COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Bestillingsoplysninger AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR HCV DK 100 Tests P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Nedenstående kit kan bruges til detektion af HCV-intern kontrol, der er amplificeret ved hjælp af AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0. Detektion af HCVintern kontrol er valgfrit for brugeren. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/42 P/N: 03788636190
Tilsigtet brug COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) er en kvalitativ in vitro-diagnosticering til bestemmelse af hepatitis C-virus RNA i kliniske prøver på COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Forekomst af HCV RNA er et tegn på en aktuel HCV-infektion hos patienter, der er et klinisk og/eller biokemisk bevis på en leversygdom. Testen anvender revers transkription af target-rna til at danne komplementær DNA (cdna), amplifikation af target-cdna med polymerasekædereationen (PCR) og nukleinsyrehybridisering til detektion af HCV RNA i humant serum eller plasma. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 er ikke beregnet til brug ved screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af hepatitis C-virus. Oversigt over og forklaring af testen Hepatitis C-virus betragtes som det vigtigste ætiologiske stof, der er skyld i 90-95% af de smittetilfælde efter transfusion, der ikke skyldes hepatitis A eller B 1,2. HCV er en enkeltstrenget, positiv sense RNA-virus med et genom, der består af ca. 10.000 nukleotider, som koder for 3.000 aminosyrer 1. HCV kan som blodoverført virus overføres via blod og blodprodukter. Forekomsten af HCV-infektioner er høj hos patienter, der har fået organtransplantation, blodtransfusion eller kommercielle koagulationsfaktorer, hos patienter med perkutan udsættelse via intravenøst stofmisbrug og hos patienter i nyredialyse. Forekomsten af HCV-infektioner, fastlagt ved immun-serologi, varierer fra 0,6% i Canada til 1,8% i USA 3. Forekomsten af anti-hcv-antistoffer hos patienter, der er inficeret med HCV, har ført til udviklingen af immun-serologiske test, der er specifikke for disse antistoffer 4,5. Implementationen af disse test har allerede reduceret forekomsten af hepatitis, der opstår efter transfusion, i hele verden. Yderligere test er foretaget ved hjælp af RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) for at fortsætte evalueringen af prøver, der fortsat er reaktive i antistof-screening-analysen. Nylige undersøgelser viser, at fortolkningen af denne supplerende test er afhængig af patientens risikostatus. I en bloddonorpopulation med lav risiko, blev f.eks. kun 50% af de RIBA-reaktive prøver bekræftet ved hjælp af en HCV RNA-test 6,7,8. Et positivt RIBAresultat er således ikke en sand indikator for en aktiv HCV-infektion, idet patienter, der er blevet raske, kan forblive HCV-positive i årevis 5. Herudover har ubestemte, supplerende testresultater vist sig hos både nyligt inficerede persioner, som er under serokonvertering, og hos personer, der er kronisk inficeret med HCV 9,10. Den immun-serologiske test er et target for aktuel og/eller tidligere eksponering over for HCV-infektion, men den kan ikke skelne mellem disse. I tilfælde med akutte HCV-infektioner kan enkelte personer desuden være ude af stand til at producere antistoffer mod HCV 11, hvilket gør diagnosticering af aktuel HCVinfektion umulig med immun-serologiske teknikker. Som alternativ kan detektion af HCV RNA med nukleinsyretest levere beviser på aktuel infektion. Ved hjælp af nukleinsyretest er det muligt at detektere HCV-viræmi før immunologisk serokonversion 12,13. Da nukleinsyretest kan detektere HCV RNA direkte, dvs. uafhængig af patientens immunologiske status, er en nukleinsyrebaseret test værdifuld ved detektion af HCV RNA hos immunsvækkede patienter 8. 2/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Principper for proceduren COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 er baseret på fem hovedprocesser: Prøveforberedelse, revers transkription af target-rna for at generere komplementær DNA (cdna) 14 ; PCR-amplifikation 14 af target-cdna ved hjælp af HCV-specifikke komplementære primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotid-detektionsprober, der er specifikke for target(s), samt detektion af de probe-bundne, amplificerede produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. Med COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 kan der foretages samtidig revers transkription og PCR-amplifikation af target-hcv og HCV Internal Controltarget RNA. Master Mix-reagenset indeholder to primere, der er specifikke for HCV og HCV-intern kontrol-rna. Detektion af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targetspecifikke oligonukleotid-prober, der tillader en uafhængig identifikation af HCV-amplikon og HCV-intern kontrol-amplikon. Intern kontrol Prøveforberedelse Revers transskription og PCR-amplifikation I enzymbaserede amplifikationprocesser, som f.eks. PCR, kan effektiviteten reduceres af de inhibitorer, der kan være i den kliniske prøve. Der er tilsat HCVintern kontrol i COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 for at muliggøre identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCRamplifikationen. HCV-intern kontrol er et RNA-plasmid med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i HCV-target-DNA-sekvensen, en randomiseret intern sekvens, der har samme længde og basesammensætning som HCVtargetsekvensen, samt en unik probebindingsregion, der adskiller HCV-intern kontrol-amplikonet fra targetamplikonet. Disse funktioner er valgt for at sikre en ensartet amplifikation af HCV-intern kontrol- og MTB-target-DNA et. HCV RNA isoleres fra plasma ved lysis af viruspartikler med et kaotropisk stof efterfulgt af fældning af RNA et med alkohol. RNA et resuspenderes i prøvediluent. HCV-intern kontrol-rna et tilføres hver prøve med lysisreagensen og fungerer som en ekstraherings-, amplifikations- og detektionskontrol for hver enkelt prøve, der behandles. Valg af target Udvælgelsen af target-rna-sekvensen for HCV afhænger af identifikationen af områder i HCV-genomet med den højeste sekvenskonservering blandt de forskellige HCV-genotyper 15,16,17. Dermed er den korrekte udvælgelse af primere og probe afgørende for testens evne til at detektere alle genotyper (se afsnittet Vurdering af ikke-klinisk funktionsevne, inklusivitetsundersøgelse af HCV-genotype ). Det 5'-untranslated region (UTR) af HCV-genomet har vist sig at have maksimal bevarelse af RNA-sekvenser blandt de kendte HCV-genotyper 18,19. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 bruger primerne KY78 og KY80 til at definere en sekvens med 244 nukleotider i det bedst konserverede 5'-UTR-område af HCVgenomet 13. Opfangningsprobe- og primersekvenserne er placeret i de mest konserverede områder i 5'-UTR-området 18. Revers transkription Der udføres revers transskriptionsreaktioner med det termostabile rekombinante enzym Thermus thermophilus DNA polymerase (rtth pol). Ved tilstedeværelsen af mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har rtth pol både revers transkriptase- og DNA polymerase-aktivitet 14. Dermed kan både revers transskription og PCR-amplifikation foregå samtidig i samme reaktionsblanding. Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplifikationsrørene (A-rør), hvor der foregår både revers transskription og PCR-amplifikation. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/42
Downstream- eller anti-senseprimeren (KY78) biotinyleres ved 5'-enden, mens upstream- eller senseprimeren (KY80) ikke biotinyleres. Reaktionsblandingen opvarmes for at lade downstream-primeren binde sig specifikt til HCV-target-RNA et og til HCV-intern kontrol-rna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleosid trifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin, og deoxyuridin (i stedet for thymidin) trifosfater, forlænger rtth pol den bundne primer og danner en DNA-streng (cdna), der er komplementær til RNA-target. Targetamplifikation Efter revers transkription af HCV-target og HCV-intern kontrol-rna opvarmes reaktionsblandingen for at denaturere RNA:cDNA-hybriden og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder upstream-primeren (KY80) sig specifikt til cdna-strengen, rtth pol forlænger i primerens 5'-3' retning, og den anden DNA-streng syntetiseres. Dette afslutter den første PCRcyklus, der giver en dobbeltstrenget DNA-kopi af targetområdet af HCV og HCVintern kontrol-rna et. Reaktionsblandingen opvarmes igen for at adskille den resulterende dobbeltstrengede DNA og vise primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne KY78 og KY80 sig til target-dna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende dntp er udvider rtth pol de bundne primere langs targetskabelonerne for at producere et dobbeltstrenget DNAmolekyle med 244 basepar, kaldet et amplikon. COBAS AMPLICORanalyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammet i COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HCV-genomen. Hele genomen amplificeres ikke. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra den kliniske prøve opnås i COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 ved hjælp af AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) og deoxyuridin trifosfat (dutp). AmpErase-enzym registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 20, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridin trifosfat i stedet for thymidin trifosfat som en af dntp erne i Master Mix-reagensen. Derfor er det kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. AmpErase-enzym, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved basisk ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Efter amplifikation denatureres resterende enzym ved tilsættelse af denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af target-amplikoner. Det er påvist, at AmpErase-enzym i COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 deaktiverer mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt HCV-amplikon pr. PCR. 4/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Hybridiseringsreaktion Detektionsreaktion Efter PCR-amplifikation tilsætter COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet automatisk denatureringsopløsning til A-rørene for at denaturere HCV-amplikonet og HCV-intern kontrol-amplikonet kemisk. Derved dannes enkeltstrenget DNA. Aliquots af denatureret amplikon overføres derefter til detektionskopper (D-kopper). En opløsning af magnetiske partikler, der er belagt med en oligonukleotid detektionsprobe for HCV (KY150) eller HCV-intern kontrol (SK535), tilsættes til de enkelte D-kopper. Det biotinmærkede HCV og HCV-intern kontrol-amplikon hybridiseres til de targetspecifikke oligonukleotidprober, der er bundet til de magnetiske partikler. Denne hybridisering af amplikonet til den targetspecifikke probe øger den samlede specificitet for testen. Efter hybridiseringsreaktionen skyller COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet de magnetiske partikler i D-koppen for at fjerne ubundet materiale og tilsætter derefter avidin/horseradish-peroxidasekonjugat. Avidin/horseradish-peroxidasekonjugatet binder sig til det biotinmærkede amplikon, der er hybridiseret til de targetspecifikke oligonukleotid-detektionsprober (HCV eller intern kontrol), der er bundet til de magnetiske partikler. COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet fjerner ubundet konjugat ved at skylle de magnetiske partikler og tilsætter derefter en substratopløsning, der indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) i hver D-kop. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den partikelbundne horseradish-peroxidase oxideringen af TMB for at danne et farvet kompleks for hvilket, der måles absorbans ved hjælp af COBAS AMPLICORanalyseinstrumentet ved en bølgelængde på 660 nm. Reagenser AMPLICOR HCV HCV PREP 96 test P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 AMPLICOR HCV prøveforberedelseskit, version 2.0 US: 83126 HCV LYS, v2.0 (HCV lysisreagens, version 2.0) 8 x 6,9 ml Xn Tris-HCl buffer 68% guanidinthiocyanat 3% dithiothreitol < 1% glykogen + 68% (w/w) guanidinthiocyanat Sundhedsskadelig HCV DIL, v2.0 (HCV prøvediluent, version 2.0) 8 x 4,8 ml Tris-HCl-buffer < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/42
HCV IC, v2.0 (HCV-internkontrol, version 2.0) 8 x 0,1 ml < 0,001% ikke-smitsom in vitro-transkriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HCV-primerbindings sekvenser og et unikt probebindingsområde < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid AMPLICOR HCV HCV CTL 8 sæt P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrolkit, version 2.0 US: 83131 NHP [Negativt plasma (humant)] 8 x 0,6 ml Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-licenserede test for antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24 antigen og HbsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder 0,1% ProClin 300 HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( )-kontrol, version 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid HCV (+) C, v2.0 [HCV (+)-kontrol, version 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,001% ikke-smitsom in vitro-transkriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HCV-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid AMPLICOR HCV HCV AMP 96 test P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifikationskit, version 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV Master Mix, version 2.0) 8 x 0,7 ml Bicinbuffer 16% DMSO Glycerol < 0,01% rtth DNA Polymerase (rtth pol, mikrobiel) Kaliumacetat < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% primerne KY78 og KY80 (én er biotinyleret) < 0,01% AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobiel) 0,05% natriumazid 6/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganopløsning, version 2.0) 8 x 0,1 ml < 2% Mangan Eddikesyre Amaranth-farve 0,05% natriumazid COBAS AMPLICOR HCV DK 100 test P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR HCV detektionskit, version 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (HCV probeopløsning 1, version 2.0) 1 x 100 test MES-buffer < 0,4% Dynabeads -opløsning (paramagnetiske partikler) belagt med HCV-specifik oligonukleotid-opfangningsprobe (KY150) 0,09% natriumazid CX4, v2.0 (HCV probeopløsning 2, version 2.0) Natriumfosfatbuffer < 0,2% emulgator 42,2% natriumthiocyanat Xn 42,2% (w/w) natriumthiocyanat + 1 x 100 test Sundhedsskadelig COBAS AMPLICOR DK 100 test P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: 83276 DN4 (Denatureringsopløsning) Xi 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå + 1,6% (w/w) natriumhydroxid 1 x 100 test Lokalirriterende CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) 1 x 100 test Tris-HCl-buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat Serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/42
SB3 (Substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150 SB (Substrat B) 5 x 75 test 5 x 5 ml 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: 53-45 Undgå enhver kontakt - indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. COBAS AMPLICOR CN4 200 test P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugat-detektionsreagens US: 83305 CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) 2 x 100 test Tris-HCl-buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-skyllekoncentrat) 2 x 250 test < 2% fosfatbuffer < 9% natriumklorid EDTA < 2% rensemiddel 0,5% ProClin 300 8/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostik. Denne test er kun beregnet til humant serum eller plasma, der er indsamlet i EDTA- eller ACD-antikoagulanter. Det er påvist, at heparin hæmmer PCR og må derfor ikke bruges med denne procedure. Undgå at pipettere med munden. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, kitler og sikkerhedsbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. Undgå bakterie- og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes aliquoter fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespidser. Reagenser fra forskellige lot eller fra forskellige flasker fra det samme lot må ikke blandes sammen. Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Du kan rekvirere MSDS er (Material Safety Data Sheets) hos din lokale Roche-forhandler. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i præamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Præamplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til præamplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre kilder target-dna-kilder. Beholdninger og udstyr til postamplifikation skal altid bibeholdes i post-amplifikationsområdet. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og i CLSI-dokument M29-A 22. Rengør grundigt og desinficer alle arbejdsflader med en nyfremstillet 0,5% natriumhypochlorit-opløsning i demineraliseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindelig tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypochlorid med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypochlorit-opløsning. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/42
ADVARSEL! Dette kit indeholder en komponent (NHP), der stammer fra humant blod. Kildematerialet er analyseret ved hjælp af test, der er godkendt af det FDA, og blev fundet ikke-reaktive for tilstedeværelsen af antistof mod HCV, antistof mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg). Test af negativ humant plasma ved hjælp af PCR-metoder påviste ikke forekomst af HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer humant blod, kan overføre smitstoffer. Derfor skal alt materiale, der stammer fra mennesker, behandles som potentielt smittefarligt. NHP skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og i CLSI-dokument M29-A 22. Rengør grundigt og desinficer alle arbejdsflader med en nyfremstillet 0,5% natriumhypochlorit-opløsning i demineraliseret eller destilleret vand. HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; HCV ( ) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 og CX PS1, v2.0, indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. Brug beskyttelsesbriller, kitler og engangshandsker ved håndtering af HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB og arbejdssubstrat (blanding af reagenserne SB3 og SB). Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Hvis der opstår kontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal du fortynde med vand, før de tørres op. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og SB eller arbejdssubstratet. Hvis der opstår hudkontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. SB og arbejdssubstratet indeholder dimethylformamid, der er rapporteret som giftigt ved høje orale doser og kan virke fosterskadende. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Hvis der opstår hudkontakt, skal du vaske grundigt med vand og sæbe samt straks søge læge. HCV LYS, v2.0, der indeholder guanidinthiocyanat, eller CX4, v2.0, der indeholder natriumthiocyanat må ikke komme i forbindelse med natriumhypochloritopløsning (blegemiddel). Denne blanding kan danne en meget giftig gas. Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. 10/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Krav til opbevaring og håndtering Reagenser må ikke nedfryses. HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 og HCV IC, v2.0 opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Der dannes et bundfald i HCV LYS, v2.0 ved opbevaring ved 2-8 C. Før brug skal den opvarmes ved 25-37 C og blandes grundigt for at opløse bundfaldet. HCV LYS, v2.0 opvarmes i højst 30 minutter efterfulgt af grundig blanding, indtil krystallerne er opløst. Før brug skal du undersøge hver enkelt flaske med HCV LYS, v2.0 mod en hvid baggrund for at se, om der er en gul farve eller tegn på utætheder. Hvis der er en gul farve eller tegn på utætheder, må den pågældende flaske ikke bruges. Kontakt den lokale Roche-forhandler for at få en ny flaske. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Arbejdslysisreagenset (klargøres ved at tilsætte HCV IC, v2.0 til HCV LYS, v2.0) skal opbevares ved stuetemperatur og bruges senest 8 timer efter klargøring. HCV MMX, v2.0 og HCV Mn 2+, v2.0 opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Arbejds-Master Mix (forberedes ved tilsætning af HCV Mn 2+, v2.0 til HCV MMX, v2.0) skal opbevares ved 2-8 C og bruges senest 4 timer efter klargøring. NHP, HCV ( ) C, v2.0 og HCV (+) C, v2.0 opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 er blandet, kan arbejdsreagensen holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagensen kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. DN4 opbevares ved 2-25 C. DN4 kan holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. DN4 kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. CN4 opbevares ved 2-8 C. CN4 kan holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning kan CN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. CN4 kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. SB3 og SB opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til de angivne udløbsdatoer. Der skal forberedes arbejdssubstrat hver dag ved blanding af SB3 med SB. Arbejdssubstrat kan holde sig i 16 timer på COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Udsæt ikke SB3, SB eller arbejdssubstrat for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. WB opbevares ved 2-30 C. WB kan holde sig til den angivne udløbsdato. Undersøg WB før fortynding, og opvarm til 30-37 C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Arbejdsvaskebuffer (1X), der er forberedt ved 1:10 fortynding af WB med destilleret eller demineraliseret vand, skal opbevares ved 2-25 C i COBAS AMPLICOR-vaskebufferreservoiret og kan holde sig i 2 uger fra forberedelsesdatoen. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/42
Medfølgende materialer Detektionsreagenser, der ikke er helt opbrugt, skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentkørsler. Kontroller udløbsdatoen på åbnede reagenser eller arbejdsreagenser, før de indsættes i COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. AMPLICOR HCV Specimen HCV PREP P/N: 21111086 123 Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 AMPLICOR HCV prøveforberedelseskit, version 2.0 US: 83126 HCV LYS, v2.0 (HCV-lysisreagens, version 2.0) HCV DIL, v2.0 (HCV-prøvediluent, version 2.0) HCV IC, v2.0 (HCV-intern kontrol, version 2.0) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrolkit, version 2.0 US: 83131 NHP [Negativt plasma (humant)] HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( )-kontrol, version 2.0] HCV (+) C, v2.0 [HCV (+)-kontrol, version 2.0] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifikationskit, version 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV Master Mix, version 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganopløsning, version 2.0) COBAS AMPLICOR HCV DK P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR HCV detektionskit, version 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (HCV probeopløsning 1, version 2.0) CX4, v2.0 (HCV probeopløsning 2, version 2.0) 12/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: 83276 DN4 (Denatureringsopløsning) CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugat-detektionsreagens US: 83305 CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-skyllekoncentrat) Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Præamplifikation - Reagensforberedelsesområdet COBAS AMPLICOR-A-ring monteret med 12 A-rør (ART: 10 4563 6; P/N: 21045636001) Holder til COBAS AMPLICOR-A-ring Genlukkelig plastpose Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoir (steril, enkeltpakket) Pipetter (50 µl og 100 µl kapacitet)* med aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser Engangshandsker, uden pulver Præamplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet 1.5 ml polypropylen-rør med skruelåg, sterile, ikke-silikoniseret, konisk (Sarstedt 72.692.005 eller tilsvarende)** Glasrack (Sarstedt 93.1428 eller tilsvarende) 95% ethanol, reagenskvalitet til mikrobiologi eller histologi (brug nyfortyndet til 70% med destilleret eller demineraliseret vand) Isopropylalkohol, reagenskvalitet Sterile overførselspipetter med lille spids, RNase-frie Sterile serologiske polystyren-engangspipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml) 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/42
Pipetter (kapacitet 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl, 800 µl og 1000 µl)* med aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser Mikrocentrifuge (maks. RCF 16.000 x g, min. RCF 12.500 x g). Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende Vortex-mixer 60 C ± 2 C tørvarmeblok Engangshandsker, uden pulver Post-amplifikation - Amplifikations-/detektionsområde COBAS AMPLICOR-analyseinstrument og printer Brugerhåndbog til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0, Metodemanual Rack med D-kopper (ART: 10 4564 4: P/N: 21045644001) Destilleret eller demineraliseret vand 5 ml serologiske pipetter Engangshandsker, uden pulver * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. ** Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. Indsamling, transport og opbevaring af prøver Bemærk! Indsamling af prøver Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 er kun beregnet til serum- eller plasmaprøver. Blod skal indsamles i SST -rør (Serum Separation Tubes) eller i sterile rør ved hjælp af EDTA (lavendelblå top) eller ACD (gul top) som antikoagulant. Prøver, der er antikoaguleret med heparin, egner sig ikke til denne test. Fuldblod skal opbevares ved 2-25 C i højst 6 timer. Plasma separeres fra fuldblod inden 6 timer efter indsamling ved centrifugering ved 1500 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet overføres til et sterilt polypropylen-rør. Transport af prøver Opbevaring af prøver Transport af fuldblod eller plasma skal foregå i overensstemmelse med de nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer. 23 Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og behandles inden for 6 timer efter indsamlingen. Serum eller plasma skal transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -70 C eller koldere og skal behandles inden for de tidsgrænser, der er angivet nedenfor. Serum- eller plasmaprøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 72 timer eller nedfrosset ved -70 C eller koldere. Det anbefales at opbevare prøverne i 250-300 µl aliquots i sterile, 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg (f.eks. Sarstedt 72.692.105). Serum- eller plasmaprøver kan nedfryses og optøs op til to gange. 14/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Brugsvejledning Bemærk! Bemærk! Bemærk! Bemærk! Bemærk! Kørselsstørrelse Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få en detaljeret brugsvejledning. Alle reagenser skal have den omgivende temperatur før brug. Undersøg visuelt, at der er en tilstrækkelig volumen i reagenserne, før testprocedure påbegyndes. Serum- og plasmaprøver skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolfilter eller stempelspidser, når det er angivet. Vær yderst forsigtig med at sikre selektiv amplifikation. Der skal bruges rør med skruelåg til forberedelse af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. Hvert kit indeholder reagenser til otte kørsler af 12 tests, der kan udføres separat eller samtidig. Hver testkørsel skal inkludere mindst én kopi af hver AMPLICOR HCV ( )-kontrol og AMPLICOR HCV (+)-kontrol (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Prøveklargørings- og amplifikationsreagenserne er pakket i engangsflasker til 12 tests. HCV ( )- og HCV (+)-kontrollerne er pakket i engangsflasker. Den mest effektive brug af reagenser, prøver og kontroller fås ved at behandle dem i batches, der kan ganges med 12. Arbejdsgang COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 kan udføres i løbet af én dag eller over to dage. Hvis testen skal afsluttes på en enkelt arbejdsdag, skal du følge instruktionerne under Reagensforberedelse, Prøve- og kontrolforberedelse og Revers transskription, Amplifikation og Detektion i rækkefølge. Testen kan udføres over 2 dage ved at starte med Prøve- og kontrolforberedelse dag 1 efterfulgt af Reagensforberedelse og Revers transkription, Amplifikation og Detektion dag 2 eller ved at starte Prøve- og kontrolforberedelse, Revers transkription og Amplifikation dag 1 og Detektion dag 2. Hvis du vil udføre prøve- og kontrolforberedelse dag 1 og revers transkription, amplifikation og detektion dag 2, skal du udføre Prøve- og kontrolforberedelse, (trin 1-15) og opbevare de behandlede prøver og kontroller som angivet under trin 15. Dag 2 skal du starte med Reagensforberedelse, derefter optø de behandlede prøver og kontroller til stuetemperatur og fortsætte med Prøve- og kontrolforberedelse, trin 16 og derefter med Revers transkription, Amplifikation og Detektion. Hvis du vil udføre prøve- og kontrolbehandlingen samt revers transkription og amplifikation dag 1, skal du fortsætte med alle trin under Reagensforberedelse og Prøve- og kontrolforberedelse. Programmer COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet i parallel tilstand (kørselstilstand), og udfør amplifikationstrinnene (se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få yderligere instruktioner). Opbevar det denaturerede amplikon til næste dag ved 2-8 C, og forsæt med Detektion dag 2. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/42
Reagensforberedelse Udført i: Præamplifikation - Reagensforberedelsesområdet 1. Fastlæg det relevante antal A-ringe, der skal bruges til testen af patientprøver og kontroller. Placer A-ringen(e) i A-ring-holderen eller -holderne. 2. Forbered arbejds-master Mix ved at tilsætte 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 til ét rør med HCV MMX, v2.0. Det er ikke nødvendigt at måle Master Mix-volumen. Tilsæt 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 til hele flasken med HCV MMX, v2.0. Sæt låg på røret, og bland godt ved at vende røret 10-15 gange. Bland ikke arbejds- Master Mix i en vortex-mixer. Den lyserøde farve i HCV Mn 2+, v2.0 bruges som visuel bekræftelse af, at HCV Mn 2+, v2.0 er blevet tilsat til HCV MMX, v2.0. Kasser det resterende HCV Mn 2+, v2.0. Arbejds-Master Mix skal opbevares ved 2-8 C og anvendes højst 4 timer efter forberedelsen. 3. Tilsæt 50 µl arbejds-master Mix i hvert A-rør med en repetitionspipette eller en pipette med aerosolfilter eller stempelspids. Luk ikke A-rør-lågene endnu. 4. Placer den eller de A-ring(e), der indeholder arbejds-master Mix, i en genlukkelig plastpose, og luk posen omhyggeligt. Flyt A-ringen eller -ringene til Præamplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet. Opbevar A-ringen eller -ringene med arbejds-master Mix ved 2-8 C i præamplifikation - prøveog kontrolforberedelsesområdet, indtil forberedelsen af prøver og kontroller er fuldført. Working Master Mix kan holde sig i 4 timer ved 2-8 C in A-rør, der er lukket i plastikposen. Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Bemærk! Bemærk! Udført i: Præamplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet For at amplificere behandlede prøver og kontroller skal du først udføre trinnene i afsnittet Reagensforberedelse. Optø behandlede prøver og kontroller til stuetemperatur, og gå videre med Prøve og kontrolforberedelse, trin 16. Før brug skal du undersøge hver enkelt flaske med HCV LYS, v2.0 mod en hvid baggrund for at se, om der er en gul farve eller tegn på utætheder. Hvis der er en gul farve eller tegn på utætheder, må den pågældende flaske ikke bruges. Kontakt den lokale Roche-forhandler for at få en ny flaske. Der dannes et bundfald i HCV LYS, v2.0 ved opbevaring ved 2-8 C. Før brug skal den opvarmes til 25-37 C i maksimalt 30 minutter og blandes grundigt for at opløse bundfaldet. 1. Klargør 70% ethanol. Til 12 tests skal du blande 11,0 ml 95% ethanol og 4,0 ml demineraliseret eller destilleret vand. 2. Mærk ét 1,5 ml rør med skruelåg for hver patientprøve, og mærk to yderligere rør med HCV ( ) C og HCV (+) C. 3. Klargør arbejdslysisreagensen. Bland HCV IC, v2.0 i 5-10 sekunder i en vortex-mixer før brug. For hver batch på op til 12 prøver og kontroller skal du tilsætte 100 µl HCV IC, v2.0 i én flaske HCV LYS, v2.0 og blande grundigt. Det er ikke nødvendigt at måle volumen af HCV LYS, v2.0. Bemærk! Selv om der ikke foretages detektion af HCV-intern kontrol, skal der tilsættes HCV IC, v2.0 til HCV LYS, v2.0. Kasser det resterende HCV IC, v2.0. Arbejdslysisreagenset kan holde sig i 8 timer ved stuetemperatur. 16/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Bemærk! Hvis du bruger frosne prøver, skal du optø prøver ved stuetemperatur og blande dem i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Centrifuger prøverøret kort for at samle prøven i bunden af røret. Undgå omhyggeligt at kontaminere handsker, når du håndterer prøver. 4. Tilsæt 400 µl arbejdslysisreagens til hver enkelt af de mærkede rør, og sæt låg på dem. 5. Klargør kontrollerne på følgende måde: Bland NHP, HCV ( ) C, v2.0 og HCV (+) C, v2.0 i mindst 5-10 sekunder i en vortex-mixer. Tilsæt 200 µl NHP til hver enkelt af de to kontrolrør. Sæt låg på rørene, og bland i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Tilsæt 20 µl HCV ( ) C, v2.0 til det rør, der er mærket HCV ( ) C, og som indeholder arbejdslysisreagens og NHP. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Tilsæt 20 µl HCV (+) C, v2.0 til det rør, der er mærket HCV (+) C, og som indeholder arbejdslysisreagens og NHP. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. 6. Tilsæt 200 µl af hver patientprøve til det korrekt mærkede rør, der indeholder arbejdslysisreagens. Sæt låg på røret, og bland i mindst 3-5 sekunder i en vortex-mixer. 7. Inkuber prøve- og kontrolrørene i en tørvarmeblok i 10 minutter ved 60 C ± 2 C. Bland dem i en vortex-mixer i mindst 10 sekunder. 8. Fjern lågene fra rørene, og tilsæt 600 µl 100% isopropylalkohol (ved stuetemperatur) til hvert rør. Sæt låg på rørene, og bland i mindst 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Inkuber rørene i 2 minutter ved stuetemperatur. 9. Placer et orienteringsmærke på hvert rør, og placer rørene i mikrocentrifugen med orienteringsmærket udad, så alle pellets kommer til at flugte med orienteringsmærkerne. Centrifuger prøverne og kontrollerne ved maksimal hastighed (12.500-16.000 x g) i 15 minutter ved stuetemperatur. 10. Brug en ny engangsoverførselspipette med lille spids til hvert rør, og fjern og kasser supernatanten fra hvert rør, idet du omhyggeligt undgår at forstyrre pelleten (der muligvis ikke kan ses). Fjern så meget væske som muligt uden at forstyrre pelleten. Træk langsom supernatanten tilbage, og lad væske løb helt væk fra siderne på røret. Brug ikke vakuumaspiration. 11. Tilsæt 1,0 ml 70% ethanol (ved stuetemperatur) i hvert rør, sæt låg på igen, og bland i mindst 3-5 sekunder i en vortex-mixer. 12. Placer rørene i mikrocentrifugen med orienteringsmærkerne udad, og centrifuger rørene i 5 minutter ved maksimal hastighed (12.500-16.000 x g) ved stuetemperatur. 13. Brug en ny engangsoverførselspipette med lille spids til hvert rør, og fjern og kasser supernatanten uden at forstyrre pelleten. Pelleten bør være tydelig at se ved dette trin. Fjern så meget af supernatanten som muligt. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/42
14. Sæt låg på rørene, og centrifuger ved maksimal hastighed i 3-5 sekunder. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten ved hjælp af en 200 µl-pipette med en ny spids til hvert rør. Pelleten bør være tydelig at se ved dette trin. Fjern så meget af supernatanten som muligt. Resterende ethanol kan hæmme amplifikationen. 15. Tilsæt 200 µl HCV DIL, v2.0 i hvert rør. Opløs pelleten så meget som muligt ved hjælp af en 200 µl-pipette med aerosolfilterspids. Sæt låg på rørene igen. Bland kraftigt i 10 sekunder i vortex-mixer. Der kan være noget uopløseligt materiale tilbage. Amplificer de behandlede prøver og kontroller højst 3 timer efter forberedelsen, eller opbevar prøverne nedfrosset ved -70 C eller koldere i op til én måned med højst to nedfrysninger/optøninger. Hvis prøverne nedfryses/optøs mere end to gange, kan det medføre tab af signaler fra HCV- eller HCV-intern kontrol. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller opbevares nedfrosset før amplifikation, skal de optøs ved stuetemperatur, blandes i 5 sekunder i vortexmixer, før der fortsættes til trin 16. 16. Tilsæt 50 µl af hver af de behandlede prøver og kontroller til de korrekt mærkede A-rør med arbejds-master Mix ved hjælp af en mikropipette med aerosolfilter eller stempelspids. Brug en ny spids til hver prøve og kontrol. Undgå omhyggeligt at overføre bundfald, der ikke er gået tilbage i opløsningen. Sæt låg på A-rørene. 17. Noter kontrollernes og prøvernes positioner i A-ringene. Amplifikationen skal startes senest 45 minutter efter tilsætning af de behandlede prøver og kontroller til A-rørene med arbejds-master Mix. Flyt de klargjorte prøver og kontroller i A-ringene til amplifikations-/detektionsområdet. De resterende behandlede prøver kan opbevares nedfrosset ved -70 C eller koldere i op til én måned. Behandlede prøver må højst nedfryses og optøs to gange. Hvis de nedfryses/optøs mere end to gange, kan det medføre tab af HCV RNA. Revers transkription, Amplifikation og detektion Udført i: Post-amplifikation - Amplifikations-/detektionsområdet Udfør den daglige instrumentvedligeholdelse som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, og gør følgende: Aftør spidsen på D-kop-håndteringsenheden med en fnugfri, fugtig klud, og tør det Aftør spidsen på D-kop-håndteringsenheden med en fnugfri, fugtig klud, og tør den Kontroller vaskebufferreservoiret, og fyld det om nødvendigt Forbered arbejdsvaskebufferen (1X) på følgende måde. Undersøg WB, og opvarm ved 30-37 C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 1 del WB til 9 dele destilleret eller demineraliseret vand. Bland grundigt. Sørg for, at der altid er mindst 3-4 liter arbejdsvaskebuffer (1X) i analyseinstrumentets vaskebufferreservoir. Tøm affaldsbeholderen Prim systemet Kontroller sprøjter og slanger under primingen Kontroller overførselsspidsen under primingen 18/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Gør følgende før hver kørsel: Kontroller affaldsbeholderen, og tøm den om nødvendigt Kontroller vaskebufferreservoiret, og tilføj om nødvendigt buffer Udskift brugte D-kop-rack Prim systemet Loading af reagenser og betjening af instrumentet 1. Kontroller mængden af reagens på COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Forbered nok reagenskassetter til udførelse af arbejdsopgaverne. 2. Bland CX PS1, v2.0 grundigt i vortex-mixeren. Tilsæt 2,5 ml CX PS1, v2.0 til en CX4, v2.0-kassette. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser den brugte CX PS1, v2.0-beholder. Angiv datoen for reagensforberedelsen på CX4, v2.0- kassetten. 3. Bland IC PS1 grundigt i en vortex-mixer, hvis der foretages detektion af HCV-intern kontrol. Tilsæt 2,5 ml IC PS1 til en IC4-kassette. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser den brugte IC PS1- beholder. Angiv datoen for reagensforberedelsen på IC4-kassetten. 4. Forbered arbejdssubstratet ved at pipettere 5 ml SB i en SB3-kassette. Bland det ved at pipettere op og ned. Kasser den tomme SB-beholder. Angiv datoen for reagensforberedelsen på SB3-kassetten. 5. Placer arbejdssubstratet i racket med generisk reagens. 6. Placer DN4- og CN4-kassetterne i racket med generisk reagens. Angiv datoen for, hvornår hver kassette blev åbnet, på kassetten. 7. Identificer reagensrackene som generiske eller testspecifikke ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINK-softwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 8. Konfigurer reagensrackene ved at indtaste eller indscanne reagenspositioner og lotnumre i analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 9. Indsæt reagensrackene i analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. Kontroller, at hver reagenskassette befinder sig på den tildelte position, og at hver kassette er sat ordentligt fast på det pågældende rack. 10. Placer D-kop-racket på D-kop-platformen. Der skal bruges én D-kop til hver detektionsreaktion og to D-kopper til hver kassette med arbejdssubstrat, før COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet kan udføre en blindkørsel. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 19/42
11. Placer A-ringen eller -ringene i COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentets thermo cyclere varmebehandlingssegment(-er). 12. Indsæt A-ringen eller -ringene i analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 13. Opret en A-ringsarbejdsliste som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. 14. Luk låget til thermo cyclerne tæt til. 15. Start COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. 16. Vent, til analyseinstrumentet indikerer, at load check er gennemført. Bemærk! Med COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet kan der udføres op til 6 separate detektioner på indholdet af hvert A-rør. Den påkrævede mængde af hver detektionsreagens beregnes af analyseinstrumentet, og der foretages et load check ved starten af hver kørsel, som indikerer, om der er nok tilgængelig reagens til at foretage de ønskede tests. 17. COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet udfører automatisk revers transkription, amplifikation og detektion. Resultaterne udtrykkes som en absorbansværdi ved 660 nm og som positiv, negativ eller usikker. 20/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0
Hepatitis C Virus Resultater Fortolkning af resultater Med intern kontrol-detektion Bemærk! Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få oplysninger om udskrivning af resultater samt fortolkning af flag og kommentarer. 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: HCV A 660 -resultat HCV IC A 660 -resultat A 660 COBAS-flag A 660 COBAS-flag Fortolkning < 0,15 NEGATIVE 0,15 POSITIVE HCV RNA ikke registreret. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelse af HCV-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med RNA, før der kan foretages en detektion. < 0,15 NEGATIVE < 0,15 NEGATIVE Inhiberet prøve. HCV RNA vil, hvis det er tilstede, ikke kunne detekteres. Behandl en anden aliquot af den oprindelige prøve, og gentag testen. Inhibitorer er ofte labile, og prøver, der i første omgang er inhiberet, er muligvis ikke inhiberet, når de behandles igen. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der indsamles en ny prøve. 1,0 POSITIVE ALLE ALLE HCV RNA detekteret. Prøven er positiv for tilstedeværelsen af HCV. 0,15, < 1,0 GZ 0.15-0.99 ALLE ALLE Usikre. Resultaterne er ikke endelige for HCV RNA. Gentag hele testproceduren som dubletter med en ny aliquot af patientprøven. Prøver med ét eller begge testresultater gentaget 0,15 A 660 skal betragtes som positive for HCV RNA. Prøver med begge testresultater gentaget, der er < 0,15 A 660, antages at være negative for HCV RNA, forudsat at IC-resultaterne for begge dubletter er 0,15 A 660. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 21/42
Uden intern kontrol-detektion 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: HKontrollerCV Result HCV-resultat A 660 COBAS Flag Fortolkning < 0,15 NEGATIVE HCV RNA ikke detekteret. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedevarelse af HCV-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravar af inhibitorer og tilstrækkeligt med RNA, for der kan foretages en detektion. 1,0 POSITIVE HCV RNA detekteret. Prøven er positiv for tilstedeværelsen af HCV. 0,15, GZ 0.15-0.99 Usikre. Resultaterne er ikke endelige for HCVRNA. Gentag hele testproceduren < 1,0 som dubletter med en ny aliquot af patientproven. Prøver med ét eller begge testresultater gentaget 0,15 A 660 skal betragtes som positive for HCV RNA. Prøver med begge testresultater gentaget, der er < 0,15 A 660, betragtes som negative for HCV RNA. Kvalitetskontrol Hver testkørsel skal inkludere mindst én kopi af hver AMPLICOR HCV ( )-kontrol og AMPLICOR HCV (+)-kontrol. Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed med hensyn til at udføre testen korrekt. Desuden skal den interne kontrol tilsættes til hver prøve under prøveforberedelsen. Den endelige detektion på COBAS AMPLICORanalyseinstrumentet er valgfrit for brugeren. Der er ikke nogen krav med hensyn til kontrollernes position i A-ringen eller A-ringene. Kontroller kørselsudskriften for flag og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få oplysninger om udskrivning og fortolkning af resultater og kommentarer. Yderligere kontroller kan testes i overensstemmelse med retningslinjer eller krav fra lokale, nationale, regionale lovbestemmelser eller akkrediteringsorganisationer. Negativ kontrol Positiv kontrol Analyseresultatet fra AMPLICOR HCV ( )-kontrollen skal være mindre end 0,1 ved A 660. Hvis absorbansen for AMPLICOR HCV ( )-kontrollen er større end eller lig med 0,1 A 660, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele processen (forberedelse af prøver og kontroller, revers transskription, amplifikation og detektion). Hvis absorbansværdien for AMPLICOR HCV ( )-kontrollen konstant er større end 0,1 A 660, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk hjælp. Analyseresultatet fra AMPLICOR HCV (+)-kontrollen skal være større end eller lig med 1,0 ved A 660. Hvis absorbansen for AMPLICOR HCV (+)-kontrollen er mindre end 1,0 A 660, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele processen (forberedelse af prøver og kontroller, revers transskription, amplifikation og detektion). Hvis absorbansen AMPLICOR HCV (+)-kontrollen konstant er mindre end 1,0, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk hjælp. 22/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0