Pak12 assay BRUGSANVISNING INDHOLDSFORTEGNELSE

Transkript

1 BRUGSANVISNING Pak12 assay REF PAK12 IVD INDHOLDSFORTEGNELSE ANVENDELSE... 2 SAMMENDRAG OG FORKLARING... 2 TESTPRINCIP... 2 REAGENSER... 2 FORHOLDSREGLER... 3 ADVARSEL:... 3 PRØVETAGNING OG OPBEVARING... 3 FREMGANGSMÅDE... 3 Medfølgende materialer... 3 Nødvendige materialer, der ikke medfølger:... 4 Testprocedure... 4 KVALITETSKONTROL... 5 FORTOLKNING AF RESULTATER... 6 BEGRÆNSNINGER... 6 SPECIFIKKE KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNEN... 6 BIBLIOGRAFI... 7 Pak12 assay IFUDA REV F

2 ANVENDELSE PAK12-analysen er en kvalitativ fastfase ELISA-analyse (enzyme linked immunosorbent assay), som er udviklet til at påvise antistoffer mod HLA klasse I-antigener samt epitoper på trombocytglykoproteinerne IIb/IIIa, Ia/IIa og Ib/IX. SAMMENDRAG OG FORKLARING Tilstedeværelsen af trombocytspecifikke antigener på forskellige trombocytglykoproteiner er blevet beskrevet af mange forskere. 1,2,3,4,5,6 Antistoffer mod trombocytspecifikke eller HLA klasse I-antigener, som er dannet pga. graviditet eller transfusion, kan medføre immundestruktion af transfunderede trombocytter. 7,8,9 Bekræftelse af disse antistoffers tilstedeværelse i patienters serum kan være en hjælp, når man søger efter mulige forligelige blodprodukter. Pak12-kittets testbrønde til fastfase ELISA-analyse indeholder monoklonalt bundne trombocytglykoproteiner IIb/IIIa og Ia/IIa fra type O- donorer med kendte trombocyttyper. HLA klasse I-glykoprotein og trombocytglykoprotein Ib/IX leveres som affinitetsoprensede glykoproteiner. Testen er designet til at påvise og differentiere mellem antistoffer mod HLA klasse I-antigener og trombocytspecifikke antigener. Brøndendes sammensætning kan ses på resultatskemaet. TESTPRINCIP Patientserum eller -plasma tilsættes til testbrøndene, som er coatet med trombocytglykoproteiner og HLA-glykoproteiner, hvilket muliggør binding af antistof, som måtte være til stede. Dernæst vaskes ubundne antistoffer væk. Et anti-humant globulinreagens (Anti- IgG/A/M) mærket med alkalisk fosfatase tilsættes til testbrøndene og inkuberes. Det ubundne Anti-IgG/A/M vaskes væk, og substratet PNPP (p-nitrophenylphosphat) tilsættes. Efter 30 minutters inkubation stoppes reaktionen med Stopping Solution. Den optiske densitet af den farve, der dannes, måles med et spektrofotometer. REAGENSER Maksimale antal test pr. kit: PAK12-analysen: 5 test pr. kit. Alle reagenser skal opbevares, som det er angivet på etiketten. REF MS TCW SD SB ESS Strips med testbrønde: Strips med testbrønde med flad bund, som er coatet med trombocytglykoproteiner og HLA-glykoproteiner. Testbrøndene er pakket i en foliepose med genluk. Brugsklar Concentrated Wash (10X): Tris (hydroxymethyl) aminomethan-bufferet opløsning indeholdende natriumchlorid og Tween % natriumazid. Fortynd med deioniseret eller destilleret vand inden brug. Opbevar fortyndet vaskeopløsning i op til 48 timer ved stuetemperatur eller i op til syv dage ved 2-8 C Specimen Diluent: Phosphatbufferet saltvandsopløsning med bovint albumin og museserum. 0,1 % natriumazid. Brugsklar Substrate Buffer: Denne opløsning indeholder diethanolamin og magnesiumchlorid. 0,02 % natriumazid. Brugsklar. Beskyt mod lys Stopping Solution: Brugsklar. AH PN PC Anti-Human IgG/A/M Conjugate: Affinitetsoprenset antistof fra ged rettet mod humane immunglobuliner (IgG/A/M), konjugeret med alkalisk phosphatase. 0,1 % natriumazid. Fortynd med Specimen Diluent inden brug PNPP Substrate: (p-nitrophenylphosphat) Krystallinsk pulver. Rekonstituér med deioniseret eller destilleret vand, og fortynd med Substrate Buffer inden brug. Beskyt mod lys Positive Serum Control: Humant serum. 0,1 % natriumazid. Fortynd med Specimen Diluent inden brug. NC Negative Serum Control: Humant serum. 0,1% natriumazid. Fortynd med Specimen Diluent inden brug. Pak12 assay IFUDA REV F

3 PS Pladelåg. FORHOLDSREGLER Anvend ikke reagenser, som er uklare eller kontaminerede. Udvis ALTID forsigtighed med henblik på at undgå kontaminering af Specimen Diluent og Conjugate. Utilsigtet kontaminering af disse reagenser med humant serum eller plasma vil medføre neutralisering af konjugatet og dernæst fejl på testen. Anvend ikke reagenser efter deres udløbsdato. Testbrønde og reagenser i kittet må ikke anvendes sammen med noget andet testsystem. Anvendelse af andre komponenter end dem, der følger med dette kit, kan medføre inkonsistente eller fejlagtige resultater. Bortskaf alle ubenyttede portioner af fortyndet Conjugate, fortyndet Positive Control og Negative Control samt fortyndet og rekonstitueret PNPP-reagens efter hver analysering. Følg ved fremstillingen af fortyndinger pipette-fabrikantens instruktioner vedr. korrekt dispensering og rens. Den enzym-substrat-reaktion, der sker under den sidste inkubation, er temperaturafhængig og skal foregå i et kontrolleret temperaturområde på C. ADVARSEL Alt human serum, der er anvendt til Positive Control og Negative Control i dette kit, er blevet testet med FDA-godkendte metoder og påvist negativt for antistoffer mod HIV, HCV og HbsAg. Ingen kendt testmetode kan dog give fuldstændig garanti for, at HIV, Hepatitis C-virus, Hepatitis B-virus eller andre smitsomme stoffer ikke er til stede. Derfor skal disse materialer håndteres som potentielt smittefarlige. Nogle af de reagenser, som følger med kittet, indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. ADVARSEL: Natriumazid reagerer med bly- og kobberrør og danner højeksplosive metalazider. Når det hældes i vasken, skal vasken skylles med store mængder vand for at undgå azidophobning. Natriumazid er en gift og er meget giftigt ved indtagelse. Bortskaf til sidst alle komponenter i henhold til lokale bestemmelser. PRØVETAGNING OG OPBEVARING Blod bør opsamles i ACD eller EDTA (plasma) eller uden antikoagulans (serum) ved en aseptisk teknik og bør testes, mens det stadig er friskt, for at minimere risikoen for at falsk positive eller falsk negative reaktioner forekommer på grund af forkert opbevaring eller kontaminering af prøven. Prøver, der ikke kan testes straks, bør opbevares ved 2-8º C i maks. 48 timer eller fryses. Prøver, der fryses ved -20 C eller koldere, holder sig godt i flere år (2-3 år). For at undgå den skadelige effekt af gentagne nedfrysninger/optøninger anbefales det dog, at prøver udportioneres og opbevares på frost. Undgå frysere, der afrimer automatisk. Serum eller plasma bør separeres fra erytrocytterne før opbevaring eller forsendelse. Partikler eller aggregater i prøven kan medføre falsk positive resultater eller dårlige værdier ved dobbeltbestemmelse. Prøver, der indeholder partikler, bør centrifugeres forud for analysering. Kun ufortyndet humant serum eller plasma er egnet til denne analyse. Forudgående fortynding af prøver i andet end normalt, ELISAnegativt humant serum kan påvirke resultaterne. Mikrobielt kontaminerede, hæmolyserede, lipæmiske, ikteriske eller varmeinaktiverede prøver kan give inkonsistente resultater og bør undgås. FREMGANGSMÅDE Medfølgende materialer Flaskerne kan indeholde mere reagens end angivet på etiketten. Sørg for at afmåle reagenset med et passende udstyr, når du fremstiller fortyndinger x 8 strips med testbrønde 2. 1 x 50 ml Concentrated Wash (10X) 3. 1 x 14 ml Specimen Diluent 4. 1 x 14 ml Substrate Buffer 5. 1 x 14 ml Stopping Solution 6. 1 x 80 µl Anti-Human IgG/A/M Conjugate 7. 3 x 50 mg PNPP Substrate 8. 1 x 0,3 ml Positive Serum Control 9. 1 x 0,7 ml Negative Serum Control pladelåg Pak12 assay IFUDA REV F

4 Nødvendige materialer, der ikke medfølger: 1. Testglas til fortyndinger af patientprøver og kontroller samt reagensfortyndinger 2. Transferpipetter 3. Mikropippetter, som kan justeres til at afgive µl og µl, og engangsspidser 4. Stopur 5. Mikropladelæser, som kan måle OD ved 405 eller 410 og 490 nm 6. Deioniseret eller destilleret vand 7. Absorberende papir 8. Mikropladevasker eller -udstyr 9. Centrifuge, som kan separere serum eller plasma fra patientprøver C vandbad eller inkubator Testprocedure 1. Lad alle reagenser opnå stuetemperatur. 2. Fremstil en brugsklar vaskeopløsning ved at fortynde Concentrated Wash. Tilsæt 1 volumen Concentrated Wash til 9 volumener deioniseret eller destilleret vand. Bland grundigt. 3. Bestem antal patientprøver, som skal testes. Tildel hver prøve en placering, der består af to kolonner, på resultatskemaet. Notér identiteten af hver enkelt prøve på resultatskemaet. Forbered prøver og kontroller 4. Fortynd som følger, og bland grundigt: Volumen af Specimen Diluent PC 150 µl 50 µl NC 600 µl 200 µl Patientprøve 600 µl 200 µl Volumen af prøve 5. Tag rammen med testbrønde ud af posen. Læg hurtigt strips, du ikke har brug for, tilbage i den beskyttende pose, og luk den til. Der leveres kun én ramme med dette kit. Bortskaf ikke, før alle strips er brugt. Vend rammen, så A1 er i øverste venstre hjørne. Sørg for at alle strips er sat rigtigt i og klikket fast i deres ramme. Markér eller nummerér hver enkelt strip for at undgå fejl. Sørg for, at pladen vender samme vej under hele analyseringen. 6. Tilsæt 300 µl fortyndet vaskeopløsning til alle brønde, og lad det stå ved stuetemperatur i 5-10 minutter, 7. Aspirér eller hæld energisk fra, og læg pladen med bunden i vejret på absorberende papir for at forhindre udtørring. 8. Tilsæt 50 µl af korrekt fortyndet kontrol eller prøve i brøndene, sådan som det er anført på resultatskemaet. Tilsæt ikke prøver eller reagenser i blanke brønde. Hvis flere patientprøver analyseres samtidig, er det kun nødvendigt at anvende ét sæt kontroller. MARKÉR HVER ENKELT STRIP FOR AT UNDGÅ FEJL. 9. Dæk testbrøndene med et pladelåg, og inkubér i minutter i et 37 C vandbad. Hvis en inkubator anvendes i stedet for, skal tiden forlænges med 10 minutter. 10. Fortynd Conjugate i forholdet 1 til 100 i Specimen Diluent. Anvend en beholder i polypropylen. Strips 2 2 x x 8 AH 20 µl 60 µl SD 2,0 ml 6,0 ml Conjugate er tyktflydende. Spidsen skal primes 2-3 gange i Conjugate før dispensering og renses efter tilsætning til Specimen Diluent. Bland grundigt. Pak12 assay IFUDA REV F

5 11. VASKETRIN a) Apirér indholdet fra hver brønd, eller hæld det fra, og dup den tør med absorberende papir. b) Tilsæt 300 µl fortyndet vaskeopløsning. c) Aspirér, eller hæld fra. d) Gentag trin b + c for i alt 3 eller 4 gange vask. e) Hæld energisk fra for at fjerne alt overskydende vaskeopløsning. Læg pladen med bunden i vejret på absorberende papir for at forhindre udtørring. Det er vigtigt at fjerne alt vaskeopløsning fuldstændigt efter den sidste vask. 12. Tilsæt 50 µl fortyndet Conjugate (fremstillet på et tidligere trin) til alle brønde, UNDTAGEN til de brønde, der er beregnet til at være BLANKE. 13. Dæk testbrøndene med et pladelåg, og inkubér i minutter i et 37 C vandbad. Hvis en inkubator anvendes i stedet for, skal tiden forlænges med 10 minutter. 14. Opløs PNPP Substrate ved at tilsætte 0.5 ml deioniseret eller destilleret vand til flasken. Sæt proppen i igen, og bland grundigt. Beskyt mod lys indtil brug. 15. Fortynd PNPP i forholdet 1 til 100 i Substrate Buffer. Strips 2 2 x x 8 PN 40 µl 120 µl SB 4,0 ml 12,0 ml Bland grundigt. Beskyt mod lys indtil brug. 16. VASKETRIN a) Apirér indholdet fra hver brønd, eller hæld det fra, og dup den tør med absorberende papir. b) Tilsæt 300 µl fortyndet vaskeopløsning. c) Aspirér, eller hæld fra. d) Gentag trin b + c for i alt 3 eller 4 gange vask. e) Hæld energisk fra for at fjerne alt overskydende vaskeopløsning. Læg pladen med bunden i vejret på absorberende papir for at forhindre udtørring. Fortsæt omgående med de næste tre trin. 17. Tilsæt 100 µl fortyndet PNPP-opløsning til alle brønde, UNDTAGEN til de brønde, der er beregnet til at være BLANKE. 18. Lad testbrøndene stå i mørke i 30 minutter ved STUETEMPERATUR (22-25 C). Inkubationstid og -temperatur efter tilsætning af PNPP er kritisk. Ændr IKKE på den fastsatte inkubationstid eller -temperatur. For ensartethed skal tidtagningen startes straks efter tilsætning af reagens til den første brønd. 19. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 µl Stopping Solution til hver brønd i den samme rækkefølge, som substratet blev tilsat. Tilsæt 200 µl Stopping Solution til de blanke brønde. 20. Aflæs absorptionen (OD) for hver brønd ved 405 eller 410 nm ved hjælp af et referencefilter på 490 nm. Hvis resultaterne ikke kan aflæses straks, så sæt brøndene tilbage i mørket i op til 30 minutter. 21. Træk de værdier, der er opnået for de blanke brønde fra værdierne i alle brønde med prøve og kontrol. Mange instrumenter til aflæsning af ELISA-analyser er programmeret til at udføre dette trin automatisk. 22. Notér resultaterne på resultatskemaet. KVALITETSKONTROL Kvalitetskontrol af PAK12-analysen er integreret i testsystemet, idet Positive og Negative Serum Controls medtages. Disse kontroller bør medtages ved alle analyseringer for at hjælpe med at afgøre, om der forekommer tekniske fejl eller reagensfejl. Pak12 assay IFUDA REV F

6 Kriterier for en gyldig analyse: Negative Control (IIb/IIIa rækker) Gennemsnitlig OD 0,175 1,000 Positive Control OD-resultater, som er opnået for prøver med dobbeltbestemmelse, skal ligge i området mellem 20 % over og under gennemsnittet af de to værdier. For prøver med resultater uden for dette område skal analysen gentages. Dårlige resultater ved dobbeltbestemmelse kan være resultat af udeladelse af prøve eller reagens, ujævn tilsætning af reagenser, ujævn temperatur under inkubation, lys under den sidste inkubation eller krydskontaminering mellem brøndene. Hvis man ikke udfører dobbeltbestemmelse, kan det medføre, at fejlagtige resultater godkendes. FORTOLKNING AF RESULTATER Testresultater, der viser OD-værdier på 2X den værdi, der blev opnået som gennemsnit for de negative kontroller af det tilsvarende glykoprotein (2 negative kontrolværdier for hvert glykoprotein), eller større, anses som positive resultater. BEGRÆNSNINGER Fejlagtige resultater kan skyldes bakteriel kontaminering af testmaterialer, utilstrækkelig inkubationstid, utilstrækkelig vask eller tømning af testbrønde, substratet udsat for lys, udeladelse af testreagenser, højere eller lavere temperatur end foreskrevet eller udeladelse af trin. Tilstedeværelsen af immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i patientprøven kan forårsage en forøget nonspecifik binding og kan give falsk positive resultater med denne denne analyse. Testresultater, der ikke passer ind i et mønster for specificiteten af alloantistof anses for inkonklusive. Resultater af denne analyse bør ikke anvendes som eneste grundlag for en klinisk beslutning. Nogle antistoffer med lav titer og lav aviditet vil muligvis ikke blive påvist med denne analyse. Antistoffer mod trombocytspecifikke antigener, som ikke findes på resultatskemaet, vil muligvis ikke blive påvist. Tilstedeværelsen af andre trombocytspecifikke antigener på GPIIb/IIIa, såsom HPA-4b (Pen b ), HPA-6a (Ca b ), HPA-6b (Ca a ), HPA-7a (Mo b ), HPA-7b (Mo a ), HPA-8a (SR b ) og HPA-8b (Sr a ), er ikke blevet bestemt for de trombocytter, der er bundet i brøndene coatet med GPIIb/IIIa. Det er muligt, at alloantistoffer til antigener i disse systemer kan være reaktive med denne analyse. Antistoffer mod HLA klasse I-antigener med lav incidens vil muligvis ikke blive påvist med dette produkt. Nogle ikke-cytotoksiske HLA-antistoffer vil muligvis blive påvist med denne teknik, som ikke reagerer med den lymfocytotoksiske analyse (LCA). SPECIFIKKE KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNEN Når dette produkt opbevares og anvendes korrekt i henhold til ovenstående procedurer, kan det påvise antistoffer mod HLA klasse I- antigener og mod trombocytspecifikke antigener identificeret på resultatskemaet. For at sikre passende reaktivitet og specificitet er hvert lot Pak12 testet før frigivelse med prøver, man ved indeholder antistoffer, som er reaktive med de glykoproteiner, der er identificeret på vedlagte resultatskema samt med prøver, man ved er fri for disse antistoffer. Ydeevneevaluering PAK12- analysen Komparativ metode Positiv Negativ I alt Positiv Negativ 13* I alt Overensstemmelse: 95,3 % Samstemmende positiv: 88,2% Samstemmende negativ: 98,2% Komparativ metode: RPHA Reverse Passive Hemagglutination Assay * Da den komparative metode benytter hele, intakte trombocytter som target for antistofpåvisningen, kan den give positive resultater med et hvilket som helst antigen, som er udtrykt på trombocytterne. 10 Targets for antistofpåvisningen i Pak12-analysen er de individuelle glykoproteiner, og denne analyse vil således ikke påvise kuldeagglutininer eller antistoffer mod erytrocytantigener, som f.eks. Lewis. Pak12 assay IFUDA REV F

7 BIBLIOGRAFI 1. Kunicki TJ, Aster RH. Isolation and immunologic characterization of the human platelet isoantigen Pl(A1). Mol Immunol 1979; 16: Van der Schoot, et al. Characterization of platelet-specific alloantigens by Immunoblotting: localization of Zw and Bak antigens. Brit. J. Haemat. 1986; 64: Kuijpers, R. W. A. M. et al. Localization of the platelet-specific Ko-system antigen Ko a /Ko b in GP Ib/IX. Blood 1989; 74: Suppl. I, 226a. 4. Kieffer, N. et al. Immunochemical characterization of the platelet-specific alloantigen Lek a, a comparative study with the Pl A1 alloantigen. Blood 1984; 64: Furihata, K. et al. On the association of platelet-specific alloantigen with glycoprotein IIIa. J. Clin. Invest. 1987; 80: Kiefel, V. et al. The Br(a)/Br(b) alloantigen systems on platelets. 1989; Blood 73: Howard JE, Perkins HA. The natural history of alloimmunization to platelets. Transfusion 1978; 18: Dutcher JP, Schiffer CA, Aisner J, Wiernik PH. Alloimmunization following platelet transfusion: the absence of a dose-response relationship. Blood 1981; 57: Schiffer CA. Clinical importance of antiplatelet antibody testing for the blood bank. I: A seminar on antigens on blood cells and body fluids. Washington DC: American Association of Blood Banks, 1980; Garratty G. Review: Platelet immunology similarities and differences with red cell immunology, Immunohematology 11 No 4: Immucor GTI Diagnostics, Inc Crossroads Circle Waukesha, WI USA EC REP Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark Germany Kontaktoplysninger, USA og internationalt: Teknisk support: waukeshatechsupport@immucor.com Immucor GTI Diagnostics, Inc IFUDA Rev F Warning Danger H302 H318 H412 EUH032 P264 P270 P273 P280 P301 + P312 P305 + P351 + P338 P310 P330 Advarsel Fare Farlig ved indtagelse. Forårsager alvorlig øjenskade. Skadelig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre. Vask hænder grundigt efter brug. Der må ikke spises, drikkes eller ryges under brugen af dette produkt. Undgå udledning til miljøet. Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: I tilfælde af ubehag, ring til en GIFTINFORMATION/læge. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Ring omgående til en GIFTINFORMATION/læge. Skyl munden. Pak12 assay IFUDA REV F