Listeria er overalt men kan styres en indsats! Lisbeth Truelstrup Hansen Professor Division for mikrobiologi og produktion Mørkhøj Bygade 19, 2860 Søborg Mail: litr@food.dtu.dk Tel: 3588 6278
Hvad er L. monocytogenes? Gram positiv bakterie 2,7-3,0 Mb genom Stavformet Katalase +, oxidase - Danner ikke sporer dvs. kun vegetative celler Fakultativ anaerobe kræver derfor ikke ilt for at vokse Vokser fra 0-40 o C med optimum temperatur ved 30-37 o C 5-6 peritrichous flageller ensartet fordeling Bevægelig < 30 o C Kan indeholde plasmider Op til 90 Kb 2
Linjer og serotyper blandt L. monocytogenes Linje I Linje II Linje III Linje IV Serotyper 1/2b, 3b, 3c, 4b 1/2a, 1/2c, 3a 4a, 4b, 4c 4a, 4b, 4c, Egenskaber Kliniske isolater Klonale lavere mutationsrater Isolater fra fødevarer Flere mutationer Flere plasmider, defekte inla Sjældne zooniske (forskellige dyr) >90% af humane listeriosis tilfælde er forårsaget af serotyperne 4b > 1/2a > 1/2b 3
Hvordan inficerer L. monocytogenes? opformering 4 Vazquez-Boland, J.A. et al., Clin. Microbiol. Rev., 14, 584, 2001
Hvem bliver syge? 1600 og 2161 personer bliver syge med listeriosis hvert år i hhv. USA og EU Indehaver af tredjepladsen! Lm er den tredje mest almindelige årsag til dødsfald pgra madforgiftning Forårsagede ca. 210 dødsfald i EU i 2014 ~90% af de personer, som får listeriosis er: Gravide og spædbørn Folk >65 år, eller Individer med et svagt immunsystem 5 (CDC, 2013, EDCD, 2015)
Listeriosis tilfælde i Danmark (2010-2014) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2010 2011 2012 2013 2014 Antal tilfælde Ca. 15% af listeriosis tilfælde er fatale 6
Listeria monocytogenes findes i miljøet Listeria spp. er saprofytisk og findes overalt i det naturlige og menneskeskabte miljø: jord overflade vand dyrefækalier foder spildevand levnedsmiddelvirksomheder gårde Listeria monocytogenes er isoleret over hele verden husdyr (kvæg, geder, får, grise, mm.) fisk planter hunde katte
Listeria monocytogenes økologi L. monocytogenes forekommer i miljøet, og kan derfor kontaminere råvarerne tidligt i produktionskæden via kontakt med jord, vand, gødning, osv. De fleste råvarer og nylavede færdige produkter vil indeholde <<0.1-1 bakterier/g, hvis de er kontamineret Den infektive dosis (ID) er høj (>10.000 bakterier), derfor er muligheden for efterfølgende vækst af bakterien i kontaminerede spiseklare produkter central i hele problematikken Tid og temperatur Vækstpotentiale i fødevaren
Hvordan havner Listeria i vores mad? 9
Nyere udbrud af listeriosis Udbrud peger mod mangel på kontrol med Listeria i flere dele af produktionskæden Canada 2008, 23 døde (Photo: www.macleans.ca) USA 2011, 33 døde (Photo: www.cdc.gov) Danmark 2014, 17 døde (Photo: newsbreak.dk)
Uventede udbrud 10 tilfælde 3 døde 35 tilfælde 7 døde Stevens, 2015 Ferris, 2014 11
Mulige smitteveje L. monocytogenes er som nævnt en patogen bakterie, der forekommer naturligt i miljøet inklusiv i jord, vand og på planter og dyr På marken: - Vandingsvand - Foder - Dyrefækalier - Gødning - Høstmaskiner (Photo: bactifeed.com) Hos fødevareproducenten: - Overflade med produktkontakt - Udstyr/opskæring - Medarbejdere - Gulvdræn (Photo: www.thestar.com) I detailleddet: - Personale - Transport - Forretninger - Køkkener (Photo: www.discovermapleleaf.ca)
Hvorfor er det så svært at kontrollere L. monocytogenes? Salttolerant (vækst ved 10% NaCl) Syretolerant (overlever ph 3-12, vækst ph 4.3-9.4) Resistens overfor udtørring Vokser i køleskabet Vedhæftes til overflader Danner biofilm Resistens over for disinfektionsmidler (fx plasmidbåren) 13
Biofilmens mulige rolle Persisterende L. monocytogenes stammer (dvs. identiske isolater) er blevet isoleret gentagne gange fra den samme virksomhed over en 12- årig periode L. monocytogenes danner biofilm på overflader i produktionsmiljøet og forøger derved dens evne til at overleve udtørring, disinfektion og rengøring Mikroskopi, der viser L. monocytogenes biofilm på rustfri ståloverflader (Hingston et al. 2013)
Trin i udviklingen af biofilm Lag med polymerer fra Tid, temperatur, smuds, overflade og rengøring (proces)vand og/eller snavs og madrester Monroe D. 2007. "Looking for Chinks in the Armor of Bacterial Biofilms" PLoS Biology Vol. 5, No. 11, doi:10.1371/journal.pbio.0050307
L. monocytogenes biofilm Hvidkål Rustfrit stål L. monocytogenes biofilm på hvidkål (24 timer ved 10 o C, Ells and Truelstrup Hansen, 2006) eller rustfrit stål (48 timer ved 15 o C, Daneshvar Alavi & Truelstrup Hansen, 2013)
Figur. SEM billeder af biofilm dannet af L. monocytogenes sammen med Shewanella putrefaciens (A, C & D) og Pseudomonas fluorescens (B). Biofilmene var dannet på rustfrit stål overflader (48 timer,100% RH & 15 o C) og fikseret med en modificeret cacodylate buffer.
Overførsel fra biofilm L. monocytogenes i biofilm overlever i et større antal men overføres i mindre grad til fødevarer, der berør den forurenede overflade. Men sammenholdes stigningen i overlevelse, fører biofilmdannelse til en mere persisterende overførsel af L. monocytogenes Samme overflade vil derfor eksempelvis kunne overføre L. monocytogenes til flere skiver ost, mm. Effektivitet af overførsel (EOT) af L. monocytogenes uden og med biofilmdannelse (Truelstrup Hansen and Vogel, 2011)
Biofilm og rengøring Trin i rengøring Forberede rengøring fjerne madrester Gøre rent ved hjælp af fysiske kræfter (højttryksspuling) og kemi Disinfektion reducere/eliminere tilbageblevne mikroorganismer Fjernelse af biofilm Oxiderende reagenter bedst, fx., Chloriner: ClO 2 men ikke HClO Pereddikesyre (peracetic acid, dvs. blanding af peroxyacetic acid, hydrogen peroxide og acetic acid) Andre teknikker: Basiske rengøringsmidler (chlorinerede) Ultralydsinstrumenter (evt. i kombination med chelators [EDTA] og enzymer) Enzymbaserede rengøringsmidler (til nedbrydelse af EPS) Naturlige antimikrobielle stoffer (essentielle olier mm.)
Biofilm og antimikrobielle stoffer Kontrol Carvacrol Citrongræsolie L. monocytogenes 568 + Salmonella Typhimurium MBEC L. monocytogenes 568 + Shewanella baltica MBEC (D Éntremont, 2015, M.Sc. afhandling)
Hygiejnisk design af udstyr Rengøring og disinfektion skal tage højde for steder, hvor det kan være svært at fjerne og inaktivere L. monocytogenes Hvor: Sortering, opskæring, transportbånd, dræn og gulve, osv. Revne, hvor det er umuligt at gøre rent Photo: Bruce Tompkin Hvorfor? Mangel på rengøring og disinfektion Dårligt hygiejnisk design Vedhæftede bakterier/biofilm Revne ved transportbånd Photo: Bruce Tompkin
Konklusioner Listeria monocytogenes findes overalt i miljøet Listeriosis er en alvorlig infektion specielt for individer i risikogrupperne Persistens og resistens overfor en række kontrolfaktorer Indsats fra jord til bord er nødvendig for at opnå kontrol med denne patogene bakterie
Stor tak til mine tidligere og nuværende studerende Marta Piercey Patricia Hingston Hessam Daneshvar Alavi Yannan Huang Laura Purdue Emma Stea Céline d Éntremont