PLATELIATM ASPERGILLUS

Transkript

1 PLATELIATM ASPERGILLUS Ag 96 TEST Platelia Aspergillus Ag er en immunenzymatisk mikrotiterplade-baseret sandwich-assay til påvisning af Aspergillus galactomannan antigen i serum og bronchoalveolær lavage (bal) væske. Indholdsfortegnelse 1. FORMÅL 2. INDIKATION VEDR. BRUG 3. RESUME OG FORKLARING 4. PROCEDURENS PRINCIP 5. REAGENSER 6- ADVARSLER FOR BRUGERE 7. FORHOLDSREGLER FOR BRUGERE 8. FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENS 9. INDSAMLING AF PRØVEMATERIALE 1. PROCEDURE 11. KVALITETSKONTROL (VALIDITETSKRITERIER) 12. FORTOLKNING AF RESULTATER 13. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 14. FORVENTEDE VÆRDIER 15. SPECIFIKKE KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE 16. LITTERATURLISTE 1

2 1- FORMÅL Platelia Aspergillus Ag er en immunenzymatisk mikrotiterplade-baseret sandwich-analyse til påvisning af Aspergillus galactomannan antigen hos voksne og børn i serumprøver og prøver fra bronchoalveolær lavage (BAL) væske. Platelia Aspergillus Ag er en test, som, når den bruges sammen med andre diagnostiske procedurer såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiologiske fund, kan bruges som en hjælp til diagnosticering af Invasiv Aspergillose. 2- INDIKATIONER VEDR. BRUG Platelia Aspergillus Ag er en immunenzymatisk mikrotiterplade-baseret sandwich-analyse til påvisning af Aspergillus galactomannan antigen hos voksne og børn i serumprøver og prøver fra bronchoalveolær lavage (BAL) væske. Platelia Aspergillus Ag er en test, som, når den bruges sammen med andre diagnostiske procedurer såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiologiske fund, kan bruges som en hjælp til diagnosticering af Invasiv Aspergillose. 3- RESUME OG FORKLARING Aspergillus infektioner starter som regel i lungerne, der er indgangsport efter indånding af Aspergillus sporer, som er tilstede i omgivelserne. Invasive former, som er blevet øget i løbet af de sidste 1 år, udgør de mest alvorlige infektioner. De opstår hovedsageligt hos neutropeniske patienter (efter behandling af kræft) og hos patienter behandlet med immunosuppressiva (organtransplantationer, især knoglemarvstransplantation) og kortikosteroider 1. Aspergillus isoleres sjældent fra blodkultur. Diagnosen er ofte baseret på non-specifikke diagnostiske eller radiologiske fund (kliniske symptomer, CT scanning, røntgenbilleder af brystkasse, etc.) Testen for opløseligt galactomannan antigen i serum viser sig at være en serologisk metode, som kan være en hjælp til diagnosticering af Invasiv Aspergillosis 9, 12, 24, 53, 61. For modtagere af solide organtransplantationer har påvisningen af galactomannan antigenet i bronchoalveolær lavage (BAL) desuden vist sig at være fordelagtig ved diagnosticering af invasiv aspergillosis i denne patientgruppe 8,17, PROCEDURENS PRINCIP 44 Platelia Aspergillus Ag er en et-trins immunenzymatisk mikrotiterplade-baseret sandwich-analyse som påviser galactomannan i humant serum og BAL-væske. Analysen bruger EBA-2 monoklonale antistoffer fra rotter, som er rettet mod Aspergillus galactomannan og er blevet karakteriseret i tidligere undersøgelser 26, 45. De monoklonale antistoffer bruges (1) til at coate mikrotiterpladens brønde og binde antigenet samt (2) til at påvise antigenet bundet til den sensibiliserede mikrotiterplade (konjugatreagens: peroxidase-bundne monoklonale antistoffer). Prøver fra serum eller BAL-væske varmebehandles ved tilstedeværelse af EDTA for at adskille immune komplekser og bundfælde proteiner, som muligvis kan interferere med testen 25. De behandlede prøver og konjugat tilføjes i brøndene coatet med monoklonale antistoffer og inkuberes. Der dannes et monoklonalt antistof - galactomannan - monoklonalt antistof / peroxidase kompleks ved tilstedeværelse af galactomannan antigen. Stripsene vaskes for at fjerne alt ubundet materiale. Dernæst tilføjes substratopløsningen, som vil reagere med komplekset bundet til brønden for at danne en blå farvereaktion. Enzymreaktionen standses ved tilsætning af syre, som ændrer den blå farve til en gul farve. Prøvernes og kontrollernes absorbans (optisk densitet) bestemmes med et spektrofotometer indstillet på en bølgelængde på 45 og 62/63 nm. 5- REAGENSER Platelia Aspergillus Ag: Produkt Nr (96 Test) Opbevar kittet ved 2-8 C. Bring alle reagenser til stuetemperatur (18-25 C) før brug. Køl alle reagenser til 2-8 C straks efter brug. Læg ubrugte strips/plader tilbage i posen og forsegl den igen. Fjern ikke tørremidlet. Efter fortynding kan arbejdsvaskeopløsningen opbevares i 14 dage ved 2-3 C. Alle reagenser bør bruges inden for 8 uger efter åbning. Reagenserne udleveres i tilstrækkelig mængde til at udføre 96 test i højst 9 batches. 2

3 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R9 R1 Komponent Indhold Mængde Microwell Strip Plate Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Conjugate Sample Treatment Solution Chromogen:TMB Solution Stopping Solution Mikrotiterplate: - 96 brønde (12 strips med hver 8 brønde) coatet med anti-galactomannen monoklonale antistoffer - Strip-etiketter mærket 85 Koncentreret vaskeopløsning (2X): - Tris NaCl buffer (ph 7,4) - 2% Tween 2 - Konserveringsmiddel: <1,5% ProClin TM 3 Negativt kontrolserum: - Humant negativt serum - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBsAg - Konserveringsmiddel: <1,5% ProClin TM 3 Cut-off kontrolserum: - Humant serum med galactomannan - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBsAg - Konserveringsmiddel: <1,5% ProClin TM 3 Positivt kontrolserum: - Humant serum med galactomannan - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBsAg - Konserveringsmiddel: <1,5% ProClin TM 3 Konjugat (klar til brug): - Anti-galactomannan monoklonalt antistof / peroxidase-mærket - Konserveringsmiddel: <1,5% ProClin TM 3 Prøvebehandlingsopløsning (klar til brug): - EDTA syreopløsning Kromogen TMB-opløsning (klar til brug): - 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (<,1%) - H 2 O 2 (<1, %) Stopopløsning (klar til brug): - 1 N svovlsyreopløsning (H 2 SO 4 ) 1 Plade / 12 x 8 Brønde 1 x 7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 1 x 8 ml 1 x 13 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Plate sealers - Selvklæbende folie til mikrotiterplader 1 x 8 folier Bemærk: TMB (3,3,5,5 -tetramethylbenzidin) er en non-carcinogenisk og non-mutagenisk kromogen til peroxidase. 6- ADVARSLER FOR BRUGERE 1. Til in vitro diagnosticering. 2. Kun til professionel brug. 3. Det anbefales ikke at bruge dette test kit til andre prøvematerialer end humant serum og BAL-væske. 4. Den positive kontrol, Cut-off kontrollen og den negative kontrol er fremstillet af humant serum, som er blevet testet og fundet non-reaktive over for HBsAg og antistoffer mod HIV-1, HIV-2 og HCV med CE-mærkede test. Alle reagenser bør dog håndteres, som om de var smittefarlige. Alle test bør køres i overensstemmelse med OSHA Standarden om blodbårne patogener, biosikkerhed niveau 2 eller andre passende biosikkerhedsprocedurer. 5. Bær beskyttelsestøj, inklusiv laboratoriekittel, øjen/ansigtsbeskyttelse og engangshandsker (det anbefales at bruge syntetiske handsker, der ikke er i latex) og håndtér kittets reagenser og patientprøverne iht. reglerne for God Laboratoriepraksis. Vask hænderne grundigt efter at have udført testen. 6. Må ikke mundpipetteres. 7. Ryg, drik eller spis ikke i lokaler, hvor der håndteres prøvematerialer eller reagenser. 8. Undgå overstænkninger med prøvemateriale eller opløsninger. 9. Spildte biologiske materialer, som ikke indeholder syre, skal tørres omhyggeligt op med et effektivt desinfektionsmiddel. Anvendelige desinfektionsmidler omfatter (men er ikke begrænset til) en opløsning med 1% klorvand (,5% natriumhypochlorit-opløsning), 7% ethanol eller,5% Wescodyne Plus. Det kan være nødvendigt at bortskaffe anvendte materialer til rengøring som biologisk farligt affald. ADVARSEL: Kom ikke opløsninger, som indeholder klorvand, i autoklaven. 1. Spildte opløsninger med syre bør absorberes (tørres op) på en passende måde eller neutraliseres med natriumbicarbonat, og området skal skylles og tørres grundigt; hvis de indeholder biologisk farligt materiale, skal området tørres af med et af de kemiske desinfektionsmidler. 11. Bortskaf alle prøver og anvendte materialer til at udføre testen, som om de var smittefarlige. Laboratoriekemikalier og biologisk farligt affald skal håndteres og bortskaffes iht. alle lokale, regionale og nationale forskrifter. 3

4 12. ADVARSEL: Følgende er en liste over potentielle kemiske farer i forbindelse med visse komponenter i kittet (se punkt 5- REAGENSER): Xi - Irriterende ADVARSEL: I henhold til EU's og USA's lovbestemte krav indeholder visse reagenser ProClin TM 3 < 1,5%. R43 : Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden S : Undgå indånding af dampe/aerosoltåger. Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker under arbejdet. Dette materiale og dets beholder skal bortskaffes som farligt affald. I henhold til USA's lovbestemte krav er 1,N svovlsyre (H 2 SO 4 ) stopopløsning stærkt irriterende eller korrosiv for huden og øjnene afhængig af længde og eksponeringens varighed; en længere eksponering kan medføre en beskadigelse af øjnene, inklusiv en permanent svækkelse af synet. I tilfælde af kontakt med øjnene, skyl øjeblikkeligt med rigelige mængder vand og rådspørg en læge. Må ikke komme i nærheden af baser og C-Ætsende reducerende stoffer; hæld ikke vand eller klorvand i denne komponent. Affald fra dette materiale anses for at være farligt syreholdigt affald; hvis det er tilladt af lokale, regionale, nationale og internationale forskrifter, er det dog muligt at neutralisere det til ph 6-8 for at bortskaffe det som ikke farligt affald, hvis personalet er trænet og udstyret til at gøre det. 13. Materialets sikkerhedsdatablad (MSDS) udleveres på forespørgsel. 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUGERE 1. FROSSEN SERUM ELLER BAL-VÆSKE PRØVER OPBEVARET UNDER UKENDTE FORHOLD KAN GIVE MISVISENDE POSITIVE RESULTATER PÅ GRUND AF KONTAMINATION MED SVAMPE OG/ELLER BAKTERIER. 2. Brug ikke kittet eller reagenserne i kittet efter den anførte udløbsdato. 3. Bland ikke reagenser fra forskellige kit, som har forskellige lot-numre, med undtagelse af Vaskeopløsning (R2, identificering*: 2x med grøn farve), Kromogen (R9, identificering*: TMB med turkis farve) og Stopopløsning (R1, identificering*:1n med rød farve), under forudsætning af, at disse reagenser er fuldkommen ækvivalente og at det samme lot-nummer bruges til en bestemt testkørsel. *på hætteflaskens etiket BEMÆRK: Vaskeopløsningen (R2, identificeret* med grøn som 2x) må ikke blandes med vaskeopløsningen (R2 identificeret* med blå som 1X), som medfølger i Bio-Rad reagens-kittet. *på hætteflaskens etiket 4. Bring alle reagenser til stuetemperatur i mindst 3 minutter før brug. 5. Bland grundigt alle reagenser før brug. 6. Bland grundigt den koncentrerede vaskeopløsning (R2), før arbejdsvaskeopløsningen forberedes og vær omhyggelig med at undgå mikrobiel kontamination. 7. Kør ikke testen, hvis der findes reaktive dampe (syrer, alkalier, aldehyder) eller støv, som kan have indflydelse på konjugatets enzymatiske aktivitet. 8. Brug særskilte pipettespidser til manuel pipettering af kontroller og prøvematerialer for at undgå overføring af prøver. 9. Overhold det anbefalede antal vaskecykler og sørg for at alle brønde fyldes helt op og dernæst tømmes helt for at sikre en passende vask af brøndene. Vask bør ikke foretages manuelt. 1. Lad ikke mikrotiterpladen tørre mellem slutningen af vaskecyklussen og tilføjelsen af reagens. 11. Brug ikke den samme beholder til konjugat- og substratopløsninger. 12. Lad ikke konjugat- eller kromogen TMB opløsninger komme i kontakt med metal eller metalioner. 13. Undgå at udsætte kromogen TMB opløsningen for stærkt lys under opbevaring eller inkubation. Lad ikke kromogenopløsningerne komme i kontakt med et oxiderende stof. 14. Undgå, at stopopløsningen kommer i kontakt med et oxiderende stof. Lad ikke stopopløsningen komme i kontakt med metal eller metalioner. 15. Brug rene, støvfrie materialer (rør, spidser, beholdere, etc.) for at reducere muligheden for kontamination med Aspergillus sporer fra omgivelserne. Da galactomannan er varmestabil, udelukker en sterilisation af det anvendte materiale ikke et kontaminerende antigen. Pyrogenfrie materialer er optimale, men standard materialer kan bruges med passende forholdsregler. 16. Sørg for at opløsningerne (sera, BAL-væske, prøvebehandlingsopløsning, konjugat) eller åbne beholdere (plader, rør, pipetter) udsættes mindst muligt for luft. 17. Hæld aldrig ubrugt konjugat tilbage i den oprindelige beholder. 18. Den kromogene TMB opløsning skal være farveløs. Fremkomsten af en blå farve efter fortynding angiver, at reagenset er kontamineret og det må ikke bruges. Bortskaf det og forbered et nyt reagens. 8- FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENS Mikrotiterplade-strips med brønde (R1) Hver ramme med 12 strips er pakket ind i en pose. Klip posen op med en saks lige under sammenføjningen. Åbn posen og tag rammen ud. Læg rammen med ubrugte strips tilbage i den oprindelige pose. Forsegl posen omhyggeligt igen og opbevar den ved +2-8 C. Efter åbning af den vakuumpakkede pose er strips stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C i den omhyggeligt forseglede, oprindelige pose. Kontrollér, om der stadig er tørremiddel i posen. 4

5 Vaskeopløsning (R2) Forbered arbejdsvaskeopløsningen efter behov ved at tilføje en del koncentreret vaskeopløsning (R2) til 19 dele deioniseret eller destilleret vand. Arbejdsvaskeopløsningen kan opbevares i 14 dage ved 2-3 C. Forbered en tilstrækkelig mængde arbejdsvaskeopløsning til at gennemføre kørslen (8 ml til en strip: 4 ml R ml destilleret vand). Efter åbning er den koncentrerede vaskeopløsning stabil indtil udløbsdatoen anført på etiketten, når den opbevares ved +2-3 o C beskyttet mod kontamination. Negativt kontrolserum (R3), cut-off kontrolserum (R4) og positivt kontrolserum (R5) Kontrollerne skal varmebehandles med EDTA syreopløsning (R7) ligesom patientprøverne, så de også kan være en kontrol for behandlingen. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C beskyttet mod kontamination. Konjugat (R6), prøvebehandlingsopløsning (R7), kromogen: TMB opløsning (R9) Disse reagenser er klar til brug. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C og ikke er blevet kontamineret. Stopreaktion (R1) Dette reagens er klar til brug. Efter åbning er dette reagens stabilt indtil udløbsdatoen anført på etiketten, når det opbevares ved +2-8 C og ikke er blevet kontamineret. 9- INDSAMLING AF PRØVEMATERIALE Denne test udføres på serum eller BAL-væske. I. SERUM Indsaml blodprøver i henhold til laboratoriets gængse procedurer. Serumprøver må ikke være kontamineret med svampesporer og/eller bakterier. Transportér og opbevar prøver i forseglede rør, beskyttet mod luft. Uåbnede prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 5 dage før testning. Efter den oprindelige åbning kan prøverne opbevares ved 2-8 C i 48 timer før testning. I tilfælde af en længere opbevaring skal serumet fryses ned til -7 C. Serumprøver kan gennemgå højst 4 fryse / optøningscykler. Prøver, der har været nedfrosset, skal blandes grundigt efter optøning, før de testes. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, som indeholder 2 mg/l bilirubin, lipæmiske prøver som indeholder ækvivalenten til 2 g/l triolein (triglycerid) eller hæmolyserede prøver som indeholder 165 mg/l hæmoglobin. Interaktioner forbundet med forhøjet albumin er ikke blevet testet. Denaturér ikke serumproteinerne. II. BAL-VÆSKE Indsaml prøver fra BAL-væske i henhold til laboratoriets gængse procedurer. Prøver fra BAL-væsker skal indsamles i steril saltopløsning og kan testes på rene prøver (som de er) eller supernatanter fra centrifugerede prøver (1. rpm i 1 min.), før prøven behandles i henhold til Punkt 1. Prøver fra BAL-væske må ikke være kontamineret med svampesporer og/eller bakterier. Transportér og opbevar prøver i forseglede rør, beskyttet mod luft. Efter den oprindelige åbning kan prøverne opbevares ved 2-8 o C i op til 24 timer. I tilfælde af en længere opbevaring kan BAL prøverne fryses (-2 C eller derunder) i op til 5 mdr. BAL prøver kan gennemgå højst 4 fryse / optøningscykler. Prøver, der har været nedfrosset, skal blandes grundigt efter optøning, før de testes. 1- PROCEDURE Medfølgende materialer Se punktet REAGENSER. Nødvendige materialer som ikke medfølger 1. Destilleret eller deioniseret vand til fortynding af koncentreret vaskeopløsning. 2. Absorberende papir. 3. Engangshandsker. 4. Beskyttelsesbriller. 5. Natriumhypochlorit (klorvand) og natriumbicarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, justerbare eller faste, til at afmåle og fordele 5 µl, 1 µl, 3 µl og 1 µl. 7. 1,5 ml mikrocentrifugerør i polypropylen med lufttætte propper, som kan tåle opvarmning til 12 C (varmeblok) eller 1 C (kogende vandbad). - Skruehætter og rør: 1,5 ml koniske rør, Bio-Rad Cat. # eller lignende. ELLER - Rør med snaphætte: EZ Mikrotestrør, 1,5 ml, Bio-Rad Cat. # eller lignende. - Hættelås til mikrorør (i USA: Fischer Scientific Cat. # NC ) eller lignende, udenfor USA: VWR Cat. # 6541 eller lignende). Disse låse forsegler rør med snaphætter og forhindrer således, at hætterne åbner sig under temperatur- og trykændringer og gør det ligeledes let at løfte rørene ud af varmeblokken eller det kogende vandbad. 8. Laboratoriecentrifuge til 1,5 ml rør i polypropylen, som kan nå op på 1.g (Brinkman Cat. # eller VWR Scientific Cat. # eller lignende). 5

6 9. Hvis der bruges varmeblok til behandling af sera/bal-væske: - Varmeblok. Følgende varmeblokmodeller anbefales: - Model med enkelt blok: Grant Cat. # QBD-1L - udenfor USA: Grant Cat. # QBD1 distribueret af VWR under Cat. # 46-74) - Model med to blokke: Grant Cat. # QBD-2L udenfor USA: Grant Cat. # QBD2 distribueret af VWR under Cat. # 46-76) - Blok til varmeblokke: begge varmeblokke (QBD-1 L, QBD1 og QBD-2L, QBD2) skal bruges sammen med Grant blok Cat. # QB-E1 distribueret udenfor USA af VWR under Cat. # Hvis der bruges kogende vandbad behandling af sera/bal-væsker: - Rund, flydende mikrocentrifuge-stativ til et 1 L kar (i USA: VWR Scientific Cat. # eller Nalgene Cat # eller lignende). - Kogende vandbad ved 1 C. 1. Vortex-blander 11. Inkubator til mikrotiterplade ved 37 ± 1 C. 12. Semiautomatisk eller automatisk mikrotiterplade-vasker. 13. Mikrotiterplade-aflæser udstyret med 45 nm og 62/63 nm filtre. Kommentarer vedrørende proceduren Negative, Positive og Cut-off Kontroller skal testes på alle kørsler for at godkende testresultaterne. Behandling af sera/bal-væsker Alle kontrolsera: negative (R3), cut-off (R4) og positive (R5) skal behandles samtidig med prøver fra serum/bal-væske: 1. Pipettér 3 µl af hver enkelt test-serum/bal-væske og kontrol over i individuelle 1,5 ml rør i polypropylen. 2. Tilsæt 1 µl prøvebehandlingsopløsning (R7) i hvert rør. 3. Bland rørene grundigt ved at omryste dem eller brug en Vortex-blander il det. Luk rørene tæt for at forhindre, at de åbner sig under opvarmning, 4. Valg af varmeblok: Varm rørene op i 6 minuttes i en varmeblok ved 12 C. Rørene må ikke sættes ind i varmeblokken, før den foreskrevne temperatur er nået (*). ELLER Valg af vandbad: Hvis der bruges kogende vandbad: varm rørene op i 3 minutter ved 1 C (*).Rørene må ikke placeres i vandbadet, før den foreskrevne temperatur er nået. 5. Tag forsigtigt de varme rør ud af varmeblokken eller det kogende vandbad og sæt dem ned i en centrifuge. Centrifugér rørene ved 1. x g i 1 minutter. Supernatanten bruges til påvisning af galactomannan antigenet. 6. Test supernatanterne ved hjælp af følgende procedure. Efter forberedelse kan supernatanten tages ud og opbevares ved 2-8 C i op til 48 timer før testning. Hvis det fremgår af analysen af resultaterne, at en ny test er nødvendig, skal en anden alikvot af prøven behandles til testning. (*) En streng overholdelse af den foreskrevne temperatur og den foreskrevne gennemløbstid såvel som brug af anbefalede materialer er væsentlig for at opnå en vellykket test. Stol ikke på den temperatur, som apparaterne viser, men kontrollér venligst, at temperaturen stemmer overens med specifikationerne ved hjælp af et kalibreret termometer, som sættes ned i et rør med mineralsk olie: Der skal opnås en temperatur på 12 C i en varmeblok og 1 C i et kogende vandbad. EIA Procedure Overhold den foreslåede protokol meget nøje. Overhold reglerne for God Laboratoriepraksis. 1. Bring alle reagenser til stuetemperatur ( C) i mindst 3 minutter før brug. 2. Forbered arbejdsvaskeopløsningen. 3. Forbered et diagram til identificering af prøver fra sera/bal-væsker og kontroller på mikrotiterpladen. Brug en brønd til negativ kontrolserum (R3), to brønde til cut-off kontrolserum (R4) og en brønd til positiv kontrolserum (R5) A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S1 G S3 S11 H S4 S12 4. Tag pladeholder og strips med mikrobrønde (R1) ud af posen. Læg alle de strips, der ikke skal bruges, tilbage i posen med tørremidlet og forsegl posen. 5. Bland indholdet i konjugatflasken (R6) ved at vende den op og ned før brug. Tilsæt 5 µl konjugat (R6) i hver brønd. Tilsæt dernæst 5 µl behandlet supernatant fra serum/bal i hver brønd som anført ovenfor. Tilsæt ikke serum/bal-væske i brøndene før konjugat. 6

7 6. Dæk pladen med et ark folie, eller et andet middel til at forebygge fordampning, og sørg for at hele overfladen er dækket og vandtæt. 7. Lad mikrotiterpladen inkubere i en tør mikrotiterplade-inkubator i 9 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Tag forseglingen af pladen. Sug indholdet i alle brønde op i en affaldsbeholder (som indeholder natriumhypochlorit). Vask pladen 5 gange med en mikrotiterplade-vasker (brug 8 µl af arbejdsvaskeopløsningen). Vend mikrotiterpladen om efter sidste vask og bank den let mod absorberende papir for at fjerne resterende væske. 9. Tilsæt hurtigt 2 µl kromogen TMB (R9) opløsning i alle brønde og undgå udsættelse for stærkt lys. 1. Lad mikrotiterpladen inkubere i mørke ved stuetemperatur ( C) i 3 ± 5 minutter. Brug ikke selvklæbende folie under denne inkubation. 11. Tilsæt 1 µl stopopløsning (R1) i alle brønde, idet der bruges samme rækkefølge som for tilsætning af kromogen TMB opløsning. Bland godt. 12. Tør bunden af hver plade godt af. 13. Aflæs hver brønds optiske densitet ved 45 nm (62/63 nm referencefilter). Mikrotiterpladerne skal aflæses inden for 3 minutter efter tilsætning af stopopløsning. 11- KVALITETSKONTROL (VALIDITETSKRITERIER) Cut-off kontrol: O.D. for hvert cut-off kontrolserum skal være,3 og,8. Positiv kontrol: Indekstallet for positivt kontrolserum skal være større end 1,5. OD for Positiv kontrol (R5) I = > 1.5 Middel OD for cut-off kontrol Negativ kontrol: Indekstallet for negativt kontrolserum skal være større end,4. OD for Negativ kontrol (R3) I = <.4 Middel OD for cut-off kontrol Hvis ingen af kontrollerne lever op til validitetkriterierne beskrevet ovenfor, er analysen ugyldigt og resultaterne for patientprøven kan ikke rapporteres. Operatøren kan beslutte at gentage analysen efter ny gennemgang af proceduren eller kontakte fabrikanten for at få assistance. Hvis analysen gentages, skal der bruges en ny alikvot af samme prøve i det gentagne analyse. Eksempel på beregning: Prøve Absorbans (OD) OD for Negativ kontrol (R3).116 OD for cut-off kontrol (R4) OD for positiv kontrol (R5) Beregninger Middel cut-off kontrolværdi Middel OD for cut-off kontrol (R4) beregnes ved at lægge OD værdierne for hver cut-off kontrol replikat sammen og dividere resultatet med 2: ( ) 2 =.523 Negativt kontrol-indekstal Det negative kontrol-indekstal beregnes ved at dividere OD for den negative kontrol med middel OD for cut-off kontrol:.116 I = = Positivt kontrol-indekstal Det positive kontrol-indekstal beregnes ved at dividere OD for den positive kontrol med middel OD for cut-off kontrol: I = = Validitet I ovenstående eksempel: Hver OD for cut-off kontrol er,3 og,8, hvilket angiver, at cut-off kontrollen er gyldig. Det negative kontrol-indekstal er <,4, hvilket angiver, at den negative kontrol er gyldig. Det positive kontrol-indekstal er > 1,5, hvilket angiver, at den positive kontrol er gyldig. Den kørte test i dette eksempel anses for at være gyldig, eftersom resultaterne lever op til validitetskriterierne for hver kontrol. 7

8 12- FORTOLKNING AF RESULTATER Tilstedeværelsen eller fraværet af galactomannan antigen i testprøven bestemmes ved beregning af et indekstal for hver patientprøve. Indekstallet (I) er prøvens OD værdi divideret med middel optisk densitet for de brønde, som indeholder cut-off kontrolserum. Beregning af middel optisk densitet for cut-off kontrol: Læg den optiske densitet for de to brønde med cut-off kontrolserum (R4) sammen og divider summen med 2. Beregning af et indekstal (I) for hver testprøve: Beregn følgende forhold for hver testprøve: OD for prøve I = Middel OD for cut-off kontrol Fortolkning af sera/bal-væsker med et indekstal <,5: Sera/BAL-væsker med et indekstal <,5 anses for at være negative for galactomannan antigen. Bemærk: Et negativt resultat kan angive, at patientens resultat ligger under analysens detektionsniveau. Negative resultater udelukker ikke en diagnose af Invasiv Aspergillosis. Det anbefales at gentage testen, hvis resultatet er negativt, men sygdommen mistænkes. Fortolkning af sera/bal-væsker med et indekstal,5 Sera /BAL-væsker med et indekdstal,5 anses for at være positive for galactomannan antigen. Det anbefales for alle positive patienter, at gentage en ny alikvot af samme prøve (serum/bal). Bemærk: En absorbansværdi på mindre end, kan angive en procedurefejl eller en fejl ved et instrument, som bør evalueres. Resultatet er ugyldigt og prøven skal køres igen. Det anbefales at foretage en regelmæssig screening (to gange om ugen) af serumprøver fra højrisiko patienter for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig positivitet for testen. Bemærk: Platelia Aspergillus Ag er beregnet til at blive brugt som en hjælp til at diagnosticere Invasiv Aspergillosis. Positive resultater opnået med Platelia Aspergillus Ag bør tages i betragtning sammen med andre diagnostiske procedurer såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiologiske fund. Eksempel på beregning: Prøve Absorbans (OD) OD for Negativ kontrol (R3).116 OD for cut-off kontrol (R4) OD for positiv kontrol (R5) Patientprøve #1.134 Patientprøve #2.436 Patientprøve # Beregninger Se punktet Kvalitetskontrol (Validitetskriterier) for at få et eksempel på beregninger til at bestemme analyse-kontrollerne validitet. Middel cut-off kontrolværdi Middel OD for cut-off kontrol (R4) beregnes ved at lægge OD værdierne for hver cut-off kontrol replikat sammen og dividere resultatet med 2: ( ) 2 =.523 Patientprøve #1 Indekstallet for patientprøve #1 beregnes ved at dividere OD for patientprøve #1 med middel OD for cut-off kontrol:.134 I = = I dette eksempel er patientprøve #1 negativ, eftersom indekstallet,26 er <,5. Patientprøve #2 Indekstallet for patientprøve #2 beregnes ved at dividere OD for patientprøve #2 med middel OD for cut-off kontrol:.436 I = = I dette eksempel er patientprøve #2 positiv, eftersom indekstallet,83 er,5. 8

9 Patientprøve #3 Indekstallet for patientprøve #3 beregnes ved at dividere OD for patientprøve #3 med middel OD for cut-off kontrol: I = = I dette eksempel er patientprøve #3 positiv, eftersom indekstallet 2,29 er,5. Se Fortolkning af positive resultater i punkt PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. En negativ test fra serum og/eller BAL-prøve kan ikke udelukke en diagnose af Invasiv Aspergillosis. Serumprøver fra patienter med risiko for Invasiv Aspergillosis bør testes to gange om ugen. 2. Platelia Aspergillus Ag proceduren samt fortolkningen af resultaterne skal følges, når der testes prøver for tilstedeværelse af galactomannan antigen. Vi tilråder kittets bruger at læse indlægssedlen omhyggeligt før kørsel af testen. Det er især vigtigt at følge testproceduren, hvad angår pipettering af reagenser, vask af plade og tidtagning af inkubationstrin. 3. Hvis prøver eller reagenser ikke tilsættes som anført i proceduren, kan det resultere i en falsk negativ test. Man bør overveje at teste ekstra prøver, hvis der findes klinisk mistanke om Invasiv Aspergillosis eller en procedurefejl. 4. Brønde med negative patientprøver kan blive kontamineret af brønde med positive kontrol/patientprøver, hvis indholdet i en brønd bliver spildt over i en anden brønd på grund af en uforsigtig håndtering af mikrotiterpladen eller en dårlig pipetteringsteknik under tilføjelse af reagenser. 5. Ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag er ikke blevet evalueret med neonatale prøver. Der er en højere incidens af antallet af falske positive galactomannan resultater rapporteret i den europæiske litteratur vedrørende prøver fra neonatale patienter 13, 15, 33, Platelia Aspergillus Ag kan udvise en reduceret påvisning af galactomannan hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom (CGD) og Jobs syndrom 56, Samtidig brug af en skimmelaktiv svampebehandling hos nogle patienter med Invasiv Aspergillosis kan resultere i en nedsat sensitivitet med Platelia Aspergillus Ag Platelia Aspergillus Ag er ikke blevet evalueret for brug med plasma eller andre typer prøvemateriale såsom urin eller CSF. 9. Ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag er ikke blevet fastlagt for manuel aflæsning og/eller visuel bestemmelse af resultat. 1. Andre svampearter såsom Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum og Histoplasma har vist reaktivitet med EBA-2 monoklonale antistoffer fra rotter, som bruges i analysen til påvisning afaspergillus galactomannan. Histoplasmose bør tages i betragtning i endemiske områder inklusiv i dele af USA 35, 49, BAL-væskers krydsreaktion med Mycoplasma pneumoniae eller anæstesimidler/smøremidler anvendt til at gøre hals/svælg området følelsesløst under sugningen er ikke blevet evalueret. 12. Positive reaktioner uden kliniske tegn: Man bør tage følgende i betragtning vedrørende tidlig påvisning af galactomannan antigen i serum eller BAL før fremkomsten af kliniske og/eller radiologiske tegn. Positive testresultater uden kliniske tegn observeres ret ofte og det er blevet påvist, at de svarer til "sande positive" test hos patienter for hvem en påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis diagnose bliver stillet senere. I visse særtilfælde bør man dog tage hensyn til specifikke faktorer under tolkning af testen: a. Der er blevet rapporteret om positive testresultater uden kliniske tegn, især hos små børn 43. Skønt nogle af disse tilfælde kunne forbindes med en reel cirkulation af Aspergillus antigener, kunne de fleste tilfælde dog anses for at være falsk positive 7. b. Galactofuranose er blevet påvist i forskellige fødevarer, især kornsorter, kornprodukter og cremedesserter 1, 27. I modsætning til humant mælk indeholder humaniseret mælk ofte høje koncentrationer af galactomannan 13. Man skal derfor tage hensyn til kostfaktorer under fortolkning af forløbet af antigenæmi hos små børn og mere generelt hos alle patienter med en ændret intestinal barriere 6, 13. Ethvert tilfælde af positiv antigenæmi, som ikke ledsages af kliniske tegn, bør tolkes endnu mere forsigtigt i denne patientgruppe. c. Der er blevet rapporteret om positive galactomannan testresultater hos patienter, som havde modtaget piperacillin/tazobactam. Der er også blevet rapporteret om visse partier eller batches af piperacillin/ tazobactam, som var fundet positive for galactomannan antigen. Derfor bør positive testresultater hos patienter, som modtager piperacillin / tazobactam tolkes forsigtigt og bekræftes med andre diagnostiske metoder. Der er også blevet rapporteret om påvisning af galactomannan i nogle amoxicillin batches i forbindelse med parenterale præparater med clavulansyre. Derfor bør der tages hensyn til semi-syntetisk ß-lactam behandlinger under fortolkning af testen 1, 3, 31. Da Platelia AspergillusAg kan påvise galactomannan antigen længe før, der opstår kliniske eller radiologiske tegn, kan forekomsten af Invasiv Aspergillosis dog ikke udelukkes. Derfor bør patienter behandlet med piperacillin/tazobactam og med positive testresultater følges omhyggeligt. d. Positive reaktioner uden kliniske tegn kan observeres hos patienter, der modtager produkter, som indeholder galactomannan enten parenteralt eller peroralt (i tilfælde af en ændring af den intestinale barriere). Tilstedeværelsen af galactomannan i disse produkter kan ofte forklares ved brugen af en gæringsproces baseret på svampemikroorganismer. Der vil dog ikke blive observeret et positivt resultat hos en patient, med mindre serumkoncentrationen af eksogen galactomannan når op på eller overskrider testens detektionstærskel. Hvis der findes et mistænkeligt positivt resultat uden andre kliniske tegn, anbefaler vi således at undersøge de produkter, som patienten modtager og navnlig deres produktionsproces og de anvendte råmaterialers oprindelse 14, 4, 48. 9

10 13. Der er blevet rapporteret om positive reaktioner for galactomannan i serum og bronchoalveolær skyllevæske i forbindelse med PLASMA-LYTE i flere undersøgelser 14, 4. Man bør derfor tage hensyn til administration af PLASMA-LYTE under fortolkning af resultaterne for denne test. 14. Resultatet af Platelia Aspergillus Ag i Bronchoalveolær Lavage (BAL) væsker fra non immunkompromitterede patienter bør tolkes forsigtigt Resultater tæt ved cut-off indekstallet (,5) bør tolkes forsigtigt og underbygges af andre kliniske eller radiologiske tegn eller laboratoriefund for invasiv aspergillosis, eftersom gråzonen hører med til fortolkningen af analysens resultat. 16. Desuden har resultater for Platelia Aspergillus Ag i Bronchoalveolær Lavage (BAL) væsker med et indekstal mellem,5-1, en lavere forudsigelig værdi end BAL prøveresultater med et indekstal på > 1,, følgelig bør resultater med et indekstal mellem,5-1, gennemgås og underbygges af andre kliniske eller radiologiske fund eller laboratoriefund for invasive aspergillosis. 14- FORVENTEDE VÆRDIER I. SERUM Den forventede prævalens af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patientgruppen; der er blevet rapporteret om rater fra 5-2% 1, 16. Følgende resultater er blevet indhentet fra kliniske undersøgelser med pædiatriske (alder 21 år) patienter i USA og voksne patienter i Nordamerika. A- Pædiatriske patienter En klinisk undersøgelse er blevet kørt på i alt 1954 serumprøver fra 129 immunkompromitterede pædiatriske (Alder 21 år) patienter med en høj risiko for Invasiv Aspergillosis (IA) og patienter diagnosticeret med påvist og sandsynlig Invasiv Aspergillosis i tre testcentre i USA for at bestemme karakteristika for ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen af indekstallene for disse patientgrupper er vist i følgende diagrammer: Pædiatriske patienter diagnosticeret uden Invasiv Aspergillosis (kontrolgruppe) I alt 1625* pædiatriske serumprøver indsamlet fra 18 immunkompromitterede pædiatriske patienter i tre testcentre i USA er blevet testet for at bestemme karakteristika for ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen af indekstallene for prøverne er vist i følgende diagram: Figur 1 Number Antal of sera Sera Fordeling af indekstallet for serum fra Distribution of the Serum Index Value from the kontrolgruppen med pædiatriske patienter (N=1625) Pediatric Control Population (N=1625) Indekstal Index >1.5 8 *Bemærk: 8 prøver fra 4 kontrolpatienter med positive galactomannan antigenresultater, som faldt sammen med en piperacillin/tazobactam (Zosyn ) behandling, blev udelukket. 1

11 Pædiatriske patienter diagnosticeret med Invasiv Aspergillosis Punktkortet afbilder galactomannan analysens resultater for 249 serumprøver fra 17 patienter i denne undersøgelse diagnosticeret med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis som defineret af EORTC/NAID definitioner. alle serumprøver fra hver enkelt patient forventes at være positive. Den forventede prævalens af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patientgruppen; der er blevet rapporteret om rater fra 5-2% 1, 24. Denne undersøgelses prævalensrate var på 13.6%. Figur 2 Indekstal Index > Pædiatriske Pediatric Proven/ patienter Probable med Påvist Aspergillosis: Sandsynlig Distribution Aspergillosis of Fordeling af Index/ indekstal Pediatric Pædiatriske Patient (N=17) patienter (N=17) Patientnummer Number B. Voksne patienter En klinisk undersøgelse er blevet kørt på i alt 1724 serumprøver fra 172 patienter med knoglemarvstransplantation og leukæmi diagnosticeret med og uden Invasiv Aspergilloses i tre testcentre i Nordamerika for at bestemme karakteristika for ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen af indekstallene for disse patientgrupper er vist i følgende diagrammer. Voksne patienter diagnosticeret uden Invasiv Aspergillosis (kontrolgruppe) I alt 1262 serumprøver indsamlet fra 143 patienter med knoglemarvstransplantation og leukæmi i tre testcentre i Nordamerika er blevet testet med Platelia Aspergillus Ag testen. Fordelingen af indekstallene er vist i følgende diagram. Figur 3 Number Antal sera of Sera Fordeling Distribution af indekstallet of the Serum for serum Index Value fra from kontrolgruppen the Adult med Control voksne Population patienter (N=1262) Indekstal Index >1.5 11

12 Voksne patienter diagnosticeret med Invasiv Aspergillosis Punktkortet afbilder galactomannan analysens resultater for 462 serumprøver fra 29 patienter i denne undersøgelse diagnosticeret med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis som defineret af EORTC/NAID definitioner. alle serumprøver fra hver enkelt patient forventes at være positive. Den forventede prævalens af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patientgruppen; der er blevet rapporteret om rater fra 5-2% 1, 24. Denne undersøgelses prævalensrate var på 16,9%. Figur 4 Indekstal Index > Voksen Adult Proven/ patient Probable med Påvist Aspergillosis: Sandsynlig Aspergillosis Distribution Fordeling of af Index/ indekstal Adult Voksne Patient Patienter (N=29) (N=29) Patient Patientnummer Number Følgende grafiske afbildning viser eksempler på henholdsvis en patient uden kliniske tegn eller symptomer på Invasiv Aspergilloses (negativ for Aspergillus) og en patient med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis (positiv for Aspergillus). Figur 5 Negativ patient: Indekstal Index CONTROL Kontrolpatient PATIENT Days Dage Figur 6 Positiv patient: Indekstal Index PROVEN Patient INVASIVE med ASPERGILLOSIS påvist invasiv aspergillosis PATIENT Days Dage 12

13 II. BAL-VÆSKE To undersøgelser er blevet kørt på i alt 449 BAL-prøver fra 178 modtagere af solid organtransplantation (SOT) og lungetransplantation med og uden invasiv aspergillosis i USA for at bestemme karakteristika for ydeevnen af Platelia Aspergillus Ag med prøver af Bronchoalveolær Lavage væske. Ud af disse kom 43 BAL prøver fra 167 modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden invasiv aspergillosis. Derudover blev en retrospektiv analyse udført på BAL prøver fra 99 evaluérbare højrisiko hæmatologi patienter i et studie uden for USA, der omfattede 58 patienter med dokumenteret eller sandsynlig invasiv aspergillose. Forventede værdier for BAL-prøver fra både modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis er anført i tabellen nedenfor. Resultaterne er anført pr. prøve fra transplantationsmodtagere med og uden kolonisering af skimmelsvampe. Tabel 1 Forventede værdier pr. prøve Modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis N =43 BAL-væsker Diagnose N Positiv (%) Negativ (%) Kontroller uden kolonisering /341 (3.2%) 33/341 (96.8%) Kontroller med kolonisering 62 12/62 (19.4%) 5/62 (8.6%) Kontrol I alt 43 23/43 (5.7%) 38/43 (94.3%) Forventede værdier for BAL-prøver fra både modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis pr. type transplantation er anført i tabellen nedenfor. Tabel 2 Forventede værdier pr. prøve Modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis pr. type transplantation N =43 BAL-væsker Type transplantation N Positiv (%) Negativ (%) Hjerte 28 3/28 (1.7%) 25/28 (89.3%) Nyre 25 3/25 (12.%) 22/25 (88.%) Lever 23 1/23 (4.3%) 22/23 (95.7%) Lunge /327 (4.9%) 311/327 (95.1%) Kontrol I alt 43 23/43 (5.7%) 38/43 (94.3%) Forventede værdier blev også vurderet i ialt 41 BAL væskeprøver fra 41 hæmatologiske patienter uden invasiv aspergillose og er præsenteret i nedenstående tabel: Tabel 3 Forventede værdier pr.prøve Hæmatologiske patienter uden invasiv aspergillose N = 41 BAL Væsker Diagnose N Positiv (%) Negativ (%) kontroller 41 8/41 (19.5%) 33/41 (8.5%) 15- SPECIFIKKE KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE A- REPRODUCERBARHED a) Undersøgelser af reproducerbarhed med serum Variabiliteten af inter- og intraanalyse for Platelia Aspergillus Ag er blevet bestemt i en undersøgelse ved brug af et panel med 6 poolede serumprøver (en negativ, en lav positiv, to positive og to høje positive) fra tre kliniske forsøgscentre i Nordamerika. Hvert enkelt af de 6 panelmedlemmer blev testet i triplikat (x3) på 3 forskellige dage, på et parti og i to centre (samlet antal replikater i hvert center = 9). Hvert enkelt af de 6 panelmedlemmer blev testet i duplikat (x2) på 3 forskellige dage, på et parti og i et tredje center (samlet antal replikater i det tredje center = 6). En (1) operatør udførte hele testforløbet i hvert center. Dataene blev analyseret i henhold til Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (tidligere National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Middel optisk densitet (OD) og middel indekstal, standardafvigelse (SD), procent variationskoefficient (%CV), inden for samme kørsel (intra- analyse og inden for samme center (inter- analyse for hvert panelmedlem i hvert center er vist nedenfor i følgende tabeller. 13

14 Tabel 4 Center 1 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høj Pos#1 Høj pos #2 Neg kontrol CO Kontrol Pos kontrol OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal N Middel Inden for kørsel (intra-analyse) 1 SD %CV I alt (interanalyse) 2 SD %CV % 4.4% 8.4% 7.6% 4.7% 5.1% 4.2% 4.4% 3.1% 3.6% % 1.4% 1.% 11.6% 4.7% 15.7% 4.7% 14.3% 5.9% 11.9% % 3.4% % 2.8% 14.3% 3.3% Center 2 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høj Pos#1 Høj pos #2 Neg kontrol CO Kontrol Pos kontrol OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal N Middel Inden for kørsel (intra-analyse) 1 SD %CV I alt (interanalyse) 2 SD %CV % 13.% 6.4% 7.6% 7.5% 7.1% 5.7% 4.8% 3.5% 3.2% % 27.% 22.7% 19.8% 9.5% 18.7% 5.3% 26.5% 5.8% 29.2% % 1.1% %.9% 5.7% 18.2% Center 3 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høj Pos#1 Høj pos #2 Neg kontrol CO Kontrol Pos kontrol OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal N Middel Inden for kørsel (intraanalyse) 1 SD %CV I alt (interanalyse) 2 SD %CV % 2.4% 12.5% 12.2% 8.2% 8.2% 8.1% 8.2% 5.3% 5.1% N/A = ikke 1 NCCLS EP5-A, Vol. 19, Nr. 2, Side 24, Ligning (C2) 2 NCCLS EP5-A, Vol. 19, Nr. 2, Side 25, Ligning (C3) og Ligning (C4) 2.% 15.8% 1.5% 11.1% 12.5% 14.3% 7.1% 6.2% 4.7% 6.8% % 5.8% % 4.1% 3.4% 6.6% 14

15 b) Reproducerbarhed med BAL-væske Variabiliteten af inter- og intraanalyse for Platelia Aspergillus Ag er blevet bestemt i en undersøgelse ved brug af et panel med 4 poolede BAL-prøver tilsat renset galactomannan (en negativ, en høj negativ, en lav positiv og en medium positiv) i 3 testcentre (To kliniske testcentre i USA og et internt center). Hvert enkelt af de 4 panelmedlemmer og kontrollerne blev testet i duplikat (x2) i 2 kørsler pr. dag på 5 forskellige dage på et parti (samlet antal resultater i hvert center = 12). To (2) operatører udførte hele testforløbet i hvert center. Dataene blev analyseret i henhold til Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (tidligere National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Middel optisk densitet (OD) og middel indekstal, standardafvigelse (SD), procent variationskoefficient (%CV), inden for samme kørsel (intra-analyse og inden for samme center (inter-analyse for hvert panelmedlem i hvert center er vist nedenfor i følgende tabel: Tabel 5 Oversigt over centre tilsammen Lav Negativ Høj negativ Medium positiv Positiv kontrol Negativ kontrol Positiv (%) Oversigt N= 6 N=6 N=6 N=6 N=6 N=6 OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal OD Indekstal Middel Inden for kørsel (Intraanalyse SD %CV % 2.5% 9.3% 8.9% 5.% 5.% 7.% 7.1% I alt (Interanalyse SD %CV % 18.9% 16.2% 13.9% 12.2% 1.2% 12.% 11.8% B- KRYDSREAKTIONER En undersøgelse for at evaluere effekten af potentiel interferens af medicinske forhold, som ikke er forbundet med Invasiv Aspergillosis, er blevet kørt med Platelia AspergillusAg kittet. Følgende serumprøver blev testet for krydsreaktioner med Platelia Aspergillus Ag. Der blev testet i alt 151 sera. Tabel 6 Patologi # Testede prøver # Positive Reumatoid Faktor 1 Positiv ANA 1 IgG Hypergammaglobulinæmi 1 IgM Hypergammaglobulinæmi 1 Cancer* 11 Non-viral cirrose (primær biliær; alkoholinduceret; lægemiddelinduceret) 1 Mange transfusioner 1 Flergangsfødende kvinder 1 HAV 1 HCV 1 Røde hunde 1 CMV 1 Syfilis (RPR+) 1 Toxoplasmose 1 Mycoplasma 1 * Et tilfælde af hver type: blære, bryst (2), tyktarm, livmoder, lunge, prostata, nyre og pladecelle(3). C- Klinisk testning KLINISKE UNDERSØGELSER I NORDAMERIKA I. SERUMPRØVER En klinisk testning for at evaluere sensitiviteten, specificiteten og forudsigelige værdier for Platelia Aspergillus Ag er blevet kørt med pædiatriske (alder 21 år) patienter i tre centre i USA og med voksne patienter i tre centre i Nordamerika. Undersøgelserne blev kørt med i alt 1954 serumprøver indsamlet fra 129 pædiatriske patienter og i alt 1724 serumprøver indsamlet fra 172 voksne patienter fra følgende patientgrupper*: Patienter uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter) Patienter med sandsynlig Invasiv Aspergillosis Patienter med påvist Invasiv Aspergillosis * Samarbejdsgruppen omkring invasiv svampeinfektion (IFICG) i den Europæiske Organisation for forskning og behandling af cancer (EORTC) og Mykose-studiegruppen (MSG) i det amerikanske Institut for allergi og infektionssygdomme (NIAID) har i 22 defineret kriterier for diagnosticering af Invasiv Aspergillosis (IA) hos patienter med ondartede hæmatologiske sygdomme eller hæmatopoetisk stamcelletransplantation. 2,39 15

16 SENSITIVITET A. Pædiatriske patienter Resultaterne fra denne undersøgelse er blevet analyseret, hvad angår patient-sensitivitet. Testningen af sensitiviteten blev kørt ved brug af Platelia Aspergillus Ag i tre centre med et samlet antal på 17 immunkompromitterede pædiatriske patienter diagnoseticeret med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis. Tabel 7 Diagnose Antal patienter Sensitivitet 95% Konfidensinterval Påvist Aspergillosis % (4/9) % Sandsynlig Aspergillosis % (5/8) % Sammenlagt påvist og sandsynlig 17* 52.9% (9/17) % Aspergillosis *Bemærk: 8 af de 17 patienter gav negative Aspergillus galactomannan antigen-resultater. Alle de 8 patienter med negative Aspergillus galactomannan antigen-resultater modtog en behandling med flere antifungale midler. Samtidig brug af en skimmelaktiv svampebehandling hos nogle patienter med Invasiv Aspergillosis kan resultere i en nedsat sensitivitet 3. B. Voksne patienter Testningen af sensitiviteten blev kørt ved brug af Platelia Aspergillus Ag i tre centre med et samlet antal på 29 voksne patienter med knoglemarvstransplantation og leukæmi med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis. Tabel 8 SPECIFICITET A. Pædiatriske patienter Specificitet med pædiatriske patienter Testningen af specificitet blev kørt ved brug af Platelia Aspergilllus Ag i tre centre med at samlet antal på 18* immunkompromitterede pædiatriske patienter uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter). Tabel 9 Diagnose Antal patienter Sensitivitet 95% Konfidensinterval Påvist Aspergillosis % (9/11) % Sandsynlig Aspergillosis % (14/18) % Sammenlagt påvist og sandsynlig Aspergillosis % (23/29) % Center Antal patienter Specificitet 95% Konfidensinterval % (38/44) % % (51/59) % 3 5 1% (5/5) % Centrene sammenlagt % (94/18) % *Bemærk: 4 patienter med positive galactomannan antigen-resultater, som faldt sammen med en piperacillin / tazobactam terapi, blev udelukket. Specificitet med pædiatriske prøver Testningen af specificitet blev kørt ved brug af Platelia Aspergilllus Ag i tre centre med et samlet antal på 1625* prøver opnået fra 18 immunkompromitterede pædiatriske patienter uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter). Tabel 1 Center Antal prøver Specificitet 95% Konfidensinterval % (785/794) % % (715/731) % 3 1 1% (1/1) % Centrene sammenlagt % (16/1625) % *Bemærk: 8 prøver fra 4 patienter med positive galactomannan antigen-resultater, som faldt sammen med en piperacillin / tazobactam terapi, blev udelukket. 16

17 B. Voksne patienter Specificitet med voksne patienter Testningen af specificiteten blev kørt ved brug af Platelia Aspergillus Ag i tre centre med et samlet antal på 143 voksne patienter med knoglemarvstransplantation og leukæmi uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter). Tabel 11 Center Antal patienter Specificitet 95% Konfidensinterval % (22/28) % % (71/77) % % (34/38) % Centrene sammenlagt % (127/143) % Specificitet med voksne prøver Testningen af specificiteten blev kørt ved brug af Platelia Aspergillus Ag i tre centre med et samlet antal på 1262 prøver opnået fra 143 voksne patienter med knoglemarvstransplantation og leukæmi uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter). Tabel 12 Center Antal prøver Specificitet 95% Konfidensinterval % (342/349) % % (552/56) % % (349/353) % Centrene sammenlagt % (1243/1262) % FORUDSIGELIG VÆRDI Forudsigelige positive og negative værdier er blevet analyseret for patientgruppen i denne undersøgelse. På baggrund af den aktuelle gennemsnitlige prævalensrate på 13,6% hos pædiatriske patienter og på 16,9% hos voksne observeret i denne undersøgelse, er de forudsigelige positive og negative værdier blevet beregnet som følger: A. Pædiatriske patienter Undersøgelsens prævalens: 13,6% PPV: 39.1% 95% Konfidensinterval: % NPV: 92.2% 95% Konfidensinterval: % B. Voksne patienter Undersøgelsens prævalens: 16,9% PPV: 59.% 95% Konfidensinterval: % NPV: 95.5% 95% Konfidensinterval: % Den forventede prævalens af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patientgruppen; der er blevet rapporteret om rater fra 5-2% 1, 24. For patientgrupper i den lavere ende af den publicerede prævalens er den positive og negative prævalens blevet beregnet igen ved hjælp af en prævalensrate på 5%. A. Pædiatriske patienter Beregnet prævalens: 5% PPV: 17.6% 95% Konfidensinterval: % NPV: 97.2% 95% Konfidensinterval: % B. Voksne patienter Beregnet prævalens: 5% PPV: 27.2% 95% Konfidensinterval: % NPV: 98.8% 95% Konfidensinterval: % 17

18 II. PRØVER AF BAL-VÆSKE- KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE Sensitiviteten og specificiteten af Platelia Aspergillus Ag med prøver af BAL-væske er blevet evalueret i to undersøgelser i USA med 116 prøver fra 62 modtagere af solid organtransplantation og 333 prøver fra 116 modtagere af lungetransplantation og uden invasiv aspergillosis og et studie uden for USA på 99 prøver fra 99 høj risiko hæmatologiske patienter med og uden invasiv aspergillose.. A.SENSITIVITET Sensitiviteten blev evalueret hos modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation diagnosticeret med invasiv aspergillosis iht. EORTC/MSG kriterier. I. Modtagere af solid organtransplantation med Invasiv Aspergillosis Ud af i alt 116 prøver fra 62 modtagere af solid organtransplantation i en undersøgelse blev sensitiviteten evalueret hos 5 modtagere diagnosticeret med invasiv aspergillosis som vist i tabellen nedenfor. Tabel 13 Sensitivitet med Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis hos modtagere af solid organtransplantation pr. patient Diagnose N Indekstal,5 Sensitivitet 95% Konfidensinterval Påvist Aspergillosis 2 2 2/2 (1%) % Sandsynlig Aspergillosis 3 3 3/3 (1%) % Påvist og sandsynlig Aspergillosis tilsammen 5 5 5/5 (1%) % Tabel 14 Sensitivitet med Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis hos modtagere af solid organtransplantation pr. type transplantation Type transplantation N Indekstal,5 Sensitivitet 95% Konfidensinterval Hjerte 1 1 1/1 (1%) 2.6-1% Nyre 3 3 3/3 (1%) % Lever 1 1 1/1 (1%) 2.6-1% I alt 5 5 5/5 (1%) % II. Modtagere af lungetransplantation med invasiv aspergillosis Ud af i alt 333 prøver fra 116 modtagere af lungetransplantation i en anden undersøgelse blev sensitiviteten evalueret hos 6 modtagere diagnosticeret med invasiv aspergillosis som vist i tabellen nedenfor. Tabel 15 Sensitivitet med Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis hos modtagere af lungetransplantation pr. Patient Diagnose N Indekstal,5 Sensitivitet 95% Konfidensinterval Påvist Aspergillosis 2 1 1/2 (5.%) % Sandsynlig Aspergillosis 4 3 3/4 (75.%) % Påvist og sandsynlig Aspergillosis tilsammen III. Hæmatologiske patienter med invasiv aspergillose Sensivitet blev også evalueret i et tredje studie i 58 prøver fra 58 hæmatologiske patienter diagnosticeret med invasiv aspergillose, som vist i tabellen nedenfor. I studiet en retrospektiv analyse blev BAL prøver fra højrisiko hæmatologiske patienter udført på Platelia Aspergillus EIA. Dataene fra dette studie offentliggjort nedenfor blev evalueret til at etablere de egenskaber af Platelia Aspergillus EIA på BAL væske 29. Tabel 16 Påvist eller sandsynlig invasiv aspergillose hos Hæmatologisk e patienter 6 4 4/6 (66.7%) % Diagnose N Index.5 Sensivitet 95% Konfidensinterval Påvist Aspergillosis /31 (1%) % Sandsynlig Aspergillosis /27 (96.3%) % Påvist og sandsynlig Aspergillosis tilsammen /58 (98.3%) % 18

19 B. SPECIFICITET Specificiteten blev evalueret i 98 BAL-prøver fra 57 modtagere af solid organtransplantation og 35 BAL-prøver fra 11 modtagere af lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis, som vist i tabellen nedenfor. Resultaterne er anført pr. prøve fra transplantationsmodtagere med og uden kolonisering af skimmelsvampe. Tabel 17 Specificitet pr. prøve Modtagere af både solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis N =43 BAL-væsker Indekstal 95% Diagnose N Negativ (%) <.5 Konfidensinterval Kontroller uden kolonisering /341 (96.8%) % Kontroller med kolonisering /62 (8.6%) % Kontrol I alt /43 (94.3%) % Specificiteten for BAL-prøver fra både modtagere af solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis er anført pr. type transplantation i tabel 18 nedenfor. Tabel 18 Specificitet pr. prøve Modtagere af både solid organtransplantation og lungetransplantation uden Invasiv Aspergillosis pr. type transplantation N =43 BAL-væsker Type transplantation N Indekstal <.5 Negativ (%) Specificiten blev også evalueret i ialt 41 BAL prøver fra 41 hæmatologiske patienter uden invasiv aspergillose og er vist i tabellen nedenfor. Tabel 19 Specificiten pr. prøve på Hæmatologiske patienter uden invasiv aspergillose N= 41 95% Konfidensinterval Hjerte /28 (89.3%) % Nyre /25 (88.%) % Lever /23 (95.7%) % Lunge /327 (95.1%) % Kontrol I alt /43 (94.3%) % Index 95% Diagnose N Negativ (%) <.5 Konfidensinterval Kontrolpatienter /41 (8.5%) % 16- LITTERATURLISTE 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 4 : s Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 22. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin.Infect.Dis. 34: s Aubry, A., R. Porcher. J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian 26. Occurrence and Kinetics of False-Positive Aspergillus GalactomannanTest Results following Treatment with β-lactam Antibiotics in Patients with Hematological Disorders. J. Clin. Microbiol. 44: s Barnes P. D. and K. A. Marr. 27 Risks, diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haemotopoeitic stem cell transplant recipients. Brit. Journ. Haemotol. 139: s Becker M. J., E. J. Lugtenburg. J. J. Cornelissen, C. V.D. Schee, H. C. Hoogsteden and S. D. Marie. 23 Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haemotological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br. J. Haemotol. 121(3): s Blijevens, N. M., J. P. Donelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 22 Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haemotopoietic stem cell transplant receipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: s Chambon-Pautas, C.,J. M. Costa, M.T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 21 Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: s

20 8. Clancy C., R. A. Jaber, H. L. Leather, J. R. Wingard, B. Staley, J. L. Wheat, C. Cline, K. H. Rand, D. Schain, M. Baz and M. H. Nyugen. 27 Bronchoalveolar Lavage Galactomannan in Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis among Solid-Organ Transplant Recipients. J. Clin. Microbiol. 45(6): s de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J Med Vet Mycol 32: s Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: s Desai R, L.A. Ross and J. A. Hoffman Poster The Role of Bronchoalveolar Lavage Galactomannan Assay in the Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Pediatric Populations. AAA Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 22. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: s Gangneux, J., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen and V. Gandemer. 22. Transient aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet. 359(9313): Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 27. Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: s Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi. 22. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J Clin. Oncol. 2: s Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester,R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 22. Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N Engl J Med. 347, 6: s Hussain S., D.L. Paterson, S. M. Studer, M. Crespo, J. Pilewski, M. Durkin, J.L. Wheat, B. Johnson, L. Mclaughlin, C. Bentsen, K. McCurry and N. Singh. 27 Aspergillus Galactomannan Antigen in the Bronchoalveolar Lavage Fluid for the Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Lung Transplant Recipients. Transplantation 83(1): s Hussain S., C. J. Clancy, M.H. Nyugen, S. Swartzentruber, H. Leather, A. M. LeMonte, M.M. Durkin, K. S. Knox, C. A. Hage, C. Bentsen, N. Singh, J.R. Wingard and L.J. Wheat. 28. Performance Characteristics of the Platelia Aspergillus Ag for detection of Aspergillus galactomannan antigen in bronchoalveolar lavage fluid. Clin. Vaccine Immunol.15 (12) : s Khan ZU, Ahmad S, and Theyyathel AM. 28 Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA, (1-3)-beta-d-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens of experimentally infected rats. Mycoses; 51 : s Klont R.R., M.A.S.H. Mennink-Kersten and P. E. Verweij. 24 Utility of Aspergillus Antigen Detection in Specimens Other than Serum Specimens. Clin. Infect. Diseas. 39: s Knox KS, Rose AS, and Hage CA. 27 Rapid Fungal Diagnosis: The Utility of Bronchoalveolar Lavage for Pneumocystis and Endemic Mycoses. Current Fungal Infection Reports; 1: s Kwak EJ and Nyugen MH. 28 Galactomannan Detection in Bronchoalveolar Lavage Fluid. Current Fungal Infection Reports; 2: s Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr Top Med Mycol 6: s Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin Microbiol Rev 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect.Immun. 62: s Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller amd E. Candolfi Recherche d antigene galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus: antigenemies positives persistantes en l absence d infection. J. Med. Mycol. 8:s Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J.Clin. Microbiol. 37: s Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts. 21. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: s Maertens J., V. Maertens, K. Theunissen, W. Meersseman, P. Meersseman, S. Meers, E.Verbeken, G. Verhoef, J. V. Eldere and K. Lagrou. 29. Bronchoalveolar Lavage Fluid Galactomannan for the Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Patients with Hematologic Diseases. Clin. Infec. Diseas. 49: Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring. 25. Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis 4: s Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring. 25. Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis 4: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F.Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini. 24. False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: s Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij. 25 Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8):