Metodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein

2013/- 2014 Metodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein BACHELOROPGAVE UGE 41/2013 TIL UGE 01/2014 PH METROPOL KØBENHAVN BIOANALYTIKER UDDANNELSE HEIDI RAVN FØDT: 090277-1972 HOVEDVEJLEDER: ULLA T. MOL KLINIK VEJLEDER: DORTE HØYER

2

FORORD Denne bacheloropgave er blevet udført ved Bioanalytikeruddannelsen København i samarbejde med Biokemisk afdeling på Herlev Hospital. Dette projekt er udført i perioden 7. oktober, 2013 til 2. januar, 2014, hvor der blev udført forsøg i laboratoriet i perioden 9. oktober til 31. november, 2013. Jeg vil gerne takke mine to vejledere Ulla Tüschow Mol og Dorte Høyer, for god vejledning gennem hele projektet. Jeg vil også rette en tak til personalet på afdelingen for support og støtte, ved udførelse af projektet i laboratoriet, og tak til afdelings bioanalytikeren, Kristina Rasmussen, for friheden til brug af diverse reagenser og forsøgsmateriale. Opgavens faglige niveau er lagt således, at den primært henvender sig til andre bioanalytiker studerende, der har gennemført modul 14 af bioanalytikeruddannelsen eller biokemisk interesserede personer med en faglig baggrund, svarerende til en bachelorgrad i medicinsk laboratorieteknologi. Opgaven forudsætter at læseren har et kendskab til C Reaktivt Proteins opbygning, funktion I teksten skrives kildehenvisninger til artikler og bøger således: [forfatterens efternavn, årstal]. Herefter kan de slås op i litteraturlisten, som er opbygget med en overskrift, der ligner kildehenvisningen. I så fald, der er flere kilder til et givent afsnit, adskilles kilder med ; f.eks. [kilde; kilde; kilde]. Heidi Ravn 3

RESUMÈ Formålet: For denne opgave er formålet at udføre en delvis metodevalidering af P- høj Sensitiv C- Reaktive Protein massek; ved at analysere patient prøver på Cobas6000 fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo, og derefter sammenligne resultaterne parvis. Dette vil give et overblik, over om der er en forskel på de tre analyseapparaters måde at analysere hscrp på. Derudover vil projektet undersøge om der kan forekomme antigen excess ved at udsætte hscrp analysen på apparaterne for en prøve med en CRP koncentration > 250 mg/l. Metoder: Der blev ved metodesammenligning analyseret 50 patient blodprøver. Prøverne blev først analyseret på Kone30i og derefter på BN Prospec. Hvorefter det var muligt at sammenligne resultaterne med Cobas6000. Ved linearitetsforsøget blev de udførte fortyndingsrækker dannet ved en sekvens fortynding med apparatets egen dilluent. Der blev anvendt 25 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Ved Intraseriel præcision blev der indsamlet fem blodprøver ved hver koncentration, som var; [0 mg/l], [5 mg/l], [10 mg/l], [1 mg/l] og [3 mg/l], og dannet serum pool, som blev analyseret på Cobas6000, BN Prospec og Kone30i. Ved antigen excess blev der anvendt en høj CRP konc. i en prøve på 270 mg/l. Prøven blev analyseret på Kone30i. derefter Cobas6000 og til sidst analyseret på BN Prospec. Resultat: Metodesammenligning mellem Cobas6000 overfor BN Prospec er der beregnet en skæring på -0,2098, og en hældning på 1,1879. R 2 på 0,9927. resultatet for BN Prospec overfor Kone30i blev der beregnet en skæring på -0,6621, og en hældning på 1,0604, og R 2 på 0,9935. For Cobas6000 overfor kone30i. blev der beregnet en skæring på -0,8954, og en hældning på 1,2626, og en R 2 på 0,9909. Linearitetsforsøget for Cobas6000 er der beregnet en skæring på - 0,0535, og hældning på 0,9749, og en R 2 på 0,9956. For BN Prospec blev beregnet en skæring på 0,4184, og en hældning på 0,9986, og en R 2 på 0,9991. Kone30i Blev beregnet en skæring på 0,504, og en hældning på 1,0091, og en R 2 på 0,9974. Intraseriel præcision blev CV % beregnet for Cobas6000 ved alle fem koncentrationer og lå mellem 0,56 % - 1,92 %. For BN Prospec blev CV % beregnet til 0,94 % til 7,57 %. Og Kone30i lå mellem 1,28 % til 3,52 %. Antigen excess Cobas6000 målte CRP prøven til 355 mg/l, BN Prospec fik et resultat på 276 mg/l og Kone30i målte CRP i prøven til 421 mg/l. Konklusion: Ved metodesammenligning af Cobas6000, BN Prospec og Kone30i vurderes det at der er en forskel i de tre apparaters måde at analysere hscrp på, men der ses en tendens til lineær sammenhæng ved sammenligning parvis af alle tre apparater i det lave område, da R 2 - værdierne ligger tæt på 1, for alle apparaterne når de sammenlignes parvis. Der er ved linearitetsforsøget lineær sammenhæng for alle tre apparater ved analysering af hscrp, da korrelationsværdien var tættest på 1 ved analysering af hscrp på alle tre analyse apparater. Der ses en tendens til at Cobas6000 og BN Prospec måler med en lille forskel, men for alle tre apparater ligger de tæt, i forhold til apparaternes måde at analysere hscrp ved Intraseriel præcision. Det er derfor ikke muligt at vurdere hvilket analyseapparat der analyserer hscrp med den bedste præcision. Ved antigen exces har det ikke været muligt at detektere antigen excess for Cobas6000, BN Prospec eller Kone30i, ved måling af en høj hscrp koncentration på 270 mg/l. 4

Indholdsfortegnelse Problembaggrund... 7 Formål... 9 Problemformulering... 10 Hypoteser... 10 Begrebsdefinitioner... 11 Teori... 11 C- Reaktivt Protein... 11 Analyseprincip... 12 Måleprincipper... 13 Metodevalg... 15 Præanalyse:... 15 Etiske overvejelser.... 16 Metodeopsætning... 16 Kvalitets kontrol... 16 Kalibrering og kontroller... 17 Metodesammenligning... 18 Linearitet... 19 Intraseriel præcisions... 20 Antigen excess... 21 Afgrænsning... 22 Metode og materialer... 24 materialer... 24 Apparatur... 24 Reagenser... 24 Prøvemateriale... 25 Metode... 26 Kvalitetssikring.... 26 5

Metodesammenligning:... 26 Linearitet:... 26 Intraseriel præcision:... 28 Antigen excess... 29 Resultater... 30 Kvalitetssikring... 30 Metodesammenligning... 43 Linearitet:... 49 Intraseriel Præcisions... 53 Antigen excess... 54 Diskussion... 55 Metodeopsætning og kvalitetssikring... 55 Metodesammenligning... 57 Linearitet:... 62 Intraseriel Præcisions:... 64 Antigen excess:... 69 Konklusion... 71 Perspektivering... 73 Referencer... 74 Bilag... 78 Bilag nr.1... 78 Bilag Nr. 2... 79 Bilag Nr. 3... 80 Bilag Nr.4... 81 Bilag nr.5... 82 Bilag Nr. 6... 83 Bilag Nr. 7... 84 6

Problembaggrund I Danmark er der i år ca. 420.000 danskere, som lever med en kardiovaskulære eller perifere vaskulære sygdomme. Af dem er der ca. 150.000 danskere der har iskæmisk hjertesygdom, som er den hyppigste hjertesygdom i Danmark. Ud af de 150.000, er der ca. 72.000 der har haft en akut blodprop i hjertet [1]. Forskning har vist, at infektionsmarkører der afspejler de inflammatoriske processer er forhøjet blandt individer med høj risiko for fremtidig hjertesygdom [2,3]. P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek er den infektionsmarkør, der har vist sig at være mest stabil som en hjertemarkør, der kan bruges til screening af umiddelbare raske personer i høj risiko gruppe for Cardio vaskulære og perifere vaskulære sygdomme[1]. Men også for patienter ved tidlig indledning af aterosklerotiske trombose i arterierne, samt emboli af trombose, der resulterer i hjerteanfald og alt for ofte, pludselig død [1]. Der er udviklet en mere sensitiv analysemetode, som hedder High Sensitive C- Reaktive Protein, (hscrp), som i forhold til den alm. CRP analysemetode, kan detektere det samme CRP molekyle ved meget lave koncentrationer [5,6]. Der er forskellige målemetoder for analysering af hscrp, da det er muligt at analysere ved tubidimetri eller nephleometrisk måleprincip, som her i opgaven vil blive sammenlignet overfor hinanden parvis ved analysering af P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek. På Biokemisk afdeling på Herlev Hospital er analysen blevet analyseret på Kone60i, for både rutinen og forskningen, indtil 01.05. 2013, hvor rutinen valgte at flytte analysering af specifikke proteiner inkl. hscrp hen på BN Prospec fra Siemens. Antistoffet til analysen på Kone60i ikke blev produceret mere. Forskningen havde dermed ikke andre muligheder end at flytte deres hscrp prøver hen på BN Prospec. Men der er blevet produceret et reagenskit til Konelab fra Thermo, som gør det muligt at analysere hscrp på analyseapparatet igen. Forskningen overvejede at benytte reagenset, men fravalgte dette på grund af prisen. En anden udfordring er den alt for lille kapacitet på BN Prospec, 7

der gjorde at forskningen anskaffede en Cobas6000 fra Roche, og valgte så at analysere deres hscrp prøver på denne analyse apparat. BN Prospec kunne ikke følge med i forhold til antallet af rutine prøver, derfor flyttede afdelingen også analyseringen af rutinens hscrp over på Cobas6000 den 01.10.2013. Klinisk biokemisk afdeling på Herlev hospital, har 3 analyseapparater der kan analysere hscrp. For den daglige rutine analysering af hscrp på patienter, og for forskningsafdelingen, har der analyseret hscrp på en Herlev - Østerbro undersøgelsen, været udfordringer om hvilket analyse apparat, der skulle anvendes til analysering af hscrp, målt på serum. For alle tre analyseapparaters vedkomne er selve analyseringen af hscrp målt på serum eller plasma ikke valideret. Da det nye reagenskit til Konelab fra Thermo ikke var anvendt, er det muligt at benytte dette kit til analysering ved projektet, og da der stadig er reagens tilbage til analysering af hscrp på BN Prospec, er det muligt at udføre en delvis metodevalidering af hscrp analysemetode på Cobas6000 fra Roche, Kone30i fra Thermo, og BN Prospec fra Siemens. Metodevalideringen omfatter en metodesammenligning, linearitets forsøg, Intraseriel præcision og antigen excess. Valideringsparametrene bliver udført på alle tre analyse apparater, og vurderet overfor hinanden parvis. CRP analyseres ved to forskellige analysemetoder. Den almindelige CRP i den daglige rutine på Kone60i fra Thermo, der defineres som P- C- Reaktivt protein [CRP], med et reference interval på [< 10 mg/l]. hscrp defineres også P-C- Reaktivt protein [HSCRP], med en beslutningsgrænse, med en øvre grænse på [3 mg/l], og analyseres på forskningsapparatet Cobas6000 fra Roche. Der foretages en rundringning til 4 af de store hospitaler i København, samt RHEL 1 og SSI 2 (se bilag nr.1). Forspørgelsen viser, at analysering af hscrp bliver udført på forskellige apparater alt efter laboratoriets valg af udbyder. Producenterne for de tre apparater har stillet en grænse for antigen excess, da det ikke er ligegyldigt hvor meget antistof der tilsættes som reagens for at detektere CRP i en patient prøve. 1 Regionhovedstadens elektive laboratorium, (før KPLL) 2 Statens serum institut. 8

Et resultat, kan detekteres som et falsk for lavt resultat, da der er mulighed for forkert aflæsning af resultat ved en høj CRP prøve. For producenten Thermo, som producerer reagenskittet til Konelab skriver producenten, i metodebladet, at der ikke vil forekomme antigen excess for prøver med en koncentration på op til 300 mg/l [9]. For Roche, der producerer reagenset til Cobas6000 er grænsen for antigen excess grænsen fastsat til 1000 mg/l [8]. Siemens, der producerer reagenset til BN Prospec, har ikke fastsat en grænse i deres metodeblad for antigen excess. Men refererer til et studie, som Siemens selv har udført, hvor de anvender 71 patient prøver på 500 mg/l, uden at der er forekommet antigen excess [13]. En artikel har ved en metodesammenligning også undersøgt fire apparater for antigen excess, ved en høj koncentration af CRP på 480 mg/l, ved analyse apparater der anvender turbidimetri og nephleometri so målemetode ved hscrp analysemetode [22]. Formål Formålet med denne opgave er at udføre en delvis metodevalidering af P- høj Sensitiv C-Reaktive Protein massek; ved at analysere patient prøver på Cobas6000 fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo, og derefter sammenligne resultaterne parvis. Dette vil give et overblik, over om der er en forskel på de tre analyseapparaters måde at analysere hscrp på. Derudover vil projektet undersøge om der kan forekomme antigen excess ved at udsætte hscrp analysen på apparaterne for en prøve med en CRP koncentration > 250 mg/l. 9

Problemformulering Kan der ses en forskel på P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek. analyseret på BN Prospec, Cobas6000 og Kone30i, ved en metodevalidering af udvalgte parametre, som metodesammenligning, linearitet, Intraseriel præcision. Der undersøges også for antigen excess., på alle tre apparater. Hypoteser Metodesammenligning: - Ved analysering af hscrp på de tre apparater, måler BN Prospec detektere en lavere koncentration, da Cobas6000 og Kone30is måleprincip er turbidimetrisk og BN Prospec er Nephleometrisk måleprincip, og er derfor bedre til detektion af specifikke proteiner, som CRP molekyler, analyseret ved en Høj sensitiv analyseprincip. Linearitet: - Der vil være en lineær sammenhængen ved vurdering af de tre analyse apparater linearitet, ved lineær regression. Intraseriel præcision: - Ved det Intraseriel forsøg for alle treanalyse apparater forventes en CV %, tæt på producenterne angivet CV % fra metodebladene for de tre apparater. For BN Prospec forventes en CV % på max 3 % [7]. For Kone30i forventes en CV % på max 2 % [8]. For Cobas forventes en CV % på max 1,6 % [9]. 10

Antigen excess: - Der vil ikke forekomme antigen excess på de tre apparater ved analysering af hscrp ved måling af en [CRP] med en koncentration > 250 mg/l. da de alle tre apparater vil fortynde til prøven er i kalibreringsområdet, så det er muligt at afgive et analyse resultat. Begrebsdefinitioner - Konelab; Er der tale om Kone30i og Kone60i. - CRP og hscrp er det samme molekyle i blodet der bliver analyseret, men hscrp er et mere sensitivt assay, og måler CRP i lave koncentrationer, [ 3 mg/l.] - Labka er det system hospitalerne har med alt information vedrørende patienter og svarene på de analyse resultater der ønskes at vide noget om, og som alle afdelinger anvender som kommunikation imellem hinanden, til oplysninger omkring svar på patienters prøver. - [HSCRP] er patientprøver analyseret på Cobas6000 for hscrp defineret i Labka for analysen - [CRP] er patientprøver analyseret på Kone60i for CRP defineret i Labka, for analysen - hscrp er de patientprøver der analyseres i dette projekt, og som analyseres på Cobas6000fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo. Teori C- Reaktivt Protein C- reaktivt protein(crp) er et af de mange akutfase proteiner, der normalt er til stede som protein i blodet. CRP koncentrationen i blodet for raske personer er < 1mg/L. Klinikere anvender CRP til at undersøge om patienter har en infektion eller ej. Niveauer af CRP stiger hurtigt i respons på infektion og inflammation, og falder tilsvarende lige så hurtigt med ændring af tilstanden [5,6]. Således er målingen af CRP almindeligt anvendt til at overvåge forskellige inflammatoriske tilstande, da CRP koncentrationen i blodet kan stige fra 50 til over 500 mg/l. Ved en bakteriel infektion stiger CRP i blodet til 20-500mg/L, mens CRP ved en viral infektion vil være under 30 mg/l [5,6]. 11

For akutfaseproteinerne er CRP koncentrationen i blodet den hurtigst stigende ved en infektion [5,6]. CRP er første respons i den akutte fase af det cellulære immunrespons og er reguleret af cytokiner, der bliver frigivet af makrofager og neutrofile granulocytter ved fagocytering af en mikroorganisme eller en nekrotiseret celle [5]. Cytokinerne er et signal stof til hepatocytterne i leveren, om at syntisere mere CRP, der derefter frigives ud i blodet, hvor CRP er med til at lave en kompliment - binding til fremmede eller beskadiget celler via Fc receptorerne. Dette fører til generering af cytokiner, der forbedrer den inflammatoriske reaktion [5,6]. CRP måles på forskellige analyse apparater, alt efter klinisk biokemisk afdelings beslutning om apparatur. Ved svarafgivelse lavere end < 3 mg/l, afgives ikke et specifik svar, det kliniske svar vil derfor være < 3 mg/l [5,6]. hscrp bliver også målt på forskellige analyseapparater, men med et måleområdet på 10 mg/l. Hvis hscrp er 1-3 mg/l, er patienten i moderat risiko, og >3 mg/l er høj risiko, for at udvikle cardio vaskulære og perifere vaskulære sygdomme, i en eller anden grad [6]. Det er derfor vigtigt at det valgte analyse apparat, med en analysemetode, der har en validitet i analyseresultaterne 10 mg/l [6]. Analyseprincip For Cobas6000, BN Prospec og Kone30i gælder det analyseprincip for hscrp analysen. En mikropartikel er coatede med antistof rettet mod human CRP. Antistoffet vil danne agglutinationer, hvis der forekommer CRP i patient blodprøven [13], som vist i figur nr. 1. Figur 1. Viser helt til venstre at antistoffet er coatede til en partikel, og i midten illustreres at der tilsættes prøven med CRP molekyler i, som så ved delen helt til højre viser at der dannes antigen- antistof komplekser. http://library.aua.edu.ag/webpath/webpath/microbio/microbe/microbe05.htm 12

Måleprincipper BN Prospec anvender nephleometri, som måleprincip. Ved nephleometri måles lyset, som spredes af antigen- antistof komplekser. Lys spredningens intensitet, er proportional med mængden af antigen- antistof komplekser i prøven [13]. Kone30i og Cobas6000 anvender tubidimetri som måleprincip, hvor det er det absorberede lys, der måles. [14]. Nephleometri og Tubidimetri For analysering ved nephleometri og tubidimetri anvendes et spektrofotometer. En lysstråle fra en lampe sendes gennem en kuvetten ved begge måleprincipper, til bestemmelse af en bestemt partikel koncentration i en prøve [14]. Figur nr. 1 viser de to måle-princippers måder at opfange lyset på. Lys spredningen og absorbsionen afhænger af bølgelængde og partikelstørrelse, da nephleometri måler lyset, som spredes af de partikel komplekser, der er aggregeret i prøven. Ved tubidimetri måles mængden af det absorberet lys [14]. Kilde: Michael Bishop Et. Al, Clinical Chemistry, 6 udgave, 2010, side 140. Figur 2. Viser et princip skitse af nephleometri og Tubidimetri. Ved nephleometri måles lyset, som spredes af antigen- antistof komplekser. Lys spredningens intensitet, er proportional med mængden af antigen- antistof komplekser i prøven[13]. Både Kone30i og Cobas6000 anvender tubidimetri som måleprincip. Ved en tubidimetri måles det absorberede lys [14]. 13

Testopsætning af BN Prospec Ved hscrp anvendes polystyrenpartikler coatede med monoklonale antistoffer i reagenset, der vil danne antigen-antistof komplekser ved at de aggregere hvis CRP er til stede i patient blodprøven [13]. Først udføres en test fortynding, som er en præreaktion, hvor der mixes lidt af serum med dilluent og antistof med proben. Hvis der kommer en meget hurtigt stigning i lys spredningen, også kaldet antal bits. Næste fortynding fremstilles automatisk, indtil at resultatet af præreaktionen ligger inden for BN Prospekts grænse [13]. For aflæsning af målesignal bruger BN Prospec en matematisk algoritme, som hedder V Line Integral [7,13], hvor det er ændringen i lys spredningens intensitet pr. tidsinterval, der beregnes. På denne måde er reaktionens maksimumhastighed proportional med protein koncentrationen. Derved bruger denne BN Prospec reaktionskinetikken til at fastslå, hvor mange måle punkter, der skal til for beregning af reaktionshastighed ved lineær regression [7,13]. Ved kalibrering af målemetoden for en nephleometrisk måling er det påkrævet med en kvantitativ kalibreringskurve, da forholdet mellem målesignalet og protein koncentration ikke er lineær, skal der en flerpunkts kalibrering til [7]. Dvs. at der skal flere fortyndinger med en kendt koncentration af antigen. Standard fortyndingerne sammenlignes med mål signalerne fra prøven med ukendt antigen koncentration. Dermed omsættes prøvens målesignal til koncentration ved brug af kalibreringskurven [7]. BN Prospec anvender 6 fortyndinger til kalibreringskurven. Ved hjælp af en matematisk log it log funktion beregner BN Prospec kalibreringskurvens forløb og dermed ændres kalibreringskurven til en ret linje [7]. Testopsætning for Kone30i Først tilsættes hscrp buffer i en reaktions kuvetten, derefter tilsættes serum og blandes. Reaktions kuvetten inkuberes i 200 sekunder, ved 340 nm, hvor der aflæses en absorbans ved 1. aflæsning. Derefter tilsættes reagenset med det specifikke antistof rettet mod human CRP og blandes med en lille mikser. Reaktions kuvetten inkuberes igen men ved 300 sekunder, hvorefter aflæsning nr. 2 foretages ved 540 nm [10,11]. - Forskel i absorbans beregnes ved at aflæsning nr. 2 minus aflæsning nr. 1. 14

Forskellen i absorbans omsættes via en kalibreringskurve til en koncentration. Ved kalibrering af hscrp analysemetoder på Kone30i anvender analyseapparatet 5 fortyndinger ud fra en kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Der dannes en krum kurve ved en splein- funktion men her ændres kurvens forløb ikke til en ret linje ved en matematisk funktion, den forbliver krum [9,14]. Testopsætning for Cobas6000 Afpipetering af serum sker hvert 6. sekund. Hvorefter hscrp buffer tilsættes, som er reagens nr. 1. Derefter tilsættes det monoklonale specifikke antistof rette mod human CRP i prøven, som er reagens nr. 2. Der ultralyds- mikses efter hver tilsætning, hvorefter reaktionen forløber [12]. Aflæsning sker i en cyklus med 8 sekunders interval ved en bølgelængde på 540 nm. Se Bilag nr. 2 Absorbansen omsættes til koncentration via en kalibreringskurve [12]. Ved kalibrering af hscrp analysemetoden på Cobas6000, anvender analyse apparatet en kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Ud fra denne laves 6 fortyndinger, som den danner en krum kalibrerings-kurve, der rettes ud ved en matematisk funktion til en ret linje [12]. Metodevalg Præanalyse: Prøvematerialet, for hele projektet, er patient blodprøver taget ved venepunktur, indsamlet i Rød/gul gel glas med clot aktivator, fra Greiner- bio One med Lot nr. A1306X0, holdbarhed: 08-2014, og derefter centrifugeret. Da patient blodprøverne er fra den daglige rutine, er prøverne allerede analyseret enten som [CRP] på Kone60i eller [HSCRP] på Cobas6000, og afgivet klinisk resultat her for. [CRP] blev brugt til forsøg hvor koncentrationen af CRP i prøven skulle være 3mg/L. [HSCRP] til forsøg koncentrationen var 3mg/L, da [CRP] på Kone60i kun måles ned til en koncentration på 3 mg/l. Ved selve analyseringen af forsøgene i dette projekt blev Kone60i udskiftet med en Kone30i. Kone60i er en rutine apparat, som er meget belastet i den daglige rutine analysering. Derfor var 15

det ikke muligt at anvende apparatet til selve projektet, da det nye reagenskit til Konelab vil kræve tid for opsætning på analyseapparatet. Etiske overvejelser. Patienter der deltager i dette projekt, vil være anonyme, da patient blodprøverne vil blive blændet efter udvælgelsen i Labka. Dermed er det ikke muligt at genfinde patienterne. De patienter der vælges til projektet har allerede fået afgivet som enten [CRP] eller et [HSCRP], og vil derfor ikke give ny viden til patienten. Da der til valideringsforsøgene bruges patientmateriale, der allerede er rekvireret af afdelingen, vil det ikke kræve patient sammentykke. Metodeopsætning Testopsætning for BN Prospec og Cobas6000 var indlagt i apparaterne inden projektets start. På Kone 30i, blev testopsætningen lagt ind i apparatet ved projektets start, ud fra firmaets anbefalinger. Der blev ikke indlagt en kontrol, da reagenskittet er nyt, og derfor ikke indkørt nogen kontrolværdier, for hscrp analysen. Kvalitets kontrol Ved opstart af projektet bliver der udført daglig vedligeholdelse på BN Prospec og Kone30i. for Cobas6000 var er der udført daglig vedligeholdelse af en forsknings bioanalytiker. For vurdering af kvalitetskontrol, vil der blive foretaget kalibrering af analyse apparaterne, som anvendes ved dette projekt, og for godkendelse af hscrp analyse vil der blive analyseret kontroller, for alle tre apparater. Ved kalibrering fastlægges apparatets respons, som funktion af koncentrationen af analysestoffet, ved at anvende en eller flere kalibrator, som er en opløsning med en kendt værdi af analysestoffet. Det er vigtigt at kalibrere inden for hele måleområdet, da det vil sikre at prøvens resultat ligger indenfor det område hvor der er kalibreret, da analysesvaret ikke vil være brugbart som svar på en prøve. Valget af kalibrator er oftest fra producenten af det reagenskit man ønsker at anvende [20]. Valget af kontrol materiale kan være materiale, som laboratoriet selv har fremstillet, som kan anvendes til daglig kontrol. For valg af kontrol materialer skal kontrollens egenskaber ligge nogenlunde op af patientprøver, da kontroller anvendes til daglig kontrol af analysens præcision og korrekthed [20]. 16

Kontrol materiale kan også være købt af en producent, der har tillagt kontrolmaterialet en koncentration af det analyse parameter, som man ønsker en kontrol af på et apparat [20] For godkendelse af kontroller på apparaterne, vurderes ud fra et acceptinterval, som er det interval kontrollerne ønskes at ligge indenfor [20]. Kalibrering og kontroller Cobas6000 vil være kalibreret og analyseret den daglige kontrol af en forsknings bioanalytiker, som også vil stå for godkendelse af apparatet til analysering af hscrp. BN Prospec vil blive kalibreret, med N Reumatologisk standard SL kalibrator, fra Siemens, med en Target værdi på 20,3 mg/l, som vist i tabel nr.1 ved opsætning af reagenser. Derefter inden analysering af projektets serum prøver, vil der ved hvert forsøg blive analyseret to kontroller. Cardiac Marker, som har et acceptinterval på [0,191 0,251 mg/l], og er en lav kontrol. Men også Immunology, som har et acceptinterval på [5,019-5,419 mg/l], og er den høje kontrol, se tabel nr. 2, begge kontroller er fra Siemens, se bilag nr. 3. Kone30i bliver der efter testopsætning af det nye reagenskit, og opsætning af reagenser kalibreret, med en CRP HS Kalibrator fra Thermo, med en Target værdi på 10,66 mg/l, som vist i tabel nr.1. Der er for det reagenskit ikke indkørt en kontrol, som det fremgår af tabel nr. 2, er der ikke et acceptinterval til godkendelse af en kontrol for denne hscrp analyse. Der vil blive anvendt den samme kontrol som der anvendes på Cobas6000, da det er laboratoriets fastlagte kontrol, for daglig godkendelse af hscrp prøver. For at kunne acceptere kontrollen på Kone30i, vil acceptintervallet for Cobas6000, blive anvendt for godkendelse af kontrollen på Kone30i ved dette projekt. Kalibrator: 17

Apparat. Kalibrator Producent Target værdi BN Prospec Kone30i N- Reumatologisk standard SL CRP HS kalibrator Siemens Thermo 20,3Mg/L 10,66 mg/l Tabel1. Viser de Kalibrator der blev anvendt til BN Prospec og Kone30i, til godkendelse af hscrp analysen. Hvert reagenskit har deres egen kalibrator, og target værdi er fastsat af producenten for reagenskittene. Kontroller: Apparat: Navn: Producent Accept interval: Cobas 6000 Chemistry, Randox nr.1 Randox [1.156-1.396 mg/l] BN Prospec Cardiac marker Siemens [0,191-0,251 mg/l] Kone30i Immunology Chemistry, Randox nr.1 Siemens [5,019-5,419 mg/l Randox - Tabel 2. Viser acceptintervallerne for de valgte kontroller til de tre apparater, for Cobas6000 var Randox kontrollen allerede godkendt af en forsknings bioanalytiker, for BN Prospec blev der anvendt en høj og en lav kontrol. For Kone30i blev der anvendt den kontrol, der anvendes på Cobas6000, da reagenskittet til apparatet ikke er indkørt, og har derfor ikke et fastlagt acceptinterval. Metodesammenligning Ved denne metodesammenligning vurderes det om der er en forskel i resultaterne for de tre analyse apparaters måde at analyserer hscrp målt i serum på. For udførelsen af metodesammenligningen, vælges ca. 50 blodprøver, som skal ligge inden for det valgte måleområde, på 10 mg/l. Det er vigtig at kunne vurdere hele måleområdet, men også vigtigt at have en del prøver til metodesammenligningen, for validiteten af resultatet [16]. Patient prøverne udvælges ud fra [HSCRP] analyse resultater fra Cobas6000. Derefter analyseres de samme prøver på Kone30i og BN Prospec. De ca. 50 serumprøver vil give et Måleresultat, der har en stor validitet, i forhold til at bearbejde resultaterne statistisk. Selve databehandlingen vil blive bearbejdet ved lineær regression, ved at benytte X og Y plot, for at få et kvantitativt overblik over data fra analyserne [16]. Derved konstrueres en regressionslinje ud fra punkterne i 18

diagrammet. Ud fra korrelations-værdien(r 2 - værdi) 3, kan sammenligningen af de to analyse apparater vurderes, ved at se om R 2 er tæt på 1 [16], ved parvis sammenligning af apparaterne. Derefter udføres et differensplot, for at tjekke overensstemmelsen mellem de to analyse apparater, der parvis sammenlignes. Det vil give et overblik over, om de to metoder, der sammenlignes parvis, giver samme resultat [16], udfra differenceplottet vil der blive valgt tre punkter i det lave måleområde (0-3 mg/l), til udregning af en procentvis afvigelse, da det kan give et billede at hvor stor afvigelse apparaterne har imellem sig ved parvis sammenligning. Til sidst vil der blive udført et konfidenceinterval, for de databeregninger ved lineær regression, som er en anden måde at se om der er sammenhæng, ved at se om hældningen er tæt 1, og skæring er tæt på 0, da dette vil give en sammenhæng ved sammenligning af de tre apparater parvis overfor hinanden. Linearitet Ved linearitetsforsøget undersøges om der er direkte proportionalitet mellem koncentration og mål resultatet på de tre analyseapparater indenfor det ønskede måleområde på [< 10 mg/l.] [16]. Dette vil give en bestemmelse af måleområdet ( 10 mg/l), om der evt. vil være en lineær sammenhæng mellem analysekomponentens respons og koncentrationen [17]. For behandling af resultaterne udføres lineær regression, hvor der vil blive udført et x og y plot, for hvert enkelt apparat, ved at have beregnet koncentration ud af x aksen og målt koncentration ud af y aksen. Udfra dette plot kan der beregnes en R 2 værdi, som skal være tæt på 1[17]. Der vælges 6-10 patient prøver med en [CRP] koncentration målt til ca. 40 mg/l, på Kone60i. Antallet af prøver bliver valg på baggrund af mængden af serum. Det er vigtigt at kunne analysere på alle tre apparater, og dermed have nok serum. Valget af patient blodprøver med en [CRP] Koncentration, er på baggrund af, kalibreringsområdet, da de 40 mg/l ligger inden for dette område, og en CRP koncentration på 40mg/L med en god præcision, [9]. 3 Er den værdi der angiver, om der er sammenhængen mellem de 2 forskellige analysemetoder. R- Værdi, skal ligge tæt på 1 19

Intraseriel præcisions Intermediær præcision er en analytisk variation til bestemmelse mellem uafhængige mål resultater, som opnås ved samme analysemetode, på samme prøvemateriale, og i samme laboratorium. Intermediær præcision inddeles i Interseriel og Intraseriel præcision [17,19], - Interseriel præcision er målinger taget over et større tidsrum, dvs. fx flere dage. - Intraseriel præcision, er målinger inden for kort tidsinterval, som fx samme dag og samme serie [17,19]. Ved dette forsøg vil der blive udført en analytisk variation ved Intraseriel præcision, og der vil blive valgt 5-10 patient blodprøver, for hver koncentration i henholdsvis lave, middel og høje område af måleområdet. Det er vigtigt at der er serum nok til at Poole med, da serum poolene skal analyseres på alle tre apparater. De tre ønskede områder er inddelt således: - Lav [0 3 mg/l] - Mellem [3 6 mg/l] - Høj [6 10 mg/l] Det er vigtig at inddele måleområdet i disse tre koncentrations niveauer, så prøverne er fordelt i hele måleområdet. Dette giver et billedet af hvordan de tre apparater måler inden for måleområdet. Analyseringen vil ske samme dag og ved at analysere 6-10 gange ved samme reagens Lot. nummer, kalibrering, kontroller og med samme bioanalytiker, da det ønskes, at der kun er variation i apparat skiftet [16,19]. Bearbejdning af analyse resultaterne beregnes ved en kvantitativ opsummering af data tallene. Først beregnes middelværdi. Middelværdien skal bruges til beregning af SD. SD beskriver hvor langt de enkelte målinger ligger fra middelværdien [17,19]. Derudover beregnes CV %, for at se om spredning er stor eller lille [17,19]. Ved at sammenholde resultaterne med producenternes angivet CV % fra deres metodeblade, overfor dette projekts beregnede CV % er det muligt at vurdere om spredningen skyldes en analytisk variation, apparaterne imellem. 20

Antigen excess For bestemmelse af et protein, som CRP ved en antigen/antistof reaktion, er det vigtigt at prøven er fortyndet, sådan at resultatet altid vil befinde sig på venstre side af kurven, se figur 3. Der er ellers mulighed for, at en udfældning/målesignal kan have to aflæsningspunkter på kurven. Dvs. at det første signal for antigen måling ligger i den stigende gren i antistof overskudsområdet, og det andet punkt ligger på den faldende gren i antistof overskudsområdet [18]. Dermed er det muligt at aflæse to punkter på referencekurven, og derved muligt at aflæse et falsk for lavt resultat, ved en høj CRP prøve. Kurven kan inddeles i 3 zoner ved at kigge på figur nr.3 - Antistof excess zone Opløsningen indeholder overskud af Antistof, kompleks dannelse giver Anledning til absorbans stigning, der er proportional med mængden CRP i prøven[18]. - Ækvivalens zone Den maximale kompleksbinding er nået [18]. - Antigen excess zone. Overskud af antigen, vil danne små opløselige komplekser, der vil give en falsk for lav absorbans [18]. Kilde: http://www.life.umd.edu/classroom/bsci423/song/lab5.html Figur 3. Grundlæggende princip i immunkemisk proteinbestemmelse, ved brug af kalibreringskurve. Ved en blå del af kurven indeholder opløsningen overskud af Antistof, kompleks dannelse giver Anledning til absorbans stigning, der er proportional med mængden af CRP i prøven, og ved den lilla del af kurve er den maximale kompleksbinding er nået, og til sidst i den røde del af kurven er der overskud af antigen, og dette vil danne små opløselige komplekser, der vil give en falsk for lav absorbans. 21

Producenternes grænse for antigen excess: Da producenterne Thermo og Roche har sat nogle grænser op på antigen excess for deres apparater(kone30i og Cobas6000), vil det være muligt ved dette forsøg at afprøve om denne påstand er rigtig [8,9]. For BN Prospec er der ikke opgivet en antigen excess grænse i deres metodeblad, men Siemens har udført et projekt selv. Hvor der er udført en analysering af hscrp, med 71 patientprøver med en CRP koncentration på 500 mg/l [13]. Ved analysering af alle tre apparater med en patient prøve på en høj [CRP] koncentration, vil det kunne give et billedet af om der vil forekomme antigen excess på de tre apparater ved analysering af hscrp. - Kone30i er der en koncentration grænse på 300 mg/l [9]. - Cobas6000 er der en koncentrations grænse på 1000 mg/l [8]. - BN Prospec er der ingen. Ved dette forsøg vælges patient blodprøver ved en koncentration > 250 mg/l, for tjek af antigen excess, ved at teste den øvre grænse, som producenterne har sat for antigen excess, på alle tre apparater [8,9]. Der vil ved dette forsøg blive brugt minimum 1 patient blodprøve, og gerne flere, hvis det er muligt at finde prøver med en [CRP] koncentration > 250 mg/l, ellers accepteres det fra afdelingen at undersøge en prøve ved dette forsøg for antigen excess. Analyse resultaterne for hscrp på Cobas6000, BN Prospec og Kone30i vil blive vurderet og diskuteret ud fra de analyse resultater, der er afgivet for hver af de anvendte [CRP] prøver. Afgrænsning Metode validering - Der er en afgrænsning i valg af valideringsparametre ved metodevalideringen, da der ikke bliver undersøgt for analytisk variation, robusthed, metrologisk sporbarhed, afsmitning, detektionsgrænse, måleusikkerhedsbudget, korrekthed og genfindingsforsøg, valget af de 22

parametre er fastsat i samarbejde med Biokemisk afdeling på Herlev, ud fra hvad de ønsker at undersøge, og de parametre vi har fravalgt er ofte muligt at indhente hos producenten. Der vil ikke ved dette projekt blive udført en inter seriel præcision, da dette skal gøres over minimum 20 dage, og det er for lang tid i forhold til udførelsen af projektet i laboratoriet. Præanalytiske forhold Der var ved de præanalytiske forhold, indflydelse på udvalg af patienter, da udvælgelsen sker i Labka, alt efter koncentrationer og apparater. Men selve blodprøven tapning, og centrifugering, er der ingen indflydelse på, da der vælges allerede analyseret patientprøver, som der er afgivet svar for henholdsvis [HSCRP] og [CRP]. Cobas6000 Da analysesvarene for [HSCRP] bliver afgivet for analyseapparatet Cobas6000 fra Roche, er dette apparat medtaget i opgaven. Men der er en begrænsning i selve analyseringen af projektets prøver, da dette er gjort med hjælp fra en forsknings bioanalytiker, og derfor er der ikke nok kendskab til denne analyse apparat, i forhold til BN Prospec og Kone30i, som der blev brugt mere tid på, at lære dem at kende. Der vil ikke blive gennemgået hvordan kalibreringskurven for [HSCRP] analysen, bliver aflæst for Cobas6000, da det ville være for omfattende for dette projekt. Der vil ikke blive gennemgået teoretisk hvordan Cobas6000 fortynder patientprøver ved analysering, og sammenlignet i diskussionen med måden apparatet fortynder kalibratoren ved dannelse af kalibreringskurven. Kone30i Der vil for kone30i ikke blive indkørt en kontrol, til dannelse af et acceptinterval for godkendelse af kontrollen for hscrp analysen på dette apparat, men i stedet blive anvendt laboratoriets egen godkendte kontrol til analysen på Cobas6000, da dette ville kræve tid. 23

Metode og materialer materialer Apparatur Cobas 6000 Roche Diagnostics, Apparat nr. 0820-30 BN Prospec System Siemens Healthcare Diagnostics, Apparat nr. 423 353 KONE 30i Thermo Scientific, Apparat nr. C3617467 Finpipette Digital 100 5000 µl Bio hit Proline. Serie nr.10 054 469 Finpipette Digital 100 5000 µl Bio hit Proline. Serie nr.8116617 Køleskab 2 8 o C. Reagenser Reagenser til BN Prospec System fra Siemens o Cardio Phase hscrp Reagens med antistof. Lot nr.167522 o Supplerende reagens (SRP), Lot nr.0115334 o N- Dilluent Siemens, Lot nr.11261879 o Kalibrator: N Rheumatology Standard SL, Lot nr. 183868A o Kontrol,(high): Immunology 1, Lot nr.167522 o Kontrol, (low): Cardiac marker, Lot nr. 167522 Reagens til Cobas 6000 fra Roche o Cardiac- C-Reactive protein (Latex) High Sensitive, (Reagens med antistof), og Buffer, Lot nr. 684947-01 o NaCl 0, 9 % mmol/l, Lot nr. 675716 (Dilluent på apparat). o Kalibrator: c.f.a.s. proteins, Lot nr. 170700-01. o NaCl 0,9 % mmol/l, Lot nr.742502 (brugt til manuel sekvens fortynding). o Kontrol: Randox, Lot nr. 662UN. Reagenser til Kone 30i fra Thermo o CRP HS Buffer, Lot nr. J113 o CRP dilluent, Lot nr. J113 24

o CRP HS reagens (med det Frysetørrede antistof), Lot nr. J113, o CRP HS CAL: Lot nr. J113 o Kontrol: Randox, Lot nr. 662UN o Sterilt vand, til fortynding af CRP HS reagens. Prøvemateriale Alle blodprøver er taget ved venepunktur, og indsamlet i rød/gul gel glas med clot aktivator, fra Greiner-Bio- One, Lot nr. A1306XO, som rutine blodprøver. Se tabel nr. 3. Alle blodprøver var bestilt af rekvirenten, og allerede analyseret for enten [HSCRP] eller[crp], og klinisk svar var afgivet til rekvirenten. Forsøg Metodesammenligning: Linearitet: Antal, og Indsamling af prøver: 50 blodprøver, der var analyseret for [HSCRP] med en koncentration. CRP 10 mg/l. Blev valgt, via Labka. 6 blodprøver med en [CRP] koncentration på ca. 40 mg/l, blev udvalgt i Labka ud fra frigivet svar. Intermediær præcision: 25 blodprøver med koncentrationer fordelt således: Antigen excess: 5 blodprøver, med en konc. På ca. 0 mg/l, som allerede var analyseret på som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 1 mg/l, som allerede var analyseret som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 3 mg/l, som allerede var analyseret som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 5 mg/l, som allerede var analyseret som [CRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 10 mg/l, som allerede var analyseret som [CRP], og valgt ud i Labka 1 blodprøve analyseret som [CRP], og med en konc. målt til 270 mg/l, og valgt ud i Labka Tabel 3 Viser hvor mange blodprøver der er blevet brugt til hvert forsøg i projektet, og hvordan de er blevet valgt, og fra hvilket apparat og koncentration af enten [CRP] eller [HSCRP], for hvert af forsøgene ved dette projekt. Blodprøverne afpipiteres, og Serum separeres i nye mærket rør, alt efter hvilken forsøg der ønskes undersøgt, og derefter sat på køl ved 4 C. 25

Metode Kvalitetssikring. For BN Prospec og Kone30i blev der først udført daglig vedligeholdelse af apparaterne. Derefter blev der på BN Prospec analyseret to kontroller, fra Siemens. Cardiac Marker (lav), og Immunology (høj), og godkendt ved vurdering af kontrollernes acceptintervaller, (Se tabel nr. 2), for hscrp analysen før alle forsøgene. Der blev for Kone30i også analyseret en kontrol,(se tabel nr. 2), Randox. Da kontrollen ikke var indkørt på apparatet, blev den analyseret min. 2 gange ved hvert forsøg i projektet og godkendt udfra om kontrollen lå niveau med acceptintervallet for Cobas6000. For Cobas6000 blev daglig vedligeholdelse og analysering af kontrollen udført, og godkendt af en forsknings bioanalytiker. Metodesammenligning: Der blev ved metodesammenligning analyseret 50 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne var allerede blevet analyseret som [HSCRP], af en forsknings bioanalytiker på Cobas6000, og afgivet svar til rekvirenten via Labka, se tabel nr. 3. Prøverne til denne del af projektet blev udvalgt via Labka, og koncentrationen skulle være 10mg/L. De 50 blodprøver, blev serum afpipeteret i nye reagensglas og mærket med et nummer fra 1-50, og derefter sat på køl ved 4 c, med prop på. Ved analyseringen af hscrp blev prøverne først analyseret på Kone30i og derefter på BN Prospec. Hvorefter det var muligt at sammenligne resultaterne med Cobas6000. Linearitet: Der blev anvendt 6 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne var allerede blevet analyseret som [CRP] på Kone60i, af en bioanalytiker fra rutinen, og afgivet svar til rekvirenten via Labka, Se tabel nr. 3. Prøverne til denne dette forsøg blev udvalgt via Labka, med en koncentration på ca. 40mg/L, se tabel nr. 4. Serum blev afpipiteres over i et reagensglas fra alle 6 prøver og blandet i en pool af serum, svarende til ca. 10 ml i alt. Nr. Målt koncentration: 1. 40.3 mg/l 2. 42.9 mg/l 3. 40.5 mg/l 4. 42.4 mg/l 26

5. 42.1 mg/l 6. 44.5 mg/l Tabel 4. Viser koncentration for hver af de 6 patient blodprøver, som blev valgt ud i Labka, med kriteriet at koncentrationen skulle være ca. 40 mg/l. Derefter blev der udført 3 fortyndingsrækker på 10 forskellige koncentrationer ud fra den poolet serum, i området 0-40mg/L, som man kan se ud fra tabel nr. 5, dvs. en fortyndingsrække til hvert af analyseapparaterne. Fortyndingerne blev dannet ud fra en sekvens fortynding, med apparaternes egen Dilluent, Fortyndingsrækken i et forventet koncentrations område. Måleområdet: [0-40 mg/l]. Fortynding: FF Sekvens fortynding Forventet Konc: Nr. 1. 1:1 1 1200μl serum fra pool. 40 mg/l 2. 1:2 2 600μl (1) + 600μl Dilluent 20 mg/l 3. 1:4 4 600μl (2) + 600μl Dilluent 10 mg/l 4. 1:8 8 600μl (3) + 600μl Dilluent 5 mg/l 5. 1:16 16 600μl (4) + 600μl Dilluent 2,5 mg/l 6. 1:32 32 600μl (5) + 600μl Dilluent 1,25mg/L 7. 1:64 64 600μl (6) + 600μl Dilluent 0,63mg/L 8. 1:128 128 600μl (7) + 600μl Dilluent 0,31mg/L 9. 1:256 256 600μl (8) + 600μl Dilluent 0,16mg/L 10. 1:512 512 600μl (9) + 600μl Dilluent 0,09mg/L Tabel 5. Viser måden de valgte fortyndinger skulle udføres, og hvilken koncentration der blev forventet efter sekvensfortyndingen, serummet blev fortyndet med analyse apparatets egen dilluent. Tabel nr. 5 Viser hvordan sekvensfortyndingerne blev udført: 1. I glas nr. 1, blev der tilsat 1200μl serum fra den poolet serum. 2. I glas nr. 2-10, blev der tilsat 600μl fortyndingsmiddel 3. I glas nr.1, blev der afpipiteres 600μl serum til glas nr.2 og blandet godt med pipetten. Fra glas nr.2, blev der afpipeteret 600μl til glas nr. 3 og blandet med pipetten, denne sekvens fortsatte til og med glas nr.10. For analysering af de tre fortyndingsrækker, blev der først analyseret på Kone30i og derefter på Cobas6000 og til sidst på BN Prospec. 27

Intraseriel præcision: Der blev anvendt 25 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne for det lave område fra 0-10 mg/l indsamlet således: - fra 0mg/L til 3mg/L var allerede blevet analyseret som [HSCRP], og afgivet svar til rekvirenten via Labka. - fra 5mg/L - 10 mg/l var også allerede blevet analyseret som [CRP], og afgivet svar til rekvirenten via Labka. Til denne del af projektet skulle koncentrationerne være inden fra hver af de 5 ønskede koncentrationer, som det fremgår af tabel nr. 6 og 7. Nr. 0 mg/l Nr. 5mg/L Nr. 10mg/L 1. 0.23 mg/l 1. 5.1mg/L 1. 10.0mg/L 2. 0.21 mg/l 2. 5.8mg/L 2. 10.3mg/L 3. 0.19 mg/l 3. 5.7mg/L 3. 11.8mg/L 4. 0.45 mg/l 4. 4.6mg/L 4. 8.9mg/L 5. 0.45 mg/l 5. 5.09mg/L 5. 12.1mg/L Tabel 6 viser de koncentrationer de indsamlede blodprøver havde, ved første del forsøg. Nr. 1 mg/l Nr. 3 mg/l 1. Del 1. 1.15 mg/l 1. 3.36mg/L 2. 0,90 mg/l 2. 3.86mg/L 3. 1.01mg/L 3. 3.97mg/L 4. 1.07mg/L 4. 3.19mg/L 5. 1.00mg/L 5. 2.97 mg/l Tabel 7. Viser de indsamlede koncentrationer ved andet forsøg Der blev ved første forsøg indsamlet [0 mg/l], [5 mg/l] og [10 mg/l], se tabel 6. Ved denne del af forsøget blev der analyseret et serum pool med 10 analyseringer i træk, da der var nok poolet serum til 10 små analysekopper ved alle tre analyse apparater. 2. Del Ved andet forsøg blev der indsamlet [1 mg/l] og [3 mg/l] se tabel 7. men ved denne del af forsøget blev der analyseret en serum pool, med 6 analyseringer i træk, da der var mindre serum i de indsamlet patientprøver, og derfor kun nok til 6 små analysekopper ved de tre analyse apparater. 28

Antigen excess Der blev anvendt 1 blodprøve, med en [CRP] koncentration på 270 mg/l, som allerede var blevet analyseret af en bioanalytiker i rutinen på Kone60i, og afgivet svar til rekvirenten. Prøven til denne del af projektet blev udvalgt via Labka, og ved det kriterium at koncentrationen skulle være > 250 mg/l. prøven blev analyseret i det primære glas, på alle tre apparater, da det blev vurderet at der var prøvemateriale nok. Prøven blev analyseret på Kone30i. derefter Cobas6000 og til sidst analyseret på BN Prospec. 29

Resultater Kvalitetssikring [HSCRP] analysen på Cobas6000 var godkendt med kalibrering, og to kontroller af en forsknings bioanalytiker. Der blev for BN Prospec godkendt en kalibrering ved opsætning af reagenser på apparat. Derudover blev de samme to kontroller analyseret på BN Prospec ved hvert forsøg, og godkendt se tabel nr. 8. Det var for Kone30i en ny testopsætning, af hscrp analysemetode, det betød at efter opsætning af hscrp analysen på apparatet blev der kalibreret. Der blev udført en kalibrering mere på Kone30i efter ca. en uges tid, da der ved Intraseriel præcision skulle analyseres med nye koncentrationer, og derfor blev det vurderet at udføre en ny kalibrering på dette apparat. Der blev analyseret den samme Randox kontrol ved alle forsøgene, se tabel nr. 7, på Kone30i. kontrollen blev analyseret mindst to gange ved hvert forsøg, for at danne et billede af hvor kontrollen befandt sig i forhold til at den ikke var indkørt, men også iforhold til acceptintervallet for kontrollen på Cobas6000. Der blev ved Intraseriel præcisions andet forsøg analyseret den samme kontrol to gange mere, se tabel nr. 8 to resultater for kontrollen i kursiv, disse analyseringer blev udført efter anden kalibrering. 30

Kalibrering af BN Prospec Figur 5 viser en kalibreringskurve, med en fortyndingsrække på 7 fortyndinger. Analyseapparatet fortynder 1: 2560, 1: 1280, 1:640, 1:320,1: 160, 1: 80 og 1: 40, se figur 5 under kurven, hvor analyse apparatet har udført en krum kurve, der er rettet ud til en næsten ret linje ved matematisk funktion. Ud af x-aksen er koncentrationen i mg/l, og y- aksen viser Bits. Apparatet godkender selv kalibreringskurven for hscrp analysen. Figur 5. Viser her en kalibreringskurve for BN Prospec, som laver 7 fortyndinger, 1: 2560, 1: 1280, 1:640, 1:320,1: 160, 1: 80 og 1: 40. Denne kalibrering blev udført til hscrp analysen. Apparatet har udført en krum kurve, der er rettet ud til en næsten ret linje ved matematisk funktion. ud af x-aksen ses koncentrationen, og y- aksen viser Bits. 31

Kalibrering af Kone30i Der blev for Kone30i kalibreret to gange, for den nye testopsætning, da Intraseriel præcision forsøget blev fortaget en gang mere med to nye koncentrationer. Der gik to uger imellem hver kalibrering. Se figur nr. 6 og 7 Ved kalibrering af hscrp analysemetode på Kone30i anvender analyseapparatet 4 fortyndinger ud fra en Kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Kone30i starter med at måle ufortyndet på kalibratoren, og derefter fortynder den 1+1, 1+2, 1+8 og 1+37. Ud fra denne måde analyse apparatet fortynder dannes en krum kurve ved en splein- funktion. X- aksen viser koncentrationen og for y-aksen er det absorbans. 32

Figur 6. Viser en 5- punkts kalibrering. Kone30i fortynder kun 4 gange, fordi den starter med at analysere på kalibratoren ufortyndet. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. 33

Figur nr. 7 viser kalibrering af Kone30i efter ca. 14 dage, ved Intraseriel præcision, da andet forsøg blev udført. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. Figur 7. Viser kalibreringskurven der blev udført ved Intraseriel præcisions andet forsøg. Figuren er en 5- punkts kalibrering. Kone30i fortynder kun 4 gange, fordi den starter med at analysere på kalibratoren ufortyndet. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. 34

Godkendelse af Kontroller Tabel nr. 8 viser resultaterne for kontrollerne analyseret på de tre analyse apparater. Kontrollen for Cobas6000 er analyseret og godkendt af en forsknings bioanalytiker. På BN Prospec blev der analyseret to kontroller. Cardiac Marker (High), og Immunology en (Low) kontroller, se tabel nr. 8,disse kontroller blev godkendt ved hvert forsøg for dette projekt. På Kone30i blev anvendt laboratoriets daglige kontrol for [HSCRP] fra Cobas6000. Da det var en ny testopsætning af hscrp analysen, var der ikke en indkørt kontrol til hscrp på Kone30i. Kontrollen blev godkendt ud fra en vurdering ved at sammenligne acceptintervallet for kontrollen på Cobas6000, se tabel nr. 8. Cobas6000 ( mg/l) Kontrol navne Chemestry Randox nr.1 Metodesammenligning 1,17 Linearitet 1,17 Intraseriel impræcision 1,17 Antigen excess 1,17 Acceptinterval for kontrollerne. [1,156-1,396] Bn Prospec ( mg/l) Kone30i ( mg/l) Low: Cardiac Marker High: Immunology nr. 1 Chemestry Randox nr.1 Low: 0,236 1,27, 0,85, 1,20, High: 5,43 1,27 Low: 0,247 1,17, 1,20 High: 5,48 Low: 0,236 0,89, 1,27, High: 5,43 1,46, 1,38 Low: 0,236 High: 5,43 1,46, 1,20 Low: [0,191-0,251] - High: [5,019-5,419] Tabel 8. Viser Resultaterne for kontrollerne, der blev analyseret på de tre apparater, ved hvert forsøg i projektet. Kontrollen er den samme for alle forsøgene på Cobas6000, og godkendt af en forsknings bioanalytiker. For BN Prospec blev de samme to kontroller analyseret ved alle forsøgene, og godkendt. Kone30i anvender den samme kontrol som Cobas6000, der er laboratoriets indkørte og anvendte kontrol for [HSCRP], Da det er en ny analyseopsætning for hscrp på apparatet, er der ikke et acceptinterval for kontrollen på Kone30i. Der er ved Intraseriel impræcision blevet udført en ekstra kalibrering, og derfor blev det valgt at analysere den samme Randox kontrol to gange efter kalibreringen(kontroller skrevet i kursiv.) 35