EULISA Cardiolipin IgG

Brugsanvisning EULISA Cardiolipin IgG Anvendelse Enzym-immunoassay til bestemmelse af IgG- autoantistoffer rettet mod Cardiolipin Micro titration 96 wells Store kit at +2-8 C For in vitro diagnostic use only Document No. E-23-0209-01 DK January, 2013 EULISA Cardiolipin IgG DANSK 212796 96

Indhold 1. Introduktion og baggrund 2. Advarsler og forholdsregler 3. Testens principper 4. Kittets indhold 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger 6. Opbevaring af kittet 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 9. Evaluering og kvalitetskontrol 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger 11. Produkt karakteristik 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenitet af bindingskapacitet 11.5. Linearitet 11.6. Præcision 11.7. Frekvensfordeling af dsdna-ab (IgG) 11.8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 12. Garanti 13. Symboler 14. Henvisninger 15. Resumé-flowdiagram Produktet, der er beskrevet heri, er blevet fremstillet i overensstemmelse med Direktiv om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik 98/79/EF. 2

1. Introduktion og baggrund Anti-phospholipid syndrom (APS) er en autoimmun sygdom, som kan omfatte kliniske tilstande såsom venøs og arteriel trombose, trombocytopeni, myokardieinfarkt, rekurrerende spontan abort og neurologiske komplikationer (1, 2, 3). Cardiolipin (CL) er det mest almindelige, negativt ladede, sure phospholipid. Autoantistoffer korreleret med APS er ikke kun rettet mod CL og lignende phospholipider, men også mod phospholipid/protein-komplekser. ß2- glycoprotein 1 (ß2-GP-1; = apolipoprotein H) er blevet identificeret som et sådant naturligt og essentielt co-antigen for CL-autoantistoffer (4, 5). Forekomsten af CL/ß2-GP-1 autoantistoffer er associeret med en tendens til tromboser (3). Udover denne diagnostiske signifikans anses disse antistoffer for at være direkte involveret i patogenesen af APS (6, 7). Den nuværende enzym-koblede immunosorbent analyse (ELISA) er beregnet til kvantitativ eller kvalitativ bestemmelse af IgG-antistoffer i human serum rettet mod CL/ß2-GP-1. Det immobiliserede antigen er en højrenset præparation af CL. Testen er hurtig (inkubationstid 30 / 30 / 30 minutter) og fleksibel (delelig fast fase, reagenser, der er parat til brug). Seks kalibratorer standardiserer de kvantitative målinger; en negativ og en positiv kontrol sikrer analysens gyldighed. 2. Advarsler og forholdsregler Testkittet er kun beregnet til in vitro diagnostisk brug og ikke til indvortes eller udvortes brug til mennesker eller dyr. Reagenserne må ikke anvendes efter deres udløbsdato. Det anbefales stærkt, at denne protokol følges. Prøvebuffer, kalibratorer og kontroller indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Vaskebufferen indeholder bromonitrodioxan og konjugatet methylisothiazolon / bromonitrodioxan som konserveringsmiddel. Substratet indeholder 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid (H2O2). Stop-opløsningen, 0,5 M svovlsyre (H2SO4), er sur og ætsende. De ovennævnte reagenser kan være toksiske, hvis de indtages. Følg rutinemæssige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. Undgå al kontakt med kroppen, brug handsker og øjenbeskyttelse. Hvis en reagens kommer i kontakt med hud eller slimhinder, skal der skylles grundigt med vand. 3

Der må aldrig pipetteres med munden. Skal bortskaffes på en måde, der er i overensstemmelse med nationale/lokale forordninger. Natriumazid kan reagere med bly- og kobbervandrør og danne eksplosive metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre ophobning af azid. Kalibratorerne og kontrollerne indeholder materialer af human oprindelse. They have produced negative results when tested for Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, hepatitis B overflade (HBs)-antigen, HIV 1/2-Ab og hepatitis C Virus (HCV)-Ab, i FDA godkendte eller Europæisk direktiv 98/79/EFoverensstemmende tests. Ingen kendte tests kan imidlertid garantere, at produkter, der er afledt fra humant blod, ikke vil være infektiøse. De skal derfor håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agenser og bortskaffes på behørig måde. Der henvises til CDC (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andre lokale/nationale retningslinjer for laboratoriesikkerhed og dekontamineringsprocedurer. 3. Testens principper Den faste fases brønde er belagt med dsdna. På denne overflade vil de følgende immunologiske reaktioner finde sted: 1. reaktion: CL/ß2-GP-1-specifikke antistoffer i prøven vil binde sig til det immobiliserede antigen og danne antigen-antistof komplekset. Herefter vaskes de ikke-bundne prøvekomponenter væk fra den faste fase. 2. reaktion: Et andet antistof, der er rettet mod humane IgG-antistoffer og konjugeret med horseradish- (peberrod) peroxidase (HRP), tilsættes. Dette konjugat binder sig til komplekset. Herefter vaskes overskydende konjugat væk fra den faste fase. 3. reaktion: Det enzymmærkede kompleks omdanner et farveløst substrat til et blåt produkt. Graden af farveudvikling afspejler koncentrationen af CL/ß2- GP-1-antistoffer (IgG) i prøven. 4. Kittets indhold a. 1 mikrobrøndsplade belagt med CL/ß2-GP-1 og hermetisk indpakket i en folielaminatpose sammen med en pose med tørremiddel. Pladen består af 12 strimler, der hver kan afrives til 8 individuelle brønde. 4

b. Prøvebuffer, 100 ml, parat til brug, orange farve. Indeholder tris-bufferet saltvand (TBS), bovin serumalbumin (BSA), Tween og natriumazid. c. Vaskebuffer, 100 ml, 10x-koncentrat, blå farve. Indeholder TBS, Tween og bromonitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml hver, 0-3,0-8,0-18 - 45 og 100 GPL-U CL/ß2-GP-1 - antistoffer (IgG) / ml, parat til brug, gradvist blåfarvet. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. e. Negativ og positiv kontrol, 2,0 ml hver, parat til brug, henholdsvis grøn og rød. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. f. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, parat til brug, rød farve. Bufferet opløsning, der indeholder stabiliserende protein, methylisothiazolon og bromonitrodioxan. g. Substratopløsning, 14 ml, parat til brug, farveløs. Indeholder en bufferet opløsning af TMB og H2O2. Indeholdt i et hætteglas, som lys ikke kan trænge igennem. h. Stop-opløsning (0,5 M H2SO4), 14 ml, farveløs, parat til brug. Forsigtig: svovlsyre er ætsende. 5

i Brugsanvisning j. Batch-specifikt analysecertifikat 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger a. Demineraliseret eller destilleret vand b. Måleglas, 1000 ml c. Rør til prøvefortynding (overførselsrør i mikrobrøndspladeformat anbefales) d. Pipetter til 10, 100 og 1000 µl (1- og 8-kanals pipetter anbefales) e. Mikrobrøndsplade-vaskeapparat (valgfri) f. Mikrobrøndsplade-fotometer udstyret med et 450 nm filter g. ELISA evalueringsprogram (anbefalet) 6. Opbevaring af kittet Kittet skal opbevares ved 2-8 C. Det er stabilt op til den udløbsdato, der er anført på boksens mærkat. Kittet må ikke anvendes efter dets udløbsdato. 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav Man må ikke ombytte eller sammensætte tilsvarende komponenter fra forskellige kits på grund af mulige forskelle på forsendelses- eller opbevaringsbetingelser. a. Før posen med den faste fase åbnes, skal den først nå op på stuetemperatur. Tag alle mikrobrøndene ud af rammen og put dem øjeblikkeligt tilbage i posen, sammen med posen med tørremiddel. Genforsegl posen hermetisk og opbevar den i køleskab til fremtidig brug. 6

b. Fortynd vaskebuffer 10x-koncentratet (100 ml, blå) med 900 ml demineraliseret vand. Bland grundigt. Den fortyndede buffer er stabil i adskillige uger, hvis den opbevares i køleskab (2-8 C). c. Klargøring af prøver: Patientprøver skal håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agens. Klargør sera i henhold til normale laboratorieteknikker og fortynd dem 1/100, fx 10 µl serum + 990 µl prøvebuffer. Bland grundigt. For at opnå hurtig dispensering under analyseproceduren anbefales det, at kalibratorer, kontroller og prøver i mikrobrønd-overførselsrør klargøres. Dette gør det muligt, at anvende en 8-kanals pipette under analyseproceduren. Hvis prøver ikke analyseres med det samme, skal de opbevares ved 2-8 C og analyseres indenfor 3 dage. For længere opbevaring anbefales -20 C eller derunder. Gentagen nedfrysning og optøning af sera skal undgås. Optøede prøver skal blandes inden de fortyndes. Prøvekrav: Stærkt lipæmiske, hæmolyserede eller mikrobielt kontaminerede sera kan forårsage fejlagtige resultater og skal undgås 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse Før analysen startes skal alle kittets komponenter være nået op stuetemperatur (23 ± 3 C). For at opnå de bedste resultater, dvs. det maksimale forhold mellem specifikt og baggrundssignal, er omhyggelig vask afgørende (trin a, c og e). Det er yderst vigtigt, at vaskeopløsningen fjernes fuldstændigt. Det gøres ved at tappe pladen resolut på adskillige lag absorberende servietter. Automatiserede vaskeapparater skal verificeres i henhold til resultater, der opnås med manuel vask. a. Umiddelbart før brug skal den faste fase vaskes én gang: fyld brøndene med 350 µl vaskebuffer hver, lad brøndene gennembløde i 10 sekunder og fjern vaskebufferen. b. Dispensér kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå), kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver hurtigt i mikrobrøndene; 100 µl pr. brønd. Dobbeltbestemmelser anbefales. Inkubér pladen i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). 7

c. Vask brøndene 4 gange som i trin a. d. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) konjugatet (14 ml, parat til brug, rød); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. e. Gentag vasketrin c. f. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) substratopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs, sort hætteglas); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. Da substratet er lysfølsomt skal intens lyseksponering (fx direkte sollys) undgås under inkubation. g. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) stopopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs. Forsigtig: ætsende!); 100 µl pr. brønd. Brug den samme sekvens som for substratet. Farven skifter fra blå til gul. Ryst pladen, helst på en orbitalryster, i ca. 10 sekunder. h. Aflæs øjeblikkeligt absorbansen i mikrobrøndsplade-fotometeret ved 450 nm. Opbevar de resterende reagenser i køleskab (2-8 C), hvis de skal bruges igen. 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Dette produkt er blevet valideret til brug med Dynex DS2 automatiseret ELISA system. En behørig programfil til analyseudførelse og -evaluering kan fås ved anmodning. Dette programs parametre er kun et forslag, og det kan være nødvendigt, at operatøren tilpasser dem til den faktiske analyses krav. Vi har generelt forsøgt, at holde os så tæt som muligt på protokollen for den manuelle udførelse, som beskrevet ovenfor. På grund af den nødvendigvis forhøjede temperatur inden i DS2 har det været nødvendigt at forkorte substratinkubationsperioden. Punkt 11.8. viser en sammenligning af analyseresultater opnået ved manuel udførelse og ved brug af DS2 ELISA systemet. 9. Evaluering og kvalitetskontrol Kvantitativ evaluering: De fremkomne data evalueres kvantitativt med standardkurven, som vist nedenfor. Den viste kurve tjener imidlertid kun som illustration. Den kan ikke erstatte målingen af kalibratorerne sammen med kontrollerne og de faktiske prøver. Kurven er blevet konstrueret med et 8

konventionelt ELISA evalueringsprogram, der anvender en 4- parameterfunktion. Spline-approksimationen er ligeledes passende. 3000 2500 Dynex DS2 --x----x-- manual op. --o----o-- 2000 mod 450nm 1500 1000 500 0 1 10 100 GPL-U / ml 0411FE00.FED/StdKurveV1010J Hvis computer-understøttet evaluering ikke er mulig, kan standardkurven tegnes i hånden. Det muliggør transformation af en prøves absorbansværdi til dens koncentration, dvs. til GPL-U CL/ß2-GP-1 antibodies (IgG) pr. ml serum. Kvalitativ evaluering: Testen kan også evalueres på en kvalitativ måde. Dette kræver kun måling af den positive kontrol. Det anbefales ikke desto mindre at måle og undersøge den negative kontrol (se nedenfor: kvalitetskontrol). I kvalitativ testevaluering sammenlignes prøvernes absorbans med grænseabsorbansen (= cut-off). Den bestemmes ved brug af den følgende formular: absorbans gränse = absorbans positiv kontrol x faktor Faktoren varierer for forskellige kit batches og er anført på det batch-specifikke analysecertifikat, der er inkluderet med hvert enkelt test-kit. Eksempel: 9

absorbans positiv kontrol = 1250 mod faktor = 0,35 absorbans grænse = 1250 mod x 0,35 = 438 mod For at få indtryk af, hvor positiv en bestemt prøve er for CL/ß2-GP-1-Ab (IgG), kan man beregne forholdet ved hjælp af formlen: forhold = absorbans prøve / absorbans grænse Eksempel: Absorbans grænse = 438 mod absorbans prøve = 1480 mod forhold = 1480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontrol: Den positive og negative kontrol kontrollerer analysens gyldighed. Deres autoriserede værdier og acceptable områder er anført på det batch-specifikke analysecertifikat. Kontrollernes værdier skal falde indenfor de angivne områder, hvis de ikke gør, er analysens resultater ugyldige. 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger Baseret på målinger af en gruppe af sera fra bloddonorer og en gruppe af positive sera (se nedenfor), foreslår vi for vurderingen af patient-sera: quantitative evaluation qualitative evaluation GPL-U CL/ß2-GP-1 Ab ratio (IgG) per ml serum normal (negative) range < 10,0 < 0,86 cut-off 12,0 1,00 equivocal range 10,0-14,4 0,86-1,16 positive range > 14,4 > 1,16 Disse specifikationer gives kun som en indikation; for at kontrollere enhver analyses nøjagtighed bør der altid inkluderes parallelprøver af normal sera. Et negativt testresultat indikerer, at patienten ikke har et forhøjet niveau af IgGantistoffer mod CL/ß2-GP-1. Hvis kliniske tegn på APS, ikke desto mindre observeres, kan yderligere anti-nukleære antistoffer måske blive bestemt. IGM/IgA antikroppar mot CL och andra antikroppar riktade mot ß2-GP-1 bör bestemes. 10

Ett positivt testresult hvisar en indikation modt APS. Prøver, der udviser resultater mellem de ovenfor anførte grænser, skal betragtes som dobbelttydige og rapporteres som sådan. Det anbefales, at endnu en prøve indsamles to uger senere og køres parallelt med den første prøve for at dokumentere en mulig ændring i antistof-titer. Som med alle serologiske tests skal resultaterne fortolkes i lyset af patientens symptomer og andre diagnostiske kriterier. 11. Performance characteristics 11.1. Standardisation Testen er standardiseret med en renset serum-præparation, der indeholder IgG-antistoffer, der specifikt er rettet mod CL/ß2-GP-1. Denne præparation er blevet kalibreret overfor for ("Harris sera"; Louisville APL Diagnostics Inc., Louisville, KY, USA). Graden af prøvereaktivitet måles i internationale enheder GPL units (GPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgG)/mL serum). 1 GPL-U/mL motsvarar till antistoff bindning kapacitet av 1 µg/ml solution av IgG antistoffy-purified från standard serum. Graden af prøvereaktivitet måles i internationale enheder (GPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgG)/ml serum). 11.2. Analytisk specificitet Testen muliggør specifik bestemmelse af humane IgG-antistoffer rettet mod CL/ß2-GP-1. 11.3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) Detektionsgrænsen er defineret som den koncentration, der svarer til middelabsorbansen af prøvebuffer plus 3-fold standardafvigelse (s). Den blev bestemt som as < 0,5 GPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgG) per ml serum (n = 24). Anbefalet måleområde: 2-100 GPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgG)pr. ml serum 11.4. Den faste fases homogenitet Måling af den faste fases homogenitet er en regelmæssig kvalitetskontrol- (QC) del af hver enkelt produktionsbatch. Denne bestemmes ved en 288-fold måling af en IgG-positiv, men ikke-mættende prøve på 3 udvalgte plader. Acceptkriterie: mod-variationskoefficient (cv) over pladerne < 8%. Figuren nedenfor viser et repræsentativt uddrag (fast fase batchnr. 2103F) af sådan en analyse. 11

plate early (n/10) late (9n/10) mean cv% row 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 line a 1838 1744 1773 1806 1795 1806 1799 1856 1871 1863 1900 1878 1827 2,6 line b 1786 1730 1800 1780 1774 1840 1829 1871 1891 1869 1839 1904 1826 2,9 line c 1742 1753 1735 1803 1804 1805 1819 1846 1888 1885 1899 1913 1824 3,4 line d 1795 1749 1782 1752 1788 1800 1828 1834 1905 1858 1899 1899 1824 3,1 line e 1824 1766 1818 1762 1820 1838 1841 1841 1846 1890 1892 1921 1838 2,6 line f 1746 1794 1754 1775 1794 1835 1852 1831 1880 1849 1887 1884 1823 2,7 line g 1743 1729 1810 1614 1778 1806 1812 1787 1865 1852 1880 1849 1794 4,1 line h 1783 1699 1821 1815 1789 1798 1821 1839 1864 1883 1848 1899 1822 2,9 mean 1782 1746 1787 1763 1793 1816 1825 1838 1876 1869 1881 1893 1822 cv% 2,1 1,6 1,7 3,6 0,8 1,0 0,9 1,3 1,0 0,8 1,3 1,2 3,0 line a line b line c line d line e line f line g line h 0 500 1000 1500 2000 mod 450nm 2000 1500 mod 450nm 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 early / late plate, row no. 0411FE00.FED/FphHomV1010J 12

11.5. Linearitet For at vurdere testens dosis-respons forhold blev positive sera målt i seriel 2- fold fortynding. Acceptkriterie: lineær regression af 4 på hinanden følgende fortyndinger skal give en korrelationsfaktor > 0,98. Et typisk resultat er vist nedenfor. 80 GPL-U / ml 60 40 serum 1 serum 2 serum 3 lin.regr.1 lin.regr.2 lin.regr.3 20 0 0 200 400 600 800 1000 nl serum / well 0411FE00.FED/LinearV1010J 11.6. Præcision For vurdering af testens præcision blev variabiliteten af resultater under de følgende forhold bestemt: a. indenfor 1 analyse og mellem 3 analyser, b. mellem 3 operatører og c. mellem 2 kit-batches. a. Intra- og inter-analysevariabilitet (n = henholdsvis 24 og 72) prøve middelværdi variability (cv, %) GPL-U/mL intra-assay inter-assay 1 10 3,2 4,6 2 19 3,2 3,4 3 65 2,8 2,9 13

b. Operatør til operatør-variabilitet (n = 12) prøve middelværdi variability GPL-U/mL (cv, %) 1 10 9,6 2 20 5,5 3 65 4,2 c. Variabilitet mellem 2 kit-batches (n = 6) prøve middelværdi variability GPL-U/mL (cv, %) 1 11 4,6 2 21 2,5 3 73 3,1 11.7. Frekvens-distribution af CL/ß2-GP-1-Ab (IgG) Denne blev analyseret for en gruppe af sera fra bloddonorer, der var ligeligt fordelt mht. køn og alder, og for en gruppe af sera, der var fundet positive i henhold til en CE-kompliant reference-elisa. Den følgende distribution af analyten blev observeret: blood donor sera positive sera n: 160 n: 26 mean: 5,3 GPL-U/mL mean: 126 GPL-U/mL mean + s: 8,2 GPL-U/mL mean - s: 59 GPL-U/mL mean + 2s: 11 GPL-U/mL mean - 2s: < 0 GPL-U/mL median: 4,7 GPL-U/mL median: 123 GPL-U/mL 95 th percentile: 9,5 GPL-U/mL 5 th percentile: 30 GPL-U/mL ROC-analyse af disse data blev brugt til at bestemme cut-off som 12,0 GPL- U/mL (8). De her præsenterede data indikerer en diagnostisk specificitet og sensitivitet for ELISA'en på henholdsvis ca. 98 % og næsten 100 %. Disse værdier gælder kun for de målte sera; andre grupper kan give andre resultater. 14

blood donor sera 60 50 40 30 20 10 0 <1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 relative frequency (%) cut-off GPL-U/mL positive sera 60 relative frequency (%) 50 40 30 20 10 cut-off 0 <1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 GPL-U/mL 0411FE00.FED/HäufgPlotV1010J 15

11.8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Variabilitet: Ved brug af prøve fra den samme kit-batch blev variabiliteten af analysens resultater sammenlignet mellem manuel udførelse og Dynex DS2 automatiseret ELISA system: manuel udførelse Dynex DS2 intra-analyse variabilitet middelværdi cv = 1,8 % middelværdi cv = 2,6 % (n = 16) inter-analyse variabilitet middelværdi cv = 3,5 % middelværdi cv = 3,2 % (n = 48) Standardkurve: vist i punkt 9 Korrelation:: 50 Dynex DS2 (GPL-U/mL) 40 30 20 10 y = 1,03 x r = 0,998 0 0 10 20 30 40 50 manual operation (GPL-U/mL) 0411FE00.FED/KorrDynexDS2-V1010J 16

12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterer, at det leverede produkt er blevet testet grundigt for at sikre, at dets egenskaber, som specificeret heri, er opfyldt. Der ydes ingen yderligere garantier. De data, der er præsenteret her, blev indhentet ved brug af den anførte procedure. Enhver procedure-modifikation kan påvirke resultaterne og Euro Diagnostica AB vil i så tilfælde fraskrive sig alle garantier, hvad end de er udtrykkelige, underforståede eller lovbefalede. Euro Diagnostica AB vil ydermere ikke acceptere noget ansvar for skader, hvad end de er direkte, inddirekte eller efterfølgende opståede som følge af ubehørig brug eller opbevaring af produktet. 13. Symboler Bestillingsnummer Batchkode Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests In vitro diagnostisk medicinsk anordning CE-overenstemmelsesmærkning Må ikke udsættes for sollys 17

Temperaturgrænse Skal anvendes inden Forsigtig Biologiske risici Producent 14. Henvisninger 1. Gromnica-Ihle, E., and Schössler, W.: Antiphospholipid Syndrome. Int Arch Allergy Immunol 123 (2000), 67-76 2. Harris, E. N., et al.: Anticardiolipin antibodies: Detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet Nov 26 (1983), 1211-1214 3. Petri, M.: Epidemiology of the Antiphospholipid Antibody Syndrome. J Autoimm 15 (2000), 145-151 4. Galli, M., et al.: Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma cofactor. Lancet 335 (1990), 1544-1547 5. Matsuura, E., et al.: Anticardiolipin antibodies recognise ß2-Glycoprotein 1 structure altered by interacting with an oxygen modified solid phase surface. J Exp Med 179 (1994), 457-462 18

6. Shoenfeld, Y., et al.: Induction and treatment of the antiphospholipid syndrome - lessons from animal models. Eur J Clin Invest 31 (2001), 736-740 7. Pierangeli, S. S., et al.: Complement activation: a novel pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome. Ann NY Acad Sci 1051 (2005), 413-420 8. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 19

15. Resumé-flowdiagram a. Fortynd sera 1/100 i prøvebuffer (100 ml, parat til brug, orange) og bland. b. Fortynd vaskebuffer 10x-koncentratet (100 ml, blå) med vand og bland. c. Vask brøndene en gang med 350 µl vaskebuffer hver. Dispensér 100 µl af kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå) og kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver i brøndene. Dobbeltmålinger anbefales. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). d. Vask brøndene 4 gange med 350 µl vaskebuffer hver. e. Dispensér 100 µl af konjugatet (14 ml, parat til brug, rød) i brøndene. Inkubér som i trin c. f. Gentag vasketrin d. g. Dispensér 100 µl af substratopløsningen (14 ml, parat til brug, sort hætteglas) pr. brønd. Inkubér som i trin c. Derefter tilsættes 100 µl stopopløsning (14 ml, parat til brug, farveløs) pr. brønd og ryst pladen kortvarigt. h. Mål øjeblikkeligt absorbansen ved 450 nm. i Kvantitativ evaluering: Bestem standardkurven og, ved brug af denne kurve, omsæt prøvernes absorbans til deres respektive antistofkoncentration (IU dsdna-ab (IgG)/ml). j. Kvalitativ evaluering: Bestem grænseabsorbansen ved at multiplicere absorbansen af den positive kontrol med den faktor, der er angivet på analysecertifikatet. Derefter beregnes prøvernes forhold ved at dividere deres absorbans med grænseabsorbansen. Internal file id._ver.-no. / date of issue: 0411FE60_1301M.FWD.doc / January 13, 2013 20