Mikrobiologiske metoder til in situ rensning af olieforurenet jord

Transkript

1 Mikrobiologiske metoder til in situ rensning af olieforurenet jord Aarhus Universitet efterår 2002 Biologisk projektarbejde Af Claus Bloch,

2 Indholdsfortegnelse 1. Indledning Olieforureninger Oprensningsmuligheder Biologisk stimulerende oprensningsteknikker Andre oprensningsteknikker Naturlig nedbrydning Forceret nedbrydning ved biostimulering Ex situ/on-site bioremediering Evaluering af bioremediering Perspektivering Konklusion...27 Litteraturliste...28 Bilag 1. Opsummering af de beskrevne remedieringsteknikker...32 Bilag 2. Eksempler på hydrocarbon-nedbrydende bakterier og svampe fundet i litteraturen

3 Forord Dette litteraturstudium er en sammenfatning af den danske og internationale litteratur under overskriften mikrobiologiske metoder til in situ rensning af olieforurenet jord. Litteraturstudiet er et biologisk projektarbejde skrevet på Afdelingen for Mikrobiel Økologi på Århus Universitet og lavet i samarbejde med NIRAS Rådgivende ingeniører og planlæggere A/S. Følgende problemformulering er bestemt for studiet: Studiet indeholder en grundig gennemgang af den indenfor området tilgængelige litteratur, både nationalt og internationalt. Der vil blive lagt vægt på en vurdering af de opnåede resultater. Desuden vil der blive udpeget metoder som med fordel vil kunne bringes til anvendelse ved fremtidige rensningsprojekter. Fokus er primært rettet mod det mikrobiologiske aspekt af oprensningsteknikkerne. Herudover vil en vurdering af de enkelte teknikker samt resultater fra disse også blive gennemgået. Søgning af litteratur blev foretaget gennem Statsbibliotekets OnLine-katalog (SOL, samt Google ( 1. Indledning Bioremediering opdeles i to typer; naturlig nedbrydning og forceret nedbrydning. Ved naturlig nedbrydning udnyttes evnen af de naturligt forekommende bakterier og svampe til at nedbryde organiske forbindelser. Ved forceret nedbrydning forsøges det at optimere miljøfaktorer, oftest ved ventilering, for at stimulerer en højere biologisk nedbrydningsrate. Hvor det ved naturlig nedbrydning ofte tager lang tid (år), så kan forceret nedbrydning reducere nedbrydningstiden markant (ofte måneder). Forskellen mellem naturlig nedbrydning og at lade naturen ordne det selv er, at der til naturlig nedbrydning knyttes et moniteringsforløb, hvori der skaffes grundig dokumentation for de naturligt forekommende mikroorganismers rolle i fjernelse af de forurenende stoffer. Herudover moniteres der for de forurenende stoffers koncentration for således at bevise 3

4 effekten af den naturlige nedbrydning. Monitering sker enten ved hjælp af in situ målinger eller ved hjælp af analyser i laboratoriet. På grund af de store strukturelle forskelle i jordmatricen opdeles bioremediering i processer der forløber i den umættede og processer der forløber i den mættede zone. Den umættede zone strækker sig fra jordoverfladen ned til grundvandsspejlet. I denne zone indeholder jordporerne vand, luft og andre gasser. Den mættede zone strækker sig fra grundvandsspejlet og nedefter og jordporerne i denne zone er fyldt med vand. Et af de første projekter som gjorde brug af stimuleret biologisk nedbrydning blev gennemført i 1972 i Pennsylvania, hvor Richard L. Raymond forsøgte at pumpe ilt ned i den mættede zone som var forurenet med benzin (NRC 1993, Reisinger 1995, Hinchee 1998). En af hovedkonklusionerne på Raymonds arbejde var, at ilttilførsel stimulerer nedbrydning af olieforbindelser. Siden de første jordoprensninger blev udført og de første videnskabelige artikler om jordoprensning blev publiceret, har fokusset flyttet sig fra de lette hydrocarboner til de tunge hydrocarboner. I dag findes der en forholdsvis stor viden om kildeoprensning af benzin, BTEX 1, MTBE 2 samt let og tung gasolie 3, mens der stadig forskes meget i nedbrydningen af de sværtnedbrydelige polyaromatiske hydrocarboner (PAH) og klorerede hydrocarboner. For disse sværtnedbrydelige forbindelser begrænser teknikkerne sig til spredningskontrol (Miljøstyrelsen 2002). 1.1 Olieforureninger Olieforureninger er ikke et nyt fænomen. De fleste mennesker mindes grundstødningen af tankskibet Exxon Valdez i Alaska marts 1989 og den efterfølgende forurening af det marine miljø. Aktuelt er der store problemer ved den spanske og franske atlanterhavskyst, hvor et gammelt 1 Benzen, toluen, ethylbenzen og xylen - lette aromatiske hydrocarboner i benzin og gasolie. 2 Methyl-tertiær-butylether, et benzinadditiv. 3 Samlebetegnelse for dieselolie og let fyringsolie. 4

5 enkeltskroget tankskib er gået til bunds og nu lækker sin last af olie. Heldigvis er store oliespild en sjældenhed, men dagligt forekommer mindre spild af olieprodukter, som udgør en fare for det lokale miljø. De vigtigste forureningskilder er benzinstationer og andre påfyldningspladser, fyringsanlæg ved boliger og industri, olietransmissionsledninger, lossepladser og spild ved trafikuheld (Kjeldsen og Christensen 1996). Olieprodukter har en meget kompleks og varierende sammensætning, afhængig af råoliens kvalitet, den videre behandling ved destillations- og crackningsprocesser, samt den eventuelle efterfølgende tilsætning af additiver. Mere end 600 hydrocarboner er identificeret i olie. Det typiske indhold af olie er 85% C, 13% H, 1,5% S, 0,5% N og 0,5% O eller 25% alkaner, 50% cykloalkaner, 17% aromater og 8% asfaltstoffer (Kjeldsen og Christensen 1996). Det er sammensætningen af olieprodukterne, som afgør deres skæbne i jorden. Jo mere forgrenede molekylerne er og jo flere ringstrukturer de har, des sværere nedbrydelige i naturen er de. 2. Oprensningsmuligheder Til oprensning af olieforurenet jord findes en del forskellige biologiske, kemiske og fysiske teknikker. Fælles for dem alle er, at de enten øger nedbrydningspotentiale for de forurenende stoffer eller fjerner de forurenende stoffer direkte eller indirekte. Valget af teknik afhænger blandt andet af den fysiske og hydrogeologiske karakter af lokaliteten, de forurenende stoffers spredning, koncentration og sammensætning, samt det påkrævede oprensningsniveau (Anderson 1995). Et oprensningsprojekt består af seks faser; 1) beskrivelse af lokaliteten, 2) ingeniørmæssige undersøgelser, 3) risikovurderinger, 4) behandlingsundersøgelser og -design, 5) opresningsudførelse og 6) afsluttende undersøgelser (Bourquin og Pedersen 1995). 5

6 2.1 Biologisk stimulerende oprensningsteknikker Oprensning ved hjælp af biologiske in situ teknikker kaldes også bioremediering. Bioremediering er defineret som: Brugen af naturligt forekommende bakterier og svampe til at nedbryde og/eller afgifte farlige bestanddele i jorden på en forurenet lokalitet for at beskytte almen sundhed og miljøet (EPA 1991). Tidligere har bioremediering primært været valgt som oprensningsteknik når det ikke har været muligt eller rentabelt at fjerne jorden og køre den til ekstern behandling. De teknologiske fremskridt indenfor beluftningsteknikker har gjort, at bioremediering i dag i visse tilfælde kan betale sig, både i tid og penge. Bioremediering omhandler generelt stimulering af naturligt forekommende bakterier ved bevægelse af luft eller vand for at tilføre oxidationsmiddel samt næringsstoffer til forureningsområdet (Anderson 1995). Vandbaserede teknikker kræver dog store mængder vand og lang inkubationstid i forhold til luftbaserede teknikker. Det skyldes primært en forskel i iltindholdet mellem luft og vand. Atmosfærisk luft har en iltkoncentration på 20,9%, mens der i vand kun kan opløses følgende mængder: luft 0,001%, ren ilt 0,005%, hydrogen peroxid 0,1%. Det vil sige, at sammenlignet med de højeste peroxidkoncentrationer vil der i luft være ca. 200 gange mere ilt per liter (Bowlen and Kosson 1995). Derfor har luftbaserede teknikker større potentiale for succes, men det afhænger af lokaliteten (Hoeppel og Hinchee 1994). De biologiske teknikker der har vist sig at være mest effektive præsenteres nærmere nedenfor. Dertil hører: 1) landfarming, 2) bioreaktorer, 3) bioaugmentation, 4) bioventilering, 5) biosparging, 6) biobarrierer, 7) forceret udvaskning samt 8) fytooprensning. Bilag 1 viser en opsummering af de beskrevne remedieringsmetoder. 2.2 Andre oprensningsteknikker Ud over de ovennævnte biologiske teknikker findes der et par fysiske/kemiske teknikker, der også fortjener at blive nævnt, idet de har vist sig effektive overfor oprensning af olieprodukter. 6

7 Dampstripning og termisk ledningsevne. Ved oprensningsmetoderne dampstripning og termisk ledningsevne øges flygtigheden af de forurenende stoffer gennem opvarmning. Dampstripning kan anvendes ved oprensning af olieprodukter i sandede jordlag. Ved dampstripning opvarmes jordlagene af den varme som afgives, når damp kondenserer ved kontakt med kold jord/grundvand. Dampinjektionen indledes typisk fra en række boringer i periferien af forureningskilden, således at der opnås en sammenhængende ring af damp og herefter en mobilisering af de forurenende stoffer mod den centrale del af kilden. De forurenende stoffer pumpes herefter op fra dette område. De væsentligste ulemper ved dampstripning er knyttet til opvarmning af bygninger, drikkevand og kloakledninger (Miljøstyrelsen 2002). Termisk ledningsevne bruges ved oprensning af stoffer med høje kogepunkter, såsom kreosot 4 og tjære 5, som ikke kan oprenses med andre in situ teknikker. Teknikken er desuden effektiv til oprensning af stoffer med forholdsvis lave kogepunkter, såsom gasolie. Ved termisk ledningsevne opvarmes jorden ved hjælp af varmelegemer til op til 700 C, hvorved al jordvæske samt de fleste forureningskomponenter bringes på gasform og/eller fordampes og fjernes ved oppumpning. Metodens største ulemper er, at den er langsom og meget energikrævende, samt at den ikke kan anvendes på lokaliteter med stor grundvandstilstrømning, da dette medfører en stor afkøling (Miljøstyrelsen 2002). Frakturering. Frakturering er en in situ teknik, hvor en kunstig sprække i jordlagene dannes ved injektion af gas eller vand. Teknikken anvendes i lavpermeable jordlag (ler, kalk, hårde bjergarter) og ved dens anvendelse opnås en mere effektiv ekstraktion af de forurenende stoffer fra jordmatricen (Miljøstyrelsen 2002, Walsted et al. 2002). 4 Et antiseptisk middel lavet af tjæreolie. 5 Mørk og tyktflydende væske dannet ved destillation af organiske stoffer som kul og træ. 7

8 3. Naturlig nedbrydning Ved naturlig nedbrydning forstås den biologiske omsætning af organiske forbindelser, hvilket i sidste ende resulterer i dannelsen af kuldioxid, vand, methan og mikrobiel biomasse. Biologisk nedbrydning involverer oxidations/reduktions (redox) reaktioner og er basalt set en elektronoverførsel fra en organisk elektrondonor (hydrocarboner) til en uorganisk elektronacceptor (ilt). Energien som udløses ved denne overførelse, bruges af bakterierne til opretholdelse af deres metabolisme og vækst. Organiske forbindelser kan nedbrydes enten via aerobe processer (respiration med ilt) eller anaerobe processer (respiration med andet oxidationsmiddel end ilt). Organiske forbindelser kan desuden både oxideres (aerobt) og reduceres (anaerobt) gennem cometabolisme, hvor deres nedbrydning er koblet til omsætning af andre organiske forbindelser, der fungerer som primær energikilde. Nedbrydning af hydrocarboner sker hurtigere og mere effektivt under aerobe forhold end under anaerobe forhold, da aerob nedbrydning giver mere energi per rektion (Reisinger 1995) (boks 1). Anaerob nedbrydning har længe været undervurderet som nedbrydningsvej (ATV 1998), men i dag ved man, at hydrocarboner såsom BTEX kan nedbrydes under stort set alle tænkelige forhold *UELü-*DOLü DQG 9RJHO 5HLQKDUG HW DO 5, Semprini 1998). De fire miljøfaktorer med størst effekt på bakteriel vækst er temperatur, ph, tilgængeligt vand og ilt (Madigan et al. 1997). Hvilke typer af bakterier som vil trives, samt hvilke(n) metabolisme de vil bruge, afhænger også af disse faktorer. Forsøg har vist, at effekten af jordens temperatur (i den mættede zone) på den biologiske nedbrydningsrate følger van t Hoff-Arrhenius ligningen, det vil sige, at raten fordobles med hver 10 C temperaturen øges (Miller et al. 1991). Den optimale temperatur for maksimal bakteriel aktivitet (mesophile bakterier) og som følge deraf nedbrydning af forurenende stoffer er som regel højere end den gennemsnitlige jordtemperatur, hvilket vil sige 20 8

9 C eller højere (Dibble and Bartha 1979, EPA 1991, Margesin and Schinner 1997, Eriksson et al. 1999). For at bibeholde et stabilt miljø for bakterierne og dermed en stabil nedbrydning er det vigtigt, at jorden på den forurenede lokalitet indeholder mineraler, såsom karbonater, som kan udligne de phændringer, som ellers er resultatet af biologisk produktion af kuldioxid og andre syrer eller baser (NRC 1993). Optimale ph forhold for de fleste kendte hydrocarbon-nedbrydende bakterier ligger mellem ph 6,5 og 8,5 (Dibble and Bartha 1979, Norris et al. 1994, Bowlen and Kosson 1995, Madigan et al. 1997). Aerob biologisk nedbrydning af organisk materiale i jorden er størst ved en fugtighed på %, men nedbrydning af hydrocarboner kan generelt foregå fra % fugtighed. Dette skyldes, at bakterierne har svært ved at overleve ved en fugtighed på under de 30 %, mens en fugtighed på over 90 % som regel bevirker et lavt iltindhold i jorden (Dibble and Bartha 1979, EPA 1991, Anderson 1995). Boks 1. Bakterielle redox-processer ved nedbrydning af formaldehyd med angivelse af Gibbs fri energi (kcal pr. mol) ved ph 7 (efter Albrechtsen 1999). Aerob resiration: CH 2 O + O 2 : &2 2 + H 2 O Nitrat-reduktion: CH 2 O + 4/5 NO /5 H + : & /5 N 2 + 7/5 H 2 O Mangan (MnIV)-reduktion: CH 2 O + 2 MnO H + : & Mn H 2 O Jern (FeIII)-reduktion: CH 2 O + 4 Fe(OH) H + : & Fe H 2 O Sulfat-reduktion: CH 2 O + SO ½ H + : &2 2 + ½ HS - + H 2 O Methandannelse, fermentation: CH 2 0 : ½ CH 3 COOH : ½ CH 4 + ½ CO 2, CO H 2 : & H 2 O û*ƒ: -120 û*ƒ: -114 û*ƒ: -81 û*ƒ: -28 û*ƒ: -25 û*ƒ: -22 9

10 Desuden har den biologiske tilgængelighed af substratet stor betydning for nedbrydningen. Den væsentligste årsag til manglende eller ringe biotilgængelighed er sorption til jordpartikler. Hvor stor en mængde stof som tilbageholdes ved sorption til jordpartiklerne, afhænger af de forurenende stoffers koncentration, flygtighed og opløselighed samt jordens partikelstørrelse og indhold af ler og organisk materiale (Skowronski et al. 1994). Lav biotilgængelighed kan i mange tilfælde også skyldes bakteriernes ringe mobilitet. Mange bakterier er mobile, men deres mulighed for at flytte sig er afhængigt af jordens vandindhold. Ved lavt vandindhold i jorden (i den umættede zone) bliver bakteriernes mobilitet reduceret, fordi deres bevægelighed er begrænset til vandfilmen på jordpartiklerne og til de mindre vandfyldte porer (Kirkebjerg et al. 1999). I litteraturen er der dog bred enighed om, at lav biotilgængelighed mest er et problem i forbindelser med stoffer, der har en lav opløselighed i vand, såsom PAH er (Aamand et al. 1995b, Müller and Mahru 2001). Der er stor enighed i, at olienedbrydende bakterier naturligt forekommer i alle miljøer (Thomas and Ward 1989, Márquez-Rocha et al. 2000, Margesin and Schinner 2001). Der findes i litteraturen beskrevet en bred vifte af bakterier, som er i stand til at nedbryde hydrocarboner (se bilag 2). Her ses at det ikke kun er bakterier, som kan nedbryde hydrocarboner, men også svampe, specielt hvidrådssvampe og gær, har dette potentiale. Med henblik på bioremediering har man dog langt fra den samme erfaring fra undersøgelser med svampe som fra undersøgelser med bakterier (Leahy and Colwell 1990). Under de fremherskende oligotrofe (næringsfattige) forhold i de fleste jorde er bakterierne udsat for forskellige former for stress, deriblandt sult. Mange undersøgelser har vist, at manglen på egnede elektronacceptorer, især ilt, er den største begrænsning for en hurtig og effektiv nedbrydning af forurenende stoffer (NRC 1993, Tiedje 1994, Norris 1995, Itävaara et al. 2000). Desuden begrænses bakteriel vækst/aktivitet af mangel på næringsstoffer (nitrogen og fosfor) (Atlas 1995, Karlson et al. 1996, Kirkebjerg et al. 1999). Derfor vil den naturlige nedbrydning være mest effektiv, hvis den forurenede jord er næringsrig samtidigt med at koncentrationen af elektronacceptorer er høj. 10

11 Den miljøfaktor som har størst indflydelse på valg af naturlig nedbrydning som oprensningsmetode er grundvandsstrømningen. Grundvandsstrømningen bestemmer, hvorvidt de tilstedeværende bakterier og svampe kan nedbryde de forurenende stoffer, inden de spredes med grundvandet (NRC 1993). Lokaliteter med størst omsætning per tidsenhed har også den største forureningsspredning og risiko for grundvandsforurening. Nedbrydningspotentialet af forurenende stoffer via naturlig nedbrydning varierer meget på de enkelte lokaliteter. Generelt vurderes nedbrydningspotentialet ud fra laboratorieforsøg og in situ moniteringsforløb at være op til 50 mg hydrocarboner/kg jord/dag (Hinchee and Ong 1992, Eyk 1997, Abbott et al. 1999, Loll et al. 2001, Andersen et al. 2002). 4. Forceret nedbrydning ved biostimulering Tteknikker til stimulering af biologisk nedbrydning kan anvendes, når den naturlige nedbrydning ikke er tilstrækkelig, når risikoen for spredning af de forurenende stoffer er for stor, eller når det påkrævede oprensningsniveau ikke kan nås indenfor den angivne/tilladte tid. Oprensningen kan foregå enten ex situ (på anden lokalitet), on-site (på overfladen af lokaliteten) eller in situ (i jorden på den forurenede lokalitet). De teknikker som er nævnt nedenfor, har alle til formål at optimere miljøfaktorer som stimulerer bakteriel vækst og dermed øger den biologiske nedbrydningsrate. Bioremediering indebærer ofte en kombination af de nedenfor anførte teknikker. Vigtigste miljøfaktor ved forceret nedbrydning er, hvor god jorden på den forurenede lokalitet er til at transportere væske og gas. Ved valg af bioremedieringssystemer som benytter sig af at flytte væsker, bør den hydrauliske konduktivitet 6 være større end 10-4 cm/s (NRC 1993, Norris et al. 1994, Anderson 1995), mens for systemer som flytter gasser bør den indre permeabilitet 7 være større end 10-9 cm 2 (NRC 1993). For begge teknikker gælder det, at de er svære at bruge i jorde som er meget 6 Mængden af grundvand som passerer gennem en enhed af jordmatricen på en given tid. Også kaldet permeabilitetskoefficienten (Bach et al. 2001). 7 Et mål for hvor godt en væske flyder gennem jordmatricen. 11

12 heterogene, eller i jorde som indeholder uregelmæssigheder som sprækker eller brud, der kan virke som kanaler (NRC 1993, Miljøstyrelsen 1995). 4.1 Ex situ/on-site bioremediering Der skal efterfølgende kort beskrives nogle ex situ/on-site teknikker på grund af deres effektive fjernelse af hydrocarboner. Landfarming/landtreatment Landfarming har i flere årtier været brugt af olieindustrien som bortskaffelsesteknik (Bleckman et al. 1995). Ved denne teknik spredes olieprodukter eller olierester ud over uforurenet jord og derefter pløjes de ned. Herefter pløjes jorden med jævne mellemrum og den biologiske nedbrydning fjerner de forurenende stoffer. Eventuelt tilføres næringsstoffer og vand til jorden i forbindelse med pløjningen (Anderson 1995). Landfarming kan også udføres i behandlingsbede, som er udstyret med bundmembraner, som forhindrer nedsivning/udvaskning. Nedbrydningen kan eventuelt fremmes gennem tilplantning af bedene (Miljøstyrelsen 1995, Michels 1998). Da landfarming som regel indebærer en kontinuerlig tilførsel af olieprodukter er der ikke udregnet nedbrydningsrater. Oprensningseffektiviteten for hydrocarboner ligger som regel mellem % afhængigt af indholdet af de sværtnedbrydelige PAH er, som ofte ligger tilbage (Anderson 1995). Bioreaktorteknik En bioreaktor er en lukket beholder, hvori forurenet jord behandles. Jorden blandes eventuelt med træflis eller lignende inden behandling for at sikre aerobe forhold gennem at øge porevolumen i jorden. Under behandlingen tilføres jorden ilt, vand, næringsstoffer og eventuelt adapterede bakterier 8 (Miljøstyrelsen 1995). 8 Bakterier som er tilpasset vækst i et miljø med høj koncentration af den pågældende forurening. 12

13 4.2 In situ bioremediering Biologiske in situ oprensningsteknikker adskiller sig alt efter i hvilken jordzone disse skal komme til anvendelse. De geologiske forskelle på den umættede og den mættede zone udgør en naturlig opdeling af teknikkerne. Generelt er et godt design af en biologisk in situ teknik, et design som forsøger at minimere overfladeafdunstningen og grundvandsafstrømningen af de forurenende stoffer, samt at maksimere den biologiske in situ nedbrydning (Semprini 1998). Teknikkerne som beskrives nedenfor er: 1) bioaugmentation, 2) bioventilering, 3) biosparging, 4) forceret udvaskning, 5) biobarrierer, 6) grundvandssænkning samt 7) fytooprensning. Bioaugmentation I mange bioremedieringssystemer anvendes tilsætning af adapterede bakterier, en proces kaldet bioaugmentation (bioforøgelse). Formålet med en sådan tilsætning er, 1) at tilføje bakterier med de ønskede nedbrydningsegenskaber, 2) at øge antallet af egnede bakterier og dermed at øge nedbrydningshastigheden, 3) at sikre bakteriernes spredning i forhold til de forurenende stoffer eller 4) at mindske akklimatiseringsfasen (lag-fasen) af det bakterielle samfund til en ny forurening (Devinny and Chang 2000). Bakterierne kan enten tilsættes som renkulturer eller som blandingskulturer. Komplekse organiske molekyler nedbrydes ofte kun af mikrobielle konsortier og derfor stimuleres deres nedbrydning i naturen igennem podning med komplekse blandingskulturer. Podekulturerne stammer enten fra den forurenede lokalitet eller er en blanding af laboratoriekulturer (Turkovskaya et al. 2000) (eksempel 1). Tilsætning af adapterede bakterier anbefales, hvis antallet af bakterier med de formodede egenskaber er lavere end 10 5 per gram jord eller per milliliter grundvand (Forsyth et al. 1995). Ud over de faktorer der påvirker de allerede tilstedeværende bakterier (se afsnit 3), så skal tilsatte bakterier desuden tilpasse sig det helt nye miljø. Det er alment accepteret, at invasioner har mindre sandsynlighed for succes i helt anderledes økosystemer og de introducerede bakterier vil således 13

14 Stimuleret olienedbrydning ved tilsætning af adapterede bakterier og næringsstoffer (Mishra et al. 2001). Formålet med dette forsøg var, at undersøge effekten af bioaugmentation på in situ bioremediering af olieforurenet jord ved et raffinaderi i Indien, hvor in situ populationen af hydrocarbon-nedbrydende bakterier var lav. Undersøgelser af jordprøver fra lokaliteten viste en in situ population på CFU (cell forming units) per gram jord, hvilket ikke er tilstrækkeligt for bioremediering. Inden selve remedieringsbehandlingen blev der lavet et in situ forsøg for at finde den mest effektive behandlingsmetode for den pågældende jord. Derfor blev der udstykket 24 arealer á 1m 2 med 2m mellemrum imellem. Disse områder blev behandlet på seks forskellige måder (fire replikater for hver behandling): (I) Næringstilsætning alene, (II) tilsætning af et konsortium, (III) tilsætning af næringsstoffer og konsortium, (IV) tilsætning af Acinobacter baumannii og Burkholderia cepacia (begge isoleret fra den pågældende jord), (V) tilsætning af Acinobacter baumannii og Burkholderia cepaci samt næringsstoffer og (VI) en ubehandlet kontrol. Af alle disse behandlinger viste behandling III sig at være den mest effektiv. Ved denne behandling faldt total petroleum hydrocarbon (TPH) koncentration fra 91,8 g/kg til 47,2 g/kg, det vil sige en reduktion på 48,5 %. På kontroljorden faldt mængden af TPH med 17 %. Herefter blev et område på 1 ha udvalgt til forsøgsområde. 1 kg konsortieopløsning samt 50L næringsblanding blev spredt for hver 10m 2 i to områder af henholdsvis (A) 4000m 2 og (B) 5900 m 2, mens et område (C) på 100m 2 forblev ubehandlet (kontrol). Jorden i alle tre områder blev vandet og pløjet hver 20 dag for at sikre optimale aerobe og fugtighedsforhold. Efter 360 dage (januar 1998 til december 1998) var TPH koncentrationen i område A faldet fra 69,7 g/kg til 5,5 g/kg (92% reduktion), men den i B var faldet fra 45,1 g/kg til 4,6 g/kg (89,7% reduktion) og i C fra 132 g/kg til 113,5 g/kg (14% reduktion). Mishra et al. konkluderede derfor, at bioaugmentation på denne lokalitet havde fremmet bioremediering. Lignende tiltag blev derfor anbefalet på andre lokaliteter med tilsvarende lav in situ population af hydrocarbon-nedbrydende bakterier. Eksempel 1. 14

15 have svært ved at finde nicher i jorden, hvor de kan overleve (Anderson 1995, Devinny and Chang 2000) (eksempel 2). Mængden af litteratur som enten afviser eller påviser virkningen af bioaugmentation er meget stor. Generelt menes bioaugmentation dog ikke at være fordelagtigt i forbindelse med forureninger af letnedbrydelige hydrocarboner, mens det menes at have effekt og være fordelagtigt i forbindelse med nedbrydning af sværtnedbrydelige PAH er og af klorerede hydrocarboner (Hoeppel and Hinchee 1994, Dernbach 1999, Mishra et al. 2001, Müller and Mahro 2001). Med henblik på anvendelsen af bioaugmentation synes det største problem at være spredning af de tilsatte bakterier i jordmatricen (Devinny and Chang 2000). Firmaerne som sælger podekulturerne overdriver generelt nedbrydningspotentialet. Således var bioaugmentation for få år siden endnu ikke bevist som en kommerciel succes (Hinchee 1998, Devinny and Chang 2000). Bioventilering Ved bioventilering gøres brug af jordbeluftning til at fremme aerob biologisk nedbrydning af forurenende stoffer. Teknikken blev oprindeligt kaldt for vakuumventilering og var baseret på oppumpning af luft fra den umættede zone med det formål at fjerne flygtige stoffer, såsom BTEX er. Man opdagede dog, at ekstraktionen typisk medførte en tilførsel af iltholdigt poreluft til oprensningsområdet, hvorved den biologiske nedbrydning blev forceret (EPA 1991, Wilson and Clarke 1994, Miljøstyrelsen 2002). Ved bioventilering anvendes både vakuumpumper og injektionspumper. Gasflowet holdes passende til at kunne forsyne jorden med ilt uden samtidigt at transportere de forurenende stoffer mod overfladen (Bowlen and Kosson 1995, Otten et al. 1997) (figur 1). Nedbrydningen kan eventuelt fremmes yderligere ved tilsætning af næringssalte og adapterede bakterier (Miller et al. 1991, Anderson 1995, Miljøstyrelsen 1995). Efter pumpestop ses ofte et signifikant tilbageslag i poreluftens forureningsniveau ( VOC rebound effect), da der i jorden indstiller sig en ny ligevægt mellem de forurenende stoffer og poreluften. For at opnå størst mulig 15

16 Remediering af benzinspild ved tilsætning af laboratoriedyrkede bakterier (Maxwell and Baqai 1995) Lækage fra en nedgravet benzintank ved en bådplads i Californien havde forårsaget en forurening af den omkringliggende jord. Et konsulentfirma undersøgte det forurenede område og foreslog på baggrund af jordog grundvandsmålinger, at oprensningen kunne foretages ved tilsætning af laboratoriedyrkede bakterier samt ventilering af jordmatricen. Jordprøverne viste at koncentrationen af nitrat og fosfat var tilstrækkelig høje for bakteriel vækst. Koncentrationen af BTEX var op til 10 mg/kg ved projektets start. Projektet forløb over 15 måneder fra juli 1993 til oktober inokuleringsbrønde blev etableret i et netværk med en afstand af 7,6m mellem hver brønd. Podning blev foretaget én gang ved at tilsætte op til 38L bakteriesuspension per brønd. Bakterieblandingen indeholdte stammer fra slægterne Bacillus, Pseudomonas, Serratia og Azobacter. Luft blev kontinuerligt pumpet ned i brøndene under hele projektet. Efter 6 måneder blev alle brønde genetableret, da jord- og grundvandsprøver indikerede tilstopning. Ydermere var hydrocarbon koncentrationen endog steget. Efter et år var BTEX koncentrationerne tilbage på samme niveau som ved projektstart og der skete ingen yderligere reduktion, hvilket betød at remedieringsprojektet var mislykket. Maxwell and Baqai konkluderede, at alt tydede på at bakterierne ikke overlevede inokuleringen. Dette skyldes enten, at de ikke var i stand til at flytte sig fra området omkring brøndene og over til den omkringliggende forurening, eller at opløsningen med bakterierne kom i kontakt med toksiske benzinkoncentrationer, hvilket jordprøver indsamlet før og efter projektet bekræftede kunne være sket. Døde bakterier i forrådnelse synes desuden at være årsagen tilstopningen af brøndene. Eksempel 2. 16

17 biologisk nedbrydning anbefales bioventilering derfor at blive drevet cyklisk (EPA 1991, Miljøstyrelsen 2002). En typisk begrænsning i oprensningseffekten ved bioventilering er den langsomme diffusive afgivelse af de forurenende stoffer fra finkornede lavpermeable jordlag. Denne hindring menes at være det største problem for en effektiv brug af bioventilering (EPA 1991, Miljøstyrelsen 2002). Da mængden af ilt ofte er begrænset i jorden (se afsnit 3) er bioventilering (sammen med biosparging, se nedenfor) den mest benyttede teknik til in situ bioremediering af hydrocarbonforurenet jord (Semprini 1998). Bioventilering af den umættede zone er en ideel teknik til oprensning efter benzin- og jetbrændstofforureninger (Bowlen and Kosson 1995, Anderson 1995). Nedbrydningsraterne ligger typisk på 8-20 mg/kg/dag (Miller et al. 1991, Hinchee and Ong 1992, Anderson 1995, Abbott et al. 1999). Figur 1. Princip ved bioventilering (Anderson 1995). Biosparging Biosparging er en udvidelse af bioventilering. Ved denne teknik blæses atmosfærisk luft ind i og/eller under den forurenede del af den mættede zone (som regel 1-1,5 m under de forurenede jordlag) (figur 2). Teknikken anvendes med fordel til fjernelse af flygtige stoffer. Ved indblæsningen af luft øges den mikrobielle omsætning af aerobt nedbrydelige stoffer, såsom let og tung gasolie. I modsætning til air sparging (luftspredning), hvor de flygtige stoffer overføres (strippes) fra grundvandszonen til den umættede zone og derefter fjernes ved vakuumventilation, så 17

18 nedbrydes de forurenende stoffer ved biosparging af bakterier i den umættede zone. For at opnå en optimal effekt kombineres biospargingsystemer derfor ofte med bioventilering (Bowlen and Kosson 1995, Aamand and Jensen 1995b, Miljøstyrelsen 2002). Som ved alle de andre teknikker er det lokalitetens geologiske randbetingelser, der bestemmer hvilken teknik der kan komme til anvendelse. Homogene sandede (eller grovere) jordlag med lav grundvandsgennemstrømning er mest velegnede til biosparging (Bowlen and Kosson 1995, Miljøstyrelsen 2002). Nedbrydningsraterne for oprensninger med biosparging ligger fra 1-10 mg/kg/dag (Bowlen and Kosson 1995, Otten et al. 1997, Damera 1999, Tang et al. 1999). En ny teknik som er ved at blive testet, er injektion af ozon. Teknikken bruges som forbehandlingstrin for biosparging. Ozontilførsel skal fremme nedbrydningen af de sværtnedbrydelige PAH forbindelser (Hinchee 1998). Figur 2. Princip ved biosparging (Otten et al. 1997). Forceret udvaskning Forceret udvaskning er en simpel in situ teknik, som kan anvendes på store områder, hvor de forurenende stoffer er lokaliseret i moderat til højpermeable jordlag. Indstrømning af vand gennem de forurenede jordlag øges og hermed øges udvaskningen af de forurenende stoffer i den umættede zone. Den forøgede vandgennemstrømning opnås typisk ved etablering af et cirkulationssystem, 18

19 hvor forurenet grundvand opsamles, renses og genanvendes (pump-and-treat) (figur 3). Den biologiske nedbrydning stimuleres ved tilførsel af ilt og næringsstoffer til vandet inden det genanvendes. (Miljøstyrelsen 1995, Miljøstyrelsen 2002). Figur 3. Princip ved forceret udvaskning (Otten et al. 1997). Biobarrierer En anden forholdsvis ny oprensningsteknik kaldes biobarrierer eller biovægge. Disse er baseret på en permeabel zone som indeholder eller skaber et reaktivt oprensningsområde rettet mod at opfange og oprense en forureningsfane (Puls 2001). En permeabel reaktiv barrierer (PRB) bruges til spredningskontrol og formålet med den er, at fjerne de forurenende stoffer fra grundvandsflowsystemet ved hjælp af fysiske, kemiske og biologiske processer. De fysiske/kemiske barrierer er generelt passive remedieringssystemer, som opbygges enten som en sammenhængende mur eller som en mur med områder der har en højere ledningsevne (porte). Barriererne kombineres ofte med beluftning eller forceret udvaskning (Semprini 1998, Tonnaer et al. 1999, Cox et al. 2002). Oprensning af hydrocarboner kan for eksempel udføres ved hjælp af en biologisk barriere (figur 4). Tilsætning af en elektronacceptor, oftest ilt eller sulfat, via en serie af brønde på tværs af en forureningsfane, resulterer i en opvækst af de allerede forekommende bakterier og dermed skabes en reaktiv barriere (Tonnaer et al. 1999, Spinnler et al. 2001). Mulige problemer for biobarrierer er passage af de forurenende stoffer over, under eller rundt om barrieren, ændringer i hastigheden eller retningen af grundvandsflow, ufuldstændig oprensning eller 19

20 tilstoppelse/nedsat permeabilitet af barrieren. Derfor er kortlægning af områdets hydrogeologi samt årstidsvariationer i grundvandstanden inden oprensningen påbegyndes en meget afgørende parameter for en succesfuld oprensning (EPA 2002). Figur 4. Eksempel på en aerob biobarriere i kombination med naturlig nedbrydning (Tonnaer et al. 1999). Grundvandssænkning. Grundvandssænkning har til formål at udvide den umættede zone og som er ensbetydende med at udvide den aerobe zone, hvor nedbrydningen af hydrocarboner er mest effektiv. Grundvandssænkning bruges når der er fare for at de forurenende stoffer skal sprede sig fra den umættede zone ned til den mættede zone (figur 5). Når grundvandssænkning bliver brugt, er det ofte i kombination med ventilationsteknikkerne. Grundvandssænkning er basalt set en fysisk teknik, men med de effekter på nedbrydningsprocesserne som en grundvandssænkning medfører, kan den godt kaldes for en biologisk stimuleringsteknik. Grundvandssænkning anvendes fortrinsvist på lokaliteter med lav grundvandstilstrømning, hvor det er muligt at opnå en tilstrækkelig pumpekapacitet (Walsted et al. 2002). 20

21 Figur 5. Forventet hydraulisk effekt ved etablering af dræn (Walsted et al. 2002). Fytoremediering Fytoremediering er en eksperimentel teknologi til oprensning af forurenet jord ved hjælp af planter og de dertilhørende bakterier. Der foreligger dog hidtil kun få forskningsresultater på området. De planter, der har været mest anvendt til formålet, er træer som poppel og pil, græsser som rajgræs og bælgplanter som lucerne. For letopløselige forurenende stoffer er optag, ophobning og nedbrydning i planterne samt fordampning herfra mulige fjernelsesmekanismer, mens fjernelsen af sværtopløselige forurenende stoffer foregår gennem bakterielle processer i planternes rodzone. I mange tilfælde er mekanismerne ikke identificeret med sikkerhed. Fytooprensning begrænses ud over at have en meget lang oprensningstid i, at teknikken kun kan anvendes til oprensning af forureninger med forholdsvis terrænnær udbredelse (ned til ca. 2 m) som 21

22 følge af planternes begrænsede roddybde. Det er derfor meget usikkert om relevante kvalitetskriterier kan matches ved hjælp af denne teknik (Salt 2000, Karlson et al. 2001, Miljøstyrelsen 2002). 5. Evaluering af bioremediering Dokumentation af effekten af en bioremedieringsteknik kræver ikke kun en påvisning af nedgang i koncentrationen af de forurenende stoffer, men også en påvisning af, at det er mikroorganismer, der er skyld i denne nedgang. Selvom andre processer kan bidrage til fjernelse af de forurenende stoffer (afgasning, udvaskning, kemisk nedbrydning m.m.), bør det kunne dokumenteres, at det er mikroorganismer, som har den største effekt. Generelt skal der opfyldes tre krav for at kunne påvise, at en given forureningsfjernelse kan kaldes bioremediering (NRC 1993): 1. Dokumentering af nedgang i koncentrationen af de forurenende stoffer. 2. Laboratorieanalyser som viser, at bakterier fra den pågældende lokalitet har potentiale til at nedbryde de forurenende stoffer under de forventede miljøforhold. 3. Et eller flere beviser på at det biologiske nedbrydningspotentiale faktisk bliver realiseret i felten, det vil sige at mikroorganismer er aktive og fjerner de forurenende stoffer in situ. Ad 1) Dette dokumenters ved hjælp af standardmålinger af jord- og grundvandsprøver i løbet af oprensningsprocessen. Ad 2) Vises ved at tage bakterier fra lokaliteten og påvise at disse har potentiale til at nedbryde de forurenende stoffer under velkontrolleret forhold i laboratoriet. I de tilfælde hvor de forurenede stoffer er letnedbrydelig, kan dette ofte omgås, hvis der foreligger tilstrækkelig med publicerede studier, der dokumenterer, at det enkelte forurenende stof er let nedbrydeligt og at det almindeligvis kan nedbrydes at bakterier. Ad 3) Det tredje krav er svært at opfylde. Der er tre måder at demonstrere biologisk in situ nedbrydning på (NRC 1993): 1) Laboratoriemålinger på jordprøver, 2) felteksperimenter og 3) 22

23 eksperimenter i modelsystemer. Jo flere af disse teknikker der bruges, des stærkere kan bioremediering understøttes. Følgende teknikker blev i 1993 beskrevet af NRC som værende brugbare: Kemiske og mikrobiologiske tests af jordprøver Antal bakterier Når bakterier metaboliserer forurenende stoffer, så formerer de sig som regel også (der kan også være tale om co-metabolisme). Derfor kan prøver der viser et fald i koncentrationen af de forurenende stoffer og en stigning i antal af hydrocarbon-nedbrydende bakterier sammenlignet med en kontrol, bruges som indikator for bioremediering. Dog er resultater af bakterietællinger generelt behæftet med stor usikkerhed og derfor kan denne metode ikke bruges som eneste bevis for bioremediering (Jørgensen et al. 1999, Cunningham and Philp 2000, Margesin et al. 2000). Antal protozoer Idet protozoer spiser bakterier, indikerer en øgning i antallet af disse også en øgning i antallet af bakterier. Denne form for ekstrapolering indeholder dog også stor usikkerhed og kan ligeledes ikke bruges som enkeltstående bevis (Madsen et al. 1991, Christensen et al. 1996). Rater af bakteriel aktivitet Målinger som demonstrerer, at bakterierne er i stand til at udføre de ønskede reaktioner ved signifikante koncentrationer af forureningskomponenterne, kan hjælpe med at vise bioremediering (Nelson et al. 1994). Bakteriel tilpasning Tiden for bakteriel tilpasning (lag-fasen) svarer til en aktivering eller tilførsel af gener (plasmider) med de ønskede egenskaber. Ved at vise, at bakterier nedbryder forurenende stoffer, som de ikke var i stand til eller gjorde meget langsomt i starten, antydes bioremediering (Leahy and Colwell 1990, Margesin et al. 2000). 23

24 Koncentration af uorganisk kulstof Bakterier producerer uorganiske kulstofforbindelser, såsom CO 2 og HCO - 3, når de nedbryder hydrocarboner. Derfor indikerer prøver med øget indhold af uorganisk kulstof i vand- og gasfasen, at der foregår biologisk nedbrydning (Margesin et al. 2000). Kulstofisotopforhold 13 C/ 12 C forholdet af uorganisk kulstof i en prøve afhænger af kulstoffets oprindelse. Dette forhold kan bruges på to måder. 1) Det er ofte tilfældet, at kulstoffet i de forurenende stoffer har et væsentligt anderledes 13 C/ 12 C forhold end det uorganiske kulstof, der kommer fra opløsningen af mineraler. Når organiske forurenende stoffer bliver nedbrudt til CO 2, så vil det uorganiske kulstof produceret fra de fleste organiske forurenende stoffer forblive beriget på 12 C i forhold til uorganisk kulstof produceret ved mineralaflejringer. Derfor, hvis det uorganiske kulstof fra jordprøverne har et 13 C/ 12 C forhold, som er meget lavere end forholdet af kulstof fra mineraler, så er det et tegn på biologisk nedbrydning (Höhener et al. 1998). 2) Den anden måde er ved at undersøge isotopfraktioneringen. Enzymer har en præference for lette isotoper, og derfor nedbrydes hydrocarboner med den lette 12 C-isotop hurtigere end dem med den tunge 13 C-isotop. Som et resultat af dette vil de tilstedeværende olieforbindelser blive relativt beriget med 13 C efterhånden som bioremedieringen fremskrider. Derfor kan observationer på fald i 13 C/ 12 C forholdet i det uorganiske kulstof sammenkoblet med en øgning af forholdet i hydrocarbonerne indikere, at det uorganiske kulstof bliver produceret ved biologisk nedbrydning af forureningskomponenten. Denne metode er lige for tiden under stor udvikling med henblik på at følge nedbrydningen af aromatiske hydrocarboner (Morasch et al. 2002, Richnow et al. 2002a, Vieth et al. submitted for publication). Koncentrationen af elektronacceptorer En formindskelse i koncentrationen af elektronacceptorer, der sker samtidigt med et fald i koncentrationen af de forurenende stoffer, er tegn på biologisk aktivitet og kan indikere at 24

25 bioremediering måske foregår. Elektronacceptorer bruges dog også til nedbrydning af andet organisk stof og derfor er koncentrationen af disse et meget uspecifikt mål for bioremediering (Höhener et al. 1998). Biprodukter fra anaerob aktivitet En øgning i koncentrationen af metaboliske produkter (bland andet methan, reducerede former af jern og kvælstofgas produceret af anaerobe bakterier) kan signalere en øgning i anaerob aktivitet og indikerer succesfuld bioremediering (Semprini et al. 1991). Koncentration af intermediære metabolitter Mikrobielle processer kan omdanne forureningskomponenter til specifikke intermediære metabolitter 9 og en øgning i koncentrationen af disse indikerer at bioremediering foregår. Denne metode bruges fortrinsvis i forbindelse med forureninger af klorerede hydrocarboner (Harkness et al. 1993, Stanley et al. 2000). Forholdet mellem nedbrydeligt/ikke-nedbrydeligt materiale Hvis en lokalitet indeholder en blanding af forureningskomponenter, så kan en nedgang i forholdet mellem de biologisk nedbrydelige og de ikke-nedbrydelige organiske forbindelser over tid indikere at mikrobiologisk nedbrydning finder sted. Dog kan dette forhold ikke fungere som enkeltstående bevis for bioremediering, da forholdet også påvirkes af differentiel transport og fordampning (Pritchard and Costa 1991, Nelson et al. 1994). Eksperimenter foretaget på lokaliteten Stimulering af bakterier Stimulering af den biologiske nedbrydning (for eksempel ved hjælp af et oxidationsmiddel eller næringsstoffer) i en mindre del af den forurenede lokalitet og efterfølgende monitering af om den 9 Også kaldet for biomarkører - stoffer som kun kan fremkomme ved biologisk aktivitet. 25

26 relative nedbrydningsrate forøges i dette kontrolområde, kan give en indikation af bioremediering (Miller et al. 1991, Margesin et al. 2000). Måling af elektronacceptor optagsrate Ved skiftevis at åbne og lukke for tilførslen af for eksempel ilt til det forurenede område kan optagsraten bestemmes og sammenlignes med et kontrolområde. Relativt hurtigt fald i iltkoncentrationen i det forurenede område kan sammen med et fald i koncentrationen af de forurenende stoffer give et mål for den biologiske nedbrydning (Semprini et al. 1990). Monitering af konservative sporstoffer Konservative sporstoffer (conservative tracers) har de samme kemiske- og transportegenskaber som biologisk nedbrydelige forbindelser, men de er ikke selv biologisk nedbrydelige. Derfor kan konservative sporstoffer bruges til at skelne mellem abiotiske ændringer i stofkoncentrationen og ændringer forårsaget af mikroorganismer (Kao et al. 2001, Schroth et al. 2001). Radioaktivt mærket forbindelser Ved at monitere skæbnen af syntetisk mærket forbindelser med en kendt mængde af en stabil isotop, som regel 13 C eller deuterium, kan det påvises om bioremediering foregår (Smith et al. 1991, Schroth et al. 2001). Eksperimentelle modeller Den sidste type af teknikker til evaluering af hvorvidt bioremediering foregår, bruger matematiske modeller og ligninger til at bestemme de forurenende stoffers skæbne. Formålet med at bruge modeller er, at se om forudsigelserne af de forurenende stoffers skæbne baseret på fortolkningen af de fænomener som finder sted under bioremedieringen holder stik med det som faktisk skete i felten og som bliver bestemt via prøvetagning (Chiang et al. 1989, Semprini et al. 1991). 26

27 5.1 Perspektivering Begrænsningerne for brug af bioremediering til oprensning af olieforureninger er få. De fleste begrænsninger forekommer i forbindelse med oprensning af forbindelser med lav opløselighed. Disse begrænsninger kan opdeles i følgende: 1) Mangelfuld viden om bakteriernes opførsel i jorden, 2) problemer med at levere de stimulerende stoffer til bakterierne i jordmatricen og 3) problemer med at sikre tilstrækkelig kontakt mellem bakterierne og forureningskomponenterne. Fremtiden vil med sikkerhed bringe ny viden på alle tre punkter og nye teknikker vil udvikles som følge af disse problemer samt nye oprensningsbehov. 6. Konklusion På baggrund af dette projektarbejde kan følgende konkluderes vedrørende oprensning af olieforureninger: Hydrocarboner kan nedbrydes af bakterier, både aerobt og anaerobt. Størst effekt opnås generelt ved aerob nedbrydning. Da mangel på ilt som regel er den største begrænsning for bakteriel vækst på forurenede lokaliteter, så er bioventilering den bedste oprensningsteknik for den umættede zone, mens den for den mættede zone er biosparging. Samtidig tilsætning af næringsstoffer (nitrogen og fosfor) kan som regel altid svare sig. Tilsætning af adapterede bakterier kan kun svare sig i forbindelse med oprensning af sværtnedbrydelige forbinder (PAH er og klorerede hydrocarboner). Fytooprensning er endnu ikke bevist tilstrækkelig effektiv til brug ved bioremediering. 27

28 Litteraturliste 1. Abbott, J. E., Alleman, B. C., Drescher, M. J., Pollack, A. J., Zwick, T. C., Watson, G. and Bowling, L Effects of Nutrient Addition on Biodegradation of Fuel-Contaminated Soils. In: Alleman, B. C. and Leeson, A. (eds.). In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp Albrechtsen, H.-J Identifikation og måling af betydende redoxprocesser. ATV Møde; Naturlig nedbrydning - en ny oprensningsteknik. Schæffergården, 14. oktober. 3. Andersen, L. L., Schondelmaier, A. M. and Toft, A Erfaringer med praktisk anvendelse af naturlig nedbrydning som afværgemetode. ATV Møde; Biologiske afværgeteknikker i jord og grundvand. Schæffergården, 6. november. 4. Anderson, W. C. (ed.) Bioremediation: Innovative site remediation technology. American Academy of Environmental Engineers, Maryland. 5. Armon, R. and Arbel, T Indigenous Soil Mikroflora Versus Introduced Mikroorganisms in Subsurface Bioremediation. In: Rubin, H., Narkis, N. and Carberry, J. (eds.). Soil and Aquifer Pollution: Non-Aqueous Phase Liquids Contamination and Reclamation. Springer-Verlag, Berlin, pp Atlas, R. M Bioremediation of Petroleum Pollutants. International Biodeterioration and Biodegradation 35: ATV-komiteen vedr. Grundvandsforurening Natural Attenuation for Remediation of Contaminated Sites. Schæffergården april. 8. Bach, J., Rikskov, U. and Gravesen, P Udvidet geologi og grundvand. Miljøstyrelsen. 9. Bleckmann, C. A., Wilson, E. J., Hayes, K. W. and Hercyk, N. L Land Treatment of Produced Oily Sand. In: Hinchee, R. E., Kittel, J. A. and Reisinger, J. H. (eds.). Applied Bioremediation of Petroleum Hydrocarbons. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp Bourquin, A. W. and Pedersen, T. A Bioremediation Engineering. In: Skipper, H. D. and Turco, R. F. (eds.). Bioremediation: Science and Applications. Soil Science Society of America, Special Publication; no. 43, pp Bowlen, G. F. and Kosson, D. S In Situ Processes for Bioremediation of BTEX and Petroleum Fuel Products. In: Young, L. Y. and Cerniglia, C. E. (eds.). Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals. Wiley-Liss, Inc. New York, pp Carvalho, D. F., Corsi, F. K., Furquim, F. E., Leal, P. and Durrant, L. R Diesel Oil: A Source for the Production of Biosurfactants. In: Alleman, B. C. and Leeson, A. (eds.). In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp Cassidy, D. P. and Irvine, R. L Biosurfactant Production by Indigenous Soil Microbes Degrading BEHP and Lubrication Oil. In: Wise, D. L., Trantolo, D. J., Cichon, E. J., Inyang, H. I. and Stottmeister, U. (eds.). Bioremediation of Contaminated Soils. Marcel Dekker, Inc. New York, pp Cederlund, H Fungal degradation of PAHs Effects of surfactants and rapeseed oil. Examensarbete 11, Institutionen för mikrobiologi, Sveriges Lantbruksuniveritet Uppsala. 15. Chiang, C. Y., Salanitro, J. P., Chai, E. Y., Colthart, J. D. and Klein, C. L Aerobic Biodegradation of Benzene, Toluene, and Xylene in a Sandy Aquifer - Data Analysis and Computer Modeling. Ground Water 27(6): Christensen, S., Rønn, R., Ekelund, F., Andersen, B., Damgaard, J., Friberg-Jensen, U., Jensen, L., Kiil, H., Larsen, B., Larsen, J., Riis, C., Thingsgaard, K., Thirup, C., Tom-Petersen, A. and Vesterdal, L Soil Respiration Profiles and Protozoan Enumeration agree as Microbial Growth Indicators. Soil Biol. Biochem. 28(7): Cox, E. E., Elder, C., Smith, B. and Klaiber, J Successfull In Situ Bioremediation of Chlorinated and Non- Chlorinated VOCs using a Sulfate Biobarrier. ATV Møde; Biologiske afværgeteknikker i jord og grundvand. Schæffergården, 6. november. 18. Cunningham, C. J. and Philp, J. C Comparison of Bioaugmentation and Biostimulation in ex situ Treatment of Diesel Contaminated Soil. Land Contamination & Reclamation, 8(4): Damera, R., Murali, D., Kinal, R. and McDermott, R Biosparging Under a Fuel Oil Plume to Expedite Site Closure. In: Alleman, B. C. and Leeson, A. (eds.). In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp Dernbach, L. S Failure of Nonindigenous Microorganisms to Remediate Petroleum Hydrocarbon- Contaminated Sites. In: Alleman, B. C. and Leeson, A. (eds.). In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp Devinny, J. S. and Chang, S.-H Bioaugmentation for Soil Remediation. In: Wise, D. L., Trantolo, D. J., Cichon, E. J., Inyang, H. I. and Stottmeister, U. (eds.). Bioremediation of Contaminated Soils. Marcel Dekker, Inc. New York, pp Dibble, J. T. and Bartha, R Effect of Environmental Parameters on the Biodegradation of Oil Sludge. Appl. Envir. Microbiol. 37: Ellis, B., Balba, M. T., and Thiele, P Bioremediation of oil contaminated land. Environ. Technol. 11: Eriksson, M., Dalhammer, G. and Borg-Karlson, A.-K aerobic degradation of a hydrocarbon mixture in natural uncontaminated potting soil by indigenous microorganisms at 20 C and 6 C. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: Eyk, J. van Petroleum Bioventing. Rotterdam: A.A. Balkema. ISBN Forsyth, J. V., Tsao, Y. M. and Bleam, R. D Bioremediation: When Is Augmentation Needed? In: Hinchee, R. E., Fredrickson, J. and Alleman, B. C. (eds.). Bioaugmentation for Site Remediation. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp *UELü-*DOLü ' DQG 9RJHO Transformation of Toluene and Benzene by Mixed Methanogenic Cultures. Appl. Environ. Microbiol. 53: Grischenkov, V. G., Townsend, R. T., MacDonald, T. J., Autenrieth, R. L., Bonner, J. S. and Boronin, A. M Degradation of Hydrocarbons in Crude Oil by Pure Bacterial Cultures Under Different Redox Conditions. In: Alleman, B. C. and Leeson, A. (eds.). In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds. Battelle Press, Columbus, Ohio, pp