57 x 10 9 /L og en blodprøve med lymfocyt antalkoncentration mellem 9 x 10 9 /L og 30 x 10 9 /L. Blodprøverne, max 24 timer gamle, blev udvalgt, for at opnå blodcelle-sedimentation. Centrifugering af prøverne blev derfor fravalgt. Holdbarhedsperioden for K2 EDTA-stabiliseret veneblod er 6 timer ved stuetemperatur, derfor skulle blodprøver helst udvælges inden for den definerede tid (16). Et stabilitetsstudie anfører holdbarheden til op til 48 timer ved +23± 2 0 C for neutrofilocytter og lymfocytter. Erytrocytter er stabile op til 24-48 timer ved +23± 2 0 C (22). Der blev valgt to K2-EDTA stabiliseret veneblodprøver til hvert af det tilstræbte forhold til 1. del af projektet. Til 2. del blev én K2-EDTA stabiliseret veneblodprøve udvalgt. 12
Dvs. antal af blodprøver blev udvalgt sådan, at de kunne dække alle de bestemte relevante forhold mellem leukocytter og erytrocytter, samt de ovennævnte leukocyt og erytrocyt antalkoncentrationer. Blodprøver blev anvendt til fremstilling af en række blandinger med leukocytkoncentrationer på 5 x 10 6 /L, 10 x 10 6 /L, 20 x 10 6 /L og 50 x 10 6 /L. Hver blanding defineres fremover som en prøve. Valg at tiden og temperatur for proceduren De udvalgte tidspunkter var: 15 min (0-tid), 30 min, 60 min, 120 min, 180 min og 240 min. Tidspunkterne blev delvis valgt ud fra Guidelines for CSV rutineanalyser, hvor CSV omgående skulle undersøges efter opsamling (<1 time), og hvor cytologiske undersøgelser af CSV skulle udføres inden for 2 timer efter lumbalpunktur, helst inden for 30 min (3). Tidspunkterne blev delvis valgt fra KB 3011 s definition af holdbarhedsperioden for CSV og delvis fra en formodning om at der muligvis kunne være en endnu længere holdbarhed for CSV (2). Temperaturen for proceduren blev udvalgt som udgangspunkt på baggrund af KB 3011 s retningslinjer for opbevaring af CSV, dvs. stuetemperatur (2). Valg af databehandling Data præsenteres ved hjælp af grafiske afbildninger af resultater De relative analysesvar for leukocyt og erytrocyt antalkoncentration, udtrykt i procent fra udgangsværdi som funktion af tiden. Det relativt analysesvar for leukocyt og erytrocytkoncentration (%) = analysesvar (ved tid 30 min,eller 60 min,eller 120,eller 180 eller 240 min ) udgangsværdi ved 0 tiden 100% (23). Etiske overvejelser Da projektet ikke havde direkte indsamling af blodprøver og CSV fra indlagte og ambulante patienter, og der kun blev anvendt eksisterende prøvemateriale, skulle der derfor ikke ansøges om tilladelse fra Videnskabsetisk Komite (24). Det analyserede CSV bliv samlet i en pool, som bestod af CSV fra flere patienter. På den måde fremstod poolen blandet og uidentificerbar, hvor det har ikke været muligt at identificere de enkelte patienter og koble afvigende resultater i CSV til patienterne. I projektet benyttedes analyserede patientblodprøver, hvor alle analysesvar, blandt andet de afvigende analysesvar, blev afgivet til rekvirenten ifølge retningslinjerne i KB-3011. 13
Ved udvælgelse af patientenes blodprøver man har forsøgt at undgå at se patientenes data. Skete dette alligevel, skulle patientenes data behandles fortroligt, og prøverne behandles med omhu. Alt prøvemateriale, som blev anvendt i projektsammenhæng, forblev i Danmark og destrueret efter projektets afslutning. Materialer og metode Materialer Apparaturer Sysmex XN-9000-5-A nr. 244181 Centrifugen Rotanta 460 R, Hettich, Nr. 1006118 Vandbad Julabo, Buch & Holm, Nr. 240510 Reagenser Tabel 2 Oversigt over reagenser, kontroller og reagensernes producent Reagens navn Lot nummer Reagensernes producent: Fluorocell WDF A 5025 Sysmex Europe GmbH Fluorocell WNR A 5050 Dette gælder for Lysercell WDF A 5002 reagenserne og kontrollerne, Lysercell WNR A 5014 der, er anført i tabellen. Cellpack DCL D 5507 BF Kontrol Level 1 QC-52361301 BF Kontrol Level 2 QC-52361302 XN-Check Kontrol Level 1 QC-52361101 XN-Check Kontrol Level 2 QC-52361102 XN-Check Kontrol Level 3 QC-52361103 Prøvemateriale Pools med CSV K2-EDTA stabiliseret veneblod i 2 ml Vacuette glas Buffy coat med neutrofilocytter Buffy coat med lymfocytter 14
Utensilier Sarstedt-rør 5ml Lot nr. 3092101 Spids glas 10 ml Lot nr. P008307 Finnpipette 5-40 µl 1A nr.08 Finnpipette 1-5 ml 2B-06 Finpipette 200-1000 µl KB-10 Finpipette 200-1000 µl 1B nr.15 Engangspipetter Pastette Lot nr. 15060102 Metode 1. del Analysering af blandinger / blodprøver Præcisions kontrolmateriale for Body Fluid i 2 niveauer, samt Fuldblods kontroller (XN-Check) i 3 niveauer, blev analyseret af KB-3011 s personale og kontrollet af studerende inden analysering påbegyndte. Alle kontrollerne for de ovennævnte kontrolmaterialer lå inden for acceptintervallerne for alle parametre. Analysering af alle blandinger, hvor blod tilsat CSV, blev målt som dobbeltbestemmelse på BF-mode programmet, blodprøver og buffy coat med to leukocyttyper (neutrofilocytter og lymfocytter) blev analyseret som enkeltbestemmelse på Fuldblod -programmet. Tolerance for dobbeltbestemmelser for leukocyt- og erytrocyt antalkoncentration blev beregnet og overholdt for alle målinger ifølge KB-3011 s analysevejledning (2). Analyseringstider for blandinger blev fastlagt ved 0-tiden, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min og 240 min. 0-tiden defineres, som tiden, hvor en blanding bliver analyseret på apparatur. Dvs. der kunne gå max. 15 min siden fremstilling af blanding CSV tilsat blod inden den blev analyseret. Oprensning af frosset CSV (cerebrospinalvæske) pool. Den beregnede volumen med frosset CSV pool i spidsglas, blev optøet i vandbad ved 37 0 C i 10 min, dernæst blev spidsglassene centrifugeret ved 3117 G i 10 min ved 20 0 C. Supernatanten blev afpipetteret i et nyt spidsglas, derved blev ca. 0,5 ml af supernatanten udtaget til et Sarstedt rør for at analysere på Sysmex. Cellefri CSV blev anvendt til fremstilling af 4 blandinger, hvor K2EDTA stabiliseret veneblod blev tilsat. Fremstilling af blandinger (blod + CSV) En blodprøve med det tilstræbte celleforhold blev udvalgt og dernæst analyseret på Sysmex med det formål at bestemme det faktiske forhold mellem leukocytter og erytrocytter. 15
4 blandinger CSV tilsat blod blev fremstillet i spidsglas med slut leukocytkoncentration på 5 x 10 6 /L, 10 x 10 6 /L, 20 x 10 6 /L og 50 x 10 6 /L. Start leukocytkoncentrationen blev fastsat til leukocyt antalkoncentration fra blodet med det tilstræbte forhold mellem leukocytter og erytrocytter. Blodvolumen, der skulle afpipetteres til slut volumen af CSV blev beregnet. Ved udvælgelsen af en blodprøve med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter på 1:400 og 1:800 til fremstilling af blandinger med leukocytkoncentration på 10 x 10 6 /L,20 x 10 6 /L og 50 x 10 6 /L, blev slutvolumen af CSV fastsat til 5 ml. Ved udvælgelsen af en blodprøve med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter på 1:700, 1:500 og 1:200 blev slutvolumen af CSV fastsat til henholdsvis 6 ml, 8 ml og 10 ml. Blandingen med slut leukocytkoncentration på 5 x 10 6 /L blev fremstillet ud fra blandingen med leukocytkoncentration på 50 x 10 6 /L, med et forhold 1:9. Blodprøven blev vendt 15 gange før afpipetteringen påbegyndtes. Hver blanding blev grundigt vendt 15 gange efter fremstillingen, derefter blev 5 ml af blandingen straks afpipetteret til et Sarstedt rør og analyseret på Sysmex ved de relevante tider. Oprensning af frosset CSV pool 1 blodprøve med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter 1:200 (1:400, 1:500, 1:700, 1:800). Cellefri CSV (Blod +CSV) Leukocyt koncentration 5 x10 6 /L (Blod + CSV) Leukocyt koncentration 10 x 10 6 /L (Blod + CSV) Leukocyt koncentration 20 x 10 6 /L (Blod + CSV) Leukocyt koncentration 50 x 10 6 /L 4 Sarstedt rør analyseres på Sysmex XN-9000 ved 0-tiden, 30 min, 60 min, 120 min,180 min og 240 min. Figur 6. Et flowdiagram, som viser diverse trin i den første del af metoden, der simulerer patientens CSV med indstiksblødning, hvor leukocytter ikke har været i forvejen. 16
Metode 2. del Til oprensning af frosset CSV pool blev der anvendt samme teknik, som blev beskrevet i 1. del af metoden. Cellefri CSV blev anvendt til fremstilling af de 5 følgende blandinger: 1. Buffy coat med neutrofile granulocytter tilsat CSV, forkortes som (bfc. /NE+CSV) 2. Buffy coat med lymfocytter tilsat CSV, (bfc. /LY+CSV) 3. Blod tilsat CSV (blod + CSV) 4. Blod + CSV tilsat buffy coat med neutrofile granulocytter, (blod + CSV) + (bfc. /NE + CSV) 5. Blod +CSV tilsat buffy coat med lymfocytter, (blod + CSV) + (bfc. /LY + CSV) Fremstilling af to blandinger (bfc. /LY+CSV) og (bfc. /NE+CSV) Der blev udvalgt en blodprøve med neutrofile granulocyt antalkoncentration mellem 27 x 10 9 /L og 57 x 10 9 /L og en blodprøve med lymfocyt antalkoncentration mellem 9 x 10 9 /L og 30 x 10 9 /L. Buffy coat blev udtaget fra hver blodprøve i et Sarstedt rør for hver leukocyttype og analyseret på Sysmex. Start leukocytkoncentration til beregningen af start volumen af buffy coat med lymfocytter, samt buffy coat med neutrofilocytter blev beregnet ud fra målinger på Sysmex. Blandinger (bfc. /LY+CSV) og (bfc. /NE+CSV) blev fremstillet i spidsglas. Slut volumen blev fastsat til 10 ml CSV og slutkoncentration for de to leukocyttyper blev bestemt til 75 x 10 6 /L. 2 ml af hver blanding blev afpipetteret i et Sarstedt rør og analyseret. Efter 1 times henstand blev de to ovennævnte blandinger genanalyseret, hvor lymfocyt og neutrofilocyt antalkoncentrationen blev bestemt. Fremstilling af blandingen (blod + CSV). En blodprøve med det tilstræbte forhold blev udvalgt, dernæst blev blodprøven analyseret for at bestemme det faktiske forhold mellem leukocytter og erytrocytter. Der blev fremstillet en blanding med slut leukocytkoncentration på 20 x 10 6 /L og slutvolumen af CSV på 10 ml, når der blev anvendt blodprøve med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter på 1:800. Ved udvælgelse af en blodprøve med forholdet mellem leukocytter og erytrocytter på 1:500 og 1:700 blev CSV slutvolumen fastsat til henholdsvis 8 ml og 6 ml. Start leukocytkoncentration blev som udgangspunkt bestemt fra blodprøven med det tilstræbte celleforhold. Start blodvolumen blev beregnet. Efter fremstillingen blev blandingen grundigt vendt 15 gange. 2 ml af blandingen blev afpipetteret til to spidsglas, og 2 ml blev yderligere afpipetteret i Sarstedt rør og analyseret. 17
Fremstilling af blandinger (Blod + CSV) + (bfc. /LY + CSV) og (Blod + CSV) + (bfc. /NE + CSV) Det første spidsglas med slut volumen på 2 ml (blod +CSV) blev tilsat en beregnet volumen af (bfc. /LY +CSV) efter 1 times henstand. Slut leukocytkoncentrationen blev derefter på 40 x 10 6 /L. Det andet spidsglas med slut volumen på 2 ml (blod +CSV) blev tilsat en beregnet volumen af (bfc. /NE+ CSV) efter 1 times henstand. Slut leukocytkoncentrationen blev derefter på 40 x 10 6 /L. 2 ml af hver blandingen blev afpipetteret i et Sarstedt rør og analyseret på Sysmex. De 5 blandinger blev analyseret ved de relevante tidspunkter. Databehandling blev udført på Microsoft Excel 2013 program. Oprensning af frosset CSV pool 1 blodprøve med høj lymfocytkoncentration 1 blodprøve med høj neutrofilocytkoncentration 1 blodprøve med de tilstræbte forhold på 1:500, 1:700 og 1:800. Cellefri CSV Buffy coat med lymfocytter og neutrofilocytter måles på Sysmex XN-9000 Buffy coat med lymfocytter + CSV Buffy coat med neutrofilocytter + CSV De 2 blandinger analyseres på Sysmex, og derefter henstår de i 1 time ved 22 0 C. (Blod +CSV) tilsat (bfc. /LY +CSV) (Blod +CSV) tilsat (bfc. /NE +CSV) (Bfc / LY +CSV) efter 1 times henstand (Bfc./ NE +CSV) efter 1 times henstand (Blod + CSV) De 5 blandinger analyseres ved 0-tiden, 30 min, 60 min, 120 min 180 min og 240 min. Figur 7. Flowdiagram, som viser diverse trin i den andel del af metoden, der simulerer patientens CSV med indstiksblødning, hvor leukocytter har været i forvejen. 18
Resultater Resultater illustreres i grafisk form, og viser følgende: 1. Leukocyt og erytrocyt antalkoncentration i CSV som funktion af tiden i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800. Leukocyt og erytrocyt antalkoncentration blev udtrykt i procent fra udgangsværdien, der defineres som leukocyt- og erytrocyt antalkoncentration ved 0- tiden og er lig med 100%. 2. Middelværdi af leukocyt og erytrocyt antalkoncentration som funktion af tiden. 3. Kvantitative ændringer af buffy coat med neutrofilocyt- og lymfocyt antalkoncentration som funktion af tiden, hvor koncentrationer ligeledes blev udtrykt relativt i procent. 4. Forholdet mellem leukocytter og erytrocytter i CSV som funktion af tiden. Resultater for en gennemsnitlig procentvis reduktion i neutrofilocyt- og lymfocyt antalkoncentration over tid er præsenteret i en tabel. Tabel 3. En gennemsnitlig procentvis reduktion i antalkoncentrationen af lymfocytter og neutrofile granulocytter Tid(min) 0 min 30 min 60 min 120 min 180 min 240 min Lymfocytter 100 7 14 26 28 34 Neutrofile granulocytter 100 15 32 39 46 51 19
LEUKOCYT ANTALKONCENTRATION % LEUKOCYT ANTAL KONCENTRATION % LEUKOCYT ANTAL KONCENTRATION % PH Metropol Larisa Holm Professionsbachelorprojekt 2015 De relative analysesvar for leukocyt antalkoncentration i CSV tilsat blod i de 5 tilstræbte forhold som funktion af tiden L E U K O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N 5 X 1 0 6 /L 140 120 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) L E U K O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N 1 0 X 1 0 120 6 / L 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) Figur 8 Figur 9 120 100 80 60 40 20 0 L E U K O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N 2 0 X 1 0 6 /L 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) LEUKOCYT ANTAL KONCENTRATION % 150 100 50 0 L E U K O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N 5 0 X 1 0 6 /L 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 TID (MIN) 1:200 1:200 1:400 1:400 1:500 1:500 1:700 1:700 Figur 10 Figur 11 Figur 8, figur 9, figur 10 og figur 11 viser de relative analysesvar for leukocyt antalkoncentrationer fra 5 til 50 x 10 6 /L i CSV tilsat blod i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800 som funktion af tiden ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser de relative analysesvar for leukocyt antalkoncentrationer, der er udtrykt i procent fra 0 tiden for de 10 prøver. For hver prøve er anført forholdet mellem leukocytter og erytrocytter. 20
ERYTROCYT ANTAL KONCENTRATION % PH Metropol Larisa Holm Professionsbachelorprojekt 2015 De relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentration i CSV tilsat blod som funktion af tiden. 140 120 100 80 60 40 20 0 E R Y T R O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N (1000-4 0 0 0 X 1 0 6 / L ) 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) ERYTROCYT ANTALKONCENTRATION % 140 120 100 80 60 40 20 0 E R Y T R O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N (2000-8 0 0 0 X 1 0 6 /L) 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) Figur 12 Figur 13 ERYTROCYT ANTAL KONCENTRATION % 120 100 80 60 40 20 0 E R Y T R O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N (4000-1 6 0 0 0 X 1 0 6 /L) 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) ERYTROCYT ANTAL KONCENTRATION % E R Y T R O C Y T A N T A L K O N C E N T R A T I O N (10000-40000 X 1 0 6 /L) 120 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) 1:200 1:200 1:400 1:400 1:500 1:500 1:700 1:700 1:800 1:800 Figur 14 Figur 15 Figur 12, figur 13, figur 14 og figur 15 viser de relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentrationer fra 1000 til 40 000 x 10 6 /L i CSV tilsat blod i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800 som funktion af tiden ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser de relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentrationer, der er udtrykt i procent fra 0 tiden for de 10 prøver. Der er anførte det tilstræbte forhold for hver prøve. 21
MIDDELVÆRDI AF DE RELATIVE ANALYSESVAR FOR ERYTROCYT ANTALKONCENTRATION % MIDDELVÆRDI AF DE RELATIVE ANALYSESVAR FOR LEUKOCYT ANTALKONCENTRATION % PH Metropol Larisa Holm Professionsbachelorprojekt 2015 M I D D E L V Æ R D I A F D E R E L A T I V E A N A L Y S ESVAR F O R L EUKOCYT A N T A L K O N C E N T R A T I O N I C S V S O M F U N K T I O N A F T I D EN 120 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 Leukkonc 5 x 10(6)/L TID(MIN) Leukkonc. 10 x 10(6)/L Leukkonc. 20 x 10(6)/L Leukkonc. 50 x 10(6)/L Figur 16 illustrerer middelværdi af de relative analysesvar for leukocyt antalkoncentrationer i CSV tilsat blod i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800 som funktion af tiden efter opbevaring ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser middelværdi de relative analysesvar for de 4 leukocyt antalkoncentrationer, som er vist i Figur 8, Figur 9, Figur 10 og Figur 11. 120 100 80 60 40 20 M I D D E L V Æ R D I A F D E R E L A T I V E A N A L Y S ESVAR F O R ERYTROCYT A N T A L K O N C E N T R A T I O N I C S V S O M F U N K T I O N A F T I D EN 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 TID (MIN) Erytrkonc (1000-4000)x 10(6)/L Erytrkonc. (4000-16 000) x 10(6)/L Erytrkonc. (2000-8000 )x 10(6)/L Erytrkonc (10 000-40 000) x 10(6)/L Figur 17 illustrerer middelværdi af de relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentrationer i CSV tilsat blod i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500, 1:700 og 1:800 som funktion af tiden efter opbevaring ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser middelværdi af de relative analysesvar for erytrocyt antalkoncentrationer, som er vist i parenteser. 22
FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER FORHOLD MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER PH Metropol Larisa Holm Professionsbachelorprojekt 2015 De tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500 og 1:700 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 2 0 0 1:700 1:600 1:500 1:400 1:300 1:200 1:100 1: 0 30 60 90 120150180210240270 TID(MIN) 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 1:2000 1:1600 1:1200 1:800 1:400 1:0 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 4 0 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 5 x 10(6)/L Figur 18 Figur 19 1:3000 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 5 0 0 1:3500 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 7 0 0 1:2500 1:2800 1:2000 1:1500 1:1000 1:2100 1:1400 1:500 1:0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L Figur 20 Figur 21 1:700 1:0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L Figur 18, figur 19, figur 20 og figur 21 illustrerer ændringer i de tilstræbte forhold 1:200, 1:400, 1:500 og 1:700 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser forholdet mellem leukocytter og erytrocytter. Der er anført leukocytkoncentration for hver prøve. 23
FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER FORHOLDET MELLEM LEUKOCYTTER OG ERYTROCYTTER PH Metropol Larisa Holm Professionsbachelorprojekt 2015 Det tilstræbte forhold 1:800 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden 1:4800 1:4000 1:3200 1:2400 1:1600 1:800 1:0 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 8 0 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 TID (MIN) 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L 5 x 10(6)/L 10 x 10(6)/L 20 x 10(6)/L 50 x 10(6)/L Figur 22 Figur 22 illustrerer ændringer i det tilstræbte forhold 1:800 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat blod som funktion af tiden ved 22 0 C. X-aksen viser tid i minutter, og Y-aksen viser forholdet mellem leukocytter og erytrocytter. Der er anført leukocytkoncentration for hver prøve. De tilstræbte forhold 1:500, 1:700 og 1:800 mellem leukocytter og erytrocytter i CSV tilsat buffy coat som funktion af tiden 1:2400 1:2100 1:1800 1:1500 1:1200 1:900 1:600 1:300 1:0 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 5 0 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID (MIN) (blod+csv) (bfc/ly+csv) (bfc/ne+csv) (blod+csv)+(bfc/ly+csv) (blod+csv)+(bfc/ne+csv) 1:2250 1:2000 1:1750 1:1500 1:1250 1:1000 1:750 1:500 1:250 1:0 D E T T I L S T R Æ B T E F O R H O L D 1 : 7 0 0 0 30 60 90 120150180210240270 TID(MIN) (blod +CSV) (bfc/ly +CSV) (bfc./ne + CSV) (blod +CSV) +(bfc./ly +CSV) (blod+csv) +(bfc./ne+csv) Figur 23 Figur 24 24