EULISA ANA Screen 6 IgG

Transkript

1 Brugsanvisning EULISA ANA Screen 6 IgG Anvendelse Enzym-immunoassay til bestemmelse af IgG- autoantistoffer rettet mod RNP, Sm, Ro (SS-A), La (SS-B), Scl-70 and Jo-1 Micro titration 96 wells Store kit at +2-8 C For in vitro diagnostic use only Document No. E DK January, 2013 EULISA Screen 6 IgG DANSK

2 Indhold 1. Introduktion og baggrund 2. Advarsler og forholdsregler 3. Testens principper 4. Kittets indhold 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger 6. Opbevaring af kittet 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 9. Evaluering og kvalitetskontrol 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger 11. Produkt karakteristik Standardisering Analytisk specificitet Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) Homogenitet af bindingskapacitet Linearitet Præcision Frekvensfordeling af dsdna-ab (IgG) Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 12. Garanti 13. Symboler 14. Henvisninger 15. Resumé-flowdiagram Produktet, der er beskrevet heri, er blevet fremstillet i overensstemmelse med Direktiv om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik 98/79/EF. 2

3 1. Introduktion og baggrund Cirkulerende autoantistoffer mod forskellige intracellulære antigener (antinukleære antistoffer, ANA) er karakteristiske for systemiske, autoimmunmedierede reumatiske bindevævssygdomme (1, 2, 3, 4). Disse omfatter systemisk lupus erythematosus (SLE), blandet bindevævssygdom (MCTD), Sjögrens syndrom (SS) A og B, progressiv systemisk sklerose (PSS, sklerodermi)/crest-syndrom og polymyositis (PM). På grund af overlappende symptomer er det ofte svært at stille diagnose på de ovenstående sygdomme og diagnosen støttes derfor normalt ved at måle deres associerede autoantistoffer. 8 antigener, der specifikt genkendes af disse antistoffer, bliver immobiliseret, række for række, på den faste fase af den aktuelle enzymkoblede immunosorbentanalyse (ELISA): antigen source disease autoantibody prevalence (5) RNP (proteins A, C, 68kDa) recombinant MCTD 95 % SLE % PM 14 % SS 4 % Sm (proteins B, B', D) bovine thymus SLE % MCTD 7 % SS-A/Ro (60kDa-protein) bovine thymus SS % SLE % MCTD % PSS 5-7 % PM 5-7 % SS-B/La recombinant SS % SLE % MCTD 5-15 % Scl-70 (DNA-topoisomerase 1) recombinant PSS % Jo-1 (Histidyl-tRNA-synthetase) recombinant PM % Denna enzym-koblede immunosorbent analyse (ELISA) er beregnet til kvalitativ summering bestemmelse af IgG-antistoffer i human serum. Testen er hurtig (inkubationstid 30 / 30 / 30 minutter) og fleksibel (delelig fast fase, reagenser, der er parat til brug). Seks kalibratorer standardiserer de kvantitative målinger; en negativ og en positiv kontrol sikrer analysens gyldighed. 3

4 2. Advarsler og forholdsregler Testkittet er kun beregnet til in vitro diagnostisk brug og ikke til indvortes eller udvortes brug til mennesker eller dyr. Reagenserne må ikke anvendes efter deres udløbsdato. Det anbefales stærkt, at denne protokol følges. Prøvebuffer, kalibratorer og kontroller indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Vaskebufferen indeholder bromonitrodioxan og konjugatet methylisothiazolon / bromonitrodioxan som konserveringsmiddel. Substratet indeholder 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid (H2O2). Stop-opløsningen, 0,5 M svovlsyre (H2SO4), er sur og ætsende. De ovennævnte reagenser kan være toksiske, hvis de indtages. Følg rutinemæssige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. Undgå al kontakt med kroppen, brug handsker og øjenbeskyttelse. Hvis en reagens kommer i kontakt med hud eller slimhinder, skal der skylles grundigt med vand. Der må aldrig pipetteres med munden. Skal bortskaffes på en måde, der er i overensstemmelse med nationale/lokale forordninger. Natriumazid kan reagere med bly- og kobbervandrør og danne eksplosive metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre ophobning af azid. Kalibratorerne og kontrollerne indeholder materialer af human oprindelse. They have produced negative results when tested for Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, hepatitis B overflade (HBs)-antigen, HIV 1/2-Ab og hepatitis C Virus (HCV)-Ab, i FDA godkendte eller Europæisk direktiv 98/79/EFoverensstemmende tests. Ingen kendte tests kan imidlertid garantere, at produkter, der er afledt fra humant blod, ikke vil være infektiøse. De skal derfor håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agenser og bortskaffes på behørig måde. Der henvises til CDC (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andre lokale/nationale retningslinjer for laboratoriesikkerhed og dekontamineringsprocedurer. 3. Testens principper Den faste fases brønde er belagt med mixed antigens. På denne overflade vil de følgende immunologiske reaktioner finde sted: 4

5 1. reaktion: Specifikke antistoffer i prøven vil binde sig til det immobiliserede antigen og danne antigen-antistof komplekset. Herefter vaskes de ikkebundne prøvekomponenter væk fra den faste fase. 2. reaktion: Et andet antistof, der er rettet mod humane IgG-antistoffer og konjugeret med horseradish- (peberrod) peroxidase (HRP), tilsættes. Dette konjugat binder sig til komplekset. Herefter vaskes overskydende konjugat væk fra den faste fase. 3. reaktion: Det enzymmærkede kompleks omdanner et farveløst substrat til et blåt produkt. Graden af farveudvikling afspejler koncentrationen af specifika antistoffer (IgG) i prøven. 4. Kittets indhold a. 1 mikrobrøndsplade belagt med Sm og hermetisk indpakket i en folielaminatpose sammen med en pose med tørremiddel. Pladen består af 12 strimler, der hver kan afrives til 8 individuelle brønde. b. Prøvebuffer, 100 ml, parat til brug, orange farve. Indeholder tris-bufferet saltvand (TBS), bovin serumalbumin (BSA), Tween og natriumazid. c. Vaskebuffer, 100 ml, 10x-koncentrat, blå farve. Indeholder TBS, Tween og bromonitrodioxan. d. Negative and positive control, 3,0 ml each, ready-to-use, green and red coloured, respectively. Contain TBS, BSA, Tween and Na-azide. e. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, parat til brug, rød farve. Bufferet opløsning, der indeholder stabiliserende protein, methylisothiazolon og bromonitrodioxan. 5

6 f. Substratopløsning, 14 ml, parat til brug, farveløs. Indeholder en bufferet opløsning af TMB og H2O2. Indeholdt i et hætteglas, som lys ikke kan trænge igennem. g. Stop-opløsning (0,5 M H2SO4), 14 ml, farveløs, parat til brug. Forsigtig: svovlsyre er ætsende. h. Brugsanvisning i. Batch-specifikt analysecertifikat 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger a. Demineraliseret eller destilleret vand b. Måleglas, 1000 ml c. Rør til prøvefortynding (overførselsrør i mikrobrøndspladeformat anbefales) d. Pipetter til 10, 100 og 1000 µl (1- og 8-kanals pipetter anbefales) e. Mikrobrøndsplade-vaskeapparat (valgfri) f. Mikrobrøndsplade-fotometer udstyret med et 450 nm filter g. ELISA evalueringsprogram (anbefalet) 6. Opbevaring af kittet Kittet skal opbevares ved 2-8 C. Det er stabilt op til den udløbsdato, der er anført på boksens mærkat. Kittet må ikke anvendes efter dets udløbsdato. 6

7 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav Man må ikke ombytte eller sammensætte tilsvarende komponenter fra forskellige kits på grund af mulige forskelle på forsendelses- eller opbevaringsbetingelser. a. Før posen med den faste fase åbnes, skal den først nå op på stuetemperatur. Tag alle mikrobrøndene ud af rammen og put dem øjeblikkeligt tilbage i posen, sammen med posen med tørremiddel. Genforsegl posen hermetisk og opbevar den i køleskab til fremtidig brug. b. Fortynd vaskebuffer 10x-koncentratet (100 ml, blå) med 900 ml demineraliseret vand. Bland grundigt. Den fortyndede buffer er stabil i adskillige uger, hvis den opbevares i køleskab (2-8 C). c. Klargøring af prøver: Patientprøver skal håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agens. Klargør sera i henhold til normale laboratorieteknikker og fortynd dem 1/100, fx 10 µl serum µl prøvebuffer. Bland grundigt. For at opnå hurtig dispensering under analyseproceduren anbefales det, at kalibratorer, kontroller og prøver i mikrobrønd-overførselsrør klargøres. Dette gør det muligt, at anvende en 8-kanals pipette under analyseproceduren. Hvis prøver ikke analyseres med det samme, skal de opbevares ved 2-8 C og analyseres indenfor 3 dage. For længere opbevaring anbefales -20 C eller derunder. Gentagen nedfrysning og optøning af sera skal undgås. Optøede prøver skal blandes inden de fortyndes. Prøvekrav: Stærkt lipæmiske, hæmolyserede eller mikrobielt kontaminerede sera kan forårsage fejlagtige resultater og skal undgås 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse Før analysen startes skal alle kittets komponenter være nået op stuetemperatur (23 ± 3 C). 7

8 For at opnå de bedste resultater, dvs. det maksimale forhold mellem specifikt og baggrundssignal, er omhyggelig vask afgørende (trin a, c og e). Det er yderst vigtigt, at vaskeopløsningen fjernes fuldstændigt. Det gøres ved at tappe pladen resolut på adskillige lag absorberende servietter. Automatiserede vaskeapparater skal verificeres i henhold til resultater, der opnås med manuel vask. a. Umiddelbart før brug skal den faste fase vaskes én gang: fyld brøndene med 350 µl vaskebuffer hver, lad brøndene gennembløde i 10 sekunder og fjern vaskebufferen. b. Dispensér kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå), kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver hurtigt i mikrobrøndene; 100 µl pr. brønd. Dobbeltbestemmelser anbefales. Inkubér pladen i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). c. Vask brøndene 4 gange som i trin a. d. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) konjugatet (14 ml, parat til brug, rød); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. e. Gentag vasketrin c. f. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) substratopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs, sort hætteglas); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. Da substratet er lysfølsomt skal intens lyseksponering (fx direkte sollys) undgås under inkubation. g. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) stopopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs. Forsigtig: ætsende!); 100 µl pr. brønd. Brug den samme sekvens som for substratet. Farven skifter fra blå til gul. Ryst pladen, helst på en orbitalryster, i ca. 10 sekunder. h. Aflæs øjeblikkeligt absorbansen i mikrobrøndsplade-fotometeret ved 450 nm. Opbevar de resterende reagenser i køleskab (2-8 C), hvis de skal bruges igen Dynex DS2 automatiseret ELISA system Dette produkt er blevet valideret til brug med Dynex DS2 automatiseret ELISA system. En behørig programfil til analyseudførelse og -evaluering kan fås ved anmodning. Dette programs parametre er kun et forslag, og det kan være nødvendigt, at operatøren tilpasser dem til den faktiske analyses krav. Vi har generelt forsøgt, at holde os så tæt som muligt på protokollen for den manuelle 8

9 udførelse, som beskrevet ovenfor. På grund af den nødvendigvis forhøjede temperatur inden i DS2 har det været nødvendigt at forkorte substratinkubationsperioden. Punkt viser en sammenligning af analyseresultater opnået ved manuel udførelse og ved brug af DS2 ELISA systemet. 9. Evaluering og kvalitetskontrol Testen kan også evalueres på en kvalitativ måde.: absorbansværd af prøver sammanlignas med absorbans gränsværd (= cut-off absorbance). Absorbans gränsværd bestems af den positive kontrol som på samma gång fungerar som kalibrator, enligt formula: absorbans gränse = absorbans positiv kontrol x faktor Faktoren varierer for forskellige kit batches og er anført på det batch-specifikke analysecertifikat, der er inkluderet med hvert enkelt test-kit. Eksempel: absorbans positiv kontrol = 1250 mod faktor = 0,35 absorbans grænse = 1250 mod x 0,35 = 438 mod For at få indtryk af, hvor positiv en bestemt prøve er for Sm-Ab (IgG), kan man beregne forholdet ved hjælp af formlen: forhold = absorbans prøve / absorbans grænse Eksempel: Absorbans grænse = 438 mod absorbans prøve = 1480 mod forhold = 1480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontrol: Den positive og negative kontrol kontrollerer analysens gyldighed. Deres autoriserede værdier og acceptable områder er anført på det batch-specifikke analysecertifikat. Kontrollernes værdier skal falde indenfor de angivne områder, hvis de ikke gør, er analysens resultater ugyldige. 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger 9

10 Baseret på målinger af en gruppe af sera fra bloddonorer og en gruppe af positive sera (se nedenfor), foreslår vi for vurderingen af patient-sera: ratio normal (negative) range < 0,82 cut-off 1,00 equivocal range 0,82-1,20 positive range > 1,20 Disse specifikationer gives kun som en indikation; for at kontrollere enhver analyses nøjagtighed bør der altid inkluderes parallelprøver af normal sera. Et negativt testresultat indikerer, at patienten ikke har et forhøjet niveau IgG antibodies listade. Närvarelse af en systemic rheumatic disease är inte sannolik men kan inte udelukkes. Ett positivt testresult indikerar en indication modt en av de ovan listade sygdommarna. Follo-up diagnosis, bör inkludera test av den specifika antistoff og identifiering av den autoimmune sygdommen bestemmes. Detta kan uppnås med en ELISA differentiating profile. Prøver, der udviser resultater mellem de ovenfor anførte grænser, skal betragtes som dobbelttydige og rapporteres som sådan. Det anbefales, at endnu en prøve indsamles to uger senere og køres parallelt med den første prøve for at dokumentere en mulig ændring i antistof-titer. Som med alle serologiske tests skal resultaterne fortolkes i lyset af patientens symptomer og andre diagnostiske kriterier 11. Produkt karakteristik Standardisation Testen er standardiseret med en renset serum-præparation, der indeholder IgG-antistoffer, der specifikt er rettet mod varje immobilised autoantigen. Denna beredning består av lager material för båda controller av testet. Proportionen av antikropparna är anpassad på så sätt att varje bidrar med samma del till den övergripande signalen. 10

11 11.2. Analytical specificity Testen muliggør specifik bestemmelse af humane IgG-antistoffer rettet mod avsnitt 1. Det har blivit validated (bland andra criteria) med hjepl af human reference seram fra Center of Disease Control (CDC; Atlanta, USA), vilka är kommerciellt tillgengeliga. Följande result (ratio values) är typiska: Serum CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Joresult DNA /La RNP /Ro 70 1 Immun- homo- speck- speck nuc- -- centro fluoresc. gen led led leolar mere ratio 2,1 8,7 7,6 3,3 8,4 1,0 6,2 0,3 6,6 8,2 Bemærk: Den tilsvarende ANA Profile 8 ELISA särskiller mellom de forskellige antigen visar: Serum # 1 reagerer ikke på kun modt dsdna, men også med Sm. Serum # 6 visar forhold vært 1 mod alle enkelt-antigener. Serum # 8 reagerer starkt mod centromer protein B, som ikke indgår i området af den nuværende ANA Screen ELISA Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) Detektionsgrænsen er defineret som den koncentration, der svarer til middelabsorbansen af prøvebuffer plus 3-fold standardafvigelse (s). Den blev bestemt som as < 0,4 (ratio; n = 24). Anbefalet måleområde 0,5 < ratio < Den faste fases homogenitet Måling af den faste fases homogenitet er en regelmæssig kvalitetskontrol- (QC) del af hver enkelt produktionsbatch. Denne bestemmes ved en 288-fold måling af en IgG-positiv, men ikke-mættende prøve på 3 udvalgte plader. Acceptkriterie: mod-variationskoefficient (cv) over pladerne < 8%. Figuren nedenfor viser et repræsentativt uddrag (fast fase batchnr. 2308I ) af sådan en analyse. 11

12 plate early (n/10) late (9n/10) mean cv% row line a ,4 line b ,4 line c ,6 line d ,4 line e ,1 line f ,4 line g ,2 line h ,7 mean cv% 1,7 1,4 1,4 1,3 1,6 1,1 1,3 1,0 1,1 1,5 1,1 1,8 1,5 line a line b line c line d line e line f line g line h mod 450nm mod 450nm early / late plate, row no FE00.FED/FphHomV1411J 12

13 11.5. Linearitet For at vurdere testens dosis-respons forhold blev positive sera målt i seriel 2- fold fortynding. Acceptkriterie: lineær regression af 4 på hinanden følgende fortyndinger skal give en korrelationsfaktor > 0,98. Et typisk resultat er vist nedenfor. En approximate lineararitet mellan prøve koncentration og resultat ratio är restricted til värdi < 2. Detta beror på den qualitativa evalueringen (stycke 9), en kontrasts ELISAs vilken är evaluerad quantitative genom en standard kurva. 8 6 sera pool 1 sera pool 2 sera pool 3 ratio nl sera pool / well 1811FE00.FED/LinearV1411J Præcision For vurdering af testens præcision blev variabiliteten af resultater under de følgende forhold bestemt: a. indenfor 1 analyse og mellem 3 analyser, b. mellem 3 operatører og c. mellem 2 kit-batches a. Intra- og inter-analysevariabilitet (n = henholdsvis 24 og 72) prøve middelværd variability (cv, %) intra-assay inter-assay 1 1,2 3,0 3,3 2 3,2 2,0 3,0 3 4,9 1,8 4,1 13

14 b. Operator to operator variability (n = 12) prøve middelværdi variability (cv, %) 1 1,2 1,7 2 3,2 1,7 3 4,7 1,8 c. Variabilitet mellem 2 kit-batches (n = 6) prøve middelværdi variability (cv, %) 1 1,0 11,9 2 2,9 11,9 3 4,4 9, Frekvens-distribution af ANA (IgG) This was analysed in a sera collective of blood donors, equally distributed by sex and age, and a collective of sera which had been found positive by independent methods (e.g. monospecific, CE-compliant reference ELISAs, immune fluorescence assays (IFA)) for at least one parameter or were clinically defined. Denne blev analyseret for en gruppe af sera fra bloddonorer, der var ligeligt fordelt mht. køn og alder, og for en gruppe af sera, der var fundet positive i henhold til en CE-kompliant reference-methods (tex (e.g. monospecific, ELISAs, immune fluorescence assays (IFA)) for en parameter eller var kliniskt diagnosticerad. Den følgende distribution af analyten blev observeret (s = standard deviation): blood donor sera positive sera n: 160 n: 63 mean: ratio = 0,49 mean: ratio = 7,3 mean + s: ratio = 0,84 mean - s: ratio = 5,4 mean + 2s: ratio = 1,19 mean - 2s: ratio = 3,5 median: ratio = 0,40 median: ratio = 7,8 95 th percentile: ratio = 0,94 5 th percentile: ratio = 2,9 14

15 ROC-analysis of these data was used to determin ROC-analyse af disse data blev brugt til at bestemme cut-off af ANA Screen 6 ELISA enligt (6). De her præsenterede data indikerer en diagnostisk specificitet og sensitivitet for ELISA'en på henholdsvis ca. 96 % og næsten 100 %. Disse værdier gælder kun for de målte sera; andre grupper kan give andre resultater. blood donor sera 50 relative frequency (%) cut-off 0 < 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0, ,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 ratio 15

16 positive sera 50 relative frequency (%) cut-off 0 < 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0, ,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 ratio 1811FE00.FED/HäufgPlotV1411J Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Variabilitet: Ved brug af prøve fra den samme kit-batch blev variabiliteten af analysens resultater sammenlignet mellem manuel udførelse og Dynex DS2 automatiseret ELISA system: manuel udførelse Dynex DS2 intra-assay variability mean cv = 1,4 % mean cv = 1,9 % (n = 16) inter-assay variability mean cv = 2,3 % mean cv = 3,6 % (n = 48) 16

17 Korrelation: 6,00 Dynex DS2 (ratio) 4,00 2,00 y = 1,01 x r = 0,998 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 manual operation (ratio) 12. Garanti 1811FE00.FED/KorrDynexDS2-V1411J Euro Diagnostica AB garanterer, at det leverede produkt er blevet testet grundigt for at sikre, at dets egenskaber, som specificeret heri, er opfyldt. Der ydes ingen yderligere garantier. De data, der er præsenteret her, blev indhentet ved brug af den anførte procedure. Enhver procedure-modifikation kan påvirke resultaterne og Euro Diagnostica AB vil i så tilfælde fraskrive sig alle garantier, hvad end de er udtrykkelige, underforståede eller lovbefalede. Euro Diagnostica AB vil ydermere ikke acceptere noget ansvar for skader, hvad end de er direkte, inddirekte eller efterfølgende opståede som følge af ubehørig brug eller opbevaring af produktet. 17

18 13. Symboler Bestillingsnummer Batchkode Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests In vitro diagnostisk medicinsk anordning CE-overenstemmelsesmærkning Må ikke udsættes for sollys Temperaturgrænse Skal anvendes inden Forsigtig Biologiske risici 18

19 Producent 14. Henvisninger 1. Nakamura, R. M., Tan, E. M.: Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic rheumatic diseases. Clin Lab Med 12 (1992), Guma, M., Keil, L. B.: Autoantibodies to cellular antigens in systemic autoimmune diseases. J Clin Immunoassay 17 (1994), Fritzler, M. J.: Clinical relevance of autoantibodies in systemic rheumatic diseases. Mol Biol Rep 23 (1996), Hietarinta, M., Lassila, O.: Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic disease. Ann Med 28 (1996), Messinger, M.: Autoantikörper bei systemischen entzündlich-rheumatischen Erkrankungen (Kollagenosen). In: L. Thomas (ed.): Labor und Diagnose (2005), TH-Books-Verlags-Gesellschaft, Frankfurt/Main, Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992),

20 15. Resumé-flowdiagram a. Fortynd sera 1/100 i prøvebuffer (100 ml, parat til brug, orange) og bland. b. Fortynd vaskebuffer 10x-koncentratet (100 ml, blå) med vand og bland. c. Vask brøndene en gang med 350 µl vaskebuffer hver. Dispensér 100 µl af kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå) og kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver i brøndene. Dobbeltmålinger anbefales. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). d. Vask brøndene 4 gange med 350 µl vaskebuffer hver. e. Dispensér 100 µl af konjugatet (14 ml, parat til brug, rød) i brøndene. Inkubér som i trin c. f. Gentag vasketrin d. g. Dispensér 100 µl af substratopløsningen (14 ml, parat til brug, sort hætteglas) pr. brønd. Inkubér som i trin c. Derefter tilsættes 100 µl stopopløsning (14 ml, parat til brug, farveløs) pr. brønd og ryst pladen kortvarigt. h. Mål øjeblikkeligt absorbansen ved 450 nm. i. Evaluering Bestem grænseabsorbansen ved at multiplicere absorbansen af den positive kontrol med den faktor, der er angivet på analysecertifikatet. Derefter beregnes prøvernes forhold ved at dividere deres absorbans med grænseabsorbansen. Internal file id._ver.-no. / date of issue: 1411FE60_1301M.FWD.doc / January 13,