Koncentrationskorrektion af analyseresultater fra delvist fordampede prøver

Cathrine Hansen 122183 Antal tegn: 37525 Vejledere: Joan Fischer Back Jakobsen, bioanalytikerunderviser Jesper Voldby, cand.scient Aflevering: 29/5 2013 Koncentrationskorrektion af analyseresultater fra delvist fordampede prøver - kan CRP, hscrp og TnI korrigeres?

Forord Stor tak til Peter Hindersson, overlæge på Klinisk Biokemisk Afdeling Sygehus Vendsyssel, Hjørring, for idéen til projektet. Herudover tak til personalet på KBA, for at give plads og støtte til udførelsen af forsøget. Resumé Formålet med projektet er at undersøge, hvorvidt det er muligt at foretage koncentrationskorrektion på analyseresultater fra prøver, som har været udsat for fordampning. Behovet for undersøgelsen er opstået, da der på Hjørring Sygehus forefindes historiske prøver nedfrosset ved -80 C, hvor man ønsker at kende koncentrationen af hscrp og TnI på nedfrysningstidspunktet. I forsøget blev en række prøver analyseret for albumin, creatinin, chlorid, natrium, CRP, hscrp og TnI. Efter analyse blev prøverne fordampet 10-20%, og de syv parametre blev reanalyseret. Albumin, creatinin, chlorid og natrium blev udvalgt og testet for deres egnethed til koncentrationskorrektion, og efterfølgende blev korrektionen foretaget. For at belyse de syv parametres stabilitet ved -80 C, blev der foretaget en gennemgang af litteraturen på området. Det har vist sig muligt at foretage koncentrationskorrektion, men hvorvidt denne korrektion er hensigtsmæssig afhænger af den enkelte paramter. Forsøget viste en vis ustabilitet hos samtlige parametre, men dette er ikke af afgørende betydning for hvorvidt parametrene er egnede, da forsøget ikke afspejler nedfrysning ved -80 C. Gennemgang af litteratur viste at samtlige parametre er stabile ved -80 C, samt minimum et døgn ved stuetemperatur, bortset fra TnI, som kun er stabil få timer ved stuetemperatur, og derfor ikke er egnet til analyse over flere timer. Projektet har relevans for blandt andet biobanker, da det belyser muligheden for at foretage koncentrationskorrektion af analyseresultater på historiske prøver. 1

Indholdsfortegnelse Indledning... 3 Baggrund... 3 Formål... 4 Problemformulering... 4 Målformulering... 4 Teori... 5 Sublimation... 5 Stabilitet... 5 Albumin... 6 Creatinin... 6 Chlorid... 6 Natrium... 6 CRP og hscrp... 7 TnI... 7 Materialer... 7 Apparatur... 7 Reagenser... 7 Prøvemateriale... 8 Metoder... 9 Fremgangsmåde... 9 Analyseprincipper... 9 Fordampning... 9 Albumin... 10 Creatinin... 10 Chlorid og natrium... 10 CRP... 10 hscrp... 11 TnI... 11 Databehandling... 11 Søgeprotokol... 12 Resultater... 13 Fordampning... 13 Målformulering 1... 16 Målformulering 2... 19 Diskussion... 24 Konklusion... 27 Perspektivering... 27 Referenceliste... 28 2

Indledning Baggrund I biobanker verden over opbevares nedfrosne blodprøver. Prøverne består ofte af serum eller plasma, og kan stamme fra mange årtier tilbage i tiden. Ved langvarig opbevaring vil der ske en sublimation af prøvematerialet (1). På Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Vendsyssel opbevares historisk prøvemateriale, som har været nedfrosset ved -80 C i 20 år. På disse prøver ønskes analyseret to markører for hjerteproblemer, som ikke blev analyseret på nedfrysningstidspunktet. Det forventes, at der er sket en betydelig evaporation af prøvemateriale siden nedfrysningen, og analyser som udføres i dag vil derfor ikke give det samme resultat, som de gjorde for 20 år siden (2) (3) (4) (5). Hjertemarkørerne som ønskes analyseret er troponin I (TnI) og højsensitiv C-reaktivt protein (hscrp). TnI anvendes ved mistanke om akut koronarsygdom (ustabil angina pectoris og akut myokardieinfarkt). Troponin stiger 4-8 timer efter akut myokardieinfarkt, og når maksimum efter 12-24 timer. TnI kan desuden, sammen med andre biomarkører, være med til at forudsige risikoen for at dø af kardiovaskulær sygdom (6). HsCRP anvendes som risikomarkør for kardiovaskulær sygdom. Studier har vist en udtalt sammenhæng mellem forhøjede værdier af hscrp og øget risiko for ustabil angina og myokardieinfarkt. Markøren anvendes prognostisk efter angioplastik og til monitorering efter myokardieinfarkt (6). Herudover inkluderes infektionsmarkøren C-reaktivt protein (CRP) i forsøget, da den øvre målegrænse for denne parameter overstiger den øvre målegrænse for hscrp. CRP er en infektionsmarkør til brug ved udredning af bakterielle infektioner, skelnen mellem bakterielle og virusinfektioner, samt kontrol af sygdomsaktivitet ved visse kroniske sygdomme (6). Måleintervallet for CRP ligger på 2,90-190 mg/l, med fortynding ved værdier over 190 mg/l. Til sammenligning har hscrp et måleinterval på 0,15-20 mg/l. Vi undrer os over, om det er muligt at korrigere for ændringer i volumen, og dermed koncentration, ved hjælp af forskellige målbare parametre i prøverne (7) (8). Undersøgelsen vil simulere evaporation af prøvemateriale, og derefter afprøve om det er muligt, at lave koncentrationskorrektions-faktorer ved hjælp af udvalgte parametre. Kravet til de udvalgte parametre er, at der blev foretaget analyse af disse på de historiske prøver 3

omkring nedfrysningstidspunktet, så det skal derfor være parametre, som var almindelige at analysere på den tid. De udvalgte parametre til undersøgelsen er albumin, creatinin, chlorid og natrium. Formål Formålet med dette projekt er, at undersøge hvorvidt det er muligt, at foretage koncentrationskorrektion på prøver udsat for fordampning. Koncentrationskorrektionen foretages ved hjælp af parametrene albumin, creatinin, chlorid og natrium. Det vurderes hvilken af de fire parametre, der er bedst egnet til at koncentrationskorrigere hjertemarkørerne TnI og hscrp samt infektionsmarkøren CRP på prøverne udsat for fordampning. Problemformulering Hvilke konsekvenser er der ved at analysere prøver udsat for fordampning, er det muligt at foretage koncentrationskorrektion på disse prøver, og findes der en parameter egnet til at koncentrationskorrigere hjertemarkørerne TnI og hscrp samt infektionsmarkøren CRP i prøver, som har været udsat for fordampning? Målformulering Vi vil: 1. Undersøge om det er muligt, at anvende parametrene albumin, creatinin, chlorid og natrium, målt i prøver som har været udsat for 10-20% fordampning, til koncentrationskorrektion. Dette gøres ved at analysere de nævnte parametre på en række prøver, derefter eksperimentelt udsætte prøverne for 10-20% fordampning, og reanalysere dem. Til sidst udregnes den teoretiske koncentration efter fordampning, og denne sammenlignes med den målte koncentration efter fordampning. Sammenligningen foretages ved hjælp af differensplots og t-test eller Wilcoxon-test. 2. Vurdere hvilken af de fire ovennævnte parametre, der er bedst egnet til at koncentrationskorrigere hjertemarkørerne TnI og hscrp samt infektionsmarkøren CRP i prøverne udsat for fordampning. Dette gøres ved at beregne koncentrationskorrektionsfaktorer for de fire parametre i samtlige prøver, korrigere hjerte- og infektionsmarkørerne, og efterfølgende bruge 4

differensplots og t-test eller Wilcoxon-test til at sammenligne de korrigerede og målte værdier. Teori Sublimation Fordampning af is kaldes sublimation. Sublimation sker uden forudgående smeltning af isen, og kan kun ske ved temperaturer under stoffets tripelpunkt. Tripelpunktet er afhængig af temperatur og tryk, og betegnes som det punkt i et fasediagram, hvor der er ligevægt mellem fast-, flydende- og gasform, altså is, vand og damp. Damptrykket angiver ved hvilket tryk det pågældende stof fordamper ved en given temperatur. Damptrykket for is ved -80 C er 5,48 10-2 Pa (1) (9) (10). Sublimation af prøvemateriale afhænger af flere forskellige faktorer såsom tid, temperatur, typen af låg på prøveglas, design af prøveglas og overfladearealet af prøvematerialet (5). Stabilitet Samtlige parametre og markører er stabile i minimum et døgn ved stuetemperatur, med undtagelse af TnI, som kun er stabil i 4 timer (6). En klinisk undersøgelse af holdbarheden af prøver med TnI-værdier på 0,04-0,15 µg/l viste efter 6 timers opbevaring ved stuetemperatur signifikante fald i værdierne. Således var koncentrationen i gennemsnit faldet med 5,7% efter 6 timer (11). I en anden undersøgelse blev prøver opbevaret ved 4 C i op til 14 dage med efterfølgende nedfrysning ved -70 C. Efter to dages opbevaring med efterfølgende nedfrysning var TnIkoncentrationen for prøver med et gennemsnitligt indhold på 5,71 µg/l faldet med 8,9% (12). TnI viste sig dog stabil ved nedfrysning i to uger ved -30 C, med efterfølgende analyse ved 37 C. Samme undersøgelse undersøgte stabiliteten ved opvarmning i vandbad op til 60 C i 5 minutter, og her viste TnI sig også stabil (13). I et klinisk studie har albumin vist sig stabil efter nedfrysning ved -80 C i 13 dage (14). Dette bekræftes i endnu et studie, hvor albumin, creatinin, chlorid, natrium og CRP alle har vist sig stabile efter nedfrysning i 13 måneder ved -80 C (15). Natrium har ydermere vist sig stabil i 2 år ved -80 C, og tilmed undergået 100 freeze-thaw cycles (nedfrysning og efterfølgende optøning) uden større ændringer i koncentration (7). 5

HsCRP har undergået op til fem og syv freeze-thaw cycles, ved henholdsvis -80 C og -70 C, uden større ændringer i koncentration (16) (17). Derudover har hscrp i samme undersøgelse vist sig stabil efter nedfrysning ved -70 C i tre uger (17). CRP har udvist instabilitet efter 13,8 års opbevaring ved -80 C, da der ved analyse blev påvist signifikant højere værdier. Dog påpeges fordampning som mulig årsag til denne stigning i koncentration (4). Det anbefales at opbevare plasmaprøver ved -80 C, da der derved opnås den bedste stabilitet for flest mulige parametre (18) (19). Albumin Albumin er et protein med en molekylvægt på 66 kd, som dannes i leveren. Det udgør ca. halvdelen af total-protein i plasma, og forekommer næsten udelukkende ekstracellulært. Albumin bruges blandt andet til bedømmelse af væskebalance og styring af væsketerapi, kontrol af renalt eller intestinalt proteintab samt defekt proteinsyntese m.fl. (6). Creatinin Creatinin er en anhydrid af creatin. Det er en svag syre, og et metabolisk slutprodukt. Creatinin bruges som screeningtest for nyrefunktion og kontrol af patienter med kendt nyresygdom (6). Chlorid Chlorid udgør 70% af de totale uorganiske anioner i plasma, og er den dominerende ekstracellulære anion. Chlorid bruges til kontrol ved korrektion af metabolisk acidose samt ved forstyrrelser i vand-, elektrolyt- og/eller syre-base-stofskiftet (6). Natrium Natrium er den dominerende ekstracellulære kation, og en afgørende faktor for vandfordelingen mellem ekstra- og intracellulærvæsken. Natrium bruges til vurdering af vand-, elektrolyt og/eller syre-base-stofskiftet ved en række tilstande (6). 6

CRP og hscrp C-reaktivt protein er en cyklisk pentamer med en molekylvægt på 120 kd. Det er en vigtig komponent i det medfødte immunsystem, og fungerer som en inflammatorisk akut-fasereaktant. Forskellige typer af inflammatorisk stimuli får CRP til at reagere uspecifikt. Koncentrationen af CRP i blodet er normalt meget lav (<1 mg/l), men stiger kraftigt under inflammation (6). TnI Muskelceller består af myofibriller, som er opbygget af tykke og tynde tråde. De tynde tråde består af bl.a. troponinkompleks. TnI er en polypeptidkæde med en molekylvægt på 24 kd, som sammen med troponin T og troponin C danner troponinkompleks. Størstedelen af TnI er bundet i muskelcellerne, men 5% findes frit i cytoplasma. Ved skade på myokardiet vil disse 5% blive afgivet til blodet først, og resten vil blive afgivet senere i forløbet (6). Materialer Apparatur Lithium-heparin prøverør - Vacuette Eppendorf Centrifuge 5810 R Dimension Vista 1500 Intelligent Lab System - Siemens Cobas 6000 c501 - Roche MiVac Duo Concentrator med Duo pumpe Genevac AE 260 Deltarange - Mettler (service 29.10.2012) Finnpipette 0,5-5ml Thermo LabSystems Engangspipettespidser Engangspipetter Dimension sample cups 1,5ml til Vista Sample cups 2,5ml til Cobas Prøveglas, plastik (13x75 mm) Reagenser ALB Flex -reagens, K1013, Siemens ECREA Flex -reagens, K1270, Siemens 7

CRP Flex -reagens, K7032, Siemens CTNI Flex -reagens, K6421, Siemens, V-LYTE STD B/Salt Bridge (SysL 1), K825, Siemens V-LYTE STD A (SysL 2), K820, Siemens V-LYTE Sample Dil (SysL 3), K835, Siemens System Diluent (SysL 4), KS804, Siemens Cuvette Wash Solution (SysL 5), KS805, Siemens Reagent probe cleaner (SysL 6), KS806, Siemens Sample probe cleaner (SysL 7), KS807, Siemens Enzyme Diluent, 790035901, Siemens Cardiac C-Reactive Protein (Latex) High Sensitive, 04628918, Roche Acid Wash, 04880307190, Roche Clean Cell, 0488029319, Roche ECO-Tergent, 06544410190, Roche Multi Clean, 04708725190, Roche NaOH-D, 04880285190, Roche Diluent NcCl 9%, 04489357190, Roche Pre-Clean, 03004899190, Roche Pro-Cell, 04880340190, Roche Probe Wash, 03005712190, Roche Kontrolmålinger samt angivelse af interne og eksterne kontroller, se bilag 1 og 2. Prøvemateriale Prøvematerialet bestod af 26 plasmaprøver fra patienter på Sygehus Vendsyssel, Hjørring. Blodprøverne blev taget i prøverør med lithium-heparin, og tidspunktet for afpipettering af plasma varierede fra få timer, og op til tre døgn, efter prøvetagning. Kriterierne for udvælgelse af prøvematerialet var, at prøverne indeholdt målbare niveauer af TnI, og bestod af minimum 1g plasma. Plasmaprøverne havde været opbevaret ved -80 C varierende fra en dag og op til 8 uger før analyse. 8

Metoder Fremgangsmåde Før udførelsen af det endelige forsøg blev der udført pilotforsøg. De 26 prøver tages ud af fryseren, og står til optøning ved stuetemperatur i cirka 3 timer. Analyse: Prøverne vendes fem til ti gange, og centrifugeres i 15 minutter ved 3400 rpm. Hver prøve analyseres for hscrp på Cobas. Herefter analyseres de hver især for hhv. albumin, creatinin, chlorid, natrium, CRP og TnI på Vista. Afvejning: Et 13x75 mm prøveglas vejes og vægten noteres. Vægten nulstilles. Der afpipetteres 1 g (+/- 0,02 g) prøvemateriale i prøveglasset, og vægten noteres. Så vidt muligt medtages eventuelt præcipitat ikke. Det oprindelige prøveglas med restmateriale bortskaffes. Dette gentages for hver af de 26 prøver. Fordampning: De 26 prøveglas placeres i MiVac Duo Concentrator, som er forvarmet til 36 C. MiVac kører i 50 minutter på indstilling (--). Afvejning: Efter fordampningen vejes prøveglas med indhold, og vægten noteres. Dette gentages for hver prøve. Analyse: Prøverne vendes fem til ti gange, og centrifugeres i 15 minutter ved 3400 rpm. Hver prøve pipetteres over i sample cups til Cobas. Præcipitat udelades. Hver prøve analyseres for hscrp på Cobas. Hver prøve pipetteres herefter over i sample cups til Vista, og prøverne analyseres for hhv. albumin, creatinin, chlorid, natrium, CRP og TnI på Vista. Analyseprincipper Fordampning Fordampning af de 26 prøver blev foretaget med mivac Duo Concentrator fra Genevac. Maskinen består af et lukket kammer med vakuum, hvori der er en centrifuge og en separat vakuumpumpe. 9

Princippet bag mivac er, at når trykket i kammeret sænkes, vil kogepunktet for det gældende opløsningsmiddel også sænkes. Når trykket er lavt nok, vil opløsningsmidlet koge, hvilket muliggør fordampning af dette ved en lavere temperatur end ved atmosfærisk tryk. Centrifugen sørger for, at prøvematerialet ikke koger over under koncentreringen, og vakuumpumpen pumper det fordampede materiale væk fra kammeret. Processen kan gøres hurtigere ved at forvarme kammeret (17). Albumin Ved ph-værdien 4,9 bindes bromocresol purpur (BCP) til albumin ved tilstedeværelsen af et opløsningsmiddel. Mængden af albumin-bcp-kompleks er direkte proportional med koncentrationen af albumin. Komplekset absorberer ved 600 nm, og måles ved hjælp af en polykromatisk (600, 540 og 700 nm) endepunktsteknik. Brugen af flere bølgelængder øger sensitiviteten, og minimerer interferens fra lipæmi (18). Creatinin I en parret enzymreaktion sker der, ved hjælp af creatinase, en hydrolysering af creatinin til creatin, og af creatin til sarcosin. Sarcosinoxidase hydrolyserer herefter sarcosin til glycin, formaldehyd og brintperoxid. Ved tilstedeværelsen af peroxidase danner brintperoxid sammen med et kromogen et farvet slutprodukt. Det farvede slutproduktet er proportionalt med mængden af creatinin i prøvematerialet, og måles ved hjælp af en bikromatisk (540 og 700 nm) måleteknik (18). Chlorid og natrium Chlorid- og natrium-analyser anvender begge indirekte V-LYTE Integrated Multisensor Technology (IMT). Ionerne måles ved hjælp af ionselektive elektroder. En fortyndet prøve placeres i multisensoren, og den gældende ion etablerer balance med elektrodeoverflade. I prøven genereres et potentiale således, at det er proportionalt med logaritmen for ionaktiviteten. Dette potentiale sammenlignes med potentialet fra en standardopløsning, og koncentrationen af den gældende ion beregnes ved hjælp af Nernst-modellen (18). CRP Analysen anvender polystyrenpartikler coatet med monoklonale antistoffer specifikke for humant CRP, som danner aggregater når de kommer i kontakt med humant CRP. Disse aggregater bestemmes turbidimetrisk. 10

Turbidimetrisk bestemmelse består i registrering af lys sendt gennem kuvetten hvori reaktionen mellem prøvemateriale og reagens foregår. Lysspredning forårsaget af partikler vil af detektoren registreres som en lyssvækkelse. Lyssvækkelsen vil være proportional med antallet af partikler. Resultatet bestemmes ved sammenligning med en kalibrator med en kendt koncentration (18) (19). hscrp Analyseprincippet er partikelforstærket immunturbidimetri. Under analysen agglutinerer humant CRP fra prøvematerialet med latexpartikler coatet med monoklonale anti-crp antistoffer. Aggregater dannet under agglutineringen bestemmes turbidimetrisk ved 546 nm. (20). Princippet bag turbidimetri er forklaret under CRP. TnI Analyseprincippet for TnI er kemiluminescent immunanalyse. Analysemetoden er en homogen sandwich kemiluminescent immunanalyse baseret på LOCI -teknologi. LOCI -reagenserne omfatter to syntetiske perlereagenser (Chemi- og Sensi-beads), og et biotinyleret anti-tni monoklonalt antistoffragment. Prøven, Chemibeads og biotyneleret antistof inkuberes, hvorved der dannes perle-tnibiotinylerede antistof-sandwiches. Herefter tilsættes Sensibeads, som binder sig til biotinet, og danner immunkomplekser af perle-par. Når komplekset belyses ved 680 nm, dannes der enkeltliniet oxygen af Sensibeads, som diffunderer ind i Chemibeads, og udløser en kemiluminescent reaktion. Denne reaktion måles ved 612 nm, og er en direkte funktion af koncentrationen af TnI i prøven (18). Databehandling Uddybende forklaring af databehandling, se bilag 3. 11

Søgeprotokol Dato Database Søgeord Antal hits Antal udvalgte full texts 26/3 2013 Google.com Sample evaporation during storage 9.250.000 2 23/4 2013 23/4 2013 Pubmed.com ctni stability 21 2 Pubmed.com CRP stability 84 2 23/4-2013 Pubmed.com Tabel 1. Søgeprotokol. Albumin stability storage temperature 155 1 Eksklusionskriterier: Prøvemateriale fra dyr. Artiklerne er udvalgt på baggrund af titel og abstract, og ti artikler er fundet ved hjælp af kædesøgning. Øvrige anvendte søgeord: Sample, plasma, serum, blood. Evaporation, sublimation, desiccation. Stability, storage, conditions, temperature. Albumin, creatinine, chloride, sodium, CRP, hscrp, c-reactive protein, TnI, Troponin I. Analyte, electrolyte, ion, protein. Bio bank, specimen bank. Normalization of laboratory results, volume correction. 12

Resultater Fordampning Fordampning og teoretisk ændring i koncentration Nr. Vægt før, g Vægt efter, g Fordampning Teoretisk ændring i koncentration 1 0,99 0,87-12,12% 13,79% 2 1,01 0,87-13,86% 16,09% 3 0,98 0,83-15,31% 18,07% 4 0,99 0,82-17,17% 20,73% 5 1,00 0,83-17,00% 20,48% 6 0,95 0,78-17,89% 21,79% 7 0,99 0,82-17,17% 20,73% 8 0,99 0,82-17,17% 20,73% 9 0,99 0,82-17,17% 20,73% 10 1,00 0,84-16,00% 19,05% 11 0,86 0,74-13,95% 16,22% 12 0,99 0,86-13,13% 15,12% 13 0,99 0,84-15,15% 17,86% 14 1,01 0,84-16,83% 20,24% 15 0,86 0,71-17,44% 21,13% 16 1,00 0,83-17,00% 20,48% 17 1,00 0,83-17,00% 20,48% 18 0,99 0,81-18,18% 22,22% 19 0,99 0,83-16,16% 19,28% 20 0,94 0,78-17,02% 20,51% 21 0,99 0,83-16,16% 19,28% 22 0,85 0,73-14,12% 16,44% 23 0,99 0,84-15,15% 17,86% 24 1,00 0,86-14,00% 16,28% 25 0,99 0,85-14,14% 16,47% 26 0,76 0,64-15,79% 18,75% Tabel 2. Prøvernes vægt før og efter fordampning, procentvis fordampning samt procentvis teoretisk ændring i koncentration. 13

Seks af prøverne levede efter optøning ikke op til kravet om at bestå af minimum 1 g prøvemateriale uden clot. Således havde prøve nummer 6 og 20 for lidt prøvemateriale, prøve nummer 11 og 22 havde clots, og prøve nummer 15 og 26 havde både for lidt prøvemateriale og clots. Den endelige fordampning af prøverne lå mellem 12,12% (nr. 1) og 18,18% (nr. 18), hvilket svarer til en teoretisk ændring i koncentration på 13,79% til 22,22%. Ændring i koncentration Nr. Teoretisk ændring i koncentration Albumin Creatinin Chlorid Natrium 1 13,79% 15,64% 13,37% 20,00% 15,35% 2 16,09% 22,36% 20,69% 25,47% 20,51% 3 18,07% 19,02% 16,62% 21,50% 16,78% 4 20,73% 21,83% 9,94% 22,64% 17,72% 5 20,48% 21,23% 21,36% 25,74% 20,32% 6 21,79% 20,95% 21,05% 22,43% 17,72% 7 20,73% 23,97% 21,24% 24,78% 19,78% 8 20,73% 21,65% 25,36% 24,04% 19,83% 9 20,73% 22,85% 35,10% 21,70% 17,52% 10 19,05% 20,00% 28,18% 21,93% 18,22% 11 16,22% 17,12% 17,95% 19,05% 16,13% 12 15,12% 16,98% 16,49% 18,10% 14,58% 13 17,86% 19,79% 18,21% 21,82% 18,60% 14 20,24% 22,07% 21,09% 23,89% 19,42% 15 21,13% 23,59% 23,57% 25,00% 20,69% 16 20,48% 21,83% 19,00% 23,28% 18,54% 17 20,48% 22,99% 14,64% 22,69% 18,47% 18 22,22% 22,22% 25,73% 23,81% 19,83% 19 19,28% 21,58% 22,39% 22,40% 19,30% 20 20,51% 20,43% 20,45% 21,21% 17,29% 21 19,28% 19,53% 23,08% 20,19% 15,60% 22 16,44% 17,07% 37,73% 19,81% 16,62% 23 17,86% 16,30% 22,73% 19,09% 16,12% 24 16,28% 21,94% 24,41% 20,34% 17,25% 14

25 16,47% 18,23% 16,50% 18,64% 15,31% 26 18,75% 21,90% 20,20% 22,43% 19,04% Tabel 3. Procentvis ændring i koncentration efter fordampning for albumin, creatinin, chlorid og natrium. Ændring i koncentration Nr. Teoretisk ændring i koncentration CRP hscrp TnI 1 13,79% - 28,13% 2 16,09% 24,82% - 4,59% 3 18,07% - 19,35% 4 20,73% 25,00% - 7,30% 5 20,48% 96,13% 6 21,79% 7 20,73% - 13,04% 8 20,73% 27,93% - 4,95% 9 20,73% 17,18% 0,76% 10 19,05% 14,72% 5,66% 11 16,22% 7,04% 12 15,12% 3,63% 13 17,86% 16,43% 59,11% - 18,18% 14 20,24% - 92,64% 15 21,13% 19,73% - 18,42% 16 20,48% - 40,94% - 21,74% 17 20,48% 15,40% 8,04% 18 22,22% 16,19% - 18,18% 19 19,28% 16,51% - 3,08% 20 20,51% 17,51% 1,59% 21 19,28% 16,85% - 20,00% 22 16,44% 29,60% 9,78% 23 17,86% 16,07% 8,06% 24 16,28% 17,22% 1,59% 25 16,47% 16,38% 26 18,75% 25,26% - 98,50% - 9,68% Tabel 4. Procentvis ændring i koncentration efter fordampning for CRP, hscrp og TnI. 15

De manglende værdier for CRP skyldes målte koncentrationer <2,90 mg/l eller >190 mg/l, for hscrp koncentrationer >20 mg/l og for TnI koncentrationer <0,015. For beregninger af fordampning, se bilag 4. Normalfordeling Ved vurdering af probit plots antages det, at prøveresultaterne før og efter for albumin, creatinin, chlorid og natrium stammer fra en normalfordeling. CRP, hscrp og TnI antages ikke at stamme fra en normalfordeling. For beregninger af normalfordeling, se bilag 4. For probit plots, se bilag 5. Målformulering 1 Differensplots De følgende fire figurer (1-4) består af differensplots for albumin, creatinin, chlorid og natrium. Differensplottene giver en grafisk afbildning af, hvor langt de målte værdier efter fordampning ligger fra de teoretiske værdier efter fordampning. Den teoretiske koncentration efter fordampning er beregnet ud fra den målte koncentration før fordampning. differens, g/l Albumin 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 15,0-0,5 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0-1,0 middelværdi, g/l Figur 1. Differensplot Albumin efter fordampning, målte og teoretiske værdier. I differensplottet for albumin ses, at der både er positive og negative differenser. Størstedelen (22/26) af differenserne er dog positive. Generelt ligger den målte værdi for 16

højt, og koncentrationen af albumin er altså steget mere end forventet under fordampningen. 15,0 Creatinin differens, μmol/l 10,0 5,0 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0 350,0 400,0-5,0-10,0 middelværdi, μmol/l Figur 2. Differensplot Creatinin efter fordampning, målte og teoretiske værdier. Differensplottet for creatinin viser både positive og negative differenser. Dog placerer de fleste af de målte værdier sig højere end de teoretiske, hvilket betyder, at koncentrationen af creatinin i de fleste tilfælde (18/26) er steget mere end forventet under fordampningen. differens, mmol/l Chlorid 12 10 8 6 4 2 0 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 middelværdi, mmol/l Figur 3. Differensplot - Chlorid efter fordampning, målte og teoretiske værdier. I differensplottet for chlorid ses det, at samtlige differenser er positive. Altså ligger samtlige af de målte værdier over de teoretiske værdier. Dette betyder, at koncentrationen af chlorid i alle prøverne er steget mere end forventet under fordampningen. 17

Natrium 8,0 6,0 differens, mmol/l 4,0 2,0 0,0 150,0-2,0 155,0 160,0 165,0 170,0 175,0 180,0 185,0 190,0 195,0-4,0-6,0-8,0 middelværdi, mmol/l Figur 4. Differensplot Natrium efter fordampning, målte og teoretiske værdier. Differensplottet for natrium viser både positive og negative differenser. Der er dog flest negative differenser, hvilket viser, at natrium i størstedelen af tilfældene (20/26), er steget mindre end forventet under fordampningen. T-test på albumin, creatinin, chlorid og natrium Tabel 5 viser resultaterne af parrede t-tests for henholdsvis albumin, creatinin, chlorid og natrium. T-testene er lavet ud fra de målte koncentrationer efter fordampning og de teoretiske koncentrationer efter fordampning. Signifikansniveauet er sat til 0,05, da dette er normal praksis inden for sundhedsvidenskab. H0: μmåle = μteori H1: μmåle μteori H 0 : De målte koncentrationer efter fordampning er ikke signifikant forskellige fra de teoretiske koncentrationer efter fordampning. H 1 : De målte koncentrationer efter fordampning er signifikant forskellige fra de teoretiske koncentrationer efter fordampning. 18

Parameter t- værdi t- tabel, f=25 H0- accept Albumin 4,853 2,060 Nej Creatinin 2,794 2,060 Nej Chlorid 8,837 2,060 Nej Natrium 2,665 2,060 Nej Tabel 5. Resultater af t- tests for albumin, creatinin, chlorid og natrium. Tabelværdien ligger, ved 25 frihedsgrader og med signifikansniveau 0,05, på 2,060. Den beregnede t-værdi ligger for alle fire parametre over tabelværdien. For samtlige af de fire parametre forkastes H 0, altså er der påvist en signifikant forskel på de målte koncentrationer efter fordampning og de teoretiske koncentrationer efter fordampning. Ingen af de fire parametre er således egnede til at foretage koncentrationskorrektion med, da deres ændring i koncentration ikke følger de teoretiske ændringer. For beregninger hørende til målformulering 1, se bilag 6. Målformulering 2 Der udføres ikke koncentrationskorrektion på TnI og hscrp, da måleværdierne for disse to er så henholdsvis spredte og få, at der ikke vil opnås et brugbart resultat. Her undersøges hvilken af de fire parametre, der er bedst egnet til at koncentrationskorrigere infektionsmarkøren CRP. Der korrigeres på de 16 CRP-værdier, som ved analyse viste en reel koncentration både før og efter fordampning. De anvendte statistiske metoder er differensplot og Wilcoxon-test, da CRP ikke er normalfordelt. Signifikansniveauet er igen sat til 0,05, da dette er almen praksis inden for sundhedsvidenskab. Koncentrationskorrektion foretages på CRP-værdierne målt efter fordampning. Det vil sige at de anvendte værdier i Wilcoxon-testen er CRP efter fordampning, som er korrigeret med den gældende parameter og CRP-værdien før fordampning. 19

H0: μmåle = μkorrigeret H1: μmåle μkorrigeret H 0 : De målte koncentrationer før fordampning er ikke signifikant forskellige fra de korrigerede koncentrationer efter fordampning. H 1 : De målte koncentrationer før fordampning er signifikant forskellige fra de korrigerede koncentrationer efter fordampning. Albumin 8 6 CRP/albumin differens mg/l 4 2 0-2 - 4-6 - 8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 middelværdi mg/l Figur 5. Differensplot CRP før fordampning og CRP efter fordampning korrigeret med albumin. Differensplottet viser flest positive differenser (12/16), hvilket betyder at de albuminkorrigerede efter-værdier ikke ligger lige så højt som før-værdierne. Teststørrelse ved Wilcoxon-test: 36 Acceptgrænse: ]29;107[ Wilcoxon-testen resulterer i en H 0 -accept, altså er der ikke påvist signifikant forskel på de målte CRP-koncentrationer før fordampning og de albumin-korrigerede koncentrationer efter fordampning. 20

Creatinin CRP/creatinin differens mg/l 20 15 10 5 0-5 - 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 middelværdi mg/l Figur 6. Differensplot CRP før fordampning og CRP efter fordampning korrigeret med creatinin. Differensplottet viser flest positive differenser (12/16), hvilket betyder at de creatininkorrigerede efter-værdier ikke ligger lige så højt som før-værdierne. Teststørrelse ved Wilcoxon-test: 25 Acceptgrænse: ]29;107[ Wilcoxon-testen resulterer i en H 0 -forkastelse, altså er de målte CRP-koncentrationer før fordampning påvist signifikant forskellige fra de creatinin-korrigerede koncentrationer efter fordampning. 21

Chlorid CRP/chlorid differens mg/l 12 10 8 6 4 2 0-2 - 4-6 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 middelværdi mg/l Figur 7. Differensplot CRP før fordampning og CRP efter fordampning korrigeret med chlorid. Differensplottet viser flest positive differenser (12/16), hvilket betyder at de chloridkorrigerede efter-værdier ikke ligger lige så højt som før-værdierne. Teststørrelse ved Wilcoxon-test: 28 Acceptgrænse: ]29;107[ Wilcoxon-testen resulterer i en H 0 -forkastelse, altså er de målte CRP-koncentrationer før fordampning påvist signifikant forskellige fra de chlorid-korrigerede koncentrationer efter fordampning. 22

Natrium CRP/natrium differens mg/l 6 4 2 0-2 - 4-6 - 8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 middelværdi mg/l Figur 8. Differensplot CRP før fordampning og CRP efter fordampning korrigeret med natrium. Differensplottet viser en tilnærmelsesvis ligelig fordeling af positive og negative differenser, henholdsvis ni og syv. Altså fordeler de natrium-korrigerede værdier sig pænt omkring før-værdierne. Teststørrelse ved Wilcoxon-test: 67 Acceptgrænse ]29;107[ Wilcoxon-testen resulterer i en H 0 -accept, altså er der ikke påvist signifikant forskel på de målte CRP-koncentrationer før fordampning og de natrium-korrigerede koncentrationer efter fordampning. Altså har både albumin og natrium vist sig egnet til koncentrationskorrektion af CRP. For beregninger hørende til målformulering 2, se bilag 7. 23

Diskussion Der er konsekvenser forbundet med analyse af prøver, som har været udsat for fordampning. Analyserne giver ikke samme resultat før og efter fordampning, da prøvernes bestanddele ændres i takt med fordampningen. Denne ændring er dog forskellig fra stof til stof, da deres stabilitet er af varierende grad. Ændringen afhænger blandt andet af temperatur og tid. Det er muligt at foretage koncentrationskorrektion på prøver udsat for fordampning, men brugbarheden af det korrigerede resultat afhænger af den korrigerende og den korrigerede parameter. I forsøget viste hverken albumin, creatinin, chlorid eller natrium sig stabile nok til korrektion af analyseresultater. Ved korrektion af CRP viste albumin og natrium sig dog egnede. TnI og hscrp viste sig begge ustabile, og dermed ikke egnede til at blive udsat for korrektion. Analyseresultaterne for albumin, creatinin, chlorid og natrium antages alle at stamme fra en normalfordeling, hvorimod CRP, hscrp og TnI ikke antages at stamme fra en normalfordeling. Dette er vurderet ud fra probit plots (bilag 5). Disse vurderinger danner baggrund for valget af hypotesetest til brug på den gældende parameter. Det kan dog ikke udelukkes, at der er sket fejl, da det er en vurderingssag. Hverken albumin, creatinin, chlorid eller natrium består hypotesetesten, som er afgørende for hvorvidt de er egnede til koncentrationskorrektion. I hypotesetestene er signifikansniveauet sat til 0,05, hvilket betyder, at der er 5% sandsynlighed for, fejlagtigt, at forkaste nul-hypotesen. Der er herved en reel risiko for en type 1 fejl, altså at der er sket en forkert forkastelse af en eller flere nul-hypoteser. Sænkes signifikansniveauet til 0,01, hvorved der opnås en tabelværdi på 2,787, vil natrium (t-værdi 2,665) bestå t-testen, og dermed vise sig egnet til korrektion. Creatinin (t-værdi 2,794) vil være lige på grænsen til at bestå testen. En sænkning af signifikansniveauet vil dog medføre en øget risiko for type 2 fejl, hvorved nul-hypotesen fejlagtigt accepteres. Det fremgår tydeligt af analyseresultaterne for TnI og hscrp, at disse ikke er egnet til at blive korrigeret. TnI viser deciderede fald i koncentrationen i 13 ud af 22 prøver, hvilket 24

slår fast, at den ikke er stabil. HsCRP viser fald ned til 98,50% og stigning op til 96,13%, hvilket slår fast, at heller ikke den er stabil. CRP viser derimod stigninger omkring det forventede, og består således en Wilcoxon-test med de målte før-værdier over for de forventede før-værdier. Ved korrektion af CRP med henholdsvis albumin, creatinin, chlorid og natrium viser både albumin og natrium sig egnede ved Wilcoxon-test. Det er ikke overraskende, at netop natrium viser sig egnet, da denne parameter var tættest på at bestå t-testen, og er da også før set anvendt som markør for volumenændringer (2) (7) (24). Creatinin er derimod mere overraskende, da albumin var tættere på at bestå sin t-test end creatinin. En succesfuld korrektion afhænger dog af de anvendte prøver. Da det kun er 16 af prøverne som korrigeres, kan det ikke udelukkes, at netop disse 16 prøver udviste mindre forskel mellem forventet og målt værdi for creatinin end for albumin. Altså kan analyseresultaterne for creatinin i disse prøver ligge tættere på de forventede resultater end de gør for albumin. Her gælder samme princip for type 1 og 2 fejl, altså kan en sænkning af signifikansniveauet muligvis føre til flere accepterede 0-hypoteser. Der er en række fejlkilder vedhæftet forsøget. Forsøget foregik ved temperaturer 20 C 37 C. Prøverne havde en temperatur på 37 C i op mod en time, og denne opvarmning kan have haft en indvirkning på parametrenes stabilitet. TnI er kun stabil i få timer ved stuetemperatur, hvilket betyder, at TnI slet ikke er egnet til at være med i forsøget, da det giver et for kort tidsrum til reanalyse. Prøverne blev, udover den normale centrifugering før analysering, centrifugeret i 50 minutter i MiVac. Det er ikke utænkeligt, at denne behandling kan have haft en indvirkning på de undersøgte parametre. Der var dog ikke en måler tilknyttet MiVac, så præcis g-kraft kendes ikke. Det kan ikke afvises, at der er sket en yderligere fordampning af prøverne før og under reanalyse på grund af anvendelse af små prøvekopper. Schowers et al. har foretaget en undersøgelse af fordampning fra små prøvekopper, og her blev observeret signifikante stigninger i koncentration af blandt andet natrium efter kun 15 minutter (24). Fordampning fra små prøvekopper over kort tid bekræftes af Burtis (25). De anvendte analysemetoder er ikke en egentlig fejlkilde, men har stor indflydelse på resultaterne af forsøget. Forskellige analysemetoder kan give forskellige resultater, og resultaterne fra dette forsøg vil ikke nødvendigvis gøre sig gældende i lignende forsøg, 25

hvor andre analysemetoder anvendes. Eksempelvis ses der en klar forskel i stabiliteten af hscrp og CRP. Denne forskel skyldes formentlig forskelle i selve analysemetoden. Der anvendes måske forskellige monoklonale antistoffer i hver af metoderne, og disse vil bindes til forskellige epitoper. Hvis de gældende epitoper er forandret af eksempelvis langvarig centrifugering eller opvarmning til 37 C, da vil analyserne give forskellige resultater. Gislefoss et al. nævner, at brug af polyklonale antistoffer øger muligheden for at delvist nedbrudte komponenter også måles, hvilket i dette tilfælde formentlig ville medføre et mere korrekt resultat (3). Kontrolmålingernes analyseusikkerhed, CV%, for albumin, creatinin, chlorid, natrium og CRP ligger fra 0,63% til 3,69%. Da usikkerheden for samtlige parametre ligger så lavt, bør den ikke have haft en udtalt indvirkning på resultaterne. CRP er den eneste af de anvendte parametre, som ikke lever op til målet for standardafvigelsen (SD) i kontrolmålingerne. Således er målværdien for 1SD lig 2,6, men den reelle værdi ligger på 2,71, svarende til en CV% på 3,69 (bilag 1). Det vurderes dog, at denne forskel heller ikke har haft indvirkning på resultaterne. Temperatur, langvarig centrifugering og analysemetoder er alle faktorer som kan ændres, hvorimod der altid vil være en vis analyseusikkerhed. Fordampning af prøver kan sandsynligvis foretages mere skånsomt, altså uden langvarig centrifugering og ved stuetemperatur, hvilket måske kan have en positiv indvirkning på de endelige resultater. Valg af analysemetoder er også værd at overveje, da disse også kan have indvirkning på resultaterne. En klar styrke ved forsøget er valget af afvejning af plasma frem for afpipettering. Dette har uden tvivl mindsket usikkerheden vedrørende mængden af prøvemateriale betydeligt. Dette valg bekræftes som en styrke af Craft et al., som i en undersøgelse af volumentab i nedfrosne prøver påpegede afpipettering som en sandsynlig fejlkilde (8). Forsøgets resultater er ikke direkte overførbare til brug på historiske prøver. Forskellige faktorer spiller ind på stabiliteten af de henholdsvis fordampede og nedfrosne prøver, og det vil derfor ikke være hensigtsmæssigt udelukkende at bruge dette forsøg som rettesnor for valg af parametre til koncentrationskorrektion. En gennemgang af litteraturen på området viser en højere stabilitet for både albumin, creatinin, chlorid, natrium, CRP og hscrp end dette forsøg har vist. Dette giver god mening, i og med at dette forsøg sandsynligvis har udsat prøverne for en mere hårdhændet behandling ved at fordampe dem, 26

end nedfrysning til -80 C er. Altså viser det konkrete forsøg, at koncentrationskorrektion vil være muligt, men ikke hvorvidt det er hensigtsmæssigt i forhold til historiske prøver. Konklusion Forsøget har vist, at koncentrationskorrektion af delvist fordampede prøver er muligt ved hjælp af udvalgte parametre, som blev målt i prøven før nedfrysning. Mens selve forsøget ikke har givet vished om hvilke parametre, der er egnet til at korrigere med og blive korrigeret, så har en gennemgang af litteraturen vist, at både albumin, creatinin, chlorid, natrium, CRP og hscrp er egnede til dette. Dog er TnI ikke egnet til korrektion, da den har en så kort stabilitet ved stuetemperatur, at den ikke er egnet til reanalyse. Perspektivering Koncentrationskorrektion er et værdifuldt redskab for biobanker verden over, da det åbner muligheden for forskning i parametre, som ellers ikke ville være mulige at analysere korrekt i historiske prøver. Således begrænser anvendelsen af koncentrationskorrektion sig ikke til hjertermarkørerne i dette projekt, men er anvendelig til alle parametre, som vurderes stabile under de forhold, som prøven har været opbevaret ved. Koncentrationskorrektion kan også anvendes til kontrol af prøvemængde under forhold, hvor prøver udsættes for forskellige påvirkninger, som utilsigtet fremmer fordampning, men hvor der stadig er brug for et præcist analyseresultat. 27

Referenceliste 1. Haynes, WM. CRC Handbook of Chemistry and Physics 92nd Edition 2011-2012. Boca Raton : CRC Press Taylor and Francis Group, 2012. 978-1-4398-5511-9. 2. Longnecker, MP et al. An Unexpected Distribution of Sodium Concentration in Serum Specimens Stored for More Than 30 Years. Annals og Epidemiology. 2003, Årg. 13, 3. 3. Gislefoss, RE et al. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2009, Årg. 47, 5. 4. Ishikawa, S et al. Comparison of C-reactive Protein Levels between Serum and Plasma Samples on Long-term Frozen Storage after a 13.8 Year Interval: The JMS Cohort Study. Journal of Epidemiology. 2007, Årg. 17, 4. 5. Burtis, CA et al. Factors Influencing Evaporation from Sample Cups, and Assessment of Their Effect on Analytical Error. Clinical Chemistry. 1975, Årg. 21, 13. 6. Lyngbye, J et al. Lyngbyes Laboratoriemedicin. København K : Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck, 2010. 978-87-17-04044-1. 7. Paltiel, L et al. Evaluation of Freeze Thaw Cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study. Cell Preservation Technology. 2008, Årg. 6, 3. 8. Craft, NE et al. Evaluation of Serum Volume Losses During Long-Term Storage. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 1993, Årg. 98, 3. 9. Redaktionen. Den Store Danske Gyldendals åbne encyklopædi. [Online] 2. Februar 2009. [Citeret: 2. Maj 2013.] http://www.denstoredanske.dk/it,_teknik_og_naturvidenskab/kemi/kemisk_laboratorie- _og_fabriksterminologi/sublimation. 10.. Den Store Danske Gyldendals åbne encyklopædi. [Online] 17. Februar 2009. [Citeret: 2. Maj 2013.] http://www.denstoredanske.dk/it,_teknik_og_naturvidenskab/kemi/fysisk_kemi_og_fysis k_elektrokemi/fasediagram?highlight=fasediagram. 11. Deans, KA et al. A practical assessment of the short-term in vitro stability of troponin I at the 99th percentile. Annals of Clinical Biochemistry. 2011, Årg. 48, 4. 12. Bayly, GR. Practical implications of in vitro stability of cardiac markers. Annals of Clinical Biochemistry. 2001, Årg. 38, 1. 13. Wojcik, M et al. Limitations of Biomarkers Serum Levels During Pulmonary Vein Isolation. Revista Española de Cardiología. 2011, Årg. 642, 2. 14. Pasella, S et al. Pre-analytical stability of the plasma proteomes based on the storage temperature. Proteome Science. 2013, Årg. 11, 1. 15. Brinc, D et al. Long-term stability of biochemical markers in pediatric serum specimens stored at -80C: A CALIPER Substudy. Clinical Biochemistry. 2012, Årg. 45, 10-11. 16. Hartweg, J et al. Stability of Soluble Adhesion Molecules, Selectins and C-Reactive Protein at Various Temperatures: Implications for Epidemiological and Large-Scale Clinical Studies. Clinical Chemistry. 2007, Årg. 53, 10. 17. Aziz, N et al. Analytical Performance of a Highly Sensitive C-Reactive Protein-Based Immunoassay and the Effects of Laboratory Variables on Levels of Protein in Blood. Clinical and Vaccine Immunology. 2003, Årg. 10, 4. 18. Elliott, P et al. The UK Biobank sample handling and storage protocol for the collection, processing and archiving of human blood and urine. International Journal of Epidemiology. 2008, Årg. 37, 2. 28

19. Rønningen, KS et al. The biobank of the Norwegian mother and child cohort Study: A resource for the next 100 years. European Journal of Epidemiology. 2006, Årg. 21, 8. 20. Inc., Genevac. Mason Technology. [Online] 2007. [Citeret: 2. Maj 2013.] http://www.masontechnology.ie/files/documents/gen4.pdf. 21. Vejen, HE. Dimension Vista Del 3 (Kap. 12.-16.). [Forskrift]. Hjørring : Sygehus Vendsyssel, Klinisk Biokemisk Afdeling, 12. Oktober 2012. 22. Burtis, CA & Ashwood, ER. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. Philadelphia : W.B. Saunders Company, 1996. 0-7216-3763-9. 23. Roche Diagnostics GmbH. CRPHS. [Analyseseddel]. Mannheim : Roche Diagnostics GmbH, 2012. 24. Schouwers, S et al. Sample evaporation from pierceable cups: Still an important source of analytical error. Clinical Biochemistry. 2010, Årg. 43, 18. 25. Burtis, CA. Sample Evaporation and Its Impact on the Operating Performance of an Automated Selective-Access Analytical System. Clinical Chemistry. 1990, Årg. 36, 3. 29