COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: 03500756 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: 03502295 001 TILSIGTET BRUG COBAS TaqMan HBV-testen, der er beregnet til brug med High Pure-systemet (HPS), er en in vitro nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af Hepatitis B-virus (HBV) DNA i humant serum eller plasma ved hjælp af High Pure System Viral Nucleic Acid-kittet til manuel prøveforberedelse og COBAS TaqMan 48 Analyzer til automatisk amplifikation og detektion. COBAS TaqMan HBV-testen er ikke beregnet til brug ved screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af HBV eller som diagnostisk analyse til konfirmering af HBV-infektioner. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Hepatitis B-virus (HBV) er et af flere vira, der er årsag til viral hepatitis. Mere end to milliarder mennesker i verden er smittet med HBV, og mere end 350 millioner af disse er kroniske smittebærere 1. Kroniske bærere har en stor risiko for at udvikle længerevarende infektionskomplikationer, herunder kronisk hepatitis, cirrhose og hepatocellulært karcinom 2,3,4. Der anvendes normalt serologiske markører som diagnostiske og/eller prognostiske indikatorer for akut eller kronisk HBV-infektion. Den mest almindelige markør for HBVinfektion er tilstedeværelsen af HBV-overfladeantigen (HBsAg). Selvom bærere kan cleare HBsAg og udvikle antistoffer mod HBsAg, er der fortsat en risiko for alvorlige leverkomplikationer senere i livet 5,6. HBV e-antigen (HBeAg) bruges normalt som en sekundær markør for at angive aktiv HBVreplikation, der er forbundet med progressiv leversygdom. Hvis HBeAg ikke cleares, synes risikoen for at få kronisk leversygdom at øges 7,8. HBV-stammevarianter kan enten producere HBsAg, som ikke kan påvises i serum, eller stammen kan miste evnen til at producere HBeAg, selvom der er en aktiv infektion til stede 9. Derfor kan anvendeligheden af denne markør til monitorering af sygdomsforløbet være begrænset 10. Evnen til at påvise HBV DNA i serum har vist sig at udgøre en prognostisk værdi for resultatet af akutte og kroniske HBV-infektioner 11,12,13,14. Metoden gør det muligt at påvise HBV DNA efter HBsAgclearance 15 eller detektion af HBV ved mangel på serologiske markører 16. Der er dog endnu ikke fastlagt et forhold mellem serologiske markører og HBV DNA-koncentrationer. Effektiviteten af antivirusbehandling af patienter med HBV kan også vurderes ved hjælp af serologiske markører eller ved at måle leverenzymfunktionen. Den mest direkte og pålidelige måling af viral replikation anses dog for at være kvantificering af viral HBV DNA i serum eller plasma 13,17,18,19. Et hurtigt og vedvarende fald i HBV DNAkoncentrationen hos patienter, der behandles med alfa-interferon, lamivudin eller ganciclovir, har vist sig at være en prædiktiv faktor for et vellykket behandlingsresultat 10,20,21,22,23,24. Monitorering af HBV DNAkoncentrationer kan forudsige udviklingen af lamivudin-resistens 25. En kvantitativ test til målingen af HBV DNA er derfor et værdifuldt værktøj, der kan bruges sammen med andre serologiske markører ved behandlingen af HBV-infektioner. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN COBAS TaqMan HBV-testen er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse for at opnå HBV DNA. (2) Automatisk PCR-amplifikation af target-dna et ved hjælp af HBV-specifikke komplementære primere og detektion af spaltede dobbeltfluorescerende, farvemærkede oligonukleotide detektionsprober, der tillader kvantificering af det amplificerede HBV-target (amplikon) og HBV-kvantificeringsstandard-DNA, som behandles, amplificeres og detekteres samtidigt med prøven. Master Mix-reagenset indeholder to primere og prober, der er specifikke for HBV DNA og HBVkvantificeringsstandard-DNA et. Master Mix-reagenset er udviklet med henblik på at sikre en ækvivalent kvantificering af HBV-genotyperne A-G. Detektionen af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targets - pecifikke og kvantificeringsstandard-specifikke dobbeltmærkede oligonukleotide prober, der tillader en uafhængig identifikation af HBV-amplikonet og HBV-kvantificeringsstandard-amplikonet. Kvantificeringen af viralt HBV RNA udføres ved hjælp af HBV-kvantificeringsstandarden. HBV-kvantificerings - standarden er et ikke-smitsomt lineariseret plasmid, der indeholder de samme primerbindingssteder som HBV target-dna og en unik probebindingsregion, der gør det muligt at skelne HBV-kvantificeringsstandard- Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument. 04404165001-13DA 1

amplikon fra HBV-targetamplikon. HBV-kvantificeringsstandarden er indarbejdet i hver enkelt prøve og kontrol med et kendt kopiantal og udføres gennem prøveforberedelse, PCR-amplifikation og detektion sammen med HBV-target. COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner HBV DNA-titeren i testprøven ved at sammenligne HBV-signalet med HBV-kvantificeringsstandardsignalet for hver prøve og kontrol. HBVkvantificeringsstandarden kompenserer for virkningen af hæmning, og kontrollerne kompenserer for forberedelsen og amplifikationsprocessen for at give mulighed for nøjagtig kvantificering af HBV DNA et i hver enkelt prøve. Forberedelse af prøver COBAS TaqMan HBV-testen isoleres HBV DNA fra plasma- og serumprøver via en generisk, manuel prøveforberedelse, der er baseret på nukleinsyrebinding til glasfibre. HBV-viruspartiklerne lyseres under inkubation ved en forhøjet temperatur med en protease- og kaotropisk lysis/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne HBV DNA fra DNaser i plasma og serum. Et kendt antal HBVkvantificeringsstandard-DNA-molekyler tilsættes til hver enkelt prøve samtidigt med lysisreagenset. Efter - følgende tilsættes isopropanol til lysis-blandingen, som derefter centrifugeres igennem en kolonne med en glasfiberfilterindsats. Under centrifugeringen bindes HBV DNA et og HBV-kvantificeringsstandard- DNA et til glasfiberfilterets overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved centrifugering. De adsorberede nukleinsyrer vaskes og elueres med en vandig opløsning. Engangsmaterialerne giver mulighed for en parallel behandling af 12 prøver eller et andet antal deleligt med 12. Den behandlede prøve, der indeholder HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard-DNA, tilsættes til amplifikations/detektionsblandingen. Derefter amplificeres og detekteres HBV-target-DNA og HBVkvantificeringsstandard-DNA på COBAS TaqMan 48 Analyzer ved hjælp af de amplifikations- og detektionsreagenser, der følger med testkittet. PCR-amplifikation Valg af target Udvælgelsen af DNA-targetsekvensen til HBV afhænger af identifikationen af de regioner i HBV-genomet, der udviser den højeste sekvenskonservering blandt alle genotyperne. Tilsvarende er udvælgelsen af primerne og proben afgørende for testens evne til at påvise alle de klinisk relevante HBV-genotyper. En region i det delvist enkeltstrengede, cirkulære DNA-genom i HBV har vist sig at have den højeste konservering af DNA-sekvenser blandt genotyperne. COBAS TaqMan HBV-testen bruger PCRamplifikationsprimere, der definerer en sekvens i den bedst konserverede præ-core/core-region af HBVgenomet. Targetamplifikation Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplikationsrørene (K-tubes), hvor PCRamplifikationen foregår. Thermo cycleren i COBAS TaqMan 48 Analyzer opvarmer reaktions blandingen for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og blotlægge de specifikke primertargetsekvenser i det cirkulære HBV DNA-genom og HBV-kvantificeringsstandard-DNA. Når blandingen afkøler, bindes primerne til target- DNA et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridin (i stedet for deoxythymidin), forlænger den termostabile Thermus specie Z05 DNA-polymerase (Z05) de bundne primere langs targetskabelonen og producerer en dobbeltstrenget DNA-sekvens, der kaldes et amplikon. COBAS TaqMan 48 Analyzer gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS TaqMan 48 Analyzer. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HBV-genomet. Hele HBV-genomet amplificeres ikke. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i COBAS TaqMan HBV-testen ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 26, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat som et af dntp erne i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplikon, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. Desuden vil ethvert ikke-specifikt produkt, der dannes efter den første aktivering af Master Mix ved hjælp af manganese, blive ødelagt af AmpEraseenzymet og derved forbedre sensitiviteten og specificiteten. AmpErase-enzymet, der findes i Master Mixreagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges det targetamplikon, der dannes under amplifikationen, ikke. 04404165001-13DA 2

Detektion af PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS TaqMan HBV-testen benytter real time 27,28 -PCR-teknologi. Anvendelsen af dobbeltfluorescerende prober gør det muligt af foretage real-time detektion af PCR-produktopbygningen ved at overvåge emissionsintensiteten i det fluorescerende rapportfarvestoffer, der frigives under amplifikationen. Proberne består af HBV- og HBV-kvantificeringsstandard-specifikke oligonukleotider, der er mærket med et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. I COBAS TaqMan HBV-testen mærkes HBV- og HBVkvantificeringsstandard-proberne med forskellige fluorescerende rapportfarvestoffer. Når de dobbeltfluorescerende, farvemærkede prober er intakte, reduceres rapportfluorescensen af den tætte afstand til quencher-farvestoffet på grund af Förster-energioverførselseffekten. Under PCR-reaktionen hybridiseres proben til en targetsekvens og spaltes af 5' 3'-nukleaseaktiviteten i den termostabile Z05 DNA-polymerase. Når rapport- og quencherfarvestofferne frigives og separeres, stopper quenching-effekten, og rapportfarvestoffets fluorescensaktivitet øges. Amplifikationen af HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard- DNA måles uafhængigt ved forskellige bølgelængder. Denne proces gentages et bestemt antal gange, og hver cyklus øger effektivt emissionsintensiteten i det individuelle rapportfarvestof, hvilket giver mulighed for en uafhængig identifikation af HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard-DNA. Styrken af disse signaler står i forhold til mængden af startmateriale ved begyndelsen af PCR-reaktionen. Grundprincipper for kvantificering i COBAS TaqMan HBV-testen COBAS TaqMan HBV-testen giver nøjagtige kvantitative resultater over et meget bredt dynamisk område, idet monitoreringen af amplikonet foregår under amplifikationens eksponentielle fase. Jo højere HBV-titeren er for en prøve, jo tidligere stiger rapportfarvestoffets fluorescens for HBV-proben til over startniveauet (se Figur 1). Da mængden af HBV-kvantificeringsstandard (QS) DNA er konstant i alle prøver, bør rapportstoffets fluorescens i HBV QS-proben optræde ved samme cyklus for alle prøver (se Figur 2). I tilfælde, hvor amplifikationen og detektionen af QS påvirkes af inhibering eller en dårlig prøvegenfinding, forsinkes fluorescensen, hvilket gør det muligt at foretage en tilsvarende justering af den beregnede HBV-target-DNAtiter. Tilstedeværelsen af det specifikke fluorescerende signal rapporteres som en kritisk grænseværdi (Ct). Ct-værdien defineres som det delcyklusnummer, hvor fluorescensen i rapportfarvestoffet overstiger en foruddefineret grænse (det tildelte fluorescensniveau), og starter på en eksponentiel vækstfase af dette signal (se Figur 3). En højere Ct-værdi angiver en lavere titer af det oprindelige HBV-target-DNA. En fordobling af titerværdien korrelerer med et fald på 1 Ct for target-hbv DNA et, mens en 10-dobling af titerværdien korrelerer med et fald på 3,3 Ct. Figur 1 viser target-vækstkurverne for en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Når virus - koncentrationen øges, skifter vækstkurverne til tidligere cyklusser. Vækstkurven helt til venstre svarer derfor til det højeste virale titerniveau, mens kurven helt til højre svarer til det laveste virale titerniveau. Figur 1 9,00 8,00 7,00 6,00 Normaliseret fluorescens 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Højeste titer Laveste titer -1,00 0 10 20 30 40 50 60 Cyklusnummer 04404165001-13DA 3

Figur 2 viser kvantificeringsstandardens vækstkurver for prøver fra en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Mængden af kvantificeringsstandard, der tilsættes til hver prøve, er konstant for alle reaktioner. Kvantificeringsstandardens Ct-værdi er den samme, uafhængig af den virale titer. Figur 2 35,00 30,00 Laveste titer 25,00 Normaliseret fluorescens 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Højeste titer -5,00 0 10 20 30 40 50 60 Cyklusnummer Figur 3 viser et eksempel på, hvordan fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve. Delcyklusnummeret (Ct) beregnes for det sted, hvor fluorescenssignalet krydser det tildelte fluorescensniveau. Figur 3 1 0,9 Normaliseret fluorescens 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Tildelt fluorescensniveau Ct-værdi = 27,1-0,1 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Cyklusnummer HBV DNA-kvantificering COBAS TaqMan HBV-testen kvantificerer viralt HBV DNA ved hjælp af en ekstra targetsekvens (HBVkvantificeringsstandard), der tilsættes til hver testprøve med en kendt koncentration. HBV-kvantifi - ceringsstandard er en ikke-smitsom lineariseret DNA-konstruktion, der indeholder fragmenter af HBV-sekvenser med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i HBV-targetsekvensen. HBV-kvantifi - ceringsstandarden genererer desuden et amplifikationsprodukt af samme længde og basesammensætning som HBV-target-DNA et. Detektionsprobebindingsregionen for HBV-kvantificerings standarden er ændret, så den skelner mellem HBV-kvantificeringsstandard-amplikon og HBV-targetamplikon. Under PCR-reaktionens annealingfase på COBAS TaqMan 48 Analyzeret belyses prøverne og exciteres af filtreret lys, og der indsamles filtrerede emmisionsfluorescensdata for hver prøve. Aflæsningerne fra hver prøve korrigeres derefter for instrumentudsving. Fluorescensaflæsningerne sendes af instrumentet 04404165001-13DA 4

til AMPLILINK Software og gemmes i en database. Der foretages præ-check for at afgøre, om datasættene for HBV DNA- og HBV-kvantificeringsstandard-DNA er valide, og der genereres markeringer, hvis dataene falder uden for de angivne grænser. Når alle præ-check er udført og godkendt, behandles fluorescensaflæsningerne for at generere Ct-værdier for HBV DNA et og HBV-kvantificeringsstandard- DNA et. De lotspecifikke kalibreringskonstanter, der følger med COBAS TaqMan HBV-testen, bruges til at beregne titerværdien for prøverne og kontrollerne, baseret på Ct-værdierne for HBV DNA- og HBVkvantificeringsstandard-DNA. COBAS TaqMan HBV-testen er baseret på WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/746 29, og titerresultaterne angives i internationale enheder (IU/ml). REAGENSER High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 test (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (lysis-/bindingsbuffer) Tris 50% (w/w) guanidin-hcl < 1% carbamid 19% (w/w) triton X-100 CAR 2 x 2 mg (RNA, frysetørret) PK 2 x 100 mg (proteinase K, frysetørret) 64% (w/w) proteinase K, frysetørret IRB 1 x 33 ml (Inhibitor Removal-buffer) Tris 65% guanidin-hcl (tilsæt 20 ml ethanol) WASH 1 x 20 ml (vaskebuffer) Tris NaCl (tilsæt 80 ml ethanol) ELB 1 x 30 ml (elueringsbuffer) RS 4 af hver (High Pure System Viral Nucleic Acid Rack-sæt) Lysis-rack Filter Tube-rack med monteret Waste-rack Elueringsrack Cover-rack WR 8 af hver (High Pure System Viral Nucleic Acid Waste-rack) 04404165001-13DA 5

COBAS TaqMan HBV Test 48 test (P/N: 03500756 190) Prøveforberedels- og kontrolreagenser HBV HPS HBV QS 2 x 1,0 ml (COBAS TaqMan HBV-kvantificeringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder et insert. DNA-insertet indeholder HBV-primerbindingssekvenser og en unik probebindingsregion. Amaranth-farve < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) 0,05% natriumazid HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [HBV høj (+)-kontrol] < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser. Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [HBV lav (+)-kontrol] < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser. Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel Amplifikations- og detektionsreagenser HBV MMX 2 x 24 test (COBAS TaqMan HBV Master Mix) 2 x 1,4 ml Tricinbuffer Kaliumhydroxid Kaliumacetat Glycerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% upstream- og downstream-primere til præ-core/coreregionen af HBV < 0,001% fluorescensmærkede oligonukleotide prober, der er specifikke for HBV og HBV-kvantificeringsstandarden < 0,001% oligonukleotid Aptamer < 0,05% Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) 0,09% natriumazid CTM Mn 2+ 2 x 24 test (COBAS TaqMan -manganopløsning) 2 x 1,0 ml < 1,2% manganacetat Iseddikesyre 0,09% natriumazid 04404165001-13DA 6

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er beregnet til brug med humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA og humant serum. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend egnede beskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå bakterie- og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. F. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespidser. G. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes sammen. H. Reagenser fra forskellige kit må ikke blandes. I. Reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. J. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. K. Der kan rekvireres sikkerhedsdatablade (SDS) ved henvendelse til dit lokale Roche-kontor. L. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 og CLSIdokument M29-A3 31. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natrium - hypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypokloritopløsning. M. FORSIGTIGT! CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C indeholder humant plasma, der stammer fra humant blod. Udgangsmaterialet er ved hjælp af FDA-godkendte test, fundet ikke-reaktivt for tilstedeværelsen af hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod HIV-1/2 og HCV samt HIV p24-antigen. Test af negativ humant plasma ved hjælp af PCR-metoder påviste ikke forekomst af HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer fra humant blod, kan overføre smitstoffer. Derfor skal alt materiale, der stammer fra mennesker, behandles som potentielt smittefarligt. CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 og CLSI-dokument M29-A3 31. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. N. HBV MMX, HBV QS og CTM Mn 2+ indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. O. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse 04404165001-13DA 7

reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING Prøveforberedelsesreagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid-reagenserne opbevares ved 15-25 C efter modtagelse. B. Elueringsbuffer (ELB) og lysis-/bindingsbuffer (LYS) opbevares ved 15-25 C. Efter åbning opbevares ELB og LYS ved 15-25 C. Efter åbning skal ELB og LYS bruges inden 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. C. Efter tilsætning af elueringsbuffer (ELB) for at rekonstituere carrier-rna og proteinase K skal eventuelt ubrugt rekonstitueret carrier-rna (CAR) og ubrugt rekonstitueret proteinase K (PK) opbevares ved -15 til -25 C. Efter rekonstitution af carrier-rna og proteinase K skal de bruges inden 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. D. Efter tilsætning af ethanol, skal Inhibitor Removal-buffer (IRB) og vaskebuffer (WASH) opbevares ved 15-25 C. Disse arbejdsreagenser kan holde sig i 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. E. Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen [Lysis-/bindingsbuffer med carrier-rna, proteinase K og HBV QS] skal anvendes straks efter forberedelsen. Eventuelt resterende materiale skal kasseres. Amplifikations- og detektionsreagenser A. Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. B. HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning for at fjerne en afmålt mængde til en batch-størrelse på 12 prøver skal det resterende HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C. Efter åbning kan HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Efter åbning skal evt. ubrugt CTM ( ) C kasseres. C. Arbejds-Master Mix (forberedes ved at tilsætte CTM Mn 2+ til HBV MMX) skal opbevares ved 2-8 C på et mørkt sted. De forberedte prøver og kontroller skal tilsættes inden 2 timer efter forberedelsen af arbejds-master Mix. D. De behandlede prøver og kontroller kan holde sig i op til 3 timer ved 20-30 C, op til 24 timer ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C i op til 1 uge. E. Amplifikationen skal startes senest 3 timer efter, de behandlede prøver og kontroller er tilsat til arbejds-master Mix. 04404165001-13DA 8

MEDFØLGENDE MATERIALER Prøveforberedelsesreagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001) LYS (lysis-/bindingsbuffer) CAR (carrier-rna) PK (proteinase K) IRB (Inhibitor Removal-buffer) WASH (vaskebuffer) ELB (elueringsbuffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid Rack-sæt) WR (High Pure System Viral Nucleic Acid Waste-rack) Amplifikations- og detektionsreagenser B. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS (P/N: 03500756 190) HBV QS (HBV-kvantificeringsstandard) HBV H(+)C [HBV høj (+) kontrol] HBV L(+)C [HBV lav (+) kontrol] CTM ( ) C [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] HBV MMX (COBAS TaqMan HBV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan -manganopløsning) NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software COBAS TaqMan 48 Analyzer AMPLILINK Software, version 3.3- eller version 3.4-serien Kontrolenhed til AMPLILINK Software Vejledninger til instrument og software: - Instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48 Analyzer til brug med AMPLILINK Software, version 3.3 og 3.4 series - Applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.3 til brug med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller - Applikationsmanual til AMPLILINK Software, version 3.4-serien Testdefinitionsfil (TDF). Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilen på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Capper til K-tubes (P/N: 03516539001) Capping tool til K-tray (P/N: 03339904001) 04404165001-13DA 9

K-carrier til COBAS TaqMan 48 Analyzer (P/N: 28150397001) K-tray-carrier (P/N: 03341488001) K-carrier-holder (P/N: 03287696001) K-carrier-transportør (P/N: 03517519001) Forbrugsartikler K-tubes, æske med 12 x 96 (P/N: 03137082001) K-trays, æske med 24 stk. (P/N: 03343146001) Krav til centrifuge Sigma 4-15C Benchtop-centrifuge eller tilsvarende microwell-pladecentrifuge, der kan yde 4600 x g centrifugering Swing-out-rotor til Sigma-centrifuge P/N: 11118 (inkluderer 2 beholdere P/N: 13218 og 2 pladeholdere P/N: 17978) eller tilsvarende ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Isopropanol (> 99%), der opfylder ACS-specifikationerne, eller bedre Ethanol (96-100%), der opfylder ACS-specifikationerne eller bedre Justerbare pipetter*: (kapacitet 250 µl og 1000 µl) med aerosolbarriere- eller DNase-frie "positive displacement"-spidser Pipette-værktøj: Drummond (P/N: 4-000-100) eller tilsvarende Vandbad, indstillet til 50 C (± 2 C) Tørvarmeblok, indstillet til 70 C (± 2 C) Sterile, serologiske engangspipetter: 5, 10 og 25 ml Sterile, koniske polypropylenrør, 15 ml og 50 ml: Corning (P/N: 430052 og P/N: 430290) eller tilsvarende Sterile 2,0 ml mikrocentrifugerør: Sarstedt (P/N: 72.693.005) eller tilsvarende Vortex-mixer Racks til rør Engangshandsker, uden talkum Kalibrerede termometre til vandbad og tørvarmeblok * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller DNase-frie "positive displacement"-spidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Håndter alle prøver og kontroller som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver COBAS TaqMan HBV-testen er kun beregnet til serum- eller plasmaprøver. Blod skal indsamles i BD SST-rør (Serum Separation Tubes) eller i rør med EDTA (lavendelblå top) som antikoagulerende middel. Fuldblod opbevares ved 2-25 C i højst 1 dag. Brugen af EDTA-plasma eller serum vil give omtrent de samme testresultater. Figur 4 viser effekten af matrixtypen på HBV DNA-resultater fra patientprøver. 04404165001-13DA 10

Figur 4 Sammenligning af EDTA-plasma- og serumprøvetyper 12,00 10,00 Plasmaprøver Gennemsnitligt resultat (Log HBV DNA IU/ml, n=2) 10 8,00 6,00 4,00 2,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Serumprøver Gennemsnitligt resultat (Log 10 HBV DNA IU/ml, n = 2) Serum eller plasma separeres fra fuldblod inden 1 dag efter prøvetagning ved centrifugering ved 800-1600 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet eller serummet overføres til et sterilt polypropylen-rør. Figur 5 viser data fra disse prøvetagningsundersøgelser. Figur 5 Holdbarhed af HBV i fuldblod med EDTA som antikoagulerende middel eller i SST-rør før separation i plasma eller serum Gennemsnitligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 Prøve-id < 1 time 25-30 C 6 timer 25-30 C 24 timer 25-30 C 48 timer 25-30 C 72 timer 25-30 C < 1 time 2-8 C 6 timer 2-8 C 24 timer 2-8 C 48 timer 2-8 C 72 timer 2-8 C B. Transport af prøver Transport af fuldblod, serum eller plasma skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 32. Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og behandles inden for 1 dag efter prøvetagningen. Serum eller plasma kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. C. Opbevaring af prøver Serum- eller plasmaprøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 3 dage, ved 2-8 C i op til 7 dage eller nedfrosset ved -20 C til -80 C i mindst 6 uger. Det anbefales, at prøverne opbevares i afmålte mængder a 800-900 µl i sterile, 2,0 ml polypropylenrør med skruelåg (f.eks. Sarstedt P/N: 72.694.006). Figur 6 viser data fra disse prøveopbevaringsundersøgelser. 04404165001-13DA 11

Figur 6 Holdbarhed af HBV i EDTA-plasma eller serum Gennemsnitligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 Tid 0 1 dag RT 3 dage RT 5 dage RT 7 dage RT 1 dag 2-8 C 3 dage 2-8 C 5 dage 2-8 C 7 dage 2-8 C 6 uger -80 C Serum- og plasmaprøver kan nedfryses og optøs op til fem gange uden tab af HBV DNA. Figur 7 viser dataene fra disse nedfrysnings- og optøningsundersøgelser. Figur 7 HBV-resultater efter op til fem nedfrysninger/optøninger 4,5 Prøve-id Gennemsnitligt resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 Kontrol 1 N-O 2 N-O 3 N-O 4 N-O 5 N-O 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Serum-1 Serum-2 Prøve-id BRUGSANVISNING Bemærk! For at få en detaljeret brugsanvisning, vejledning i udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer, kommentarer og fejlmeddelelser henvises til: (1) instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48 Analyzer til brug med AMPLILINK Software, version 3.3- og 3.4-serien; (2) applikationsmanualen til AMPLILINK Software, version 3.3-serien til brug med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller (3) applikationsmanualen til AMPLILINK Software, version 3.4-serien. Bemærk! Alle amplifikations- og detektionsreagenser skal have opnået den omgivende temperatur før brug. Hvis de opbevares ved 2-8 C, skal de tages ud mindst 30 minutter før brug. Bemærk! Serum- og plasmaprøver skal tempereres til den omgivende temperatur 15-30 minutter før brug. Bemærk! Brug pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement"-spidser, når dette er angivet. Vær yderst omhyggelig for at undgå kontaminering. 04404165001-13DA 12

Kørselsstørrelse: Hvert kit indeholder reagenser til fire kørsler af 12 tests, der kan udføres separat eller samtidig. Hver testkørsel skal inkludere mindst én replikat af hver af kontrollerne CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C med op til 24 prøver og kontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Amplifikations- og detektionsreagenserne er pakket i flasker til 24 test. Den mest effektive anvendelse af reagenser, prøver og kontroller opnås ved at behandle dem i batches, der kan multipliceres med 12. Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Hvis der benyttes frosne serum- eller plasmaprøver, skal prøverne placeres ved stuetemperatur, indtil de er fuldstændig optøede, og blandes på vortex-mixer i 5-10 sekunder før brug. Bemærk! Fortsæt først, når reagenserne har opnået den omgivende temperatur. Forvarm varmeblokken/varmeblokkene til 70 C (± 2 C) og vandbadet til 50 C (± 2 C), før oprensningsreaktionerne startes. A. Reagensforberedelse Bemærk! Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen forberedes først, når alle prøver og kontroller er tempereret ved den omgivende lufttemperatur i 15-30 minutter. 1. Inhibitor Removal-bufferen forberedes ved at pipettere 20 ml 96-100% ethanol til Inhibitor Removalbuffer (IRB). Bland ved at vende røret 5-10 gange. Der er nok rekonstitueret Inhibitor Removalbuffer til 48 test. 2. Vaskebufferen forberedes ved at pipettere 80 ml 96-100% ethanol til vaskebufferen (WASH). Bland ved at vende røret 5-10 gange. Der er nok rekonstitueret vaskebuffer til 48 test. 3. Forvarm elueringsbufferen (ELB) til 70 C (± 2 C) i et 2,0 ml mikrocentrifugerør med skruelåg. Der kan bruges flere rør. Elueringsvolumen pr. prøve er 75 µl. Forvarm den mængde, der er angivet i tabellen nedenfor, i overensstemmelse med antallet af test. Antal replikater Reagenser 12 24 Elueringsbuffer (ml) 2,0 4,0 4. Tilsæt med en pipette den mængde isopropanol, der er angivet i tabellen nedenfor, i overensstemmelse med antallet af test i et rent, sterilt rør. Antal replikater Reagenser 12 24 Isopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipettér 0,5 ml elueringsbuffer (ELB) til carrier-rna et (CAR). Sæt proppen i, vend røret om, og bland på vortex-mixer, indtil alt carrier-rna et er opløst. Det rekonstituerede carrier-rna er nok til 24 test. Ubrugt rekonstitueret carrier-rna kan opbevares ved -15 til -25 C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. 6. Pipettér 5,0 ml elueringsbuffer (ELB) til proteinase K (PK). Sæt proppen i, vend røret om, og bland på vortex-mixer, indtil alt proteinase K er opløst. Den rekonstituerede proteinase K er nok til 24 test. Ubrugt rekonstitueret proteinase K kan opbevares ved -15 til -25 C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. 7. Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen forberedes på følgende måde ved at pipettere de mængder, der er angivet i nedenstående tabel, i overensstemmelse med det antal prøver og kontroller, der skal behandles: Antal replikater Reagenser 12 24 Lysis-/bindingsbuffer (ml) 7,0 14,0 Carrier-RNA (µl) 140 280 HBV QS (µl) 39 78 Proteinase K (ml) 1,4 2,8 Bemærk! Mængden af HBV QS er specifik for COBAS TaqMan HBV-testen. 04404165001-13DA 13

Bemærk! Hvis der anvendes rekonstitueret carrier-rna eller proteinase K, skal det optøs til stuetemperatur og vendes flere gange før brug. Tilsæt den angivne mængde lysis-/bindingsbuffer til et rent, sterilt 50 ml rør. Tilsæt den angivne mængde rekonstitueret carrier-rna til røret med lysis-/bindingsbufferen. Bland HBV QS på vortex-mixer i 3-5 sekunder, og tilsæt den angivne mængde HBV QS til røret med lysis-/bindingsbufferen og det rekonstituerede carrier-rna. Sæt låg på røret, og bland ved at vende røret 10-15 gange. Bland IKKE på vortex-mixer. Blanding på vortex-mixer vil danne bobler i opløsningen. Tilsæt den angivne mængde rekonstitueret proteinase K til røret med lysis-/bindingsbufferen. Sæt låg på røret, og bland ved at vende røret 10-15 gange. Bland IKKE på vortex-mixer. Blanding på vortex-mixer vil danne bobler i opløsningen. Start med at afpipettere lysis-/ bindingsarbejdsopløsningen straks straks efter tilsætningen og blandingen af proteinase K og lysis-/ bindingsbufferen. Ubrugt lysis-/bindingsbuffer (LYS) kan opbevares ved 15-25 C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Ubrugt lysis-/bindingsarbejdsopløsning skal kasseres. B. Prøve- og kontrolklargøring Bemærk! Det anbefales at bruge justerbare pipetter med aerosolbarrierespidser til denne procedure. Bemærk! Der kan benyttes en doseringspipette med sterile kombinationsspidser af passende størrelse til trin 1, 14, 16, 19 og 22. Der skal dog udvises ekstra forsigtighed for at undgå reagensspild og krydskontaminering. Bemærk! Undgå spild af lysis-/bindingsarbejdsopløsning, prøve, kontrol og isopropanol på forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene under hele proceduren. Bemærk! Brug handsker, der sidder stramt og passer til brugerens hænder. Skift handsker ofte, men især efter håndtering af positive kontroller og åbning af fulde lysisrackrør. Lågenes inderside må på intet tidspunkt berøres (f.eks. under åbning og lukning). Bemærk! Ved håndtering af kitkontroller og kliniske prøver, indsættes den negative kontrol, før der fortsættes til den positive kitkontrol. 1. Pipettér 625 µl lysis-/bindingsarbejdsopløsning til hver brønd i lysisracket (I, transparent). Undgå at dryppe i forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene. Skub forsigtigt lågene ned til lukket position. Aktiver ikke lukkemekanismen. 2. Pipettér forsigtigt 500 µl prøve eller kontrol i den relevante brønd ved at åbne én brønd ad gangen. Undgå at dryppe i forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene. Skub, efter hver prøve eller kontrol er tilsat, låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt henover midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 3. Efter tilsætningen af alle prøver og kontroller blandes det fyldte lysisrack på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Undgå voldsom blanding på vortex-mixeren. Bekræft visuelt, at alle brønde er blandet grundigt på vortexmixeren. 4. Placér forsigtigt lysisrackene i et forvarmet vandbad ved 50 C (± 2 C), og undgå stænk. Inkuber lysisracket i 10 minutter. Under inkubationen skal lysisracket være nedsænket i vandet uden at flyde. Sørg for, at lysisrackets øvre overfladeareal mellem brøndene forbliver tørt under inkubationen. Tør forsigtigt lysisrackets top og bund af, når det er taget op af vandbadet. 5. Lysisracket centrifugeres i 10-20 sekunder ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Centrifugen når muligvis ikke op på den indstillede hastighed. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 6. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og pipettér 250 µl isopropanol i hver brønd. Skub efter tilsætning låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. Bemærk! Mængden af isopropanol er specifik for hver COBAS TaqMan Test. 7. Bekræft visuelt, at alle racks er forsvarligt lukket. Bland prøverne ved at vende racket tre gange, og bland derefter racket på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Undgå voldsom blanding på vortexmixeren. Bekræft visuelt, at alle brønde er blandet grundigt på vortex-mixeren. 8. Lysisracket centrifugeres i 10-20 sekunder ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Centrifugen når muligvis ikke op på den indstillede hastighed. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 04404165001-13DA 14

9. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og overfør 750 µl af prøve- eller kontrolblandingen til de tilsvarende brønde på Filter Tube-racket (II, gult) med det monterede Waste-rack (hvidt). Skub, efter hver prøve- eller kontrolblanding er tilsat, låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 10. Når alle prøver eller kontroller er tilsat, centrifugeres Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 11. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og overfør den resterende prøve- eller kontrolblanding til de tilsvarende brønde på Filter Tube-racket. Luk, efter hver prøve- eller kontrolblanding er tilsat, brøndens låg fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen. Kasser lysisracket korrekt. 12. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 13. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Waste-racket. Indsæt et nyt Waste-rack, og sæt Filter Tube-racket på plads. 14. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 400 µl Inhibitor Removal-buffer (IRB) ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af Inhibitor Removal-buffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 15. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 16. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 700 µl vaskebuffer (WASH) ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af vaskebuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 17. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 18. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Waste-racket. Indsæt et nyt Waste-rack, og sæt Filter Tube-racket på plads. 19. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 700 µl vaskebuffer ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af vaskebuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 20. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 3 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 21. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Placer Filter Tube-racket på elueringsracket (IIIA, blåt), og sæt Filter Tube-racket fast på elueringsracket. Kasser Waste-racket korrekt. 22. Åbn alle låg på Filter Tube-racket, og pipettér 75 µl af den forvarmede elueringsbuffer (ELB) i midten af hvert filter uden at berøre filteret. Bemærk! Elueringsbufferen må ikke tilsættes ved at afpipettere ned langs brøndens sider. Skub efter tilsætning af elueringsbuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 23. Inkuber elueringsracket ved stuetemperatur i mindst 3 minutter efter tilsætning af elueringsbuffer til den sidste brønd, skub låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 24. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 3 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 25. Fjern Filter Tube-racket fra elueringsracket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Filter Tube-racket korrekt. 04404165001-13DA 15

26. Placer Cover-racket (IIIB, blåt) på elueringsracket (IIIA, blåt) Tryk det ned på elueringsracket, så det klikker på plads. Skub låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så alle lågene lukkes til. 27. De behandlede prøver og kontroller bruges direkte til PCR. Brug 50 µl af de behandlede prøver og kontroller til amplifikation. Tilsæt de behandlede prøver og kontroller til arbejds-master Mix inden 3 timer efter, at prøve- og kontrolforberedelsen er fuldført. Hvis de behandlede prøver og kontroller ikke kan anvendes inden 3 timer efter forberedelsen, kan de opbevares ved 2-8 C i op til 24 timer i det tildækkede elueringsrack eller nedfrosset ved -20 C i op til 1 uge i sterile 2,0 ml polypropylen - rør med skruelåg (f.eks. Sarstedt P/N: 72.694.006). Amplificer de behandlede prøver og kontroller inden 3 timer efter, at prøverne og kontrollerne er tilsat arbejds-master Mix. Amplifikation og detektion Bemærk! K-carriers/K-tray-carrier og K-carrier-/K-tray-carrier-holdere skal tørres med en fnugfri klud, der er fugtet med en 70% isopropanolopløsning. C. Reagensforberedelse Bemærk! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), arbejds-master Mix (arbejds-mmx) og arbejds-master Mix plus behandlede prøver og kontroller er lysfølsomme. Disse reagenser skal beskyttes mod lys. Bemærk! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX) og COBAS TaqMan -mangan- opløsning (CTM Mn 2+ ) skal tempereres ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter før forberedelsen af arbejds-master Mix. Bemærk! Arbejds-MMX skal forberedes, når prøve- og kontrolforberedelsen er fuldført. Bemærk! Arbejds-MMX skal bruges inden 2 timer efter forberedelsen. Bemærk! Når de behandlede prøver og kontroller er tilsat arbejds-master Mix, skal ampli - fikationen påbegyndes inden 3 timer. 1. Temperer én flaske med HBV MMX og én flaske med CTM Mn 2+ ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter. 2. Placer en K-carrier/K-tray-carrier i en K-carrier-/K-tray-carrier-holder. 3. Anbring nye K-tubes eller en ny K-tray i K-carrieren/K-tray-carrieren uden at berøre siderne på K-tubes. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. Det er ikke nødvendigt at afbalancere thermo cycleren, når der bruges en K-tray. 4. Fjern lågene på K-tubes ved hjælp af capperen til K-tubes, hvis det er relevant. Placer lågene i parkeringspositionsholderen til K-tubes. 5. Forbered arbejds-mmx på følgende måde: Til 24 test tilsættes 191 µl CTM Mn 2+ til én flaske med HBV MMX. Sæt låg på flasken, og bland ved at vende flasken 10 gange. Bland ikke arbejds-mmx på vortex-mixer. Beskyt arbejds-mmx mod lys, og brug det inden 2 timer. Til 12 test fjernes 660 µl HBV MMX, som placeres i et 2 ml rør. Tilsæt 90 µl CTM Mn 2+ til 2 ml røret med HBV MMX, sæt låg på røret, og bland grundigt ved at vende det 10 gange. Beskyt arbejds-mmx mod lys, og brug det inden 2 timer. Resten af det ubrugte HBV MMX og CTM Mn 2+ opbevares i de oprindelige flasker ved 2-8 C. Efter åbning kan HBV MMX og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C i 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Bemærk! Mængden af CTM Mn 2+ er specifik for COBAS TaqMan HBV Test. 6. Tilsæt 50 µl arbejds-mmx til hver K-tube eller K-tray-brønd. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller blev opbevaret nedfrosset før amplifikationen, skal de optøs ved stuetemperatur, før der fortsættes til trin 7. 7. Tilsæt 50 µl af hver af de behandlede prøver og kontroller til den relevante K-tube eller de relevante K-tray-brønde med arbejds-mmx ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement-spids. Bland forsigtigt hver prøve eller kontrol ved at afsuge og afpipettere tre gange uden at danne bobler. 8. Gentag trin 7 for hver behandlet prøve eller behandlet kontrol, indtil de alle er blevet overført til K-tubes eller K-tray-brønde. Brug en ny spids til hver prøve og kontrol. Inspicer manuelt for at kontrollere, om der er bobler, og fjern dem om nødvendigt. Sæt låg på K-tubes eller K-tray ved hjælp af et Capper til K-tubes/Capping tool til K-tray. Kontroller manuelt, at der er tilsat de korrekte mængder. 9. Amplifikationen skal startes senest 3 timer, efter de behandlede prøver og kontroller er tilsat K-tubes/K-tray med arbejds-mmx. 04404165001-13DA 16

D. Indsættelse af reagenser i og betjening af COBAS TaqMan 48 Analyzer 1. Tænd for computerarbejdsstationen, og log på Microsoft Windows-operativsystemet ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 2. Tænd for COBAS TaqMan 48 Analyzer. Kontroller, at instrumentet initialiseres og er klar til brug. Hvis der fra tidligere kørsler stadig er placeret K-carriers eller K-tray-carriers i en af thermo cyclerne, skal de fjernes ved hjælp af K-carrier-transportøren. 3. Åbn AMPLILINK Software på computeren. Log på ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 4. Klik på ikonet Orders for at oprette K-carrier- eller K-tray-carrier-ordrer for de prøver, der skal analyseres. Vælg fanen Sample, klik derefter på knappen New, og indtast ordrenummeret for en prøve ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Vælg testdefinitions - filen for COBAS TaqMan HBV-testen. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Gentag processen for hver prøve. Klik på knappen Save. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. 5. Indtast kvalitetskontroloplysninger ved at vælge fanen Quality Control i vinduet Orders. Klik på knappen New, og indtast oplysningerne fra COBAS TaqMan HBV Test Controls Value-kortet, der følger med kittet, ved hjælp af tastaturet, eller indlæs dem ved hjælp af barkodescanneren. Indtast lotnummer, udløbsdato, intervaller for Low (+)- og High (+)-kontroller samt lotspecifikke kalibreringskoefficienter for COBAS TaqMan HBV Test i de angivne felter. Klik på OK. 6. Tildel et K-carrier-/K-tray-nummer til kørslen ved at klikke på fanen K-Carrier i vinduet Orders. Klik på New i vinduet K-Carrier. Indtast K-carrier-/K-tray-nummeret fra barkoden på K-carrieren/ K-trayet i cellen til højre for K-Carrier ID ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Marker afkrydsningsfeltet K-Tray under feltet K-Carrier ID, hvis der bruges en K-tray. Vælg testdefinitionsfilen til COBAS TaqMan HBV-testen på testpanelet i nederste del af vinduet. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Bemærk! Resultaterne fra en tidligere kørsel med det samme K-carrier-id skal godkendes. 7. Marker den første række i kolonnen Type (T) i arbejdslisten (Worklist). Fremhæv dette felt for at få adgang til rullemenuen, og vælg derefter den ønskede kontroltype. Dobbeltklik derefter på prøveid-feltet for den samme række. Vinduet LookUp Control åbnes med de tilgængelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilsvarende kalibrerings- og kontrolværdier i oplysningsruden nederst til højre. Gentag processen for de ønskede kontroller. 8. Dobbeltklik på den første position (række) for at indtaste prøverne i arbejdslisten Worklist. Vinduet Lookup Sample med de tildelte prøveordrer åbnes. Brug tasterne Skift + pil, hvis mere end ét ordrenummer ønskes markeret. Kontrollér, at alle ordrer er tildelt testdefinitionsfilen for COBAS TaqMan HBV-testen. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. 9. Klik på Save for at gemme K-carrier-/K-tray-carrier-ordretildelingen. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. Det er ikke nødvendigt at afbalancere thermo cycleren, når der bruges en K-tray. E. Amplifikation og detektion 1. Vælg ikonet Systems under fanen System. Klik på Open for at åbne thermo cycleren. Når låget til thermo cycleren er helt åbent, og meddelelsen Ready to Load vises i vinduet Systems, skal låget til thermo cycleren løftes op og holdes åbent. Overfør K-carrieren/K-tray-carrieren med de(t) tillukkede K-tubes/K-tray med arbejds-master Mix samt prøver og kontroller til thermo cycleren ved hjælp af K-carrier-/K-tray-carrier-transportøren. Luk låget til thermo cycleren. 2. Klik på Start i vinduet Systems under ikonet TC for at lukke låget på thermo cycleren og starte kørslen. 3. COBAS TaqMan 48 Analyzer udfører automatisk amplifikation og detektion. 04404165001-13DA 17