CYTOLOGISK TEKNIK Sebastian Frische, Anatomisk Institut
VÆV BESTÅR AF: Vand Proteiner (i cytoplasma, i organeller, i membraner) Lipider (lipiddråber, membraner) Kulhydrater (glykogengranula, glykosyleringer) Nukleinsyrer (DNA, RNA) små opløste stoffer (ioner, aminosyrer mm)
VÆVSPRÆPARATION TIL HISTOLOGISK ANALYSE Fiksering (kemisk, fysisk) Indstøbning (paraffin, plast) Snitning (lysmikroskopi/elektron mikroskopi) Farvning (uspecifik, selektiv, specifik)
FIKSERING Formål: Standse metabolske processer Bevare vævsstruktur Tilføre fysisk stabilitet
FIKSERING Kemisk Aldehyder Osmium tetroxid Fysisk Frysning
ALDEHYDER Vand Proteiner Anvendes i opløst i vand Virker ved at krydsbinde proteinerne i vævet Lipider Kulhydrater Nukleinsyrer små opløste stoffer Stoffer der er bundet til proteiner fikseres i større eller mindre grad
FORMALDEHYD Formalin: 37% formaldehyd, 10% methanol i vand Trænger hurtigt ind i vævet, men krydsbinder proteinerne relativt langsomt (24 timer eller mere)
GLUTARALDEHYD Trænger langsommere ind i vævet en formaldehyd, men krydsbinder proteinerne relativt hurtigt. Kan krydsbinde mange proteiner ved hjælp af de to reaktive aldehydgrupper
OSMIUM TETROXIDE Vand Proteiner Virker ved danne et netværk i vævet, hvor i vævets bestanddele holdes fast Lipider Kulhydrater Nukleinsyrer små opløste stoffer
FRYSNING Vand Proteiner Lipider Kulhydrater Nukleinsyrer små opløste stoffer Virker ved at få vandet i vævet til at stivne De fleste stoffer fastholdes i vævet, men tabes let under videre bearbejdning
FIKSERINGSPROCEDURE Immersionsfiksering Vævet skæres i små stykker Stykkerne placeres i fikseringsvæsken Perfusionsfiksering Fiksativ ledes ind i det levende væv via blodbanen Vævet skæres i stykker og placeres i fikseringsvæsken
VÆVSPRÆPARATION TIL HISTOLOGISK ANALYSE Fiksering (kemisk, fysisk) Indstøbning (paraffin, plast) Snitning (lysmikroskopi/elektron mikroskopi) Farvning (uspecifik, selektiv, specifik)
INDSTØBNING Paraffin Plast Dehydrering Dehydrering Ufikserede bestanddele tabes! alkohol/xylen alkohol/xylen Infiltrering Afkøling alkohol/ xylen Lysmikroskopi Infiltrering Polymerisering Lys- og elektronmikroskopi
VÆVSPRÆPARATION TIL HISTOLOGISK ANALYSE Fiksering (kemisk, fysisk) Indstøbning (paraffin, plast) Snitning (lysmikroskopi/elektron mikroskopi) Farvning (uspecifik, selektiv, specifik)
SNITNING Lysmikroskopi Mikrotom Stålkniv Paraffinsnit (tykkelse 5 μm) Objektglas Elektronmikroskopi Ultra-mikrotom Glaskniv eller diamantkniv Plastsnit (tykkelse 50 nm) Grid (små metalnet)
Ultramikrotom
SNITNING - FRYSESNIT Lysmikroskopi Kryo-stat Stålkniv tykkelse 10 μm Objektglas Elektronmikroskopi Ultracryomikrotom Glaskniv eller diamantkniv tykkelse 50 nm Grid (små metalnet)
Kryostat
Kryo-ultramikrotom
I mikroskopet ser vi på 2D snit af 3D væv
VÆVSPRÆPARATION TIL HISTOLOGISK ANALYSE Fiksering (kemisk, fysisk) Indstøbning (paraffin, plast) Snitning (lysmikroskopi/elektron mikroskopi) Farvning (uspecifik, selektiv, specifik)
FARVEMETODER Uspecifikke: hæmatoxylin, eosin, toluidinblå, sølv Selektive Van Gieson (kollagen), Mallory-azan (bindevæv), PAS (kulhydrater), Orcein (elastin) etc. Specifikke: Feulgen (DNA), immunomærkning, enzymhistokemi (enzymfunktion), lectiner, in situ hybridisering (RNA), autoradiografi
BASOFILI OG ACIDOFILI Aniongrupper: Tiltrækker + ladet farve Basofili R-COO - (protein) hæmatoxylin (blå) R-PO 4 - (DNA,RNA) toluidin blåt R-SO 4 - (GAG) methyl blåt Kationgrupper: Tiltrækker ladet farve Acidofili Eosinofili R-NH 3 + (protein) eosin (rødt) orange G anilin (blåt)
Levervæv Hæmatoxylin og Eosin (HE)
Pancreas HE
Neuron Sølvfarvning
Lever Uranylacetat og bly
Metakromasi Strukturer får en anden farve end farvestoffet: f.eks. toluinblåt Når antallet af bundne farvestofmolekyler er lavt: Blåt Når antallet af bundne farvestofmolekyler er højt: Rødt
Tre selektive farvemetoder Orcein Van Gieson Mallory (elastiske fibre) (kollagen) (bindevæv)
Tyndtarm Periodic acid Schiff (PAS)
Enzymhistokemi Påvisning af enzymfunktion i vævssnit Elektronmikroskopi
Autoradiografi Lokalisation af radioaktiv probe
Immunomærkning Indirekte metode Lysmikroskopi Elektronmikroskopi
Immunomærkning Indirekte metode Peroxidase, DAB
Cellefraktionering Sortering af cellefragmenter efter massefylde ved anvendelse af gradvist forøget tyngdefelt (centrifugering)
To-foton laser konfokalmikroskopi: LIVE in vivo Interdigiterende dendritiske celler Th (CD4+) lymfocytter Figur fra Bousso: Nature Reviews Immunology, 8, September 2008