Bachelorprojekt. Implementering af P-renin

Bachelorprojekt Implementering af P-renin Udarbejdet af Rie Pedersen 07.09.87 Bachelorprojekt: 11.04.11 10.06.11 Vejledere: Heidi Hvid Nielsen Klinisk Biokemisk Afd. Køge Sygehus Henrik Sander Pyndt Professionshøjskolen Metropol

2

3

Resumé Efter at det var blevet politisk besluttet fra Region Sjællands side af, at KBA Køge sygehus skulle implementere analysen for P-renin, gik et mindre studie i gang. Prøver blev før sendt til Biolab Glostrup Hospital, hvor de anvendte en analysemetode ved navn RIA. På KBA Køge sygehus ville man implementere analysen for P-renin på apparaturet Liaison fra DiaSorin, hvor analysemetoden er CLIA. Så for at kunne implementere analysen, skulle der udføres en godkendt validering og en metodesammenligning mellem RIA og CLIA. Plasmaprøverne der skulle anvendes til metodesammenligning modtog KBA Køge sygehus fra Biolab Glostrup Hospital samt en fortyndingsrække, baseret på korrekthedsmateriale fra NIBSC. Valideringen gav en god akkuratesse, præcision og robusthed og metodesammenligningen viser at der er signifikant forskel på de to metoder og at CLIA måler lidt højere end RIA. Ved akkuratesse forsøget sås det at blev der målt i det lave måleområde fandtes der stor forskel mellem den målte værdi og den beregnede sande værdi. Valideringen vidste at CLIA ikke var en dårlig metode selvom den målte højere end RIA, men derimod kunne det betyde at RIA måske bare måler lidt længere fra den sande værdi. Dermed blev konklusionen at P-renin analysen på apparaturet Liaison sagtens kan implementeres. Forord Til dette projekt har der været et stort samarbejde mellem Biolab Glostrup Hospital og KBA Køge sygehus. Dermed siges der stor tak for hjælpen, det har været til stor gavn. Firmaet DiaSorin har været rare at sponsorere integrale og kontroller til hele projektet, hvilket har været til hjælp. 4

Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Forord... 4 Introduktion... 6 Indledning... 6 Problemformulering... 6 Materiale og metode... 7 Metodevalg... 7 Indsamling af prøver... 8 Analyseprincipper... 8 Prorenin... 9 Reagenser og kontroller... 9 Analysering... 10 Databehandling... 11 Resultater... 12 Diskussion... 15 Konklusion... 20 Perspektivering... 20 Referencer... 21 Bilag... 22 5

Introduktion Indledning Renin er et proteinspaltende enzym der produceres i de juxtaglomerulære celler i nyrerne (1). Renin er en del af renin- angiotensin-aldosteron systemet (RAAS), hvor renin bliver frigivet ved lavt blodtryk i nyrerne(2). Renin er klinisk relevant at måle på, idet det bruges ved udredning af hypertension (3). Eksempelvis ses der forhøjet renin koncentration ved nyrearteriestenose som er en forsnævring af blodtilførelsen til den ene eller begge nyrer. Det betyder at trykket falder og renin bliver frigivet og aktiverer derved RAAS, hvorved blodtrykket stiger. Det betyder at renin forsat bliver frigivet og dermed forsat vil være forhøjet blodtryk i resten af kroppen. Eksempelvis ses der for lav renin koncentration ved primær aldosteronisme, som er en overproduktion af hormonet aldosteron fra binyrerne. I dette tilfælde vil renin koncentrationen være ekstrem lav, grundet det forhøjede blodtryk, faktisk så lavt at det kan være umåleligt (4). Derfor er det vigtigt at have en analyse der kan måle ved ekstrem lave koncentrationer. Der skal spares på laboratorierne i regionen. Derfor har Region Sjælland besluttet at der så vidt muligt ikke længere skal sendes prøver udenfor regionen til analysering. Det betyder for Køge sygehus klinisk biokemisk afdeling (KBA) at analysen for P-renin skal implementeres. Det er tiltænkt fra regionens side af at KBA Køge sygehus skal udføre analysen for hele Region Sjælland. I øjeblikket sender KBA Køge sygehus prøver som skal analyseres for P-renin, til Biolab Glostrup Hospital. På Biolab Glostrup Hospital anvendes analysemetoden radioimmunoassay (RIA). Dette er en manuel analysemetode, hvilket vil sige meget bliver gjort med håndarbejde. Metoden måler på enzymaktiviteten af renin i plasmaet. Ved beslutningen om at KBA Køge sygehus skulle implementere analysen for P-renin, undersøgte man hvilke muligheder der var indenfor denne analyse. KBA Køge sygehus opdagede at firmaet DiaSorin i år 2010 (1) havde frigivet en automatiseret analysemetode for P-renin ved at benytte Chemilumiscent Immunoassay (CLIA) på apparaturet Liaison. Denne analysemetode måler på det direkte renin i plasmaet, det betyder at der måles på den mængde renin der findes i plasmaet. På KBA Køge sygehus eksisterer apparaturet Liaison allerede, og derfor ville det være hensigtsmæssigt at kunne udføre analysen for renin på dette apparatur. Ved implementering af analysen P-renin kræves det at der bliver udført en validering af analysen på apparatet Liaison. Ved en validering er det vigtigt at undersøge om metoden lever op til den ønskede anvendelse og fungerer efter hensigten i laboratoriet. Problemformulering Er det muligt at gennemføre en godkendt validering af analysen P-renin på apparaturet Liaison? Kan KBA Køge sygehus udføre analysen for P-renin på apparaturet Liaison frem for den nuværende benyttede metode RIA på Biolab Glostrup Hospital, uden at det har betydning for akkuratessen? 6

Materiale og metode Metodevalg KBA Køge sygehus har et dokument Validering af analysemetoder (7), der beskriver alle parametre, som indgår i en validering. Dette dokument anvendes ved indførelse af ny analyse på et nyt apparat for at sikre gyldigheden af de opnåede analyseresultater, så der leves op til de kravspecifikationer, der er fastsat af afdelingen. Dokumentet beskriver hvilke praktiske undersøgelser og beregninger, der skal udføres for at en given analysemetode kan opfylde de stillede krav. Når en analyse efter validering på et apparat konkluderes til at være valid/godkendt, skal dette forstås som, at den er erklæret egnet til formålet med analysen på apparatet. Idet apparatet Liaison og dets tilhørende reagenser er CE-mærket, er det ikke nødvendig at lave en fuld validering, da CE-mærket betyder at det er valideret af leverandøren og lever op til de opstillede krav til analyserne. Her er der valgt at have fokus på følgende valideringsparametre: akkuratesse, præcision og robusthed for at vurdere om analysen P-renin kan implementeres på apparatet Liaison. Ved bestemmelse af præcision blev der lavet en intraseriel impræcision. Til denne bestemmelse blev der anvendt humant pool materiale i tre niveauer, og der blev målt på de pågældende prøver mindst ti gange i hver af dem. Ved bestemmelse af robustheden blev der lavet en interseriel impræcision. Dag-til-dag variationen siger noget om analysens usikkerhed ved at måle på den samme prøve i en længere periode, i og med at der skiftes integrale og kalibratorer med forskellige lot numre, der skiftes starterreagens og vaskebuffer, forskellige personer betjener apparatet og at der evt. har været teknikker på. Til denne bestemmelse blev der anvendt humant pool materiale i tre niveauer. Akkuratessen kontrolleres ved at analysere korrekthedsmateriale, hvor den sande værdi kendes. Dette korrekthedsmateriale bestilles hos firmaet NIBSC. NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control Assuring the quality of biological medicines) er et firma der beskytter sundheden. Korrekthedsmaterialet er verden sundheds organisationen (WHO) international standard. Og er derfor et godkendt materiale at arbejde med. Ved undersøgelse om KBA Køge sygehus kan udføre analysen for P-renin på apparaturet Liaison frem for den nuværende benyttede metode RIA på Biolab Glostrup Hospital, udføres der en metodesammenligning. Dette gøres ved at udføre en bestemmelse af inakkuratessen ved sammenligning mellem målinger udført på Glostrup (ved RIA) og i Køge ved CLIA. Der skal bruges 30-50 (7) prøver til en metodesammenligning. Der blev indgået en aftale med Biolab Glostrup Hospital, idet det ville kræve en længere tidsperiode, at indsamle et tilstrækkeligt antal prøver på KBA Køge sygehus. Ved arbejde med analysen P-renin anvendes et referenceinterval, indtil dags dato anvendes 6-60 mlu/l (5) referenceintervallet som Biolab Glostrup Hospital har fastlagt. Idet det er dem der udfører analysen. I Region Syddanmark Sygehus Lillebælt anvender man allerede analysemetoden CLIA ved brug af apparaturet Liaison og her bruger de referenceintervallet 4-50 miu/l (6). Idet der er forskel på den metode der skal implementeres CLIA og den nuværende benyttede metode RIA, skal referenceintervallet tages i betragtning om det stadig er aktuelt eller om der skal beregnes et nyt referenceinterval. De etiske overvejelser blev godkendt af Sys Johnsen etisk ansvarlig, inden vi gik i gang med målingerne. 7

Indsamling af prøver Vi modtog 45 plasmaprøver som dækkede hele måleområdet fra Biolab Glostrup Hospital. Plasmaprøverne modtog vi opbevaret i en flamingokasse, med et fryseelement i for at holde temperaturen nede. Inden afsendelse fra Biolab Glostrup Hospital havde plasmaprøverne været opbevaret ved -20 C eller derunder. Plasmaprøverne blev først placeret i 80 C fryseren, da vi modtog dem, og senere flyttet over i 20 C fryseren, da det er der alle prøver står som skal analyseres. Dermed opbevarede vi plasmaprøverne som anvisningerne fra DiaSorin (1). Til indsamlingen af det humane pool tappede vi blod fra tre testpersoner. Vi ville skabe et pool bestående af tre niveauer for at dække måleområdet. En testperson skulle hvile i mindst en halv time, som er det der gøres dags dato under prøvetagning, og ville få taget sine prøver liggende. Her forventedes det at renin niveauet ville være mindst muligt, idet kroppen har slappet af og blodtrykket har indstillet sig. Denne testperson blev kaldt hvile og fik taget 10 * 7 ml EDTA-glas. En anden testperson løb op og ned af trapperne i 15 minutter og fik taget 10 * 7 ml EDTA-glas siddende og blev kaldt aktiv. Her forventedes det at renin niveauet ville være lavt, idet pulsen stiger og at blodtrykket stiger og dermed bliver der ikke frigivet renin. En tredje testperson fik taget 10 * 7 ml EDTA-glas siddende med det samme og blev kaldt siddende. Her forventedes det at renin niveauet ville være normalt, idet der ikke er ydet noget eller gjort noget for at mindske blodtrykket. EDTA glassene blev centrifugeret med det samme efter prøvetagning ved stuetemperatur i 10 minutter. Herefter blev hver testpersons plasma overført til hver deres bæger hvor plasmaet fra de 10 glas blev blandet. Herefter afpipetterede vi over i mindre portioner bestående af 600 µl over i kryorør/afpipetteringsrør. Vi opbevarede alle rørerne ved 20 C indtil de skulle anvendes. Da vi havde problemer med bestillingen af korrekthedsmaterialet fra NIBSC, var Biolab Glostrup Hospital rare at sende en fortyndingsrække bestående af 11 prøver og opbevarede dem ved 20 C indtil anvendelse. Vi modtog også hvilke koncentrationer de forskellige rør skulle have, som Biolab Glostrup Hospital havde regnet ud ved brug af fortyndingsformlen. De havde startet med at have en stamopløsning med en vis volumen og koncentration og ud fra den havde de lavet fortyndingsrækken. Denne koncentration blev betragtet som den sande værdi. Analyseprincipper Princippet (1) for analysen på apparatet Liaison er CLIA. CLIA er en sandwich kemiluminescens immunanalyse der anvendes til en kvantitativ reninbestemmelse. Der anvendes to antistoffer i analysen, hvor det første er et specifikt musemonoklonalt antistof der er coated med magnetiske partikler og fungerer som den faste fase. Det andet antistof er et musemonoklonalt reninspecifikt antistof der er bundet til et isoluminol-derivat og fungerer som konjugatet antistof-isoluminol. Under inkubationen vil det renin og prorenin der findes i prøver, kalibratorer og kontroller binde sig til antistoffet med den faste fase. At det er en sandwich metode kommer til udtryk ved at reninmolekylet danner bro imellem antistoffer. Og ved vaskeproceduren efter inkubationen bliver ikke bundet-materiale fjernet. Der bliver nu tilsat starterreagens der reagerer med isoluminolen. Dermed sker der en reaktion idet ammoniumbindingen brydes og dermed udsendes der energi (lys). Lyset bliver målt i relative lysenheder (RLU). Der er omvendt proportionelt med koncentrationen af renin i prøver, kontrolmateriale og kalibratorer. Princippet er illustreret i en lille billedserie nedenfor i figur 1. 8

200µl prøvemateriale, 20 µl paramagnetiske partikler og 100µl konjugat. + H 2 O 2 /OH - Figur 1: Disse figure illustrere analyseprincippet. Først bliver der tilsat prøvemateriale, paramagnetiske partikler og konjugat. Derefter binder renin og prorenin til det paramagnetisk coatede antistof. Og det renin specifikke antistof-isoluminol binder sig til renin og ikke prorenin (illustreret i det midterste billede). Herefter tilsættes startereagensder og der udsendes energi i form af lys. Princippet for radioimmunoassay (RIA) består af at enten et antistof eller et antigen er gjort radioaktivt. Den mest anvendte RIA-metode består af et mærket antigen som konkurrerer med et andet umærket antigen, de konkurrerer om et begrænset antal antistof bindingssteder (8). På Biolab Glostrup Hospital måles renin koncentrationen baseret på en aktivitetsmetode. Det betyder at Biolab Glostrup Hospital selv tilsætter angiotensinogen fra får idet koncentrationen af angiotensinogen kan variere. Det medfører en højere produktion af angiotensin I som også er det der måles på. Biolab Glostrup Hospital kalibrerer overfor WHO internationale standard renin og dermed kan de udgive resultater i miu/l. Hele metoden er en længerevarende proces idet der skal inkuberes over flere trin og det hele foregår ved håndkraft. Der måles hvor meget radioaktivt bundet der er ved brug af en gammatæller. Prorenin Prorenin er en forløber til renin og findes i en koncentration der er 10 gange højere end renin koncentrationen (9). Prorenin findes i to forskellige former en lukket og en åben form. Prorenin har en aktiv side ligesom renin har og er derved tilgængelig for angiotensinogen. Ved prorenin i lukket form forstås det, at en klap dækker den aktive side, hvorimod klappen i den åbne form er åben og den aktive side står nu frit. Hvis den åbne form optræder i prøver vil man få falsk forhøjet renin koncentration, idet konjugatet antistof-isoluminol kan binde sig til den aktive side. Ved omkring de -5 C til 4 C kan klappen i prorenin åbne sig og derved være i åben form (9), det kaldes cryoaktivering. Det er derfor vigtigt at prøverne ikke opbevares ved temperaturer mellem -5 C og 4 C. Figur 2: illustrerer hvad der skal forstås med åben og lukket form af prorenin, til højre ses renin (9). Reagenser og kontroller Det benyttede integrale (et kit nok til 100 bestemmelser, som består af paramagnetiske partikler, konjugatet antistof-isoluminol og buffer). Med integralet medfølger kalibratorer hhv. A og B. Kalibratorerne skal man selv opløse, til dette følges den medfølgende vejledning. Kalibratorerne udgør en høj og en lav 9

koncentration og danner en to-punkts kalibreringskurve, hvor koncentrationer kan aflæses ud fra de målte RLU-værdier. Dermed benyttes kalibreringskurven under hver enkelt måling. Der skal kalibreres hver gang der startes på et nyt integrale. Systemvæske eller vaskebuffer bruges under hele forløbet ved arbejde på apparatet. Bufferen er en fosfatbuffer og bruges ved skylle procedurer af pipettespidser og rørsystemet, det gøres efter hver afpipettering og efter hver analysering, for at mindske risikoen for kontaminering. Det anvendte starterreagens starter 1 (4% NaOH) og starter 2 (0,12% peroxid opløsning) bliver tilsat efter vaskeproceduren og starter dermed en reaktion af lysudsendelse der bliver målt i RLU. Lyskontrollen (Er en lyskontrol der anvendes under daglig opstart af apparaturet. Lyskontrollen fastslår baggrundsbelysningen og måler pipetterne overfor hinanden). Resultaterne angives i relative lysenheder (RLU) der er omvendt proportional med de pågældende koncentrationer. De anvendte kontroller i to forskellige niveauer måles og vha. kalibreringskurven beregnes koncentrationen. Den angivne koncentration skal ligge indenfor det givne acceptinterval og ellers laves en ny kalibrering. Disse kontroller består begge af rekombineret humant renin og benyttes efter endt kalibrering og efter endt analysering, for henholdsvis at kontrollere kalibreringen og prøverne. En detaljeret oversigt over anvendte materialer og reagenser ses i bilag i tabel 11 og 12. Analysering Præcision: Prøverne vi anvendte var fra vores humane pool, med de tre forskellige niveauer; hvile, siddende og aktiv. Vi optøede fem prøver fra hvert niveau. Vi lagde dem på et vendeapparat, så materialet blev vendt stille og roligt, mens prøverne optøede. Da prøverne var tøet op tjekkede vi om der var luftbobler i og fjernede boblerne, med enden af en vatpind, hvis det var tilfældet. Vi satte prøverne på og bestilte dem manuelt (at oplyse apparatet, ved at taste, hvad prøven hedder, hvor den står og hvad der skal udføres på prøven) idet prøverne ikke havde nogen stregkode som apparaturet kunne genkende. Akkuratesse: Her anvendte vi den fortyndingsrække vi havde modtaget fra Biolab Glostrup Hospital. Vi optøede prøverne, igen på et vendeapparat. Efter optøning lagde vi mærke til at de pågældende rør ikke sad fast i rack`ne til apparaturet, vi valgte at overføre prøverne til kryorør og gav dem samme nummerering som Biolab Glostrup Hospital havde gjort. Herefter satte vi prøverne på og bestilte dem manuelt, idet prøverne ikke havde nogen stregkode. Robusthed: Den interserielle måling er blevet udført alle dage også de dage hvor præcisionsmålingerne, akkuratesseforsøget og metodesammenligningen blev udført. Der var dage hvor vi kun lavede denne måling. Der er blevet kalibreret halvdelen af de dage hvor målingerne blev udført, for at få så mange kalibreringer med som muligt. Der blev skiftet lot nummer både på integralet og kalibratorer. Prøverne vi anvendte var fra det humane pool, med de tre forskellige niveauer; hvile, siddende og aktiv. Prøverne var blevet tøet op på vendeapparatet og der blev sikret at der ikke var luftbobler i. Vi satte prøverne på apparaturet og bestilt dem manuelt. Metodesammenligning: Vi optøede kun halvdelen af prøverne til at starte med, for der ikke skulle gå for lang tid inden analyse. Prøverne blev optøet som ved de andre prøver, ved at ligge dem på et vendeapparat. Prøverne blev sat på apparaturet og disse prøver havde stegkode på som apparaturet kunne 10

genkende og gik dermed automatisk i gang med at analysere. Da apparaturet var færdig med at analysere gik vi i gang med at optø de sidste frosne prøver og satte dem på. Der var en af de første prøver der målte > 500 miu/l, med den lavede vi en fortynding der hedder 1:2 (300 µl prøve og 300 µl diluent)med endocrinology diluent fra DiaSorin. Den fortynding satte vi på apparatet og bestilte den manuelt, idet den ingen stregkode havde. Databehandling Ved præcisionsmålingerne og robusthedsmålingerne beregnes der en CV% som bliver vurderet. For akkuratesse målingerne beregnes der en Bias% og et biasplot der vil blive vurderet samt beregnes en parret t-test, for at undersøge om der er signifikant forskel på de to metoder.. Til metodesammenligningen undersøges det om dataerne er normalfordelt, hvorefter der udføres de dertil passende beregninger for at undersøge om der er signifikant forskel på de to metoder. Hertil beregnes der også et Biasplot der vil blive vurderet. 11

Resultater Som start præsenteres resultaterne for præcisionsmålingerne. Der er her beregnet en CV% for hver af de tre niveauer. Rådata inklusiv kontroller kan ses på bilag tabel 13. Tabel 1: viser resultaterne for præcisionsmålinger. Præcisionsmålingerne foregik den samme dag og prøvematerialet er fra det humane pool. Der blev beregnet en CV% for hver af de forskellige niveauer. Prøveid. Hvile Siddende Aktiv Middelværdi 15,06666667 37,59166667 33,89166667 SD 1,153912974 2,742082266 1,707980377 CV% 7,658714429 7,294388647 5,039529021 Idet der under metodesammenligningen blev analyseret en del kontroller, blev der også beregnet en CV% for disse. Rådata for disse kontrolmålinger kan ses på bilag tabel 14. Tabel 2: viser resultaterne af præcisionsmåling med kontrolmateriele. Der er her blevet analyseret på samme dag. Kontrol.nr. K1 K2 middelværdi 26,81176 98,81176 SD 0,982269 2,779362 CV% 3,663576 2,812784 Herefter præsenteres resultaterne fra akkuratessemålingerne. Der er udført en kalibrering til at starte med og en igen mellem anden og tredje omgang af kontroller, alt det og rådata kan ses på bilag tabel 15. Der er her beregnet en Bias%. Tabel 3: viser resultaterne fra akkuratessemålingerne. Materialet var her en fortyndingsrække modtaget fra Biolab Glostrup Hospital. Fortyndingsrækken er lavet ud fra noget korrekthedsmateriale fra NIBSC. Bias % 38,46154 2,564103-3,846154-1,923077-9,904153-5,92-4,08-1,84 Idet data er parrede blev der undersøgt om data var normalfordelt og derefter udført en parret t-test. Tabel 4: viser de statistiske beregninger der er udført for at undersøge om der er signifikant forskel mellem den beregnede sande værdi og CLIA. Beregning Sand værdi vs. CLIA Skævhed 1,588558 Topstejl 1,535665 T-test beregnet 0,043535 T-test tabel (9) 2,365 12

Difference between methods Dette er et biasplot over akkuratessemålingerne, der giver et billede af hvordan målingerne ligger. 7 6 5 4 3 2 1 0-1 -2-3 0 100 200 300 Mean of all methods Zero bias Figur 3: illustrerer hvordan akkuratessemålingerne ligger visuelt. Af x-aksen ses middelværdien af de to metoder og af y-aksen ses differensen mellem de to metoder. Den sorte stiplede linje er forskellen mellem de to metoder. Og de røde stiplede linjer er 95% grænserne, hvis alle differencerne ligger indenfor de røde linjer er differenserne normalfordelte. Her præsenteres robusthedsmålingerne. Der er her beregnet en CV%. På bilag tabel 16 ses rådata for robusthedsmålingerne inklusiv bemærkning om der er kalibreret og/eller skiftet diverse reagenser. Tabel 5: viser resultaterne for robusthedsmålingerne. Disse målinger er foregået over en periode for at vise dag-til-dag variationen. Der er her anvendt prøvemateriale fra det humane pool. Og videre er der beregnet en CV%. Hvile Siddende Aktiv Middelværdi 16,27333 38,96 35,27333333 SD 1,047082 3,1075484 1,658082656 CV% 6,434343 7,9762536 4,700669031 Idet der under alle målinger er blevet analyseret på kontrolmateriale, udføres der også en robusthedsmåling på kontrollerne. Rådata ses på bilag tabel 17. Tabel 6: viser resultaterne for robusthedsmålingerne med kontroller. Disse målinger foregik over en periode og videre blev der beregnet en CV% for hver af kontrollerne. Kontrolnr. K1 K2 middelværdi 26,6 97,3490566 SD 1,617774083 5,807343582 CV% 6,081857454 5,965485218 Til metodesammenligningen blev der ud fra resultaterne beregnet et biasplot for at vise hvordan målingerne lå i forhold til hinanden. Resultaterne (rådata) for metodesammenligningen kan ses i bilag i tabel 18. 13

Difference between methodes Difference between methods 150 100 50 0 Zero bias -50-100 0 500 Mean of all methods Figur 4: dette er biasplottet for CLIA vs RIA med alle 45 patientprøver. Af x-aksen ses middelværdien af de to metoder og af y- aksen ses differensen mellem de to metoder. Den sorte stiplede linje er forskellen mellem de to metoder. Og de røde stiplede linjer er 95% grænserne, hvis alle differencerne ligger indenfor de røde linjer er differenserne normalfordelte. Der blev lavet et biasplot hvor de to høje værdier blev ekskluderet, for så at se hvordan målingerne lå i forhold til hinanden. 60 50 40 30 20 10 0-10 -20 0 100 200 300 Mean of all methods Zero bias Figur 5: dette er biasplottet for CLIA vs RIA, hvor der er ekskluderet to prøver. Af x-aksen ses middelværdien af de to metoder og af y-aksen ses differensen mellem de to metoder. Den sorte stiplede linje er forskellen mellem de to metoder. Og de røde stiplede linjer er 95% grænserne, hvis alle differencerne ligger indenfor de røde linjer er differenserne normalfordelte. Resultaterne blev også undersøgt om var normalfordelt og da det ikke var tilfældet, blev der udført en Wilcoxon test. Resultatet for den test ses i tabel 8. Tabel 7: viser resultaterne for Wilcoxon testen. Med den kan det ses om der er signifikant forskel på de to metoder. Wilcoxon's W statistic 149,5 2-tailed p <0.0001 (normal approximation, corrected for ties) 14

Diskussion Valideringen gav en god akkuratesse, præcision og robusthed. Metodesammenligningen viser at der er signifikant forskel mellem de to metoder og at CLIA måler lidt højere end RIA. Men selvom der er forskel på de to metoder, fortæller valideringen ikke at CLIA er en dårligere metode. Faktisk viser CLIA sig at være en god metode, idet der ikke ses en CV% der er højere end 8% og en akkuratesse der viser at der måles tæt på den sande værdi, dog ses der lidt problemer i det lave måleområde. Det kan tyde på at RIA ikke er en dårlig metode, men ligger måske lidt længere fra den sande værdi end hvad CLIA gør, i hvert fald i dette tilfælde på KBA Køge sygehus. Andre studier har også udført forsøg med apparaturet Liaison fra DiaSorin, hvor der er udført metodesammenligninger. I dette studie ses der nærmere på hvad andre studier viser og siger om CLIA-metoden på apparaturet Liaison fra DiaSorin og RIA-metoden, og sammenlignes med dette studies resultater. Fejlkilder Under dette forsøg/projekt på KBA Køge sygehus har der været nogle systemfejl angående bestillinger af kontroller. Eksempelvis ved metodesammenligningen var der lidt problemer med apparaturet og indstillingen af kontroller. Liaisonapparatet bestilte ukontrollerede automatiske kontroller, hvilket hurtigt udløste mangel på kontrolmateriale. Det medførte stop på apparaturet, hvilket der hurtigt blev rettet op på. Dog havde de midlertidige afbrydelser haft en lille indflydelse på inkubationstiden, der blev indikeret ved at resultatet fik et flag der symboliserede +/- 2 minutter på inkubationstiden. Det udløste en bekymring for resultaterne, men da kontrollerne lå indenfor acceptintervallet, havde det ikke påvirket resultaterne. Under præcisionsmålingerne og robusthedsmålingerne havde det været en fordel hvis pool prøverne havde præsenteret tre forskellige niveauer og ikke kun de to det blev til. Idet der er så meget tale om vigtigheden af at kunne måle ved meget lave koncentrationer, havde det været oplagt at have haft en human prøve med en meget lav koncentration, som kunne havde været en del af præcisionsmålingerne og robusthedsmålingerne. I stedet bruges, hvad DiaSorin og andre har fundet ud af ved disse koncentrationer. Det eneste KBA Køge sygehus ved om lave koncentrationer, udspringer fra akkuratesseforsøget og der målte KBA Køge sygehus lidt under den sande værdi. Under akkuratesseforsøget blev der analyseret med en ikke godkendt kalibrering, men resultaterne blev godkendt idet kontrollerne efter endt analyse var acceptable. KBA Køge sygehus har ikke selv lavet fortyndingsrækken til akkuratesseforsøgene, hvilket havde været en fordel, idet der dermed ikke vides helt under hvilke forhold den blev lavet, dog stoler KBA Køge sygehus på at Biolab Glostrup Hospital har gjort det helt efter bogen. For at opnå pålidelige resultater, blev der gjort alt for at pool prøverne var ens og ville kunne opfattes som en og samme prøve fordelt i mindre portioner. Det blev blandt andet gjort ved at plasmaet fra de 10 EDTAglas blev blandet sammen i et bæger, et for hver af de tre testpersoner. På den måde blev det sikkert at det er den analytiske variation der blev målt og ikke den biologiske. Igen da vi modtog plasmaprøverne fra Biolab blev de straks opbevaret i -80 C fryseren for at undgå optøning og cryoaktivering. Valideringen Til præcisionsmålingen og robusthedsmålingen, hvor der blev anvendt prøver fra et humant pool, bestående af hvile, siddende og aktiv og et forsøg på at opnå plasma i tre forskellige niveauer henholdsvis lavt, normalt og højt, lykkedes ikke. Den siddende og aktive var i nogenlunde samme niveau, dermed blev der arbejdet med to niveauer. Det humane pool er baseret på raske personer og dermed har det været 15

svært at skabe et højt renin niveau. Det kan diskuteres om det overhovedet har været nødvendigt at lave det humane pool til præcisionsmålingen og robusthedsmålingen, man kunne have nøjes med at udføre målingerne med kontrolmateriale. Men idet kontrolmaterialet består af rekombineret renin og ikke humant renin, ville det være interessant at se hvordan CV% ville se ud med humant materiale. Idet det kan give det mest realistiske billede, man kunne forestille sig at der eksempelvis ikke fandtes prorenin i kontrolmaterialet hvilket er tilfældet for humane prøver. Præcisionsmålingerne skulle efter hensigten analyseres to gange, men ved en fejl var apparaturet ikke programmeret til at analysere i dobbeltbestemmelse, derfor måtte prøverne analyseres igen for at opnå et tilstrækkeligt antal målinger. Ved anden måling ses et generelt koncentrationsfald, for hvile falder koncentrationen gennemsnitlig med ca. 2 miu/l, for siddende er det med ca. 5 miu/l og for aktiv er det med ca. 3 miu/l. Det kan være årsag til, at der ses en større CV% (for hvile 7,7% og aktiv 5,0%) end hvad DiaSorin oplyser (prøve A 3,7% og prøve B 2,8%) (1).I øvrigt blev der ved en fejl ikke udført kontrolanalysering til sidst. Resultaterne for præcisionsmålingerne ses i tabel 1. Andre studier har også anvendt DiaSorin Liaison, deres resultater ses i tabel 9. Tabel 8: en oversigt over hvad andre studier har fået i den intraserielle måling. Først angives middelværdien og i parentesen angives CV%. Reference Middelværdi Renin i miu/l (CV%) KBA Køge (humant materiale) 15,1 (7,7) 33,9 (5,0) 37,6 (7,3) KBA Køge (kontrol materiale) 26,8 (3,7) 98,8 (2,8) DiaSorin (1) 15,1 (3,7) 33,8 (2,8) DiaSorin (kontrol materiale)(1) 27,1 (5,6) 99,0 (2,4) Dorrian et al (11) 25 (7,2) 106,9 (1,3) Tabel 9 viser en oversigt over hvad andre studier har fundet af CV% i deres intraserielle måling samt KBA Køge sygehus. KBA Køge sygehus har en højere CV% når det er humant materiale end når det er kontrolmateriale. Det kunne tyde på at der er forskel på om det er humant materiale eller om det er rekombineret materiale. DiaSorin har også anvendt kontrolmateriale til deres intraserielle måling. Her ses det at deres CV% er lidt højere for deres kontrolmateriale end for deres humane materiale. Der ses ikke nogen logisk forklaring på hvordan det kan lade sig gøre. KBA Køge sygehus CV% for kontrolmaterialet ligger meget tæt på det DiaSorin har af CV% for humant materiale, og bedre end DiaSorins CV% for kontrolmateriale. Dorrian et al CV% er tilnærmelsesvis tæt på KBA Køge sygehus CV% for humant materiale, det er dog ikke helt målt i samme niveau, og dermed kan det kun give en idé om hvor KBA Køge sygehus og Dorrian et al ligger i forholdt til hinanden. Da både KBA Køge sygehus og Dorrian et al begge er eksterne laboratorier er det tankevækkende at begge finder samme højere CV% end hvad DiaSorin oplyser. Akkuratesseforsøgene blev udført vha. korrekthedsmateriale fra NIBSC. Der blev fremstillet en, fortyndingsrække, tilsendt fra Biolab Glostrup Hospital. Ved analyse af fortyndingsrækken opstod der problemer med kontrollerne, idet de lå under acceptintervallet efter kalibreringen, de lå så indenfor acceptintervallet efter endt analysering. Der blev bestilt en ny kalibrering og det samme skete igen. Resultaterne blev accepteret idet resultaterne lå forholdsvis tæt på den beregnede værdi og fordi kontrollerne efter endt analyse var indenfor acceptintervallet. Resultaterne ses i tabel 2. Her ses at Bias% i den helt lave ende af måleområdet er høj, hvilket betyder at KBA Køge sygehus Liaison måler lavere end 16

den sande værdi i den del af måleområdet. Det fortæller også at Liaison tilsyneladende måler forkert i det område. Omkring de 5-6 miu/l i måleområdet begynder KBA Køge sygehus Liaison at måle højre end den sande værdi i form af at Bias% falder til negative værdier. Efter at Bias% bliver negativ ses der ikke noget systematik. Den negative Bias% overstiger ikke 10 % og det indikerer at KBA Køge sygehus Liaison måler tæt på den sande værdi. For at se om der var signifikant forskel mellem den sande værdi og CLIA-metoden blev der beregnet en parret t-test, der viste at der ikke var signifikant forskel. På figur 3 ses et biasplot over målingerne, her illustreres hvordan de ligger. Her ses det at de første fire målinger ligger meget tæt på 0. Og dermed meget tæt på den sande værdi, idet der ikke er nogen særlig stor differens. Herefter ses det at de sidste fire målinger ligger lidt mere spredt i takt med at der måles højere oppe i måleområdet, men ikke så det har større betydning. Idet alle målingerne ligger indenfor de røde stiplede linjer ses det at data er normalfordelt. Hvilket også de statistiske beregninger i tabel 4 viser. Ved robusthedsmålingerne var der både teknikkerbesøg og skiftning af integrale lot nummer. Der blev også ved flere lejligheder udskiftet vaskebuffer og starterreagens. Der blev løbende fyldt op af reagensmoduler. Under perioden blev der også kalibreret ved flere lejligheder samt udført vedligeholdelse af apparaturet. Efter disse faktorer blev målingerne vurderet og det blev besluttet at der var målinger nok. Resultaterne for robusthedsmålingerne ses i tabel 5. Flere har anvendt DiaSorin Liaison til forsøg hvor de har udført en interseriel måling, deres resultater ses i tabel 10. Tabel 9: en oversigt over hvad KBA Køge sygehus og andre har opnået af CV% i en interseriel måling. CV% angivet i parentes. Reference Middelværdi Renin i miu/l (CV%) KBA Køge (humant materiale) (tabel 3) 16,27 (6,43) 35,27(4,7)38,96(7,98) KBA Køge (kontrol materiale) 26,6(6,1) 97,3(6,0) DiaSorin sted 1 (1) 5,2(2,7) 13,2 (0,6) 34,4 (1,2) 83,0(0,9) 263,5(1,7) DiaSorin sted 2 (1) 17,3(12,2) 36,6(7,0) 82,3(5,4) 244,7(9,3) DiaSorin (kontrol materiale) sted 1 27,3(0,4) 103,0(0,2) (1) DiaSorin (kontrol materiale) sted 2 27,2(1,9) 100,2(4,2) (1) Dorrian et al (11) 4,9(9,2) 8,5(10,4) 27,5(7,9) 109,8(7,3) Morganti et al (12) 4,2(41,0) 12,4(24,7) 29,8(18,1)35,1(10,7) 50,5(11,5) 436(10,7) Tabel 10 viser en oversigt over CV% i den interserielle måling. Her ses det at KBA Køge sygehus CV% for det humane materiale er større i forhold til hvad DiaSorin har for deres humane materiale på sted 1, hvor kittet er udviklet. Men sammenlignes der med DiaSorin sted 2 der er et eksternt laboratorium, ser det bedre ud for KBA Køge sygehus CV%. Her ligger KBA Køge sygehus lidt lavere i CV% end sted 2. KBA Køge sygehus ligger lavere end Dorrian et al og Morganti et al., derimod ligger Dorrian et al meget ens med DiaSorin sted 2, hvor Morganti et al ligger meget langt fra hvad alle andre har fået af CV%, her ses der meget høje CV%. KBA Køge sygehus CV% for kontrolmateriale er lidt højere end hvad DiaSorin har fået både på sted 1 og 2. Det er modsat af hvad der var tilfældet i præcisionsmålingen, hvor KBA Køge sygehus havde en bedre CV% end DiaSorin hvad angår kontrolmateriale. Der er forskel på hvor mange målinger der er blevet udført for at opnå disse CV%. Eksempelvis har KBA Køge sygehus 15 målinger (tabel 5) med det humane materiale, hvor Dorrian et al har 28 målinger (11) og DiaSorin har 40 målinger for hvert sted (1). Dermed har KBA Køge sygehus ikke lige så mange målinger som de andre, men har alle faktorer med ind over når dag-til-dag 17

variationen skal findes. For at opnå alle faktorer kan det variere med mængden af målinger. Og udfra oversigten i tabel 10 ses det at KBA Køge sygehus har en fornuftig CV% i den interserielle måling, når man tænker på at der er med en immunkemisk reaktion at gøre. Metodesammenligning Ved metodesammenligningen blev der undersøgt om der var signifikant forskel på de to metoder. Til det blev der udført en non-parametrisk test (wilcoxon test). Resultaterne for wilcoxon testen ses i tabel 8. Her ses at sandsynligheden for at forskellen skyldes tilfældighed er 0,1%. Det betyder at der er signifikant forskel på de to metoder. For at illustrere hvordan målingerne lå i forhold til hinanden se figur 4. På Figur 4 ses et biasplot for CLIA vs. RIA. Her ses at målingerne ligger meget klumpet og tæt på 0, der ligger et par målinger lidt fra klumpen og til sidst ses to målinger helt ude i det høje område af måleområdet og med større differenser. Det ses også at jo længere op i måleområdet man kommer jo mere differens bliver der mellem de to metoder. Klumpen af målinger viser også at CLIA-metoden gennemsnitligt måler højere end RIA-metoden. Det er dog svært at se hvordan målingerne ligger præcist i forhold til hinanden. Idet de to målinger ligger langt fra de andre og for bedre at se hvordan målingerne i klumpen ligger, ekskluderes de to målinger og der blev lavet et nyt biasplot se figur 5. Her ses at målingerne ligger lidt mere spredt. Det ses også at størstedelen af målingerne har en negativ differens og dermed måler CLIA højere end RIA. Dette kunne måske skyldes en fejlkilde, det kunne være at prøverne har været udsat for cryoaktivering under transporten og dermed har der været mere prorenin i prøven end da de blev analyseret på Biolab Glostrup Hospital. Velvidende at der under en metodesammenligning hører en præcisionsmåling til, blev dette ikke udført med RIA-metoden idet det ikke var muligt. Der vil nu ses nærmere på hvad andre studier har fundet ud af ved deres metodesammenligninger. Morganti et al har udført en sammenligning mellem plasma renin aktivitet (PRA) og chemiluminescent immunreaktive renin (CLIR) og har diskuteret deres inter- og intraserielle variation. I begge undersøgelser havde CLIR en mindre variation end PRA. Der var dog en undtagelse ved et af deres laboratorier. De nævner at PRA har en dårlig reproducerbarhed og at det er en analysemetode der tager lang tid idet inkubationstiden er 18 timer (12), hvorimod CLIR er lettere at reproducere og har en inkubationstid på 30 minutter. Inkubationstiderne har både fordele og ulemper. Med den lange inkubationstid vil cryoaktiveret prorenin kunne lukke sig sammen igen, hvor det under den korte inkubationstid ikke kan nå at lukke sig sammen. En anden ting der kan give forhøjede renin koncentrationer er behandling med renin inhibitorer. Det er dokumenteret at aliskiren forandrer prorenin og gør det genkendeligt for fange antistoffet (antistoffet der er coated med de paramagnetiske partikler). Morganti et al er kommet frem til at CLIR er en valid analysemetode og er et godt alternativ til PRA til screening tests, så som aldosteron-renin ratio der bruges til diagnosticering af primær aldosteronisme. De nævner at CLIR er enklere, hurtigere og reproducerbart, dette gør CLIR til fremtiden. CLIR og CLIA består af samme analyseprincip og derfor er det muligt at sammenligne med KBA Køge sygehus resultater. KBA Køge sygehus fandt også en god reproducerbarhed i form af en CV% på mindre end 8% i robusthedsmålingerne. Dermed er KBA Køge sygehus og Morganti et al enige hvad det angår. Man skulle dog mene at KBA Køge sygehus er bedre til at reproducere hvis CV% sammenlignes, her ses i tabel 10, hvor Morganti et al finder store CV%. Dorrian et al har udført en screeningsprocedure for primær aldosteronisme baseret på den nye metode fra DiaSorin på apparaturet Liaison (CLIA). Dermed har Dorrian et al udført en metodesammenligning mellem CLIA og PRA. De finder frem til en overordnet god sammenhæng mellem de to metoder, dog ikke for prøver 18

der med metoden PRA var under 1ng/mL/h, her så man ikke nogen sammenhæng. Deres fokus var at klarlægge hvorvidt CLIA er anvendelig i forhold til screening af primær aldosteronisme og stadig bevare en god sensitivitet og specificitet. I deres forsøg på at sammenligne de to metoder som screeningstest fandt de frem til at den samme patientgruppe blev identificeret og dermed er CLIA ligeså anvendelig ved screening af primær aldosteronisme. Campell et al beskriver metoden ir-prc (immunoassay Plasma renin koncentration) som er ligesom CLIA. De nævner at ir-prc CV% er ens med CV% for PRA. De fortæller at ir-prc og PRA er ens og begge kan bruges til screening for primær aldosteronisme, men er dog skeptiske over at ir-prc kan give falsk positiv aldosteron-renin ratio, hvis patienten har nedsat plasma angiotensinogen koncentration. De virker skeptiske overfor at ir-prc kan måle ved meget lave koncentrationer, som er tilfældet for primær aldosteronisme, hvor der skal kunne måles < 2 miu/l (9). Ved at have set hvad andre studier fortæller om de to metoder og hvad KBA Køge sygehus selv har erfaret, ser det ud til at CLIA-metoden er ret ens med RIA-metoden også selvom KBA Køge sygehus måler lidt højere end Biolab Glostrup Hospital. Det der er vigtigt, er at man ikke for målt nogen der er syge til at være raske eller omvendt. Med det nuværende benyttede referenceinterval og med sammenligningen mellem CLIA og RIA, var der enkelte tilfælde hvor CLIA målte en syg til at være rask og omvendt. Det var dog omkring cut off værdierne i referenceintervallet. Men det udelukker ikke at KBA Køge sygehus kan anvende det samme referenceinterval, selvom der skriftes analysemetode, idet det kan skyldes en biologisk variation eller en analytisk variation. Ved et interview med Erik Frandsen Biolab Glostrup Hospital, fortalte han at de arbejder med en analytisk variation på 6 %, det er dog ikke noget der er dokumenteret. KBA Køge sygehus ville nok vælge at en lidt højere analytisk variation og dermed være dækket ind. Præanalytisk Hvad angår det præanalytiske ved denne analyse findes der ikke nogen standardisering indenfor det. DiaSorin skriver at prøvematerialet skal være humant EDTA-plasma og at klokkeslæt og patientens stilling skal noteres. De anbefaler at patientforberedelse og prøveindsamling bliver standardiseret (1). Efter prøvetagning skal prøverne centrifugeres i en ikke afkølet centrifuge, hvorefter EDTA-plasmaet skal adskilles fra cellerne, og straks nedfryses til -20 C eller derunder. De anbefaler prøverne straks bliver analyseret når de er sat på apparaturet. Alt dette blev der taget hensyn til. Ved alle patientprøver var prøvetagningen standardiseret, de blev taget liggende efter at patienten havde hvilet i en halv time. Campell et al beskriver at det præanalytiske er meget vigtig, man skal især undgå cryoaktivering som tidligere beskrevet foregår ved -5 C til 4 C. Derfor er det vigtigt at behandlingen af prøver foregår ved stuetemperatur eller ved -20 C eller derunder. Campell et al er ikke de eneste der nævner vigtigheden af at undgå cryoaktevering, det har Iervasi et al, Dorrian et al og Morganti et al også nævnt. Campell et al forklarer også vigtigheden af at prøverne hurtigt skal centrifugeres. Hvis en blodprøve står for længe ved stuetemperatur ville det kunne resultere i at prorenin vil åbne op. En anden grund kunne være at der ville være forskellige rumtemperaturer i de forskellige årstider. En tredje grund kunne være hvis patienten får inhibitor behandling eksempelvis aliskiren, for hvis dette er tilfældet vil inhibitorerne kunne åbne prorenin. De nævner at blodprøverne skal centrifugeres indenfor en halv time og helst indenfor 10 minutter. Straks efter centrifugering skal prøverne fryses ned. 19

Konklusion Idet valideringen gav en præcision og robusthed på < 8% samt en god akkuratesse, betragtes valideringen som værende godkendt. Dermed er det muligt at gennemføre en godkendt validering af analysen P-renin på apparaturet Liaison. Ved metodesammenligningen målte CLIA højere end RIA, men dermed kan det stadig anbefales at KBA Køge sygehus implementere analysen for P-renin. Det skal dog siges ved indførelse af analysen anbefales det at se hvad litteraturen siger ved speciale sygdomme. Det er også vigtigt at angive hvilken analytisk variation der arbejdes med så klinikeren kan tage højde for det. Perspektivering Det ville være muligt at fortsætte med den interserielle måling, idet der findes flere pool prøver i fryseren. En anden interessant undersøgelse kunne være at undersøge hvor stor betydning det har for prøven, hvis prøver bliver opbevaret i køleskab. Og ved implementering af analysen P-renin, er det vigtigt at få standardiseret prøvetagningen. 20

Referencer 1. Liaison Direct Renin (310470). DiaSorin S.p.A (2010) 2. Iervasi, A., Zucchelli, G.C., Turchi, S., Emdin, M., Passino, C., Ripoli, A., et al. (2005). Analytical and clinical performance of an automated chemiluminescent immunoassay for direct renin measurement: comparison with PRA and aldosterone assays. Science direct. 3. Lyngbye, J. (2001). Dansk laboratoriemedicin: en håndbog. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busk. Side 389. 4. http://da.wikipedia.org/wiki/conns_syndrom 5. www.glostruphospital.dk/nr/rdonlyres/20f5335f-e5a6-4563-a39a- 3FA5A54F1637/0/Renin_P_0205.doc 6. http://www.sygehuslillebaelt.dk/wm261869 7. Klinisk Biokemi Køge/Fakse (2010). Validering af analysemetoder. Region Sjælland Sygehus Nord. 8. Andersen, H., Sørensen, U.B., Thomsen, E. (2008). Immunkemiske metoder teori og praksis. Nucleus. Side 35. 9. Campbell, D.J., Nussberger, J., Stowasser, M., Danser, A.H.J., Morganti, A., Frandsen, E., et al. (2009). Activity Assays and Immunoassays for Plasma Renin and Prorenin: Information Provided and Precautions Necessary for Accurate Measurement. Clinical Chemistry 867-877. 10. Lauritsen, O.S. (2008). Statistik for Bioanalytikere. Odontologisk Boghandel & Forlag, København. 11. Dorrian, C.A., Toole, B.J., Alvarez-Madrazo, S., Kelly, A., Connell, J.M., Wallace, A.M. (2010). A screening procedure for primary aldosteronisme based on the DiaSorin Liaison automated chemiluminescent immunoassay for direct renin. Clinical Biochemistry 195-199. 12. Morganti, A. (2010). A comparative study on inter and intralaboratory reproducibility of renin measurement with a conventional enzymatic method and a new chemiluminescent assay of immunoreactive renin. Hypertension 28:1307-1312. 21

Bilag Tabel 10: viser en detaljeret liste over de anvendte reagenser. Reagens Producent Lot. nr. Ref. nr. Udløbsdato Integrale (Direct Renin) DiaSorin 015034/015035 310470 2011-07-26 /2012-05-27 Systemvæske/vaskebuffer DiaSorin 920103 2011-05-12 Starterreagens 1 DiaSorin 033351/047351 /226497 Starterreagens 2 DiaSorin 033151/047151 /226496 Lyskontrol DiaSorin 001102/042101 /319101 2012-02-26 /2012-06-30 2012-02-28 /2012-06-30 2012-01-30 /2012-10-30 Kontrol 1 DiaSorin 7520180 310471 2012-07-02 Kontrol 2 DiaSorin 7530180 310471 2012-07-02 Kalibrator A DiaSorin 7500230/7500231 310470 2012-05-27 Kalibrator B DiaSorin 7510230/7510231 310470 2012-05-27 Endocrinology Diluent DiaSorin 001101 319133 2012-01-30 Reaktionsmoduler (kuvetter) DiaSorin 10388188/10249189 319130 2013-09/2013-06 Renin (stamopløsning) 100 µl 10.000 miu/l WHO 68/356 2009-02-25 (fortyndingsdato) Tabel 11: viser en detaljeret liste over de anvendte materialer. Materialer Producent Lot. nr. Ref. nr. Udløbsdato Venosafe 5,5 ml EDTA-glas Terumo 1009004 2012-02 Kanyle, (sommerfugl) Terumo 101102B Adapter Terumo 1007004 Afpippeteringsrør, (m. prop) Sarstedt 7332/0302020 MN*SVS21 BQ30 XX- VF10HGSQ 2013-10 Engangspipetter Sarstedt Finpipette 100-1000 µl Thermo V88421 Pipettespidser (Finntip 1000) Thermo 9226A0 Finpipette 1-5 ml 2579 Pipettespidser (Finntip 5ml) Thermo 8120N0/9027M0 Pur-zellin, (vat) Hartmann 103210283 2016-06 Alkoswaps, (sprit) Medic Denmark 140111 LOT + 5 ÅR 22

Tabel 12: viser rådata for præcisionsmålingerne inklusiv kontroller. Prøveid Enhed µlu/ml Prøveid Enhed µlu/ml Prøveid Enhed µlu/ml Kontrol 1( 21,9-32,9) 28 Kontrol 2 (81,1-121,6) 99,7 Hvile 16,7 Siddende 40,7 Aktiv 34,7 Hvile 16,1 Siddende 40,7 Aktiv 35,1 Hvile 16,2 Siddende 40,4 Aktiv 35,8 Hvile 16,5 Siddende 40,3 Aktiv 35,4 Hvile 15,4 Siddende 40,2 Aktiv 35,8 Kontrol 1 26,7 Kontrol 2 98,2 Hvile 13,7 Siddende 36,4 Aktiv 32,7 Hvile 14,1 Siddende 35,2 Aktiv 30,8 Hvile 14,2 Siddende 34,7 Aktiv 31,7 Hvile 14,2 Siddende 35,4 Aktiv 32,6 Hvile 14,2 Siddende 36,7 Aktiv 32,9 Hvile 15,8 Siddende 37,3 Aktiv 35,3 Hvile 13,7 Siddende 33,1 Aktiv 33,9 Middelværdi 15,06666667 37,59166667 33,89166667 SD 1,153912974 2,742082266 1,707980377 CV% 7,658714429 7,294388647 5,039529021 Tabel 13: viser rådata over kontrollerne for præcisionsmålingen. Kontrolnr.: K1 K2 28,6 102,6 27,3 103,6 27,1 100,4 27,6 97,3 28,1 98,2 26,8 104,3 27 94 25,4 97,5 24,6 96,5 25,8 98,3 27,1 96,2 27,5 97,2 26,9 97,7 25,9 98,6 27 98,7 26,3 97,2 26,8 101,5 23

middelværdi 26,81176 98,81176 SD 0,982269 2,779362 CV% 3,663576 2,812784 Tabel 14: viser rådata for akkuratesseforsøgene inklusiv kontroller og bias%. Prøveid Køge Sygehus - CLIA Enhed µlu/ml % Bias Kontrol 1 (21,9-32,9) 19,7 Kontrol 2 (81,1-121,6) 61,5 0 <0,5 Kontrol 1 22,9 Kontrol 2 89,8 Kontrol 1 15,4 Kontrol 2 71,3 0,98 <0,5 1,95 1,2 38,46154 3,9 3,8 2,564103 7,8 8,1-3,846154 15,6 15,9-1,923077 31,3 34,4-9,904153 62,5 66,2-5,92 125 130,1-4,08 250 254,6-1,84 500 >500 Kontrol 1 24,6 Kontrol 2 87 Tabel 15: viser rådata for robusthedsmålingerne med humant materiale inklusiv bemærkninger ved skift af reagenser. Hvile Siddende Aktiv Bemærkning Enhed Enhed Enhed Prøvedato µlu/ml µlu/ml µlu/ml 2011.04.12 15,8 37,3 Kalibreret. Nyt starterreagens og 35,3 vaskebuffer. 13,7 33,1 33,9 2011.04.13 16,8 40,4 34,7 Kalibreret. 16 38,9 36,1 2011.04.18 17,4 43 Nyt vaskebuffer og 37,6 starterreagens. 17,6 42,1 39,5 2011.04.19 16,8 40 36,5 Nyt vaskebuffer. 17,1 40,1 35,3 Teknikker besøg, der blev skiftet pippetter og starterpumpe. 2011.05.02 15,9 35,5 35,1 Kalibreret. Nyt vaskebuffer og starterreeagens. 24

16,5 35,8 34,3 2011.05.03 14,9 34,5 32,9 2011.05.04 17,5 43,3 33,4 16,5 40,1 35,1 2011.05.05 15,6 39 34,7 16 41,3 34,7 Nyt integrale lot. nr. tages i brug. Kalibreret. Nyt starterreagens. Kalibreret. Nyt vaskebuffer. Nyt starterreagens og vaskebuffer. Middelværdi 16,27333 38,96 35,27333333 SD 1,047082 3,1075484 1,658082656 CV% 6,434343 7,9762536 4,700669031 Tabel 16: viser rådata for robusthedsmålingerne med kontrolmateriale. Kontrol 1 Kontrol 2 Prøvedato Enhed: miu/l Enhed: miu/l 2011.04.12 28,2 99,6 27,8 99,9 27 96,5 26,5 99,9 26,5 98 26,7 97 2011.04.13 28,6 102,6 27,3 103,6 27,1 100,4 27,6 97,3 28,1 98,2 26,8 104,3 27 94 25,4 97,5 24,6 96,5 25,8 98,3 27,1 96,2 27,5 97,2 26,9 97,7 25,9 98,6 27 98,7 26,3 97,2 26,8 101,5 27,2 101,4 26,4 102 26,2 101 25

26 98,5 2011.04.18 30,2 101,8 29,5 104,1 28,4 106,5 29 106,4 29,4 29,4 2011.04.19 27,5 98,2 28,2 102,4 28,5 105,9 28,5 102 26,5 27,5 27,1 2011.05.02 26,7 93,4 26,1 92,6 25,9 97,4 26,5 98,4 2011.05.03 25,9 82,3 24,7 89,6 24,1 84,2 25 93,8 2011.05.04 22,4 90,7 23,4 89 25,1 88,8 24,2 85,3 24,3 111,1 24,6 91,4 2011.05.05 25,1 95,7 25 92,4 25,5 91 24,3 91,5 middelværdi 26,6 97,3490566 SD 1,617774083 5,807343582 CV% 6,081857454 5,965485218 26

Tabel 17: viser rådata for metodesammeligningen inklusiv kontroller og eventuelle flag. Prøveid RIA: Enhed miu/l CLIA: Enhed µlu/ml Flag Kal Kontrol 1 (21,9-32,9) 28 Kontrol 2 (81,1-121,6) 103,1 Kal Kontrol 1 mislykket Kontrol 2 mislykket Kontrol 1 27,4 Kontrol 2 98,8 Kontrol 1 27,5 t Kontrol 2 101,3 t 35097 138 191,6 t 34964 1 1,2 t 35088 1 4,3 t Kontrol 1 26,2 t Kontrol 2 95,8 t 35148 133 145,6 t 35047 7 13,3 t 35147 38 36,4 t Kontrol 1 25,2 t Kontrol 2 97,4 t 35217 101 101,8 t 35045 1 12,2 t 35146 58 58,8 t Kontrol 1 mislykket t Kontrol 2 58 t+ 34924 1 3,7 t+ 35226 25 33,5 t+ 35046 14 17,9 t+ Kontrol 1 mislykket Kontrol 2 mislykket 35161 176 233,7 t, Q 35184 115 121,8 Q 35072 24 22,7 Q Kontrol 1 27,2 Kontrol 2 97,4 35042 30 38,8 Q 35140 35 62,6 35139 5 12 Kontrol 1 26,5 Kontrol 2 98,7 35043 5 7,4 35141 200 231,2 35037 5 6,5 35036 53 54,9 35035 6 11,7 34733 22 27,4 34720 74 82,6 27

34714 47 55,1 34778 525 >500 34734 154 137,8 34779 37 45 34782 33 42,1 34780 16 19,9 34682 2 3,1 34729 34 27,5 35003 2 4,4 35001 37 32,2 34913 539 457,9 34805 2 4 34914 2 4,1 34875 75 82,1 34833 1 5,4 34772 256 261,2 34768 13 14,7 34765 170 200,2 34969 39 57,1 34968 56 53,9 Kontrol 1 26,6 Kontrol 1 26,8 Kontrol 2 99,3 34778 329,2 28