ADVANCE TM HRP Kode K4067 Kode K4068 Kode K4069 Klar til brug 500 ml 110 ml 11 ml Anvendelsesområde Til in vitro diagnostisk brug. Systemet er beregnet til anvendelse sammen med primære antistoffer fra mus eller kanin, som brugeren leverer ved kvalitativ identificering af antigener ved hjælp af lysmikroskopi i normale og patologiske formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsprøver. Herunder ses en liste med anbefalede produkter fra Dako, som bør anvendes med henblik på optimal anvendelse af ADVANCE TM HRP. Se General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Generel vejledning til immunohistokemisk farvning ) for: (1) Principper for proceduren, (2) Nødvendige materialer, der ikke medfølger, (3) Opbevaring, (4) Klargøring af præparater, (5) Farvningsprocedure, (6) Kvalitetskontrol, (7) Fejlfinding, (8) Fortolkning af farvning, (9) Generelle begrænsninger. Resumé og forklaring Principper for proceduren Medfølgende reagenser ADVANCE HRP-detektionssystemet indeholder en yderst følsom IHC-farvningsteknik. Systemet er velegnet til detektering af antigener i lave koncentrationer. Systemet indeholder ikke biotin, hvilket eliminerer eller reducerer betydeligt uspecifik farvning, der opstår fra endogen avidin-biotin-aktivitet i lever, nyrer, lymfevæv og kryostatsektioner. Alle reagenser i ADVANCE HRP-systemet er klar til brug. Systemet består af en yderst følsom metode, hvilket resulterer i, at optimale fortyndinger af det primære antistof kan være flere gange større end de, der anvendes til de traditionelle EnVision-, ABC- eller LSAB-metoder. 1-5 Enhver endogen peroxidaseaktivitet standses ved at inkubere præparaterne med en egnet endogen peroxidaseblokerende reagens. Derefter inkuberes præparaterne med et korrekt karakteriseret og fortyndet primært muse- eller kaninantistof, efterfulgt af sekventielle 30-minutters inkuberinger med ADVANCE HRP Link og ADVANCE HRP Enzyme. Farvningen afsluttes med en 5 30 minutters inkubering med et egnet substratkromogen. ADVANCE TM HRP Link Denne reagens indeholder sekundære anti-muse- og anti-kaninantistoffer i en Tris-HCl-buffer, der indeholder stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. ADVANCE TM HRP Enzyme Denne reagens indeholder antistoffer, der er polymeriserede med peberrodperoxidase i en Tris-HCl-buffer, der indeholder stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. Reagenserne i ADVANCE HRP-detektionssystemet er meget velegnede til immunohistokemiske procedurer. Reagenserne leveres klar til brug. Yderligere fortynding af reagenserne eller ændring af inkuberingstemperaturen kan give fejlagtige resultater. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Absorberende servietter Kontrolvæv, positivt og negativt Kontrastfarve; vandbaseret, f.eks. Automation Hematoxylin (kode S3301), Hematoxylin for IHC (kode S3302) og Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3309) Dækglas Destilleret vand Ethanol, absolut og 95 % Lysmikroskop (20x 800x) Monteringsmedier, såsom Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) eller ikke-vandigt permanent monteringsmedium, Ultramount (kode S1964) Primære antistoffer og negativ kontrolreagens Objektglas, poly-l-lysinbelagte eller Silanized Slides (kode S3003) Farvningsglas eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 3-40 minutter) Vaskeflasker Vaskebufferopløsning Xylen, toluen eller xylenerstatninger Yderligere nødvendige materialer, der ikke medfølger Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l PAP Pen (kode S2002) (118764-002) 306008DK_002 s. 1/5
Anbefalede Dakoprodukter Dako kode Produktnavn Produkttype S3800 Autostainer Plus Instrument S2001 S2003 Peroxidase Block Dual Endogenous Enzyme Block Peroxidase-blokker Endogen peroxidase-blokker S3006 K3461/K3469 K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Wash Buffer 10x For Automated and Manual IHC Use. AEC+ Ready-to-use Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Vaskebuffer Substratsystem Kontrastfarve Forholdsregler Opbevaring 1. Til professionel brug. 2. Anvend ikke reagenser efter udløbsdatoen ved den anbefalede opbevaringsmetode. Hvis reagenser opbevares under andre betingelser end de, der er angivet i indlægssedlen, skal de bekræftes af brugeren. 3. Udskift ikke med reagenser fra andre partier eller sæt fra andre producenter. 4. Enzymer og substrat-kromogener kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke sættets komponenter, og udfør ikke farvning i stærkt lys, f.eks. direkte sollys. 5. Andre inkuberingstider eller temperaturer end de angivne kan give fejlbehæftede resultater. Sådanne ændringer skal bekræftes af brugeren. 6. Som ved alle produkter, der er udledt af biologisk materiale, gælder det, at produkterne skal håndteres på korrekt vis. 7. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 8. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. Opbevares ved 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Derfor skal der inkluderes positive og negative kontroller samtidig med patientprøver. Hvis der observeres en uventet farvning, som ikke kan forklares med forskelle i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et defekt system, kontaktes Dako Technical Support. Forberedelse af reagenser Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen. Vaskebufferopløsning TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kode S3006), er den anbefalede vaskebuffer til den automatiske og manuelle IHC-detektion. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kode nr. S1968), og PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kode nr. S3024), er ligeledes egnede vaskebufferopløsninger til manuel farvning. Vaskebufferopløsninger, der indeholder natriumazid, frarådes. Natriumazid inaktiverer peroxidase (HRP), hvilket medfører negativ farvning. Ubrugt buffer skal opbevares ved 2 8 C. Kassér bufferen, hv is den er uklar. Destilleret vand kan anvendes til skylning af peroxidase-blokkeren, substratet og modfarvestoffet. Primært antistof Slutbrugeren skal optimere de koncentrerede antistoffer. Fortyndinger skal klargøres med Antibody Diluent (kode S0809) eller en fortynder, der indeholder 0,05 mol/l Tris-HCI-buffer med 1 % bovint serumalbumin (BSA). En inkuberingstid på 30 minutter er tilstrækkelig for de fleste primære antistoffer, der anvendes sammen med systemet. Negativ kontrolreagens En ideel negativ kontrolreagens skal indeholde et antistof, der ikke udviser en specifik reaktivitet over for humant væv eller normalt/ikke-immunt serum i den samme matrix/opløsning som det fortyndede primære antistof. Den negative kontrolreagens skal være af samme underklasse og dyreart som det primære antistof, fortyndet til den samme immunoglobulin- eller proteinkoncentration som det fortyndede primære antistof med samme fortynder. Inkuberingsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. (118764-002) 306008DK_002 s. 2/5
Kontrastfarve DAB-kromogen giver et slutprodukt, der er uopløseligt i alkohol, og kan anvendes sammen med alkoholbaseret hæmatoxylin. Når AEC-substratkromogen anvendes, er det farvede slutprodukt fra farvningsreaktionen opløseligt i alkohol og må kun anvendes sammen med vandbaseret kontrastfarve, såsom Automation Hematoxylin (kode nr. S3301), Hematoxylin for IHC (kode nr. S3302), Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode nr. S3309). Kontrastfarvningen med hæmatoxylin efterfølges af en grundig skylning i destilleret vand, hvorefter objektglassene nedsænkes i et bad med 0,037 mol/l ammoniak eller lignende blånelsesmiddel. 0,037 mol/l ammoniakvand klargøres ved at blande 2,5 ml 15 mol/l (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter vand. Ubrugt 0,037 mol/l ammoniak kan opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) i en flaske med tætsluttende prop i maks. 12 måneder. Se producentens vejledning vedrørende alternative kontrastfarvningsprocedurer. Monteringsmedium Glycergel Mounting Medium (kode nr. C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kode nr. S3025) anbefales til vandig montering. Glycergel skal opvarmes til mindst 50 C umiddelbart inden brug. Ikke-vandigt permanent monteringsmedium Ultramount (kode S1964) kan også anvendes. Klargøring af præparater Præstationskarakteristika Farvningsprocedure Anvendes sammen med formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssnit samt frosne vævssnit og celle-smear. Inden IHC-farvningen skal vævene fikseres og behandles. Fiksering forhindrer autolyse og putrefaktion af ekscideret væv, bevarer antigenicitet, forbedrer det refraktive indeks af vævsbestanddelene og øger de cellulære elementers resistens over for vævsbehandling. Vævsbehandling omfatter dehydrering, fjernelse af dehydrerende midler, infiltrering af de indlejrende medier, indlejring og sektionering af væv. De mest almindelige fiksativer til IHC-vævsklargøring er beskrevet i General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Generel vejledning til immunohistokemisk farvning ). Ovenstående er kun beregnet som en vejledning. De optimale procedurer skal fastlægges og bekræftes af brugeren. Antistofferne i dette produkt er blevet absorberet i fast tilstandsform med henblik på at fjerne antistoffer, der krydsreagerer over for human immunoglobulin (Ig), men der kan være krydsreaktivitet over for Ig fra andre arter i mindre grad. Anti-muse- og anti-kanin-ig er blevet affinitetsrenset på en kolonne med hhv. muse- og kanin-ig. Den kombinerede aktivitet er rettet mod primære muse- og kaninantistoffer og omfatter binding både til IgG, alle IgG-underklasser og IgM. HRP på polymeren er fremstillet af HRP med høj specifik aktivitet. Ukonjugerede molekyler er fjernet med gelfiltreringskromatografi. Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med produktets indhold inden brug. De medfølgende reagenser og vejledningen er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af produktets reagenser eller ændring af inkuberingstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige resultater. Alle reagenser skal have stuetemperatur (20 25 C) inden immunofarvningen. Desuden skal alle inkuberinger foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget uspecifik farvning. Tildæk objektglas, som udsættes for træk. Hvis der anvendes lange inkuberingstider, skal vævet anbringes i et fugtigt miljø. Automatiseret Programmér Dako Autostainer / Autostainer Plus-systemet på følgende måde: TRIN 1: Vælg automatisk programmering iht. protokolskabelon. TRIN 2: Anbring reagenserne i instrumentets reagensstativ, og fyld glasballonerne med vaskebuffer og destilleret vand. TRIN 3: Sæt objektglassene i instrumentet. TRIN 4: Start kørslen. TRIN 5: Tag objektglassene ud af instrumentet. Manuel (Se ovenstående liste med kompatible Dako-produkter til hvert trin). TRIN 1: ENDOGEN ENZYMBLOKKER Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud, og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagensen inden for det foreskrevne område. Tilsæt Dual Endogenous Enzyme Block eller Peroxidase Block, så præparatet er dækket. Inkubér i 5 10 minutter ved Dual Endogenous Enzyme Block eller Peroxidase Block, afhængigt af koncentrationen af det endogene enzym i det analyserede væv. Skyl forsigtigt med destilleret vand eller bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at vandet rammer vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer. (118764-002) 306008DK_002 s. 3/5
TRIN 2: PRIMÆRT ANTISTOF ELLER NEGATIV KONTROLREAGENS Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør en tilstrækkelig mængde optimalt fortyndet primært antistof eller negativ kontrolreagens, så præparatet er dækket. Inkubér i 30* (±1) minutter. Skyl forsigtigt med bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at opløsningen rammer vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer i 5 minutter. TRIN 3: ADVANCE TM HRP Link Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Tilsæt ADVANCE TM HRP Link, så præparatet er dækket. Inkubér i 30* (±1) minutter. Skyl som i trin 2. TRIN 4: ADVANCE TM HRP Enzyme Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Tilsæt ADVANCE TM HRP Enzyme, så præparatet er dækket. Inkubér i 30* (±1) minutter. Skyl som i trin 2. TRIN 5: SUBSTRATKROMOGEN Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Tilsæt substratkromogen, så præparatet er dækket. Inkubér i 5 30 minutter (AEC+) eller 5 10 minutter (DAB+). Skyl forsigtigt objektglassene med destilleret vand. Affald fra substratkromogen opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. Anbring de skyllede objektglas i et bad med friskt destilleret vand. TRIN 6: HÆMATOXYLIN-KONTRASTFARVE (valgfri) Nedsænk objektglassene i et hæmatoxylin-bad. Inkuberingstiden afhænger af styrken af den anvendte hæmatoxylin. Skyl objektglassene i et bad med destilleret eller deioniseret vand i 2-5 minutter. * Kortere inkuberingstider anbefales med alternativ fortynding af det primære antistof for at opnå øget gennemløb. De anbefalede inkuberingstider er 30 minutter for at opnå den største sensitivitet. Kvalitetskontrol Forskelle i vævsbehandlingen og de tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover nedenstående procedurer. I kvalitetskontrolvejledningen i College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry og reference 6 til 8 findes der yderligere oplysninger. I specifikationsarket for hvert af de anvendte primære antistoffer findes oplysninger om sensitivitet og immunoreaktivitet. I "General Instructions for Immunohistochemical Staining" ( Generel vejledning til immunohistokemisk farvning ) findes der yderligere oplysninger om positive og negative kontroller. Fortolkning af farvning Generelle begrænsninger I General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Generel vejledning til immunohistokemisk farvning ) findes retningslinjer for fortolkning. I General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Generel vejledning for immunohistokemisk farvning ) findes generelle begrænsninger. Anvendelse af gamle eller ikke-buffered fiksativer eller vævs udsættelse for høj varme (højere end 60 C) under behandlingen kan medføre en reduceret farvningssensitivitet. Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidase-aktivitet kan ses i hæmoproteiner, såsom hæmoglobin, myoglobin, cytokrom og catalase samt i eosinofiler. 9,10 Denne aktivitet kan hæmmes ved inkubering af præparater med Peroxidase Block i 5 minutter eller Dual Endogenous Enzyme Block i 5-10 minutter inden tilsættelse af det primære antistof. Blod- og knoglemarv-smear samt frosne vævsprøver kan ligeledes behandles med denne reagens. Proceduren fjerner imidlertid ikke det rødbrune pigment i hæmoproteiner. Alternativt kan en opløsning af methanol-hydrogenperoxid anvendes. Visse antigener kan blive denatureret med denne procedure. Vævsprøver fra personer, som er inficerede med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), kan udvise uspecifik farvning med peberrodperoxidase. 11 Normalt/ikke-immunt serum fra de samme dyrekilder som det sekundære antiserum, der anvendes i blokeringen, kan medføre fejlagtigt negative eller fejlagtigt positive resultater, der skyldes autoantistoffer eller naturlige antistoffer. Reagenserne i dette sæt leveres i den optimale fortynding. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigendetektion. (118764-002) 306008DK_002 s. 4/5
Fejlfinding Observation Kommentar Signalet er for kraftigt ADVANCE HRP er et yderst følsomt detektionssystem, der giver mulighed for at anvende en større fortynding af de primære antistoffer. Hvis antistofferne ikke fortyndes tilstrækkeligt, bliver signalet for kraftigt. Forbered en serie fortyndinger af det primære antistof, og vælg en fortynding, der ligger på niveauet inden fall-off -punktet. Baggrund på kant Vævet er tørret ud. Ved manuel farvning anbringes objektglassene i et fugtkammer. Baggrund på positive analyser Fortynd det primære antistof yderligere (se Signalet er for kraftigt herover). Baggrund på negative analyser Den negative kontrolreagens koncentration skal svare til koncentrationen af primært antistof med optimal titer. Hvis dette ikke er tilfældet, fortyndes den negative kontrol yderligere. Uspecifik farvning Vask er altafgørende. Hvis en korrekt skylning efterfulgt af 5 minutters inkubering ikke er tilstrækkelig, skal der vaskes to gange á 5 minutter. Intet signal Analysen varer for længe Rækkefølgen for ADVANCE TM HRP Link og ADVANCE TM HRP Enzyme er altafgørende for en reaktion: kontrollér, om den korrekte rækkefølge er anvendt. Det primære antistof var fortyndet for meget. Forbered en serie fortyndinger af antistoffet med henblik på at finde den korrekte fortynding. ADVANCE HRP giver mulighed for enten høj følsomhed eller kortere inkuberingstider eller en kombination heraf. Hvis der generelt ønskes en kortere analysetid, skal det primære antistof være mere koncentreret. Referencer 1. Calkins H, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27:1131 2. Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28:771 3. Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology. Bristol-Wright-PSG 1983; 212 4. Nagle RB, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31:1010 5. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2:161 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilber DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 7. National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 9. Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 10. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1990; 46 11. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 06/10 (118764-002) 306008DK_002 s. 5/5