Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Kode K4002 15 ml Kode K4003 110 ml Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Denne vejledning gælder for Dako EnVision +, Peroxidase (DC EnVision+ System, HRP). Dette kit er beregnet til brug med primære antistoffer fra kanin der leveres af brugeren ved kvalitativ identifikation af antigener med lysmikroskopi i normale og patologiske paraffinindstøbte væv, kryostatvæv eller cellepræparater. Væv der er behandlet med en række forskellige fikseringsmidler inkl. ethanol, B-5, Bouin s, zinkformalin og neutral bufferet formalin, kan anvendes. Der henvises til General Instructions for Immunohistochemical Staining eller detektionssystemets vejledning for IHC-procedurer for så vidt angår: (1) Procedureprincip (2) Nødvendige materialer der ikke medfølger, (3) Opbevaring, (4) Klargøring af prøve, (5) Farvningsprocedure, (6) Kvalitetskontrol, (7) Fejlfinding, (8) Fortolkning af farvningsresultater, (9) Almindelige begrænsninger. Resumé og forklaring Procedureprincip Leveret reagens EnVision+ System, HRP er en to-trins IHC-farvningsteknik. Systemet er baseret på et HRP-mærket polymer som er konjugeret med sekundære antistoffer. Det mærkede polymer indeholder ikke avidin eller biotin. Ikkespecifik farvning fra endogen avidin-biotin-aktivitet i lever, nyre, lymfevæv og kryostatsnit er derfor elimineret eller væsentligt nedsat. Reagensen i EnVision+, HRP er brugsklar. Dette system er en meget følsom metode, og optimale opløsninger af det primære antistof er derfor op til 20 gange højere end de opløsninger der anvendes ved den traditionelle PAP-teknik, og mange gange større end dem der anvendes ved traditionelle ABC- eller LSAB-metoder. Denne protokol har et forbedret signalsystem til påvisning af antigener der er til stede i lave koncentrationer eller til primære antistoffer med lav titer. Primære antistoffer fra kanin reagerer godt med det mærkede polymer. Fortolkning af eventuel positiv farvning eller mangel på samme bør suppleres af morfologiske og histologiske undersøgelser med ordentlige kontroller. Eventuel endogen peroxidaseaktivitet undertrykkes ved inkubation af prøven med en passende endogen blokerende reagens. Prøven inkuberes derefter med et behørigt karakteriseret og fortyndet kanin primært antistof efterfulgt af inkubation med det mærkede polymer, idet der anvendes to sekventielle inkubationer på hver 30 minutter. Det bør bemærkes at ved antistoffer der kræver enzymnedbrydning eller genfinding af target, kan det være nødvendigt at øge inkubationstiderne for det primære antistof og det mærkede polymer med 5 10 minutter. Farvning afsluttes med inkubation i 5 10 minutter med et passende substratkromogen. Kode K4002: Følgende rækker til 150 vævssnit baseret på 100 µl pr. snit. Flaske nr. Mængde Beskrivelse 2 1x15 ml Mærket polymer: Peroxidase-mærket polymer konjugeret til ged anti-kanin immunglobuliner i tris-hcl buffer indeholdende stabiliserende protein og et anti-mikrobielt stof. Flaske nr. Mængde Beskrivelse 1 1x110 ml Mærket polymer: Peroxidase-mærket polymer konjugeret til ged anti-kanin immunglobuliner i tris-hcl buffer indeholdende stabiliserende protein og et anti-mikrobielt stof. Kode K4003: Følgende rækker til 1100 vævssnit baseret på 100 µl pr. snit. (107934-004) 302063DK_003 s. 1/6
Nødvendige materialer der ikke medfølger Absorberende gaze Kontrolvæv, positive og negative Kontrastfarve, vandbaseret, f.eks. Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3309) Dækglas Destilleret vand Endogen peroxidase-blokerende reagens såsom Dual Endogenous Enzyme Block (kode S2003) Ethanol, absolut og 95% Lysmikroskop (20x 800x) Monteringsmidler, f.eks. Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) eller ikke-vandbaseret, permanent monteringsmiddel, Ultramount (kode S1964 Primære antistoffer og negative kontrolreagenser Objektglas, poly-l-lysin-coatede eller Silanized Slides (kode S3003) Farvningsbeholdere eller bade Substratkromogenopløsning, f.eks. AEC+ Substrate-Chromogen (kode K3469, 100 ml brugsklar) eller Liquid DAB+ (kode K3468) Timer (til 3 40 minutters intervaller) Vaskeflasker Vaskebufferopløsning Xylen, toluen eller xylen-substitutter Følgende materialer kan anvendes, men medfølger ikke Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l PAP-pen (kode S2002). Forholdsregler Opbevaring 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Reagenser må ikke anvendes efter den udløbsdato der er angivet for den foreskrevne opbevaringsmetode. Reagenser der opbevares under andre betingelser end dem der er angivet på indlægssedlen, skal godkendes af brugeren. 3. Der må ikke anvendes reagenser fra andre lotnumre eller fra andre producenters kits. 4. Enzymer og substratkromogener kan blive forringet ved udsættelse for stærkt lys. Opbevar ikke kittets dele og udfør ikke farvning i stærkt lys, f.eks. direkte sollys. 5. Inkubationstider eller -temperaturer der afviger fra de angivne, kan give fejlagtige resultater. Sådanne ændringer skal godkendes af brugeren. 6. Som med alle produkter afledt fra biologiske kilder bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 7. Der skal bæres personligt beskyttelsesudstyr så kontakt med øjne og hud undgås. 8. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokale og nationale bestemmelser. EnVision+, HRP skal opbevares ved 2 8 C. Må ikke fr yses. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen der er trykt på reagensglas og produktmærkat. Ændringer i udseendet på en reagens, f.eks. bundfald, kan være et tegn på at reagensen er ustabil eller forringet. I sådanne tilfælde må reagensen (-erne) ikke anvendes. Der er ingen synlige tegn på at disse produkter kan være ustabile. Positive og negative kontroller bør derfor testes samtidig med patientprøverne. Kontakt Dako s tekniske service hvis der observeres uventet farvning som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med kittet. (107934-004) 302063DK_003 s. 2/6
Klargøring af reagens Det er praktisk at fremstille følgende reagenser før farvning: Vaskebufferopløsning TBST, 0,05 mol/l tris-bufferet saltvand med Tween (kode S3006) anbefales som vaskebuffer ved automatisk og manuel IHC-påvisning. TBS, 0,05 mol/l tris-bufferet saltvand (kode S1968) og PBS, 0,02 mol/l fosfatbufferet saltvand (kode S3024) er også velegnede vaskeopløsninger ved manuel farvning. Vaskebufferopløsninger der indeholder natiriumazid kan ikke anbefales. Natriumazid inaktiverer peroxidase fra peberrod (HRP) med negativ farvning som resultat. Ubrugt buffer opbevares ved 2 8 C. Uklar buffer bør kasseres. Der kan anvendes destilleret vand til at skylle peroxidaseblokker, substrat og kontrastfarve. Primært antistof Brugsklare antistoffer i NP-series Plus er optimerede og anbefales til brug med Dako Plus højfølsomme detektionssystemer. Koncentrerede antistoffer kan også rekvireres fra Dako. Optimering af koncentrerede antistoffer skal udføres af slutbrugeren. Fortyndinger bør fremstilles med Antibody Diluent (kode S0809) eller en diluent der indeholder 0,05 mol/l tris-hcl-buffer med 1% kvægserumalbumin (BSA). Dako s N-series brugsklare antistoffer er ikke optimeret til brug med Dako Plus detektionssystemer. En inkubationstid på 30 minutter er tilstrækkelig til de fleste primære antistoffer der anvendes med dette kit. Negativ kontrolreagent Ideelt set skal en negativ kontrolreagens helst indeholde et antistof der ikke udviser specifik reaktivitet med humant væv eller normal/ikke-immun serum i samme matrix/opløsning som det fortyndede primære antistof. Den negative kontrolreagens bør tilhøre samme underklasse og dyreart som det primære antistof, fortyndet til samme immunglobulin- eller proteinkoncentration som det fortyndede antistof og under anvendelse af samme diluent. Inkubationstiden for den negative kontrolreagens bør være den samme som for det primære antistof. Universal Negative Control+ optimeret for brug med kanin (kode NP001) NP-Series Plus brugsklare antistoffer anbefales som negativ kontrolreagens ved brug af Dako NP-Series Plus brugsklare antistoffer. Der henvises til afsnittet Kvalitetskontrol for mere detaljerede oplysninger om klargøring af negative kontrolreagenser. Kontrastfarvning Det farvede slutprodukt af farvereaktionen er uopløseligt i alkohol og kan anvendes med alkohol- eller vandbaserede kontrastfarver, f.eks. Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3309). Efter kontrastfarvning med hæmatoxylin skylles objektglassene grundigt med destilleret vand, hvorefter de nedsænkes i et bad af 0,037 mol/l ammoniak eller lignende blåfarvningsmiddel. 0,037 mol/l ammoniakvand fremstilles ved at blande 2,5 ml af 15mol/L (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter vand. Ubrugt 0,037 mol/l ammonium er holdbar i op til 12 måneder ved opbevaring i stuetemperatur (20 25 C) i en godt tillukket flaske. Se producentens vejledning for alternative kontrastfarvningsprocedurer. Monteringsmidler Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) anbefales som vandbaserede monteringsmidler. Glycergel skal opvarmes til mindst 50ºC umiddelbart før brug. Ikke-vandbaseret, permanent monteringsmiddel (Ultramount, kode S1964) kan også anvendes. Klargøring af prøve Der henvises til General Instructions for Immunohistochemical Staining og/eller antistof-specifikationsarket. Før immunhistokemisk farvning skal vævene fikseres og bearbejdes. Fiksering forhindrer autolyse og forrådnelse af udskårne væv, bevarer antigeniciteten, fremmer vævsbestanddelenes refraktive indeks og øger celleelementers modstand mod vævsbearbejdning. Vævsbearbejdning omfatter dehydrering, fjernelse af dehydreringsmidler, infiltrering med indstøbningsmidlet, indstøbning og udskæring af væv. De mest almindelige fikseringsmidler til immunhistokemiske vævspræparater beskrives i General Instructions for Immunohistochemical Staining. De nævnte instruktioner er kun vejledende. Brugeren skal selv bestemme og bekræfte bedst mulig procedure. (107934-004) 302063DK_003 s. 3/6
Farvningsprocedure Kommentarer til proceduren Brugeren bør læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig bekendt med produktet før det anvendes. Reagenserne og den medfølgende vejledning er beregnet på optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagensen eller ændring af inkubationstider eller temperaturer kan medføre fejlagtige resultater. Alle reagenser skal opnå stuetemperatur (20 25 C) før immunfarvning. Alle inkubationer skal ligeledes udføres ved stuetemperatur. Sørg for at vævssnit ikke tørrer ud under farvningsproceduren. Tørre vævssnit kan udvise mere ikke-specifik farvning. Objektglas der kan blive udsat for træk, skal tildækkes. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævene anbringes i et fugtigt miljø. EnVision+ System, HRP s følsomhed kan øges yderligere ved at forlænge inkubationstiderne d trin 2 og 3 med 5-10 minutter. Farvningsprotokol TRIN 1 PEROXIDASEBLOKKER Overskydende buffer bankes af. Tør forsigtigt omkring prøven med en fnugfri serviet (f.eks. Kimwipe eller et stykke gaze) så overskydende væske fjernes og det sikres at reagensen forbliver i det foreskrevne område. Tilsæt tilstrækkelig Peroxidase Block fra Flaske 1 til at dække prøven. Inkubér i 5 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret vand eller bufferopløsning fra en vaskeflaske (sørg for ikke at rette væsken direkte mod vævet), og anbring prøven i et friskt bufferbad. TRIN 2 PRIMÆRT ANTISTOF ELLER NEGATIV KONTROLREAGENS Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene af som før. Tilsæt tilstrækkelig optimalt fortyndet primært antistof eller negativ kontrolreagens til at dække prøven. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med bufferopløsning fra en vaskeflaske (sørg for ikke at rette væsken direkte mod vævet), og anbring objektglassene i et friskt bufferbad. Hvis det bliver nødvendigt at afbryde farvningsproceduren, kan objektglas opbevares i et bufferbad efter inkubation af det primære antistof (trin 2) i op til en time ved stuetemperatur (20 25 C) uden at det påvirker resultatet. TRIN 3 TRIN 4 TRIN 5 TRIN 6 PEROXIDASE-MÆRKET POLYMER Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene af som før. Tilsæt tilstrækkelig Labelled Polymer fra Flaske 2 til at dække prøven. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl objektglassene som i trin 2. SUBSTRATKROMOGEN Tør objektglassene af som før. Tilsæt tilstrækkelig substratkromogenopløsning til at dække prøven Inkubér i 5 10 minutter. Skyl forsigtigt med destilleret vand fra en vaskeflaske (sørg for ikke at rette væsken direkte mod vævet). Substratkromogenopløsning skal indsamles i en beholder til farligt affald og bortskaffes korrekt. HÆMATOXYLIN KONTRASTFARVNING (valgfri) Objektglassene nedsænkes i et bad af vandigt hæmatoxylin (kode S3309. Inkubationstidens længde afhænger af styrken på det anvendte hæmatoxylin. Skyl forsigtigt i et bad af destilleret vand. Dyp objektglassene 10 gange i et bad af 0,037 mol/l ammoniak eller lignende blåfarvningsmiddel. Skyl objektglassene i et bad af destilleret eller deioniseret vand i 2 5 minutter. MONTERING Prøver kan monteres og dækkes med dækglas ved hjælp af et vandbaseret monteringsmiddel f.eks. Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount (kode S3025) eller et ikkevandbaseret permanent monteringsmiddel, Ultramount (kode S1964) Objektglas kan også dehydreres og monteres permanent. Kvalitetskontrol Forskelle i bearbejdning af vævsprøver og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan medføre betydelige udsving i resultaterne og nødvendiggøre regelmæssige interne kontroller. Se vejledningen for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry og referencerne 1 3 for yderligere oplysninger. Se de enkelte specifikationsark for de anvendte primære antistoffer for oplysninger om følsomhed og immunreaktivitet. Se General Instructions for Immunohistochemical Staining for yderligere oplysninger om positive og negative kontroller. (107934-004) 302063DK_003 s. 4/6
Fortolkning af farvningsresultat Produkt-specifikke begrænsninger Se General Instructions for Immunohistochemical Staining for fortolkningsvejledning. Vævsfarvning kræver at vævet er blevet håndteret og behandlet korrekt før farvning. Forkert fiksering, frysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, udskæring eller kontamination med andre væv eller væsker kan give artefakter, optagelse af antistoffer eller falskt negative resultater. Brug af gamle fikseringsmidler eller fikseringsmidler der ikke er tilsat buffer kan mindske farvefølsomheden. Det samme gælder hvis vævene udsættes for høj varme (temperaturer over 60 C) under bearbejdning. Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidaseaktivitet kan observeres i hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin, cytochrom, katalase samt eosinofiler. 4,5 Denne aktivitet kan hæmmes ved inkubation af prøver med peroxidaseblokker i 5 minutter før tilsætning af det primære antistof. Blod- og knoglemarvsudstrygninger og frosne væv kan også behandles med denne reagens. Denne procedure fjerner imidlertid ikke det rødbrune pigment fra hæmoproteiner. Alternativt kan man anvende en opløsning af methanol-hydrogenperoxid. Visse antigener kan blive denatureret som følge af denne procedure. Væv fra personer inficeret med hepatitis B-virus som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg) kan udvise ikke-specifik farvning med peroxidase fra peberrod. 6 Normale/ikke-immune sera fra samme dyreart som de sekundære antisera der anvendes i blokeringstrin kan give falskt negative eller falskt positive resultater pga. autoantistoffer eller naturlige antistoffer. De reagenser der følger med dette kit er blevet fortyndet optimalt. Yderligere fortynding kan forringe antigen-påvisningen. Fejlfinding Problem Mulig årsag Løsningsforslag 1. Ingen objektglas blev farvet. 2. Svag farvning af alle objektglas. 3. For høj baggrundsfarvning på alle objektglas. 1a. Reagenser brugt i forkert rækkefølge. 1b. Natriumazid i bufferbad. 2a. Snit indeholder for meget opløsning efter vaskebad. 2b. Objektglas ikke inkuberet længe nok med antistoffer eller substratblanding. 3a. Prøverne indeholder høj endogen peroxidaseaktivitet. 3b. Paraffin ikke fjernet fuldstændigt. 3c. Objektglas ikke skyllet ordentligt. 3d. Hurtigere end normal substratreaktion pga. for høj rumtemperatur. 3e. Vævssnittene tørrede ud under farvning. 3f. Ikke-specifik binding af reagenser til vævssnit. 3g. Antistoffet er for koncentreret. 1a. Tjek anvendelse af reagenser. 1b. Brug frisk, azidfri buffer 2a. Bank forsigtigt overskydende opløsning af før der tørres omkring snittet. 2b. Tjek anbefalede inkubationstider. 3a. Brug længere inkubationstid for peroxidaseblokkeren, Flaske 1. 3b. Brug friske xylen- eller toluenbade. Hvis flere objektglas farves samtidig, bør det andet xylenbad indeholde frisk xylen. 3c. Brug friske opløsninger i bufferbade og vaskeflasker. Prøv i stedet at bruge TBST 0,05 mol/l trisbuffer indeholdende 0,3 mol/lnacl og 0,1% Tween (kode S3306). 3d. Brug kortere inkubationstid med substratkromogenopløsning. 3e. Brug fugtighedskammer. Tør kun 3 4 objektglas af ad gangen før tilsætning af reagens. 3f. Tilsæt en blokerende opløsning der indeholder et irrelevant protein. 3g. Se højere fortynding af det primære antistof. BEMÆRK: Hvis problemet ikke skyldes en af ovennævnte årsager, eller hvis den foreslåede løsning ikke løser problemet, bedes De ringe til Dako s tekniske service for yderligere assistance. Yderligere oplysninger om farveteknikker og klargøring af prøver findes i Handbook Immunochemical Staining Methods 7 (kan rekvireres fra Dako), Atlas of Immunohistology 8 og Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 9 (107934-004) 302063DK_003 s. 5/6
Referencer 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 4. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 5. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 6. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 7. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 8. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 9. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Yderligere referencer Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 11/12 (107934-004) 302063DK_003 s. 6/6