Validation of f-calprotectin assay by ELISA

- As well as comparison of collection- and extraction procedures. Karina Jensen BEP 2000 Advance ScheBo Quick-prep Quantum Blue

Validation of f-calprotectin assay by ELISA - As well as comparison of collection- and extraction procedures. Validering af f-calprotectin-analysen ved ELISA - samt sammenligning af opsamlings- og ekstraheringsmetoder. Karina Jensen, bn10s021, UCSJ. Professionsbachelorprojekt. 8.10.2013-3.1.2014 Klinisk vejleder: Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afdeling Køge. Institutionsvejleder: Kim Blanksø Pedersen. Bioanalytikerunderviser, UCSJ Campus Næstved. Antal anslag i rapporten: 42.816 Reference til billeder på forside: Billeder af BEP 2000 Advance fra Siemens og Quantum Blue fra Bühlmann er taget på KBA, Køge i perioden: okt.-dec. 2013. Billede med ScheBo Quick-prep blev lokaliseret på: http://www.alphalabs.co.uk/product-information/diagnostic-products/faecal-testing--- calprotectin.aspx 1

Resumé Baggrund: Region Sjælland udfører, som den eneste region i Danmark, ikke f-calprotectinanalysen, i stedet sendes patientprøver til Randers for analyse. Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge Sygehus vil gerne imødekomme kliniske ønsker, fra blandt andet gastromedicinske afdelinger og specialister i regionen, og kunne tilbyde flere og bedre diagnostiske analyser. Formål: I dette projekt valideres f-calprotectin-analysen ved ELISA-metoden fra Bühlmann ved sammenligning med andre valideringer/studier til eventuel implementering samt vurdering af egnethed af forskellige ekstraheringsmetoder. Desuden vil hurtigtesten Quantum Blue fra Bühlmann blive undersøgt. Materialer og metoder: 47 patientprøver blev analyseret på BEP 2000 Advance med f-calprotectin ELISA-reagenskit. Afvejning og ekstrahering samt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann blev anvendt som opsamlingsmetode. Hurtigtesten Quantum Blue blev ligeledes anvendt til analyse af f- calprotectin. Resultater: Metodesammenligning mellem ekstraheringer fra KBA, Randers og egne resultater på samme prøver gav en korrelationskoefficient (R 2 ) på 0,9646. Sammenligning af prøver opsamlet/ekstraheret ved afvejning og opsamlet/ekstraheret med ScheBo Quick-prep med ELISAreagenskit på BEP gav en R 2 på 0,9899. Intra- og intermediær præcision havde en gennemsnitlig CV % på 6,2 og 32,8. Resultatsammenligning af ELISA-reagenskit på BEP og ScheBo Quick-prep på Quantum Blue gav en R 2 på 0,9646. Konklusion: Der var en rigtig god overensstemmelse mellem resultaterne fra KBA, Køge og KBA i Randers. Implementering af analysen kan derfor anbefales i høj grad. Dog anbefales det, at analysere den intra- og intermediære præcision igen inden analysen implementeres. Der var også en god overensstemmelse mellem ELISA-reagenskit på BEP og ScheBo Quick-prep på Quantum Blue. Hurtigtesten anbefales dog ikke, da den ikke er bedre end ELISA på BEP. 2

Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Forord... 4 Introduktion... 5..Afgrænsning... 5...Problemformulering... 6..Metodiske overvejelser... 7 Materialer og metoder... 13 Materialer... 13 Metoder... 14 Resultater... 16 Diskussion... 21 Konklusion... 29 Perspektivering... 30 Referenceliste... 31 Bilag 1 - Analyseskema over anvendte referencer/ressourcer.... 33 Bilag 2 - Protokoller... 36 Bilag 3 - Rådata... 41 3

Forord Denne rapport er skrevet i forbindelse med det afsluttende professionsbachelorprojekt (PBP) på bioanalytikeruddannelsen fra oktober 2013 til januar 2014. Projektet blev udført i samarbejde med professionshøjskolen UCSJ og Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) på Køge Sygehus. Formålet med PBP er selvstændigt at kunne udvælge, tilrettelægge og gennemføre et udviklingsarbejde indenfor det bioanalytiske arbejdsområde med anvendelse af relevant videnskabelig tilgang (1). Professionsbachelorprojekt demonstrerer dette ved at udføre en validering af en biokemisk analyse samt en vurdering af egnet ekstraheringsprocedure. Den praktiske del af projektet blev udført på KBA, Køge. i samarbejde med medstuderende Mia Kühl Laursen og Trine Marie Jensen. Ligeledes er materiale- og metode- samt resultatafsnittene i rapporten skrevet i samarbejde med Mia Kühl Laursen og Trine Marie Jensen. En særlig stor tak til Kim Blanksø Pedersen. Bioanalytikerunderviser på UCSJ Campus Næstved, Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Anja F. Frederiksen. Specialist i specielanalyser på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Pierre Bouchelouce. Ledende overlæge på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Majken M. Jansen. Laborant på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Signe Wildt. Overlæge på Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus samt KBA i Randers og hele KBA på Køge. Karina Jensen, bioanalytikerstuderende, januar 2014. 4

Introduktion Region Sjælland udfører, som den eneste region i Danmark (DK), ikke f-calprotectin-analysen, som anvendes til diagnosticering af kronisk inflammatoriske tarmsygdomme, på engelsk inflammatory bowel disease (IBD). Dette betyder for gastroenterologiske afdelinger, specialister m.v. må sende patientprøver ud af regionen for at få foretaget en analyse (2). På Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus sendes patientprøverne til KBA Randers Sygehus. Dette er både langsommeligt, på grund af at svar fra Randers kun sendes hver 14. dag, og omkosteligt da det er dyrere at få analyseret prøverne i en anden region (3). På opfordring af Signe Wildt, Overlæge på Gastromedicinsk Afdeling, Køge og i forbindelse med, at KBA, Køge gerne vil kunne imødekomme kliniske ønsker i form af flere og bedre analyser, blev det besluttet at validere f-calprotectin-analysen på apparatet BEP 2000 Advance (BEP) fra Siemens til eventuel implementering på KBA, Køge. Afgrænsning Fokus i opgaven vil ligge på egnethed af reagenskit og ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann ved ELISAsandwich metoden analyseret på BEP 2000 Advance fra Siemens samt hurtigtesten Quantum Blue ligeledes fra Bühlmann. Med hensyn til patientmateriale, har vi valgt kun at samle ind fra patienter (ptt.) tilknyttet Gastromedicinsk Afdeling, Køge, da vi vil være sikre på at have materiale indeholdende calprotectin. Patientprøver fra eksempelvis praktiserende læger udelukkes, da der er en risiko for at modtage for få patientprøver og prøver med manglende indehold af calprotectin. Årsagen til valg af disse reagenskit og apparaturer er, at vi har størst mulighed for at finde resultater foretaget af andre afdelinger og i litteraturen til sammenligning med egne producerede resultater. Dermed afgrænses der fra, om der er andre apparaturer, reagenskit fra andre producenter etc. der kunne være interessante at undersøge i forhold til f-calprotectin. Desuden vil fokus være rettet på om, analysen sætter andre krav til bioanalytikeren eller afdelingen i form af økonomi, ændret arbejdsgange eller efteruddannelse af personale. 5

Problemformulering Hvilke resultater fås ved at analysere f-calprotectin på BEP 2000 Advance fra Siemens med reagens fra Bühlmann, og stemmer disse resultater overens med resultater produceret på samme apparat og med samme reagens anvendt på KBA Randers? Hvordan er overensstemmelsen mellem resultater fra fæces-ekstrahering med reagens fra Bühlmann og ekstrahering med ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann, og vil ScheBo Quick-Prep være velegnet som opsamlingsmetode for patienten? Hvordan stemmer resultater fra ScheBo Quick-Prep produceret på BEP 2000 Advance overens med resultater opnået ved anvendelse af hurtigtesten Quantum Blue fra Bülhmann, og kunne denne være et alternativ til analyse af f-calprotectin på BEP? IBD dækker over sygdommene Crohns sygdom (Morbus Crohn, på engelsk: Crohn s Disease, CD) og blødende tyktarmsbetændelse (colitis ulcerosa, på engelsk: Ulcerative colitis, UC). Incidensen for CD er firedoblet de sidste 20 år (4) og ligger på 600 ppt. (5). Tilfælde af UC er fordoblet de sidste 20 år (4), og ligger på 500 ptt. årligt (6). I DK er prævalensen for både CD og UC 15.000 ptt. (5,6). Ætiologien bag IBD er stadig ukendt, men man mener blandt andet, at den kronisk inflammatoriske tilstand skyldes et autoimmunt respons, især hos genetisk disponerede. Desuden ses CD hyppigere hos rygere, og UC hos eksrygere (5,6). Sygdommen viser sig oftest i 20-30 års alderen i form af mavesmerter, diarré, vægttab samt pus og blod i afføringen (5,6). Symptomerne skyldes inflammation opstået i colon ved UC (6). Ved CD kan inflammation opstå et eller flere steder, og hvor som helst, i gastrointestinalkanalen, men oftest ses inflammation i den sidste del af ileum, colon og rectum (5), se figur 1 (7). Figur 1: Illustration af hvor i mave-tarmkanalen IDB forekommer ved henholdsvis CD og UC (7). Diagnosticering af IBD kan stilles ved hjælp af biopsier fra rectum, koloskopi af og biopsi fra colon samt kapselendoskopi og MR-skanning til undersøgelse af tyndtarmen. Blod- og fæcesprøver kan også indikere sygdomsaktivitet. Måling af calprotectin i fæces kan differentiere mellem raske og syge samt mellem IBD og irritabel tarmsyndrom (på engelsk Irritable Bowel Syndrome, IBS), som er 6

en funktionel lidelse og altså ikke en sygdom, men oftest med lignende symptomer (8). IBD er kronisk, sygdomsaktiviteten kan dog nedsættes med anti-inflammatoriske og immunsupprimerende lægemidler. I svære tilfælde kan en operation være nødvendig, hvor dele af eller hele tarmen fjernes (5,6). Til behandlingsmonitorering af IBD er f-calprotectin-analysen også velegnet (8,9). Calprotectin: Calprotectin er en akut fasereaktant, som deltager i immunresponset ved inflammation. Calprotectin findes i især neutrofile granulocytter, men også i makrofager, monocytter mm. (10). Molekylet er opbygget af to underenheder kaldet myeloid-related protein-8 (MRP8) og myeloidrelated protein-14 (MRP14), se figur 2 (11). Disse giver calprotectin en særlig evne til at binde calcium og zink, afhængig af bindingen får calprotectin forskellige egenskaber. Figur 2: Calprotectinmolekyle med de to underenheder MRP8 (til venstre) og MRP14 (til højre). MRP8 består af 93 aminosyrer, og MRP14 består af 114 aminosyrer og er bundet sammen med ikke-kovalente bindinger. MRP8 er den aktive del af molekylet, mens MRP14 regulerer MRP8 (10), (11). Ved binding til calcium ændres molekylets form og de hydrofobe flader vendes ud mod proteiner såsom casein kinase, der regulerer blandt andet transduktionssignaler, DNA-reparation og - transkription mm. Zink er også med til formation af calprotectin og spiller en stor rolle ved at hæmme vækst af blandt andet B.burgdorferi ( Borrelia-bakterie) og C.albicans (candidagærsvamp). Desuden hæmmes calprotectinets cytotoksiske aktivitet (10). Metodiske overvejelser Én af årsagerne til at f-calprotectin ikke er blevet analyseret på KBA i Køge er, at der ikke findes noget korrekthedsmateriale, altså en golden standard, som vi kan referere til og sammenligne resultater med (2,11,13). KBA i Randers udførte en validering af f-calprotectin på BEP 2000 Advance i 2012 (13) og har fulgt producenten af ELISA-reagenskittet Bühlmann s vejledning for f- 7

calprotectin-analysen (12). I mangel på metrologisk sporbarhed valgte KBA i Randers at kontrollere analysens korrekthed ved at medtage eksterne kontroller, som skulle ligge indenfor en standarddeviation (SD) på 2 (13). Til validering af f-calprotectin-analysen skal der undersøges hvorvidt f-calprotectin kan analyseres på BEP 2000 Advance ved brug af ELISA-sandwichmetoden (se figur 3) ved siden af de daglige rutineprøver, hvorvidt vi får de samme resultater på analysen, som dem vi har valgt at sammenligne os med, i dette tilfælde Klinisk Biokemisk Afdeling på Randers sygehus (12,13). Desuden undersøges der om implementeringen af analysen medfører ændringer for personale, apparatur, økonomi og afdeling. Ydermere vil opsamlings- og ekstraheringsmetode med ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (15) blive undersøgt, vurderet og sammenlignet med afvejning og ekstrahering. ScheBo Quick-prep vil desuden blive undersøgt både i forhold til egnethed af analyse på BEP, holdbarhed af ekstraheringsbuffer samt selve opsamlingen af fæcesprøve af pt. Point of Care Testing (POCT) - apparaturet Quantum Blue fra Bühlmann (15) til hurtig test af f-calprotectin, vil også blive sammenlignet med ELISA-metoden, både egne resultater og resultater fra KBA, Randers. F-calprotectin - Analyseprincip: Til måling af calprotectin i fæces anvendes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) på BEP. ELISA er en sandwichmetode, som anvendes til at detektere antigener eller bestemmelse af antistoffer ved enzymer (12), se figur 3. Figur 3: Illustration af de forskellige trin i en ELISA-analyse. Karina Jensen. 20.12.2013. På calprotectin-komplekser bindes antigenerne til de specifikke, monoklonale antistoffer coatet på overfladen af brøndene i mikrotiterpladen. Et andet antistof konjugeret med enzymet horseradish peroxidase (HRP) tilsættes og reagerer med antigen. Substratet tetramethylbenzidin (TMB) tilsættes og reagerer med enzymet HRP, som herved 8

udvikler et blåt farvestof. Ved tilsætning af stopreagens forskydes ph-værdien og substrat/enzymreaktionen blokeres således. Herved skifter farven fra blå til gul. Intensiteten af farvesignalet er proportionalt med mængden af calprotectin i fæces. Absorbansen aflæses fotometrisk ved 450 nm (12). For at målesignalerne kan omregnes til koncentrationer, skal der udarbejdes en kalibreringskurve. Målesignalerne udtrykkes i OD-værdier (optical density) og er den værdi, der registreres af ELISAreaderen. Kalibratorerne, medfølgende reagenskittet fra Bühlmann, har en kendt koncentration på 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g (12). Kalibreringskurven dannes således ud fra OD-værdien hen ad x-aksen og koncentrationer af calprotectin i kalibratorer op ad y-aksen i en semilogaritmisk graf ved at benytte en 4-parametrisk datamodel. Denne model benyttes for at få en mere lineær graf, som ligner kalibreringskurven i produktvejledningen fra Bühlmann (2). Ud fra kalibreringskurven kan der nu angives koncentrationer på prøver med ukendt koncentration af calprotectin. Ifølge Bühlmann har f-calprotectin-analysen en sensitivitet og en specificitet på henholdsvis 84,4 % og 94,5 %. Andre studier viser samme tendens ved måling af f-calprotectin ved ELISA-metoden, dog ikke med reagenskit fra Bühlmann, men fra andre producenter og på forskelige apparaturer (8, 12, 16, 17). Denne undersøgelse viste foruden, at analysen er sensitiv og specifik, også at den er egnet til differentiering af IBD og IBS. ScheBo Quick-prep fra Bühlmann er et opsamlingsrør med en doseringstip til opsamling af fæces, se figur 4 til højre (18). Røret indeholder ekstraheringsbuffer, som fæces kommes direkte i. Figur 4: ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (18). Denne metode skulle gøre det nemmere at opsamle fæces for pt. og nemmere/hurtigere for bioanalytikeren at analysere på BEP eller Quantum Blue, idet trin i ekstraheringsproceduren springes over (12, 14). 9

Quantum Blue (figur 5) fra Bühlmann er en hurtigtest hvis princip også er et sandwich immunoassay. Her er de monoklonale antistoffer coatet på testmembranen. Calprotectin-antigener binder sig til Figur 5: Hurtigtesten Quantum Blue fra Bühlmann. Billede taget på KBA i Køge i perioden okt.-dec. 2013. Figur 6: Testkassette tilhørende Quantum Blue. Fortyndede fæcesekstraheringer tilsat brønd yderst til højre på kassetten. Stregerne i det ovale felt er henholdsvis kontrolstreg og teststreg. Billede taget på KBA i Køge i perioden okt.-dec. 2013. antistofferne, hvorefter et andet detektions-antistof konjugeret med guld kolloider binder sig til komplekset på membranen. Intensiteten af testlinjen afhænger af, hvor meget calprotectin der er bundet, se figur 6, og måles og kvantificeres af Quantum Blue Readeren (15). Litteratur til sammenligning af apparaturet med BEP vil den fundne litteratur blive vurderet i diskussionen (19, 20). Patientmateriale: Der skal indsamles 30-50 fæcesprøver med ukendt koncentration af calprotectin fra ptt. tilknyttet Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus fra ptt. tilknyttet afdelingen. Ptt. herfra afleverer to fæcesprøver, hvoraf den ene bliver sendt til analyse på KBA, Randers, og den anden modtager vi til analyse. Disse prøver bliver ekstraheret efter Bühlmann s procedure (12). Ved modtagelse opsamles og ekstraheres prøverne og opbevares ved -18 C indtil analysering. Pools blandes af patientmateriale og anvendes til udregning af den intra- og intermediære præcision. Pools inddeles efter lav-, middel- og høj koncentration af calprotectin efter anbefalingerne fra Bühlmann (12). Anvendt statistik Til validering af f-calprotectin-analysen anvendes de samme parametre, som KBA, Randers. Korrekthed er målesandheden, altså hvor tæt egne resultater ligger på den sande (vedtagne) værdi og er et udtryk for den systematiske variation. Korrektheden beregnes og vurderes ved sammenligning af egne og andre laboratoriers resultater samt analysering af certificerede eksterne kontroller og sammenligning af disse resultater med andre laboratorier (21). Korrekthed 10

udtrykkes i bias og er den gennemsnitlige afvigelse i forhold til den sande værdi. Vi vil sammenligne resultater med KBA, Randers, måle på kalibratorer samt lav- og høj kontrol fra Bühlmann og eksterne kontroller fra Equalis (22) og sammenligne disse resultater med Randers. Til metodesammenligningen vil der blive udarbejdet et x-y plot med lineær regression og et differensplot i Excel. X-y plottet er udtryk for den lineære sammenhæng mellem to variabler, i dette tilfælde mellem egne resultater og resultater fra KBA, Randers. Sammenhængen mellem de to variabler udtrykkes i R - korrelationskoefficienten, og den skal ligge så tæt på 1 som muligt (21). Differensplottet udtrykker gennemsnittet af egne og Randers målte værdier hen ad x-aksen og differenser mellem egne og Randers målte værdier op ad y-aksen. Værdier fordelt tæt på nullinjen (x-aksen) udtrykker et perfekt differensplot (21). Der blev valgt at anvende samme måleområde som KBA, Randers på 30-1800 μ/g. Måleområdet er fastsat ud fra anbefalingerne fra Bühlmann (12). Bias er den målte gennemsnitlige afvigelse fra den sande værdi, eller targetværdi. I dette projekt er vores targetværdi bl.a. resultaterne fra de eksterne kontroller fra Equalis målt i Randers. Præcision er udtryk for den tilfældige præ-, post- og analytiske variation. Her vil det være den analytiske variation der vil blive fokuseret på. Der vil altid være små variationer i analyseapparaturets målinger. På laboratoriet udtrykkes variationerne som impræcision og beregnes ud fra spredningen (SD) og variationskoefficienten (CV %) (21). SD er spredningen mellem gentagne målinger på samme prøve, altså hvor langt resultaterne spreder sig fra den målte middelværdi. CV % anvendes til at vurdere hvor meget resultaterne spreder sig fra hinanden, og er altså et udtryk for den gennemsnitlige variation i forhold til middelværdien (23). Impræcisionen beregnes ud fra intraseriel impræcision (repetérbarhed), hvor der foretages 5 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pools) med henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie. Der beregnes også intermediær præcision, hvor der foretages dobbeltbestemmelse på samme prøve (pools) med lav- middel- og høj koncentration over minimum 10 forskellige serier med forskellige reagenslot. Bühlmann opgiver en intramediær præcision på 4 % og intermediær præcision på < 15 %. Randers fik en intramediær CV % på 9,87 %, 4,26 % og 3,24 % for henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration og en intermediær CV % på < 20 %, som de har fastlagt som krav til analysen (13). 11

Parret t-test fortæller om forskellen i de målte middelværdier i to grupper af data, der hører sammen parvis. Der vurderes hvorvidt der er en signifikant forskel på det målte eller ej (H1- eller H0-hypotesen). Er teststørrelsen stor, indikerer det en signifikant forskel i opsamlingsmetoderne. Er teststørrelsen lille, skyldes det blot tilfældigheder, og metoderne vil derfor være lige gode at anvende (23). Den parrede t-test vil blive anvendt til sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann og til vurdering af bufferens holdbarhed i ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann både ved 20-25 C og ved 5 C. Dette er for at se om temperatur påvirker resultaterne, når ptt. får opsamlingskittet ScheBo Quick-prep med hjem. Bühlmann anbefaler, at prøven tages, opbevares ved 2-8 C og analyseres indenfor 6 døgn (15). Projektet deles op i 4 forsøg. Her er hvad vi vil gøre med forsøgene præsenteret nedenfor i tabel 1 for at gøre det mere overskueligt: Forsøg Formål Prøvemateriale Beregninger 1 Metodesammenligning - korrekthed Sammenligning af resultater produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP med resultater fra KBA, Randers produceret ved ELISAreagenskit fra Bühlmann. Sammenligning af egne resultater produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP med resultater fra eksterne kontroller fra Equalis, interne kontroller og kalibratorer fra Bühlmann produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP. Apparaturets analytiske præcision Intramediær præcision på henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie. Intermediær præcision på henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration fordelt på 10 serier. 2 Egnet ekstraheringsmetode Sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann 3 Holdbarhed af ekstrakt Vurdering af holdbarheden af fæces efter ekstrahering. Prøverne analyseres yderligere efter 24, 48 og 72 timer. 4 Quantum Blue Sammenligning af resultater ved ELISA-reagenskit på BEP med resultater produceret med ScheBo Quick-prep på Quantum Blue fra Bühlmann. 30 patientprøver med calprotectinkoncentrationer indenfor måle-området (30-1800 μg/g). Opsamlet, afvejet og ekstraheret med hænderne og med ScheBo Quick-prep. 2 Eksterne kontroller fra Equalis med ukendt koncentration af f-calprotectin. 2 Interne kontroller med en lav og en høj værdi samt 5 kalibratorer (A-E) fordelt på henholdsvis 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g calprotectin. 5 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pool). 10 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pool). 10 udvalgte patientprøver fordelt i måleområdet (resultater fra forsøg 1). 20 patientprøver fordelt i måleområdet (fra protokol 1). 30 patientprøver ekstraheret med ScheBo Quick-prep. Differensplot og lineær regression. Bias %. Middelværdi, SD og CV %. Standardkurve ved 4- parametrisk logistikprogram. Middelværdi, SD og CV %. Middelværdi, SD og CV %. Parret t-test. Parret t-test. Differensplot og lineær regression. 12

Materialer og metoder Materialer Reagenser/utensilier/apparatur Til forsøg 1 blev der anvendt kit fra Bühlmann (lot nr. 1945, 1552, 1552.1) indeholdende ekstraheringsbuffer, mikrotiterplade coatet med anti-calprotectin, vaskebufferkoncentrat, inkubationsbuffer, kallibratorer A til E, en lav og en høj kontrol, mærket enzymkonjugat, TMBsubstrat og stopopløsning. Af apparaturer blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools og mini-rotator til homogenisering af suspensionerne. Til forsøg 2. De samme reagenser blev anvendt som i forsøg 1. Derudover blev der anvendt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann til ekstrahering af fæces (lot nr. 2313), spidsrør med skruelåg, 82 x 13 mm afpipetteringsglas med låg fra Sarstedt og 2 ml rør. Af apparaturer blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools, mini-rotator og mini-shaker til homogenisering af suspensionerne, analysevægt (10-150 mg) til afvejning af fæces og brug af stinkskab under ekstraheringen. Til forsøg 3 blev der anvendt fem ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (lot nr. 2313) fra forsøg 1 til ekstrahering af patientprøve 5 med en calprotectinkoncentration på 243 μg/g (resultat fra KBA, Randers). Her blev BEP 2000 Advance fra Siemens også anvendt til analysering samt centrifuge. Til forsøg 4 blev der anvendt et kit fra Bühlmann indeholdende ekstraheringsbuffer, Chase-buffer, som er en fortyndingsbuffer (15), test cartridge og RFID chip card (lot nr. 0108.XHR). Yderligere blev der anvendt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (lot nr. 2313) fra forsøg 3 og spidsrør med låg. Apparaturet Quantum Blue fra Bühlmann blev anvendt til analysering af prøverne. Herudover anvendtes mini-shaker til homogenisering af prøverne. 13

Metoder I november 2012 blev der indsamlet 18 patientprøver i form af fæces fra ptt. tilknyttet Medicinsk Gastroenterologisk Afdeling, Køge i perioden. Ptt. afleverede to fæcesprøver hver, én blev sendt til Randers, og den anden modtog vi på KBA, Køge. Desuden modtog vi fæcesprøver og ekstraheringer til analyse i Køge fra 29 ptt., som allerede var analyseret i Randers. Vi kendte altså koncentrationerne på alle patientprøver, som var fordelt mellem 15-9000 μg/g, inden vi selv analyserede prøverne (se bilag 2 for detaljeret fremgangsmåde og bilag 3 for analyseresultater). Ved forsøg 1 blev ekstraheringerne fra Randers analyseret. Inden analysering på BEP 2000 Advance, blev Calprotectin ELISA-kittet stuetempereret. Prøverne blev optøet og vendt på mini-rotator i 10 minutter. Derefter overført til afpipetteringsglas med låg og centrifugeret i 5 minutter ved 3000 g. Alle reagenser, kalibratorer og kontroller blev vendt for homogenisering. Reagenser, patientprøver, kontroller og kalibratorer blev placeret på apparatet ifølge reagens/kontrol oversigten. Efterfølgende blev BEP 2000 Advance igangsat ved hjælp af afdelingens D4-procedure (24), og de opnåede data blev udskrevet og bearbejdet som beskrevet i metodiske overvejelser. Der blev desuden fremstillet pools til præcisionsforsøg (intermediær og intramediær præcision) ud fra først nævnte ekstraheringsmetode fra flere patientprøver med kendte koncentrationer. Disse blev centrifugeret og 300 µl blev udportioneret til 2 ml rør. Koncentrationerne til pools på henholdsvis lav, middel og høj blev valgt ud fra indlægssedlen til ELISA-kittet fra Bühlmann, for at kunne sammenligne resultater (12). Ved forsøg 2 blev prøverne mærket med prøvenummer. Et stativ, et tomt 10 ml rør og en podepind blev placeret på præcisionsvægten, hvorefter denne blev tændt. Der blev afvejet mellem 50 og 100 mg fæces. Vægten på prøven blev vurderet og noteret i et skema. Et stykke af podepinden blev klippet af og ekstraheringsbuffer blev tilsat (49 X vægtvolumenet), hvorefter låget blev skruet på røret. Prøven blev homogeniseret på mini-rotator i 30 minutter, og efterfølgende blev 1 ml af ekstraktet overført til et 2 ml rør mærket med prøvenummer. Prøven blev frosset ved -20 C. 14

ScheBo Quick-prep blev mærket med samme prøvenummer. Doseringstippen blev dyppet i røret med fæcesprøven til rillerne i tippen var fyldt op med prøvematerialet og blev derefter placeret i røret. Røret lukkes ved at trykke podepinden ned og dreje med urets retning. Herefter blev ekstraktet homogeniseret på mini-shaker i 30 sekunder. Efter prøven havde hvilet i 10 minutter, blev den igen homogeniseret på mini-shaker til fæces var fuldstændig væk fra doseringstippen. Prøven blev frosset ved -20 C. Prøverne blev optøet og klargjort til analysering som i forsøg 1. Ved forsøg 3 blev der udvalgt en fæcesprøve med en kendt koncentration af calprotectin. Denne prøve blev ekstraheret (som ved forsøg 1) til 5 ScheBo Quick-Prep mærket med køl og 5 ScheBo Quick-prep, som derefter hver især blev overført til et afpipetteringsglas og disse blev mærket med stuetemperatur. Prøverne blev natten over opbevaret henholdsvis i køleskab og ved stuetemperatur. Efterfølgende blev prøverne analyseret på BEP 2000 Advance ved henholdsvis 0, 24 og 48 timer. Ved forsøg 4 blev de ekstraherede ScheBo Quick-prep fra Bühlmann analyseret på Quantum Blue. Ekstraktet blev fortyndet i forholdene 1:150 ved at blande 3 ml fortyndingsbuffer med 20 µl af ekstraktet i et spidsrør med låg. Herefter blev prøven homogeniseret på mini-shaker i ca. 10 sekunder og hvilte efterfølgende i 10 minutter. 80 µl af det fortyndede ekstrakt blev afpipetteret til brønden i testkassetten og efter 15 minutter blev denne aflæst i Quantum Blue (15). Resultaterne blev nedskrevet i et skema til videre bearbejdning. 15

Resultater Forsøg 1 De 5 kalibratorer (A-E, i skema S1-S5) fordelt på henholdsvis 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g calprotectin havde en CV % 5 % bortset fra målingerne på kalibrator A (S1), som havde en CV % på 59,2, se tabel 2. Tabel 2: Oversigt over targetværdier, målte middelværdier samt SD og CV %. Standard Target Middel SD CV % S1 30 16 9,5 59,2 S2 90 94,8 4,7 4,9 S3 300 286,4 14,2 5,0 S4 900 903,8 11,5 1,3 S5 1800 1688,1 354,1 21,0 Ud fra de målte værdier blev der dannet en standardkurve med et 4-parametrisk logistikprogram, hvorfra målinger på ukendte prøver kan beregnes, se tabel 3. Tabel 3: Standardkurve fra kørsel 4 på BEP. 16

% Bias (egne målinger på BEP) Egne målte middelværdier Validation of f-calprotectin assay by ELISA Resultater fra ekstraheringer foretaget på KBA, Randers og egne producerede resultater på de samme prøver på KBA, Køge gav en korrelationskoefficient (R 2 ) på 0,9646. Den lineære sammenhæng er illustreret i tabel 4 nedenfor, se desuden rådata anvendt til metodesammenligning i bilag 3. Tabel 4: Den lineære regression mellem ekstraheringer fra Randers og egne målte middelværdier af samme ekstraheringer fra Randers. Metodesammenligning 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 500 1000 1500 Værdier fra Randers y = 0,9898x + 6,6024 R² = 0,9646 Metodesammenligning Lineær (Metodesammenligning) Differensplottet i tabel 5 udtrykker gennemsnittet af egne og Randers målte værdier hen ad x- aksen og differenser mellem egne og Randers målte værdier op ad y-aksen. Bortset fra de 2 værdier liggende på -27,0 og 29,5 holder de andre målte værdier sig indenfor en bias % på 20. Tabel 5: Differensplot over ekstraheringer fra Randers og egne målte middelværdier af samme ekstraheringer fra Randers. 40,0 % Bias (differensplot) 30,0 20,0 10,0 0,0-10,0-20,0-30,0 0 500 1000 1500 Randers % Bias (differensplot) 17

% Bias ScheBo Quick-prep Validation of f-calprotectin assay by ELISA Sammenligning af målinger på prøver opsamlet og ekstraheret ved afvejning og opsamlet og ekstraheret med ScheBo Quick-prep med ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP. Den lineære sammenhæng mellem de 9 prøveresultater havde en R 2 på 0,9899, se tabel 6. Tabel 6: Den lineære regression mellem opsamling og ekstrahering ved afvejning og ved ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. Metodesammenligning 1200 1000 y = 1,1636x - 19,055 R² = 0,9899 800 600 400 200 Metodesammenligning Lineær (Metodesammenligning) 0 0 200 400 600 800 1000 Afvejning Differensplottet i tabel 7 udtrykker gennemsnittet af resultater opnået på opsamling og ekstrahering ved afvejning og opsamling og ekstrahering med ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. I differensplottet ses de målte værdier hen ad x-aksen ved afvejning og differenser mellem de målte værdier af afvejning og ScheBo Quick-prep op ad y-aksen. Der ses en bias % mellem - 38,9 og 52,3, se bilag 3 for rådata. Tabel 7: Differensplot over opsamling og ekstrahering ved afvejning og ved ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. 60,0 40,0 20,0 % Bias (differensplot) 0,0-20,0-40,0-60,0 0 200 400 600 800 1000 Afvejning % Bias 18

Til måling af korrekthed med eksterne kontroller fra Equalis blev differencen (bias %) målt til at være -33,3 % for kontrol 36A og -22,2 % for kontrol 36B. For kontrol 47A og B fik vi en bias % på henholdsvis -20,6 og -25,2. Målingerne på de 2 eksterne kontroller viste altså en forskel på over 20 bias %, som vist i nedenstående tabel 8. Der ses desuden en stor spredning (SD) og en høj CV % i de målte værdier i forhold til target opgivet af Equalis (22). Tabel 8: Resultater af målinger på eksterne kontroller. Equalis Middelværdi Target Bias % SD CV % middelværdi 36A 28,5 42,7-33,3 10,0 35,2 36B 119 153-22,2 24,0 20,2 47A 196 247-20,6 36,0 18,4 47B 432,5 578-25,2 102,9 23,8 De 2 interne kontroller medfølgende reagenskit fra Bühlmann havde en lav og en høj calprotectinkoncentration. Target, altså den værdi, vi burde få ved analysering, er opgivet i reagenskittets datasheet, se tabel 9. Analysen gav en SD på 7,1 og en CV % på 6,6 for den lave kontrol. Analysering af den høje kontrol gav en SD på 14,1 og en CV % på 3,6. I tabel 8 ses en middelværdi for LOW og HIGH på 108,25 og 395,875 μg/g. Middelværdien angivet i tabel 8 er middelværdien for alle analyseserierne, hvor både kontroller og kalibratorer blev analyseret. Tabel 9: Resultater fra analyser af kitkontroller fra Bühlmann. Kit kontroller Target Middel Bias % SD CV % LOW 108 108,25 0,2 7,1 6,6 HIGH 459 395,875-13,8 14,1 3,6 Beregning af intramediær præcision på 5 dobbeltbestemmelser på samme pool med henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie gav en intramediær præcision på 3,7 SD for pool med lav koncentration, 23,4 SD for pool med middel koncentration og en SD på 197,1 for pool med høj koncentration. CV % var Tabel 10: Skema over middel- og SD-værdi samt CV % ved den intramediære præcision. Middel SD CV% 70,1 3,7 5,3 756,5 23,4 3,1 1933,5 197,1 10,2 på henholdsvis 5,3, 3,1 og 10,2, se tabel 10 til højre. For detaljeret dataoversigt se, bilag 3. 19

Quantum Blue Validation of f-calprotectin assay by ELISA Beregning af intermediær præcision på samme prøve (pool) med henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration fordelt på 10 serier gav for lav pool en SD på 4,5 og en CV % på 5,9. Pool med middel koncentration gav en SD på 60,8 og en CV % på 9,3. Målinger på pool med høj koncentration gav værdier på 790,6 SD og 83,2 CV %, se tabel 11 til højre. For detaljeret Tabel 11: Skema over middel- og SD-værdi samt CV % ved den intermediære præcision. Middel SD CV% 76,2 4,5 5,9 651,3 60,8 9,3 950,7 790,6 83,2 dataoversigt se, bilag 3. Forsøg 2 Forsøget med sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann mislykkedes. Der er derfor ingen brugbare data til at lave en t-test. Forsøg 3 Forsøget til vurdering af holdbarhed af ekstraheringsbuffer mislykkedes også. Der er derfor ingen brugbare data til at lave en t-test. Forsøg 4 Resultater fra sammenligning af resultater ved ELISA-reagenskit på BEP med resultater produceret med ScheBo Quick-Prep på Quantum Blue fra Bühlmann på KBA, Køge gav en R 2 på 0,9646. Tabel 12: Den lineære regression mellem BEP og Quantum. Den lineære sammenhæng er illustreret her i tabel 12, se desuden rådata anvendt til metodesammenligning i bilag 3. 1200 1000 800 600 400 200 0 Metodesammenligning Quantum Blue 0 500 1000 1500 BEP 2000 advance y = 0,9279x + 46,739 R² = 0,991 Metodesammenligning Quantum Blue Lineær (Metodesammenlignin g Quantum Blue) 20

% Bias Validation of f-calprotectin assay by ELISA Tabel 13 herunder udtrykker en differens på målingerne foretaget på BEP og Quantum Blue. 2 ud af de 5 målinger havde en bias % < 10, en enkelt måling havde en bias på 25 %, de 2 resterende målinger viste en bias % på - 100 og 293, se rådata i bilag 3. Tabel 13: Differensplot over målingerne foretaget på BEP og Quantum Blue. % Bias (difference) 350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0-50,0-100,0-150,0 0 200 400 600 800 1000 1200 BEP 2000 Advance % Bias (difference) Diskussion Resultater Forsøg 1 Målinger på kalibratorerne (S2-S5) gav en rigtig god CV % på 5 bortset fra S1, som gav en CV % på 59,2. Denne høje CV % skyldes, at de resultater vi fik, lå langt under targetværdien på 30 μg/g opgivet af Bühlmann (12), desuden var der kun resultater fra bestemmelse ved kørsel 2, 5 og 7. Hvis de enkelte bestemmelser medtages i stedet for, giver det en lavere CV % på 40,6, dog er dette stadig en meget høj gennemsnitlig variation i forhold til target. Resultaterne fra metodesammenligning produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP med resultater fra KBA, Randers også produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann gav en god lineær korrelation på 0,9646 og med en gennemsnitlig bias på 0,3 %, se bilag 3. En perfekt lineær korrelation på 1 betyder, at man har fået nøjagtig samme resultater på målingerne, som de resultater der sammenlignes med. I x-y plottet (tabel 4) ses vores målte middelværdier 21

nogenlunde jævnt fordelt omkring regressionslinjen, som repræsenterer de målte værdier fra KBA, Randers. Lægerne Konikoff MR og Denson LA foretog i 2006 en systematisk gennemgang af publiceret litteratur omhandlende f-calprotectin (8). Konikoff og Denson fandt en god korrelation på 0,80-0,90 ved sammenligning af forskellige validerede ELISA-reagenskit. Et norsk studie fra 2008 (16) fik en korrelation på 0,87 ved sammenligning af calprotectin målt i fæces med resultater opnået på patientmateriale foretaget ved koloskopi. I et nyligt studie fra 2013 (9) fandt man en korrelationskoefficient på 0,741 ved sammenligning af resultater fra ELISA og koloskopiske undersøgelser. Vores målinger viser altså en endnu bedre korrelation mellem resultaterne målt på ekstraheringer fra KBA, Randers og de samme prøver målt i Køge end de omtalte studier. I differensplottet i tabel 5 ligger de fleste målinger indenfor en bias % på 20. Der er to målinger, som ligger på henholdsvis -27,0 og 29,5. Begge prøver indeholdte en høj calprotectinkoncentration, som blev målt til 669 μg/g og 899 μg/g samt 916 μg/g og 694 μg/g i henholdsvis Køge og Randers. Ved sammenligning af resultater fra prøver opsamlet ved afvejning og ekstraheret med ELISAreagenskit fra Bühlmann og prøver opsamlet og ekstraheret med ScheBo Quick-prep fik vi en rigtig god korrelationskoefficient på 0,9899, se tabel 6. Der skal dog tages forbehold for dette resultat, da det kun lykkedes os at få sammenlignelige resultater fra 9 prøver, se resultater fra ekstraheringer på KBA, Køge i bilag 3. Differensplottet til sammenligning af resultater mellem afvejning og ScheBo Quick-prep ved ELISAanalyse på BEP viser en stor forskel i den målte gennemsnitlige afvigelse med ScheBo Quick-prep og afvejning. Der ses et vidt spænd fra - 38,9 og 52,3 bias % i tabel 7. Til måling af korrekthed med eksterne kontroller fra Equalis blev differencen (bias %) målt til at være -33,3 % for kontrol 36A, 22,2 % for kontrol 36B. For kontrol 47A og B fik vi en bias % på henholdsvis 20,6 og 25,2. Den opnåede bias % ligger faktisk ikke så langt fra, hvad de fik ved analyse af kontroller fra Equalis i Randers, som lå mellem 27,9 % - 48,4 %. 22

Analysen af de 2 interne kontroller tilhørende reagenskittet fra Bühlmann gav en SD på 7,1 og en CV % på 6,6 for den lave kontrol og en SD på 14,1 og en CV % på 3,6 for den høje. KBA i Randers fik en SD og CV % for lav kontrol på 4,2 og 4,6 samt 18,7 og 6,1 for høj kontrol. Ved målinger på den lave kontrol får vi en højere SD og CV % end Randers, men ved den høje kontrol ligger resultaterne lidt under, forskellen er dog ikke stor og må derfor antages at være i orden (13). Der ses desuden en lav bias % på 0,2 og -13,8 i forhold til target opgivet af Bühlmann (12). Beregning af den intramediære præcision gav en gennemsnitlig CV % på 6,2 (tabel 10). Til sammenligning fik KBA i Randers en samlet intraseriel CV % på 4,61, som må siges at ligge ret tæt på vores resultat. Bühlmann angiver den intramediære præcision til 4 % (12), forskellen er dog ikke så stor og kan derfor accepteres. I den førnævnte undersøgelse af Konikoff og Denson (8) fandt de gennem flere studier en acceptabel intramediær præcision på < 5 %. Vores ligger altså for højt i forhold til begge undersøgelser og Bühlmann, og man burde måske analysere igen med 20 dobbeltbestemmelser, ligesom Bühlmann har gjort, i stedet for kun 5 dobbeltbestemmelser, som vi gjorde. Dette kunne muligvis give en værdi < 5 %. Den intermediære præcision blev på KBA, Randers beregnet til < 15 CV %, som også Bühlmanns anbefaler værdien ligger indenfor. Vi fandt en gennemsnitlig intermediær CV % på 32,8. Dette ligger alt for højt, også i forhold til de acceptable krav. I Randers ville man acceptere en CV % på < 20, da den biologiske variation svinger utroligt meget (13). Denne høje gennemsnitlige CV % skyldes især CV % for pool med høj koncentration. Det ville være bedst at foretage en ny interseriel analyse med pool med lavere koncentration, så forskellen i målingerne ikke bliver så stor. Herved kan vi desuden få en måling over minimum 10 serier og ikke kun over de 6 serier, der lykkedes at få resultater på. Undersøgelsen, som før nævnt (8), fra 2006 fandt en gennemsnitlig CV % på 10-40. Dette mener man skyldes den biologiske dag-til-dag variation i ptt., og gør det sværere at tolke på resultaterne. Forsøg 2 og 3 Forsøgene med sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann samt vurdering af holdbarhed af ekstraheringsbuffer mislykkedes begge. Ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann i 23

forsøg 2 blev analyseret i samme serie. Denne kørsel mislykkedes dog grundet forkert placering af kitreagenser på BEP. Der var byttet rundt på TMB-substrat og stopsolution. Dette er utroligt ærgerligt, og det anbefales derfor at foretage en ny analyse. Forsøg 3, som var undersøgelse af ekstraheringsbuffers holdbarhed blev analyseret i samme serie, som også mislykkedes af samme årsager som før nævnt. Dette skyldes, at reagenserne fra kit forblev på apparatet uden at de blev efterkontrolleret til kørsel af 10. og sidste serie. Var forsøgene lykkedes, var der blevet udarbejdet en t-test til at vurdere, om der er en signifikant forskel i måden at ekstrahere på samt en signifikant forskel i de målte værdier over henholdsvis 0, 24, 48 og 72 timer. Forsøg 4 Resultater fra sammenligning af resultater ved ELISA-reagenskit på BEP med resultater produceret med ScheBo Quick-Prep på Quantum Blue fra Bühlmann på KBA, Køge gav en R 2 på 0,9646, som må siges at være en rigtig god korrelation mellem de to analysemetoder (tabel 12). I artiklen A new rapid Quantitative Test for fecal calprotectin predicts endoscopic activity in ulcerative colitis (9) fandt man frem til en korrelatioskoefficient på 0,911 ved sammenligning af 123 patientprøver med henholdsvis ELISA og Quantum Blue. Sydora, Sydora og Fedorak (19) fandt ved sammenligning af disse metoder, at der ikke var signifikant forskel på resultaterne opnået ved ELISA og Quantum Blue. 50 ptt. blev undersøgt, og man fandt ydermere at Quantum Blue også kan differentiere mellem IBD og IBS, når man sammenlignede med dertilhørende kontroller. I et studie foretaget i Belgien for nyligt (20) fandt man ligeledes en god R 2 på 0,89 mellem ELISA og Quantum Blue. Her blev der undersøgt 142 fæcesprøver, og undersøgelsen viste også at Quantum Blue er ligeså god til at differentiere mellem IBD og IBS. Vores målinger viser altså en endnu bedre korrelation mellem resultaterne målt på ekstraheringer fra KBA, Randers og de samme prøver målt i Køge end de omtalte studier. I differensplottet (tabel 13) fik vi en gennemsnitlig bias % på 41,4. Det er dog ikke et resultat, vi kan anvende til at godkende Quantum Blue-metoden, da der kun blev foretaget analyse på 5 patientprøver. En god korrekthed og validering på en analyse kræver mindst 30-50 patientprøver. Differensplottet udtrykker gennemsnittet af målte værdier og differenser mellem ELISA og 24

Quantum Blue. Der ses en ulig fordeling af værdier et godt stykke fra nullinjen bortset fra 2 resultater, der holder sig under en bias % på 10. Patientmateriale Ud af de 48 patientprøver vi modtog, var det kun 37 af dem, det lykkedes os at få resultater på til metodesammenligningerne. Dette skyldes, at vi ikke fik et resultat efter analyse, eller også lå koncentrationen af f-calprotectin i patientprøverne uden for måleområdet, altså < 30 μg/g og > 1800 μg/g. Pools, blandet ud fra flere patientprøver til udregning af den intra- og intermediære præcision, blev inddelt i en pool med lav koncentration af f-calprotectin, pool med middel koncentration af f- calprotectin og pool med høj koncentration af f-calprotectin. I den intraserielle analyse blev CV % for lav og middel pool udregnet til 5,3 og 3,1, altså en god variationskoefficient, som ligger tæt på de 4 % anbefalet af Bühlmann (12), de 4,6 % de fik i Randers (13) og 5 % anbefalet i førnævnte studie (8). For den høje pool galt dog ikke samme pæne tendens, da vi fik en CV % på 10,2. Dette skyldes, at pool med høj calprotectinindhold havde en alt for høj koncentration på 1933,5 μg/g, som ligger uden for det acceptable måleområde. Den gennemsnitlige intermediære præcision havde en CV % på 32,8. Dette skyldes igen den høje pool med koncentration > 1800 μg/g og CV % på 83,2 (tabel 11). Ved den intermediære præcision tillades der en højere CV % på 15 ved Bühlmann og 20 på KBA, Randers, da der skal tages højde for biologisk variation/dag-til-dag variation. CV % for lav og middel pool fordelte sig på 5,9 og 9,3, som må siges at være en lille gennemsnitlig variation i forhold til middelværdien. Man kan stille spørgsmål til hvor relevant den høje CV % er for pool med høj koncentration, da man er syg ved en koncentration > 50 μg/g. Ved forhøjede værdier > 200 μg/g differentieres der mellem IBD og IBS (12). Måden at opbevarer patientprøver på har en stor betydning for de resultater, vi får ved analysering. Dels skal ubehandlet fæces på køl hurtigst muligt og opbevares i højst 6 dage for ikke at få et forkert resultat. Dels skal fæcesprøver efter ekstraheringen analyseres inden 5 døgn (12). Vi ville gerne have undersøgt forskellen i at opbevare ekstraherede prøver ved 5 C og ved 20-25 C samt forskellen i holdbarhed af fæcesprøver ekstraheret ved afvejning og ekstraheret ved 25

ScheBo Quick-prep. Analyserne mislykkedes, og fik vi derfor ingen data, som kunne vise, om der var en signifikant forskel i de målte værdier, og dermed indvirkning på holdbarhed af de to ekstraheringsmetoder. Metoder ELISA-sandwichmetoden med reagenskit fra Bühlmann foretaget på BEP viser en rigtig god sensitivitet og specificitet. Vi har godt nok ikke selv udregnet disse i valideringen, da vi antog, ligesom KBA, Randers, at udregninger fra Bühlmann var korrekte. Bühlmann opgiver en sensitivitet på 84,4 % og en specificitet på 94,5 %, dette gælder også i forhold til differentiering mellem IBD og IBS (12). Ifølge Konikoff og Denson s undersøgelser (8) er sensitiviteten og specificiteten for ELISAmetoden 100 % og 97 %. I studiet A new rapid Quantitative Test for fecal calprotectin predicts endoscopic activity in ulcerative colitis (9) er der opnået en sensitivitet på 70,2 % og en specificitet på 93,8. Litteraturstudiet fra Oslo Universitetshospital (16) fik en sensitivitet og en specificitet på henholdsvis 89-98 % og 81-91 %. Pavlidis, Chedgy og Tibble (17) fandt en sensitivitet på 82 % og en specificitet på 77 %. Bortset fra det første studie nævnt (8) ligger sensitiviteten generelt tæt på, hvad Bühlmann opgiver. Specificiteten i de nævnte studier ligger også generelt tæt op ad Bühlmann s 94,5 %. Ifølge studierne viser analysen ydermere en god positiv prædiktiv værdi (PPV) liggende mellem 70 og 96 %, bortset fra et enkelt studie hvis PPV var på kun 28 % (17). Den negative prædiktive værdi (NNP) ligger generelt højt mellem 80-98 %, bortset fra litteraturstudiet (8), som ligger nede på 56 %. Sensitiviteten for ELISA-analysen på 84,4 % (12) ligger lidt under end, hvad EliA-metoden fra producenten Phadia opgiver. Metoden analyseres blandt andet på KBA i Gentofte og Odense på apparaturet ImmunoCap 250 ligeledes fra Phadia og har en sensitivitet på 97,7 %, specificitet på 89,8 %, en PPV på 96 % og en NPV på 95 % (2). Specificiteten for ELISA-metoden ligger til gengæld højere på 94,5 %. Analysering på ImmunoCap 250 kræver, afdelingen laver en ny cut-off værdi og et nyt referenceinterval. Dette kunne give anledning til fejl og misforståelser i forhold til kommunikation mellem afdeling og læger eksempelvis (2). 26

ScheBo Quick-prep fra Bühlmann som opsamlingsmetode kan ikke anbefales, da selve opsamlingen af fæces kan volde problemer i forhold til pt. Det kan være svært at ramme røret, skrue podepinden ordentlig fast, og desuden skal ScheBo Quick-prep opbevares på køl efter opsamling. Det er ikke særlig hygiejnisk at skulle opbevare prøven i køleskabet blandt madvarer. Den kliniske anvendelse af ScheBo Quick-prep viste sig at være mere besværlig end først antaget. Vi havde store problemer med at analysere direkte på prøverøret, og måtte derfor overføre ekstraktet til et passende prøveglas. Skal dette gøres i rutinen på en almindelig arbejdsdag, kommer det til at tage næsten ligeså lang tid som ved afvejning og kan derfor ikke betale sig. ELISA-sandwichmetoden med reagenskit fra Bühlmann foretaget på BEP er at foretrække frem for Quantum Blue. Der kan nemt blive byttet om på testkassetterne, når der analyseres mange prøver. Desuden skal testkassetterne indsættes i Quantum Blue med 1 minuts mellemrum for at blive aflæst. Dette gør, at bioanalytikeren er forpligtet til at være ved analysepladsen konstant. I alt tager en analyse på Quantum Blue ca. 30 minutter, mens BEP er ca. 2,5 time om at analysere. Ved analyse på apparatet BEP sættes alle prøver på inden analyse, som sparer tid og frigiver bioanalytikeren til andre arbejdsopgaver under analysen. Undersøgte artikler (9, 19, 20) viser en sensitivitet for Quantum Blue på 75-100 % og en specificitet mellem 83 og 100 %. Ydermere fandt man PPV og NPV til at være på 86 % og 80,3 % (9). Bühlmann opgiver ingen sensitivitet, specificitet, PPV eller NPV. Måleområdet for Quantum Blue er 100-1800 μg/g. Dette gør, at der er en risiko, om end lille, for falsk negative resultater, da referenceintervallet er 50 μg/g. Implementering af analysen vil blandt andet imødekomme ønsket om en kortere svarafgivelse på 1 uge til lægerne på Gastromedicinsk Afdeling. I dag får afdelingen svar hver 14. dag fra KBA, Randers. Dette er for lang tid og også dyrt, da der, udover betaling for selve analysen, skal betales for afsendelse af patientprøver. Ydermere vil analysen bidrage til færre kikkertundersøgelser, som er tidskrævende og dyrere (3), og et tættere samarbejde blandt sygehusene og faggrupperne i region Sjælland. Færre kikkertundersøgelser kommer desuden også pt. til gode, da det er ret ubehageligt, at få foretaget en sådan. 27

F-calprotectin analysen er også en god analyse til behandlingsmonitorering af IBD. Ved korrekt behandling vil koncentrationen af calprotectin være faldende hos pt. Dette skyldes, at behandlingen oftest består af anti-inflammatoriske og immunsupprimerende lægemidler, der nedsætter aktiviteten af denne akut fasereaktant ved inflammation. For personalet på KBA, Køge vil der ikke være nogen ændringer i forhold til ELISA-analysen på apparaturet. Patientprøverne kan analyseres sideløbende med andre specialanalyser på BEP. Det tager ikke længere tid, at analysere f-calprotectin end de andre analyser tager, så her vil der heller ingen ændringer være. De ændringer personalet derimod vil opleve er håndtering af fæces ved afvejning og ekstrahering samt den tid det tager at forberede prøven til analyse. Implementering af f-calprotectin analysen vil ikke komme til at koste afdelingen betydeligt, da analysen kan foretages på BEP, og der derfor ikke skal købes nyt apparatur. ELISA-proceduren med reagenskit fra Bühlmann koster 298 kr. pr. analyse (25). Disse udgifter vil blive dækket, da det selvfølgelig er den der bestiller analysen, som betaler. ScheBo Quick-prep koster 15 kr. pr. styk, men da det ikke er relevant at anvende metoden, er det heller ikke relevant at diskutere de økonomiske aspekter. Det skulle da kun være i forhold til anvendelse af hurtigtesten Quantum Blue, hvor ScheBo Quick-prep har sin helt rigtige berettigelse. Der er ikke opgivet oplysninger angående omkostninger i forbindelse med hurtigtesten Quantum Blue fra Bühlmann. Det har ej heller været muligt at finde litteratur herom. 28

Konklusion Resultater, opnået ved at analysere f-calprotectin på BEP 2000 Advance fra Siemens med reagens fra Bühlmann, viste en rigtig god overensstemmelse mellem KBA i Køge og i Randers. Sammenligningen af disse to metoder gav en korrelationskoefficient (R 2 ) på 0,9646. Den intramediære præcision havde en gennemsnitlig CV % på 6,2 og en gennemsnitlig intermediær præcision på 32,8 CV %. Både den intramediære og den intermediære præcision ligger tæt op ad de resultater KBA i Randers har fået. Dog er begge CV % høje i forhold til Bühlmann s resultater og anbefalinger. Det anbefales derfor at gentage forsøgene med intramediær og intermediær præcision før implementering af f-calprotectin på KBA, Køge Sygehus. Overensstemmelsen mellem resultater fra fæces-ekstrahering med reagens fra Bühlmann og ekstrahering med ScheBo Quick-prep fra Bühlmann var god. Her fik vi en korrelationskoefficient på 0,9899. Dog anbefales det ikke at anvende ScheBo Quick-prep fra Bühlmann, da analyse af ScheBo Quick-prep-røret på BEP ikke er muligt, og da opsamling og opbevaring af fæcesprøven kan være ret besværligt for patienten. Resultatsammenligning af ELISA-reagenskit på BEP og ScheBo Quick-prep på Quantum Blue fra Bühlmann gav en R 2 på 0,9646 og stemmer dermed rigtig godt overens. Det anbefales dog ikke at anvende apparatet, som et alternativ til f-calprotectin analysen på BEP, da der hurtig kan opstå forvirring med testkassetter og at bioanalytikeren er forpligtet til at være ved analysepladsen konstant samt at den ikke er bedre end ELISA på BEP. Implementering af analysen kan i høj grad anbefales. Dog anbefales det, at analysere den intra- og intermediære præcision igen inden analysen implementeres. 29

Perspektivering Med de nye analyser bioanalytikeren hele tiden skal forholde sig til, er det vigtigt, at vi er på forkant med udviklingen indenfor medicinsk laboratorieteknik og kvalitetssikring heraf, som også er en del af vores kernefaglighed. Denne kernefaglighed gør os bioanalytikere værdifulde som diagnostisk samarbejdspartner og kan give et mere sammenhængende patientforløb i sundhedsvæsenet. I fremtiden vil vi også stadig se mere Point Of Care Testing- (POCT) udstyr. Her kunne det tænkes at hurtigtesten Quantum Blue kunne anvendes i forbindelse med monitorering af behandling hos IBD-patienter hos den praktiserende læge eller i forbindelse med, at bioanalytikeren er ude til ptt. i hjemmet, som en ny forbedret patientservice. Bioanalytikere kører i dag i forvejen ud til ptt. der skal have taget en blodprøve, så her ville det være oplagt, at anvende Quantum Blue. Ligeledes kunne ScheBo Quick-prep være en fordel at anvende i dette tilfælde, da opsamling og ekstrahering af fæces med denne metode er forholdsvis nemt. Hos den praktiserende læge ville vi desuden kunne være behjælpelige med at sikre korrekt prøvetagning, oplæring i brugen af POCT udstyr og dermed kvalitetssikring af analyseresultater. 30

Referenceliste 1) Bioanalytikeruddannelsen Næstved. Modul 14 Professionsbachelorprojektet. UCSJ; 2013. [8.10.2013] Lokaliseret på: http://fronter.com/cvusj/links/index3.phtml?v=6&treeid=392045&elementid=1103529&el ement_type=element&mainframe=..%2flpathobj%2fpage.php%3fpageid%3d1103529%26 editmodus%3d0 2) Pers. Comm. med Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge; 1.10.2013-18.12.2013. [Samtaler og emailkorrespondance] 3) Pers. Comm. med Signe Wildt. Overlæge på Gastroemedicinsk Afdeling, Køge. Køge: Klinisk Biokemisk Afdeling; 28.10.2013. [Samtale] 4) Sundhedsstyrelsen. Referenceprogram for kronisk inflammatoriske tarmsygdomme. København: Sundhedsstyrelsen; 2007 [14.11.2013] Lokaliseret på: http://sundhedsstyrelsen.dk/publ/publ2007/plan/sfr/refprg_ibd.pdf 5) Colitis-Crohn Foreningen. Hvad er Crohns sygdom? Odense: Colitis-Crohn Foreningen; 2008 [15.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ccf.dk/information/crohns-sygdom 6) Colitis-Crohn Foreningen. Hvad er Colitis Ulcerosa? Odense: Colitis-Crohn Foreningen; 2008 [15.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ccf.dk/information/colitis-ulcerosa 7) Doctor Tipster. Inflammatory bowel disease (IBD). [Figur 1] Doctor Tipster; 2011-2012 [18.11.2013] Lokaliseret på: http://www.doctortipster.com/17422-inflammatory-boweldisease-ibd.html 8) Konikoff MR, Denson LA. Role of Fecal Calprotectin as a Biomarker of Intestinal Inflammation in Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis. 2006; 12 (6): 524-534. [10.10.2013], Lokaliseret på: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1097/00054725-200606000-00013/full 9) Lobatón T, Rodriguez-Montana F, Lopez A et al. A new rapid Quantitative Test for fecal calprotectin predicts endoscopic activity in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2013; 19 (5): 1034-1042. [10.10.2013] Lokaliseret på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23470502 10) Dhas DBB, Bhat BV, Gane DB. Role of calprotectin in infection and inflammation. Curr Pediatr Res. 2012; 16 (2): 83-94. [10.10.2013] Lokaliseret på: http://www.pediatricresearch.info/yahoo_site_admin/assets/docs/83-94-dhas-vishnu- Calprotectin.156232656.pdf 11) Winther MJ. Calprotectin Protein Molecule [Figur 2] Fine Art America; 2009 [5.12.2013] Lokaliseret på: http://fineartamerica.com/featured/calprotectin-protein-molecule-drmark-j-winter.html 12) Bühlmann. Calprotectin ELISA. Schweiz: Bühlmann Laboratories AG; 2013. 31

13) Hoffmann-Lücke E. Valideringsrapport for F-Calprotectin, stofk. (mg/kg) (NPU26814) på BEP 2000. Regionshospitalet Grenaa: Klinisk Biokemisk Afdeling Randers. Dokumentnr.: 7005081, version 2. 5.9.2012 [4.12.2013] Lokaliseret på: http://e-dok.rm.dk/edok/e_700905.nsf/7f1b6e1ae8d23bd1c125729100450e46/c2d94673d9b0147bc12579650 0451d56/$FILE/DOMC2D94673D9B0147BC125796500451D569B8GB4.pdf 14) Bühlmann. ScheBo Quick-Prep TM. Schweiz: Bühlmann Laboratories AG; 2012. 15) Bühlmann. Quantum Blue Calprotectin High Range. Schweiz: Bühlmann Laboratories AG; 2012. 16) Jahnsen J, Røseth AG, Aadland E. Measurement of calprotectin in faeces. Tidsskr Nor Legeforen. 2008; 128: 743-5. [10.10.2013] Lokaliseret på: http://tidsskriftet.no/article/36090/en_gb 17) Pavlidis P, Chedgy FJQ, Tibble JA. Diagnostic accuracy and clinical application of faecal calprotectin in adult patients presenting with gastrointestinal symptoms in primary care. Scand J of Gastroenterol. 2013; 48: 1048 1054. [19.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23883068 18) Alpha Laboratories. Quick-Prep [Figur 4] Alpha Laboratories Ltd. [5.12.2013] Lokaliseret på: http://www.alphalabs.co.uk/product-information/diagnostic-products/faecal-testing--- calprotectin.aspx 19) Sydora Mj, Sydora BC, Fedorak RN. Validation af a point-of-care desk top device to quantitate fecal calprotectin and distinguish inflammatory bowel disease from irritable bowel syndrome. JCC. 2012; 6: 207-214 [10.10.2013] Lokaliseret på: http://www.eccojccjournal.org/article/s1873-9946(11)00212-1/fulltext 20) Coorevits L, Baert FJ, Vanpoucke HJM. Faecal calprotectin: comparative study of the Quantum Blue rapid test and an established ELISA method. Clin Chem Lab Med. 2013; 51(4): 825-831 [10.10.13] Lokaliseret på: http://www.degruyter.com/view/j/cclm.2013.51.issue-4/cclm-2012-0386/cclm-2012-0386.xml;jsessionid=500f1e99c8ef364e35a56add72bc1fe5 21) Sindt C, Jørgensen HL. Statistiske metoder i biomedicin. 1. udg. 2. oplag. København: Books on Demand GmbH Danmark; 2013. 22) Pers. Comm. med Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge; 18.11.2013 [Oversigtsliste over eksterne kontroller fra Equalis]. 23) Thomas Bendsen. Noter i statistik. VIA University College: Bioanalytikeruddannelsen; 2009-2013. [18.11.2013] Lokaliseret på: http://statnoter.biolyt.dk/ 24) D4-dokument. BEP 2000 Advance. Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus. 2013. Version 5. Dokumentnr.: 310050/afd. 13. 25) Klinisk Biokemisk Afdeling. Information til alle afdelinger. Regionshospitalet Randers, Grenaa: Klinisk Biokemisk Afdeling, Randers. 28.9.2011 [19.11.2013] 32

Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peerreviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) Validation of f-calprotectin assay by ELISA Bilag 1 Analyseskema over anvendte referencer/ressourcer. Navn: Karina Jensen Modul: Modul 14 Produktionsår: 2013/2014 Titel: F-calprotectin Problemformulering: Hvilke resultater fås ved at analysere f-calprotectin på BEP 2000 Advance fra Siemens med reagens fra Bühlmann, og stemmer disse resultater overens med resultater produceret på samme apparat og med samme reagens anvendt på KBA Randers? Hvordan er overensstemmelsen mellem resultater fra fæces-ekstrahering med reagens fra Bühlmann og ekstrahering med ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann, og vil ScheBo Quick-Prep være velegnet som opsamlingsmetode for patienten? Hvordan stemmer resultater fra ScheBo Quick-Prep produceret på BEP 2000 Advance overens med resultater opnået ved anvendelse af hurtigtesten Quantum Blue fra Bülhmann, og kunne denne være et alternativ til analyse af f-calprotectin på BEP? Reference 1 1 2 3 4 5 6 Bemærkninger Bioanalytikeruddannelsen Næstved. Modul 14 Professionsbachelorprojektet. UCSJ; 2013. [8.10.2013] Lokaliseret på: http://fronter.com/cvusj/links/index3.phtml?v=6&treeid=392045&eleme ntid=1103529&element_type=element&mainframe=..%2flpathobj%2fpa ge.php%3fpageid%3d1103529%26editmodus%3d0 Pers. Comm. Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge; 8.10.2013. Pers. Comm. Signe Wildt. Overlæge på Medicinsk Gastroenterologisk Afdeling, Køge. Klinisk Biokemisk Afdeling; 28.10.2013. Sundhedsstyrelsen. Referenceprogram for kronisk inflammatoriske tarmsygdomme. København: Sundhedsstyrelsen; 2007 [14.11.2013] Lokaliseret på: http://sundhedsstyrelsen.dk/publ/publ2007/plan/sfr/refprg_ibd.pdf Colitis-Crohn Foreningen. Hvad er Crohns sygdom? Odense: Colitis-Crohn Foreningen; 2008 [15.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ccf.dk/information/crohns-sygdom Colitis-Crohn Foreningen. Hvad er Colitis Ulcerosa? Odense: Colitis-Crohn Foreningen; 2008 [15.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ccf.dk/information/colitis-ulcerosa x X X X X X Samtale Samtale Rapport Beskrivelse af professionsbachelorprojektet Informationshæfte Informationshæfte 33

Doctor Tipster. Inflammatory bowel disease (IBD). [Figur 1] Doctor Tipster; 2011-2012 [18.11.2013] Lokaliseret på: http://www.doctortipster.com/17422-inflammatory-bowel-diseaseibd.html Konikoff MR, Denson LA. Role of Fecal Calprotectin as a Biomarker of Intestinal Inflammation in Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis. 2006 [10.10.2013], Juni; 12 (6): 524-534. Lokaliseret på: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1097/00054725-200606000- 00013/full Dhas DBB, Bhat BV, Gane DB. Role of calprotectin in infection and inflammation. Curr Pediatr Res. 2012; 16 (2): 83-94. [10.10.2013] Lokaliseret på: http://www.pediatricresearch.info/yahoo_site_admin/assets/docs/83-94-dhas-vishnu-calprotectin.156232656.pdf Bühlmann. Calprotectin ELISA. Schweiz: Bühlmann Laboratories AG; 2013. Hoffmann-Lücke E. Valideringsrapport for F-Calprotectin, stofk. (mg/kg) (NPU26814) på BEP 2000. Regionshospitalet Grenaa: Klinisk Biokemisk Afdeling Randers. Dokumentnr.: 7005081, version 2. 5.9.2012 [4.12.2013] Lokaliseret på: http://e-dok.rm.dk/edok/e_700905.nsf/7f1b6e1ae8d23bd1c125729100450e46/c2d94673d9b 0147bc125796500451d56/$FILE/DOMC2D94673D9B0147BC1257965004 51D569B8GB4.pdf -PrepTM. Schweiz: Bühlmann Laboratories AG; 2012. Laboratories AG; 2012. Jahnsen J, Røseth AG, Aadland E. Measurement of calprotectin in faeces. Tidsskr Nor Legeforen. 2008; 128: 743-5. [10.10.2013] Lokaliseret på: http://tidsskriftet.no/article/36090/en_gb Pavlidis P, Chedgy FJQ, Tibble JA. Diagnostic accuracy and clinical application of faecal calprotectin in adult patients presenting with gastrointestinal symptoms in primary care. Scand J of Gastroenterol. 2013; 48: 1048 1054. [19.11.2013] Lokaliseret på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23883068 Sydora Mj, Sydora BC, Fedorak RN. Validation af a point-of-care desk top device to quantitate fecal calprotectin and distinguish inflammatory bowel disease from irritable bowel syndrome. JCC. 2012; 6: 207-214 [10.10.2013] Lokaliseret på: http://www.eccojccjournal.org/article/s1873-9946(11)00212-1/fulltext Coorevits L, Baert FJ, Vanpoucke HJM. Faecal calprotectin: comparative study of the Quantum Blue rapid test and an established ELISA method. Clin Chem Lab Med. 2013; 51(4): 825-831 [10.10.13] Lokaliseret på: http://www.degruyter.com/view/j/cclm.2013.51.issue-4/cclm-2012-0386/cclm-2012-0386.xml;jsessionid=500f1e99c8ef364e35a56add72bc1fe5 Sindt C, Jørgensen HL. Statistiske metoder i biomedicin. 1. udg. 2. oplag. København: Books on Demand GmbH Danmark; 2013. Thomas Bendsen. Noter i statistik. VIA University College: Bioanalytikeruddannelsen; 2009-2013. [18.11.2013] Lokaliseret på: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=6 Pers. Comm. Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge; 18.11.2013. X X X X X X X X X X X X X X Figur Artikel Artikel Procedurebeskrivelse Valideringsrapport Procedurebeskrivelse Procedurebeskrivelse Artikel Artikel bestilt gennem biblioteket på UCSJ Artikel Artikel Hjemmeside Oversigtsliste over eksterne kontroller fra 34

D4-dokument. BEP 2000 Advance. Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus. 2013. Version 5. Dokumentnr.: 310050/afd. 13. Klinisk Biokemisk Afdeling. Information til alle afdelinger. Regionshospitalet Randers, Grenaa: Klinisk Biokemisk Afdeling, Randers. 28.9.2011 [19.11.2013] X X Equalis Apparaturinstruks Informationsseddel 1 Reference-kategorier: Kategori 1: Videnskab og forskning (peer-reviewed), på dansk; Kategori 2: Videnskab og forskning (peer-reviewed), andre sprog end dansk; Kategori 3: Lærebog; Kategori 4: Faglig artikel (ikke peer-reviewed artikler fx fra fagblade); Kategori 5: Debat- og populærartikel (holdningsprægede artikler (uden referencer), indlæg, avisartikler, radio- og tv-interviews, samtaler mv.) Kategori 6: Andet (under andet skrives, hvad dette er, eksempelvis film fra YouTube (faglig, debat el. lign. angives), analysevejledning, datasheet osv.) 35

Bilag 2 - Protokoller. Protokol 1 - BEP 2000 Advance Formål Formålet med forsøget er at analysere f-calprotectin på BEP 2000 Advance sideløbende med de specialanalyser der i forvejen analyseres. Der anvendes ELISA-sandwichmetode med 30 patientprøver, som opsamles og ekstraheres. Desuden anvendes Schebo Quick-Prep som opsamlingsmetode med de samme 30 patientprøver, som også ekstraheres. Metoderne er en resultatsammenligning med Randers sygehus ved: 1) Måling af korrekthed via differensplot og lineær regression. 2) Måling af korrekthed i forhold til eksterne kontroller. 3) Måling af præcision (CV %), hvor der laves a) 10 dobbeltbestemmelser på tre patientprøver fordelt på lav, middel og høj samt b) dobbeltbestemmelse over 10 serier (kørsler). Teori Proteinstoffet calprotectin udgør en stor del af proteinindholdet i de neutrofile granulocytter og findes blandt andet i afføringen hos alle. Der ses en stigning i koncentrationen af calprotectin ved inflammatoriske tarmsygdomme. Calprotectin anvendes til at differentiere mellem inflammatoriske tarmsygdomme og sværhedsgraden af disse hos patienter med længevarende diarre samt til behandlingsmonitorering af inflammatoriske tarmsygdomme. Til at analysere f-calprotectin anvendes ELISA-metoden på BEP 2000 Advance. Dette er en sandwichmetode hvor en mikrotiterplade er coated med et specifikt monoklonalt antistof som binder specifikt til calprotectin-antigen-komplekser. Ved tilsættelse af stop-opløsning omdannes suspensionen fra blå til gul farve og denne måles spektrofotometrisk ved 450 nm. Farveintensiteten er direkte proportional med koncentrationen af calprotectin. Materialer Reagenser Utensilier Apparatur Patientmat. Vaskebufferkoncentrat Inkubationsbuffer Kallibratorer A til E Engangspipetter Mikrotiterplade coated med anti-calprotectin BEP 2000 Advance Centrifuge ( 3000 x g) Mini-rotator Ekstraherede fæcesprøver fra 29 patienter tilsendt fra Randers sygehus. 36

Kontroller - lav og høj Mærket enzymkonjugat TMB-substrat Stopopløsning Eksterne kontroller Sikkerhed Da der håndteres biologisk materiale skal proceduren for sikkerhed og bortskaffelse foregå efter laboratoriets henvisninger. Fæcesekstrakter tilsendt fra Randers sygehus blev mærket med nummer og analyseret på BEP 2000 Advance. Påsætning af prøver på BEP 2000 Advance Metoder 1. Kontroller mærkning af reagenser, kontroller og kallibratorer med barcoder og placer dem i reagensracks. 2. Kontroller mærkning af patientprøver og placer dem i reagensracks. 3. Rackene placeres i apparatet fra højre mod venstre i rækkefølgen 5 - I - R og til sidst patientprøver. 4. Herefter følges apparaturinstruks (BEP 2000 Advance i D4) for bestilling af analyser. Protokol 2 - Ekstraktion Formål Formålet ved dette forsøg er at vurdere egnet ekstraktionsmetode ud fra 10 udvalgte patientprøver fordelt i måleområdet (resultater fra protokol 1). Teori For at kunne vurdere den mest egnede ekstraktionsmetode, skal metoderne sammenlignes. Dette gøres ved at udføre en t-test. T-testen fortæller om forskellen i de målte middelværdier i en stikprøve, som repræsenterer populationen. Der vurderes hvorvidt der er en signifikant forskel på det målte eller ej (H 1 - eller H 0 -hypotesen). Er teststørrelsen stor, indikerer det en signifikant forskel i opsamlingsmetoderne. Er teststørrelsen lille, skyldes det blot tilfældigheder, og metoderne vil derfor være lige gode at anvende. Materialer 37

Reagenser Utensilier Apparatur Patientmat. Ekstraktionsbuffer Vaskebufferkoncentrat Inkubationsbuffer Kallibratorer A til E Kontroller - lav og høj Mærket enzymkonjugat TMB-substrat Stopopløsning Eksterne kontroller Engangspodepinde Rør med skruelåg Engangspipetter Mikrotiterplade coated med anticalprotectin Schebo Quick-prep BEP 2000 Advance Centrifuge ( 3000 x g) Mini-rotator Præcisionsvægt (10-150 mg) Stinkskab Fæcesprøver fra 49 patienter. Metoder Prøvenummer og opsamlingsmetode noteres i skema. Der opsamles på følgende måder: 1 Afvejning (10 prøver) a. Mærk (fx 1 som prøvenummer og A for fremgangsmåde A) og vej de tomme rør sammen med podepinden. e. Homogeniser prøven på mini-rotator og bland b. Tag 50-100 mg fæces med på max podepinden hastighed og i 30 placer minutter. denne i røret. f. c. Overfør Vurder prøvemængden, 1,5 ml af ekstraktet notér til vægt, et 2 ml rør. g. Frys knæk prøven. podepinden og placer den og h. Når prøven prøven i røret. skal analyseres optøs denne og d. centrifugeres Tilsæt ekstraktionsbuffer i en mikrocentrifuge (49 x i 5 minutter ved 3000 x g. i. Påsæt vægtvolumenet, prøven på se BEP skema 2000 til Advance. højre) til røret og forsegl røret. Vægt (mg) - Fæces Volumen (ml) - Ekstraktionsbuffer 50 2,5 55 2,7 60 2,9 65 3,2 70 3,4 75 3,7 80 3,9 85 4,2 90 4,4 95 4,7 100 4,9 B. Schebo Quick-Prep (10 prøver) a. Schebo Quick-Prep mærkes (fx 1 som prøvenummer og B for fremgangsmåde B) og åbnes og doseringstippen tages op. Notér konsistens. b. Tippen dyppes i fæcesprøven i røret til rillerne er fyldte med prøvematerialet. c. Prøven homogeniseres på vortex i 30 sekunder. d. Prøven hviler i 10 minutter og homogeniseres på vortex i 30 sekunder. Dette gentages indtil fæces er fuldstændig fjernet fra doseringstippen. e. Frys prøven. f. Når prøven skal analyseres optøs denne og centrifugeres i en mikrocentrifuge i 5 minutter ved 3000 x g. g. Påsæt prøven på BEP 2000 Advance. 38

Protokol 3 - Holdbarhed af ekstrakt Formål Formålet med dette forsøg er at vurdere holdbarheden af fæces efter ekstraktion. Teori Patienter der skal have målt f-calprotectin får opsamlingskit med hjem. Prøven skal tages og sendes til analyse indenfor 5 døgn. Ud fra opsamlingsmetoden Schebo Quick-Prep vurderes det, hvor lang tid bufferen i Schebo Quick-Prep kan holde sig ved ca. 5 C samt ved stuetemperatur (20-25 C), uden det har nogen indflydelse på analyseresultatet. Patientvejledning Når patienten skal undersøges for forhøjet calprotectin, får de af lægen på afdelingen udleveret en ScheBo Quick-Prep samt eventuelt et engangsbækken, plastichandsker, et plasticrør og en ufrankeret returkuvert. Patienten opsamler fæces fra bækken ved hjælp af ScheBo Quick-Prep. Schebo Quick-Prep åbnes og doseringstippen tages op. Doseringstippen dyppes i fæcesprøven i en dybde af ca. 2 cm. Dette gøres fem forskellige steder i prøven. Doseringstippen sættes plads i Schebo Quick-Prep og denne placeres i plasticrøret, der herefter lægges i returkuverten og sendes med posten til laboratoriet. Fremgangsmåde Der udvælges 20 patientprøver fordelt i måleområdet (fra protokol 1). Disse prøver analyseres yderligere efter 24, 48 og 72 timer. Protokol 4 - Quantum Blue Formål Formålet med dette forsøg er at analysere f-calprotectin ved brug af Quantum Blue med Schebo Quick-Prep som opsamlingsmetode. Metoden er en metodesammenligning med ELISA-proceduren. Teori 39

Proteinstoffet calprotectin udgør en stor del af proteinindholdet i de neutrofile granulocytter og findes blandt andet i afføringen hos alle. Der ses en stigning i koncentrationen af calprotectin ved inflammatoriske tarmsygdomme. Calprotectin anvendes til at differentiere mellem inflammatoriske tarmsygdomme og sværhedsgraden af disse hos patienter med længevarende diarre samt til behandlingsmonitorering af inflammatoriske tarmsygdomme. Fæces opsamles ved hjælp af Schebo Quick-Prep og placeres direkte i den dertilhørende buffer i røret og analyseres herefter på Quantum Blue. Til at analysere f-calprotectin anvendes ELISA-metoden på Quantum Blue. Dette er en sandwichmetode hvor de monoklonale antistoffer er coated på en membran i testkassetten som binder specifikt til calprotectin-antigen-komplekser. Ved tilsættelse af stop-opløsning omdannes suspensionen fra blå til gul farve og denne måles spektrofotometrisk ved 450 nm. Farveintensiteten er direkte proportional med koncentrationen af calprotectin. Materialer Reagenser Utensilier Apparatur Patientmat. Fortyndingsbuffer (Chase) Kontroller - lav og høj Schebo Quick-prep Engangspipetter 2 ml rør Test cartridge RFID Chip card Quantum Blue Vortex Evt. centrifuge Stinkskab Fæcesprøver fra 30-50 patienter. Fremgangsmåde Alle reagenser og prøver skal have stuetemperatur. Præparering af prøver 1. Schebo Quick-prep mærkes (fx 1 for prøvenummer og d for forsøg 4) og åbnes og doseringstippen tages op. 2. Tippen dyppes i fæcesprøven i en dybde af ca. 2 cm 5 forskellige steder. 3. Prøven homogeniseres på vortex i 30 sekunder. 4. Prøven hviler i 10 minutter og homogeniseres på vortex i 30 sekunder. Dette gentages indtil fæces er fuldstændig fjernet fra doseringstippen. 5. Fortynd ekstraktet 1:150. Tag 20 µl prøve + 3 ml fortyndingsbuffer i et nyt rør og vortex igen. Lad prøven stå i 10 minutter eller centrifuger i 5 minutter på 3000 x g. 6. 80 µl af det fortyndede ekstrakt pipetteres over i den runde brønd på testkassetten. 7. Placer testkassetten i Quantum Blue aflæseren. 8. Aflæs resultatet efter 15 minutter. 40

Bilag 3 - Rådata Ekstraheringer på KBA, Køge Prøve nr afvej 1 afvej 2 Middel schebo 1 schebo 2 Middel Quantum Randers 1 892 870 881 959 1064 1011,5 1001 1876 2 71 72 71,5 61 58 59,5 0 102 3 0 0 0 0 0 0 110 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 200 200 200 148 150 149 186 243 6 255 271 263 316 316 316 286 105 7 0 0 0 0 0 0 0 914 8 0 0 0 0 0 0 1594 0 9 68 66 67 67 64 65,5 0 53 10 59 50 54,5 84 82 83 0 65 11 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 67 14 53 56 54,5 53 50 51,5 0 39 15 0 0 0 0 0 0 0 0 16 61 61 61 68 65 66,5 0 52 17 56 53 54,5 0 0 0 0 56 18 93 92 92,5 58 55 56,5 0 217 51 0 0 0 166 171 168,5 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 Randers Ekstraheringer 1 2 prøvenr bestem bestem Middel Randers % Bias 21 314 299 306,5 296 3,5 22 180 193 186,5 185 0,8 23 907 891 899 694 29,5 25 182 195 188,5 169 11,5 26 595 570 582,5 512 13,8 27 688 651 669,5 610 9,8 28 317 329 323 361-10,5 29 68 68 68 63 7,9 32 1171 1023 1097 1190-7,8 33 912 841 876,5 914-4,1 34 68 73 70,5 84-16,1 41

35 1315 1530 1422,5 1390 2,3 36 649 689 669 916-27,0 37 61 61 61 74-17,6 38 90 91 90,5 108-16,2 39 61 65 63 56 12,5 40 65 62 63,5 62 2,4 41 177 175 176 186-5,4 42 63 70 66,5 77-13,6 43 50 53 51,5 47 9,6 44 1114 1043 1078,5 970 11,2 45 130 126 128 133-3,8 46 3049 8970 6009,5 1674 47 286 289 287,5 285 0,9 48 317 324 320,5 306 4,7 49 94 91 92,5 85 8,8 Resultater for analyse af kalibratorer: Standard nr LOT kørsel 1 dobbelt LOT kørsel 2 dobbelt LOT kørsel 3 dobbelt LOT kørsel 4 dobbelt LOT kørsel 5 dobbelt LOT kørsel 6 dobbelt kørsel 7 dobbelt kørsel 8 dobbelt 1 1945 22 22 1552 6 0 1945 22 24 1552.1 23 20 1552 11 0 1552.1 25 20 11 0 25 25 2 1945 91 88 1552 92 95 1945 91 90 1552.1 93 95 1552 100 103 1552.1 92 99 102 102 92 92 3 1945 285 280 1552 208 298 1945 291 296 1552.1 279 294 1552 294 293 1552.1 296 293 285 300 291 299 4 1945 859 907 1552 971 874 1945 918 891 1552.1 943 867 1552 962 863 1552.1 912 890 949 861 908 885 5 1945 1847 1727 1552 0 1625 1945 1735 1882 1552.1 1928 1730 1552 2024 1612 1552.1 1973 1662 2041 1618 1870 1735 Middelværdi af dobbeltbestemmelse på kalibratorer (S1-S5): kørsel 1 kørsel 2 kørsel 3 kørsel 4 kørsel 5 kørsel 6 kørsel 7 kørsel 8 Middel S1 22 3 23 21,5 5,5 22,5 5,5 25 Middel S2 89,5 93,5 90,5 94 101,5 95,5 102 92 Middel S3 282,5 253 293,5 286,5 293,5 294,5 292,5 295 Middel S4 883 922,5 904,5 905 912,5 901 905 896,5 Middel S5 1787 812,5 1808,5 1829 1818 1817,5 1829,5 1802,5 kørsel 9 kørsel 10 42

Standard Target Middel Bias % SD CV % S1 30 16-46,7 9,5 59,2 S2 90 94,8 5,3 4,7 4,9 S3 300 286,4-4,5 14,2 5,0 S4 900 903,8 0,4 11,5 1,3 S5 1800 1688,1-6,2 354,1 21,0 Middelværdi, SD og CV % resultater af enkeltbestemmelse for S1 på kørsel 2 som blev målt til 6, kørsel 5 og 7 til 11 samt på enkeltbestemmelse for S5 på kørsel 2 som blev målt til 1625. Standard Target Middel Bias % SD CV % S1 30 17,8-40,8 7,2 40,6 S2 90 94,8 5,3 4,7 4,9 S3 300 286,4-4,5 14,2 5,0 S4 900 903,8 0,4 11,5 1,3 S5 1800 1597,5-11,25 308,1 19,3 Interne kontroller fra reagenskit: Kontroller kit LOT kørsel 1 dobbelt LOT kørsel 2 dobbelt LOT kørsel 3 dobbelt LOT kørsel 4 dobbelt LOT kørsel 5 dobbelt LOT kørsel 6 dobbelt kørsel 7 dobbelt kørsel 8 dobbelt LOW 1945 118 114 1552 101 101 1945 120 116 1552.1 101 103 1552 108 110 1552.1 106 104 111 118 102 99 HIGH 1945 400 406 1552 380 390 1945 407 433 1552.1 391 380 1552 404 420 1552.1 375 389 389 390 396 384 Eksterne kontroller fra Equalis: Equalis 1 2 Middel værdi Target middelværdi Bias % 36A 32 25 28,5 42,7-33,3 36B 115 123 119 153-22,2 47A 200 192 196 247-20,6 47B 447 418 432,5 578-25,2 43

Intramediær præcision: fra kørsel 3 Målt på de samme prøver på samme kørsel Intramediær præcision 1 1 dobbelt 2 2 dobbelt 3 3 dobbelt 4 4 dobbelt 5 5 dobbelt Lav 63 67 72 67 73 74 75 73 71 66 Middel 787 740 753 768 771 761 761 792 723 709 Høj 1710 1748 1752 1822 1863 2369 2161 2173 1845 1892 Beregninger på middelværdi af de 5 dobbeltbestemmelser samt samlet middelværdi, SD og CV %: 1 2 3 4 5 middel - lav konc. 65 69,5 73,5 74 68,5 middel - middel konc. 763,5 760,5 766 776,5 716 middel - høj konc. 1729 1787 2116 2167 1868,5 Middel SD CV% 70,1 3,7 5,3 756,5 23,4 3,1 1933,5 197,1 10,2 Intermediær præcision: Pools blandet ved kørsel 3 Intermediær præcision kørsel 1 dobbelt kørsel 2 dobbelt kørsel 3 dobbelt kørsel 4 dobbelt kørsel 5 dobbelt kørsel 6 dobbelt kørsel 7 dobbelt kørsel 8 dobbelt kørsel 9 dobbelt kørsel 10 LAV 64 62 0 0 68 68 84 78 71 80 81 77 78 75 77 77 MIDDEL 0 0 1008 919 733 695 696 646 674 681 621 586 561 544 717 661 HØJ 1635 1619 1594 1592 1665 1650 1752 0 0 0 1562 1731 1570 1478 1949 1903 Beregninger på middelværdi over de 10 kørsler samt samlet middelværdi, SD og CV %: kørsel 1 kørsel 2 kørsel 3 kørsel 4 kørsel 5 kørsel 6 kørsel 7 kørsel 8 kørsel 9 kørsel 10 Middel LAV 63 0 68 81 75,5 79 76,5 77 Middel MIDDEL 0 963,5 714 671 677,5 603,5 552,5 689 Middel HØJ 1627 1593 1657,5 876 0 1646,5 1524 0 middel SD CV% 76,2 4,5 5,9 651,3 60,8 9,3 950,7 790,6 83,2 44

Holdbarhedsforsøg: Holdbarhed på prøve nr 5 0 timer 1 måling 0 timer 2 måling 24 timer 1 måling 24 timer 2 måling 48 timer 1 st 133 135 117 121 0 2 st 126 132 0 3 st 130 128 0 4 st 128 124 109 117 0 5 st 127 127 117 116 0 1 køl 133 125 0 2 køl 135 137 133 124 0 3 køl 138 127 122 123 0 4 køl 135 142 0 5 køl 141 140 0 t-test 21 C Middel 0 timer Middel 24 timer 5 C 134 119 129 129 136 128,5 129 132,5 122,5 126 113 138,5 127 116,5 140,5 t-test (pværdi) 0,01013231 t-test (p-værdi) 0,090334 Metodesammenligning mellem vores ScheBo ekstraheringer målt på BEP og Quantum Blue Prøve nr schebo 1 schebo 2 Middel Quantum %Bias 1 959 1064 1011,5 1001-1,0 2 61 58 59,5-100,0 3 28 28 28 110 292,9 5 148 150 149 186 24,8 6 316 316 316 286-9,5 Correlation : Lineær correlation, r 2 : 0,991 Hældningskoefficient: 0,9279 Skæring med y-akse: 46,739 Gennemsnitlig % bias : 41,4 45