Hætten af på Underfyldte glas Decappitaded underfilled Bloodsamples

2014 Hætten af på Underfyldte glas Decappitaded underfilled Bloodsamples Martin Gade Bagger Studie nr. BA11s143 Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr. 1519 af 16/12/2013 kap. 5, 19 Dato: 12-06-2014 Vejleder Ninna Ryssel Mink Pia Christensen Fredericia Sygehus University College Syddanmark Antal anslag: 48749

Indholdsfortegnelse Forord... 4 Abstrakt... 5 INDLEDNING... 6 Baggrund... 6 Formål... 7 Problemformulering... 8 TEORI... 8 Udredning... 8 Referenceintervaller... 9 Hæmolyse indvirkning på analysesvar... 9 Analyseapparaternes metoder... 12 SYSMEX... 13 MODULAR... 14 ABL... 16 MATERIALE & METODER... 16 Design... 16 Materiale... 16 Dataindsamling... 17 Inklusionskriterier... 18 Eksklusionskriterier:... 18 Delforsøg 1... 19 Delforsøg 2... 19 Delforsøg 3... 20 ETIK... 20 LITTERATURSØGNING... 21 2

DATABEHANDLING OG STATISTIK... 21 RESULTATER... 23 Delforsøg 1... 23 Delforsøg 2... 26 Delforsøg 3... 28 DISKUSSION... 29 KONKLUSION... 32 LITTERATURLISTE... 33 Bilag.1... 35 Rådata - SYSMEX... 35 Bilag.2... 37 Rådata - MODULAR... 37 Bilag 3... 39 Rådata ABL... 39 3

Forord I nærværende afhandling har jeg været beskæftiget med emnet Hætten af på Underfyldte glas? Decappitaded underfilled Bloodsamples? Afhandlingen er et resultat af et meget spændende og lærerigt forløb, og en afslutning på et bachelor studie. Gennem udarbejdelse af afhandlingen, har jeg benyttet mig af flere personer, som jeg skynder en særlig tak. En særlig tak rettes til min vejledere Ninna Ryssel Mink og Pia Christensen for god vejledning og hjælp til udarbejdelsen af afhandlingen. Der rettes også en stor tak til Sygehus Lillebælt, Fredericia for godt samarbejde og hjælp til udtagning og analyse af blodprøverne. Til sidst vil jeg også rette en stor tak til de patienter, der deltog i min undersøgelse. Ydermere vil jeg gerne komme med en tak min far Børge Bagger for støtte gennem forløbet og ikke mindst min kone Satsuki Kato, for at holde mig oppe. Martin Bagger (studienr. BA11s143) December, 2014. 4

Abstrakt Baggrund: Nye vejledende prøvetagningsprocedurer blev i 2014 fremsat af producenten bag prøvetagningsremedier, BD Vacutainer, hvor det blev anbefalet ikke at trykudligne underfyldte prøveglas. Underfyldning bør undgås, men dette er ikke altid muligt at opnå i praksis. I dette projekt blev der undersøgt, om udvalgte analyseresultater bliver påvirket, når svarene fra underfyldte trykudlignet prøveglas, sammenlignes med svarene fra underfyldte ikke trykudlignet prøveglas. Desuden blev der undersøgt, om analysesvaret for et halvt ikke trykudlignet prøveglas vil være påvirket i forhold til analysesvaret for et glas, der er helt fyldt. Metode: Indsamling af analysematerialet er sket på Fredericia Sygehus, i perioden d. 3. oktober 2014 til d. 19. november 2014. På patienter blev der, ud over den rekvirerede prøve der blev fyldt helt, udtaget 2 ekstra underfyldte glas. Her blev kun det ene trykudlignet. Disse analyseresultater blev parret og ved probit plot fundet normalfordelt. En parret t test blev brugt til afklaring af om der var signifikant afvigelse på resultaterne. Resultater: Der blev fundet signifikant afvigelse på WBC, RBC, HGB, Kalium og Natrium imellem de rekvirerede prøver og de ikke trykudlignede underfyldte glas. Kun LD havde signifikant afvigelse mellem prøveglassenes analyseresultater imellem de underfyldte glas. Konklusion: Der kan konkluderes, at underfyldte glas fortsat bør undgås, men hvis der opsamles et underfyldt glas, vil det ikke give signifikant afvigelse på analyseresultatet, om der trykudlignes eller ej. Kun analyseparameteret LD for underfyldte glas viste signifikant afvigelse. Denne parameter burde dog være undersøgt med større data. 5

INDLEDNING Baggrund Blodets og kredsløbets hovedopgave er at sikre hurtig stof- og varmetransport mellem dele af kroppen. En anden vigtig opgave er at bidrage til, at kroppens celler til enhver tid er omgivet af væske. Blodets hovedopgave er at fungere som et transportsystem, der forsyner hele kroppen med energi, byggesten samt hormoner der styrer forskellige processer i målcellerne. Som et af de forsynende organer i kroppen og ved dets udstrækning og det at det har forbindelse til hele kroppen, er en prøve i form af en blodprøve et godt diagnostiskt redskab. Dette skal forståes ud fra det at blodbanen er defineret som et lukket system, vil der ved tegn på infektion eller anden abnormal tilstand i kroppen, vil kendskab til prøvens komponentsammensætning kunne bruges til at udrede patienter. Blodprøver bruges til et utal af formål og er et godt redskab til diagnosticering af patienter, for hvem en blodprøve kan bruges til at give vigtig information om patientens kliniske tilstand. (1) Blodet består af hovedsageligt af blodlegemerne erytrocytter(rødeblodlegemer), de hvide blodlegemer blodlegemer(leukocytter) og blodpladerne(trombocytter). Plasmaet indeholder de her beskrevne blodkomponenter, hvor plasmaet i sig selv hovedsageligt består af 92 % vand og en proteinkoncentration på 7 %. Plasmaet er fyldt af mindre molekyler i form af næringssalte, glukose, enzymer, proteiner og koagulationsfaktorer. Plasmaet udgør størstedelen af blodet, hvor erytrocytterne har en overvægtning af blodkomponenterne på ca.45 % i en blodprøve. Antallet af erytrocytter er lige så stort som det samlede antal af alle andre celletyper i organismen. Deres funktion er at transportere ilt og kuldioxid rundt i kroppen, og kaldes det røde blodlegeme, ud fra dets farve fra hæmoglobinet. Molekylet hæmoglobin er bestående af en globin del, der er bygget af 4 polypeptider, der er parvist ens. Til hver polypeptidkæde er der knyttet en hæmgruppe med et jernatom i midten. Produktionen af erytrocytter samt leukocytter sker for de voksne personer begge i knoglemarven. De er nøje tilpasset intervaller for, hvad normalværdien af komponenterne er i kroppen, der senere i denne afhandling vil blive defineret under referenceintervaller. Disse intervaller er med til udredning, da disse intervaller afspejler symptomer i kroppen i form af forhøjede eller lave værdier. Ved en infektion, vil antallet af leukocytter i blodet stige, hvor de er blevet rekrutteret til det inficerede sted. Alt efter om koagulationsfaktorer er bevaret i en blodprøve, eller om de er brugt, hedder det henholdsvist plasma eller serum. Serum er her blodets væske, hvor koagulationsfaktorerne er opbrugt. Blodprøver er fx med til at fortælle noget om patienternes 6

generelle helbredsmæssige tilstand, evaluere organernes funktion, måle balancen af elektrolytter og måle glukoseniveauet i blodet (1). Formålet med en blodprøve er at undersøge indholdet af et eller flere komponenter i patientens blod. Blodet kan undersøges for dets bestanddele, så man opnår viden om det enkelte komponenters antal. Det er derfor afgørende, at den udtagne prøve er repræsentativ for personens in-vivosituation. For at sikre ovenstående har Fredericia Sygehus (FS), bl.a. fremsat retningslinier for blodprøvetagninger 2, hvor der ud over en standardiseret tilgangsvinkel sikres høj kvalitet af blodprøven, indgår anvisning om at udligne tryk ved prøveglas, der bliver underfyldt. Desuden er der retningslinier for forebyggelse af hæmolysedannelse ved trykudligning af underfyldte glas. 2 På FS anses dette netop som en bedste måde at forebygge dannelsen af hæmolyse. Producenten af prøvetagningsglas BD-Vacutainer har, efter et for nyligt udført forsøg 3, fremsat nye anbefalinger for blodprøvetagning, hvor der i tilfælde ved for lidt opsamlet prøvemateriale, ikke længere anbefales at trykudligne prøveglasset. Deres forsøg viste, at der var større tendens for dannelse af hæmolyse i trykudlignede glas, sammenlignet med ikke trykudlignede glas. Her må producentens anbefalinger tolkes, som meget modstridende med retningslinjerne på FS. Denne uoverensstemmelse kunne skyldes, at producenten har udviklet nye tiltag for deres produkter, hvilket har indflydelse på, om trykudligning fortsat er nødvendig. Blodprøvens kvalitet har en stor betydning for det endelige analysesvar. Ved udtalt hæmolyse vil prøven ikke længere være in vivo repræsentativ, og det vil være nødvendigt at bestille en ny prøve, som kan være til stor gene for patienten. 4 Hvis trykudligning ikke længere er et nødvendigt tiltag, men derimod en faktor som øger hæmolysedannelsen, vil det være en stor lettelse for arbejdsgangen, hvis trykudligning kan undgås. Desuden vil det mindske kontamineringsfaktorer og smitteveje. Formål Formålet med denne afhandling er at belyse, om FS har en velbegrundet grund til at fravælge at trykudligne underfyldte prøvetagningsglas, hvilket kan føre til lettere arbejdsgang samt mindske 7

kontaminering, eller om nuværende retningslinier fortsat er den bedste måde at sikre kvaliteten af blodprøver. Der forsøges så vidt muligt altid at opnå et helt fyldt glas; men hverdagsbilledet kan se anderledes ud, hvor prøveglas bliver underfyldte på grund af problematisk prøvetagning. Problemformulering Hvordan vil resultaterne for følgende analyser: - Hæmolyse - Hæmoglobin - Leukocytter - Trombocytter - Laktatdehydrogenase (LD) - Kalium - Erytrocytter - Ioniseret calcium blive påvirket, når svarene fra underfyldte trykudlignet prøveglas, sammenlignes med svarene fra underfyldte ikke trykudlignet prøveglas. Hvordan vil analysesvaret for et halvt ikke trykudlignet prøveglas være påvirket i forhold til analysesvaret for et glas, der er helt fyldt? TEORI Der tages hver dag talrige blodprøver ved venepunktur på landets sygehuse og i almen praksis. Undersøgelser af disse blodprøver spiller en vigtig rolle for korrekt diagnose og behandling af patienter. Ikke sjældent udbedes en akut analyse af visse blodprøver på grund af, at disse vurderes værende livsnødvendige. Derfor er det nødvendigt at blodprøverne er taget korrekte og bliver analyseret korrekt. Udredning Analyser bygger på teori om cellestørrelser, opbygning, fysiologi samt kemi. Alt dette bliver sat sammen for at forskellige analyseapparater vil være i stand til at give et svar. Disse svar er dog nødvendige, da de skal kunne bruges i samspil med en klinisk vurdering. 8

Til at vurdere analysesvaret sammenlignes svaret med normalområdet, som også kaldes referenceintervallet. 5 Referenceintervallet er det område hvor hovedparten af en rask befolkning befinder sig i. Når et analysesvar afviger fra dette referenceinterval, tilskrives værdien en abnormal status, dette er dog ikke altid gældende. Referenceintervaller Forskellige teknikker og biologiske forhold kan bevirke, at der er naturligt forekommende afvigelser fra et gældende referenceinterval. I hverdagspraksis er anamnesen, samt den kliniske undersøgelse af patienten af stor betydning for lægen for at komme frem til den korrekte diagnose. Laboratoriemedicinske tjenester har dog en stigende betydning. Vurderingen af et laboratorieresultat er i høj grad afhængigt af det kliniske skøn. Den målte værdi, har på grund af de naturligt forekommende afvigelser, ikke samme betydning for alle. 5 Ved opnåelse af et referenceinterval, er der brugt en forsøgsgruppe bestående af personer, som ikke har nogen defineret sygdom, der vil kunne influere på det gældende parameter, der analyseres for. Af de værdier der er fremkommet, er der defineret et 95 % referenceinterval. Dette dækker over 95 % af de analyseredes værdier, minus de øverste og laveste 2,5 %. Ved at blive vurderet i dette interval, er der 95 % sandsynlighed for, at patienten er rask. Patienten kan dog stadig være rask, uden at ligge inden for dette interval, hvis den pågældende persons værdi befinder sig i de 5 % af værdierne, som er trukket fra. Dette interval bruges til at vurdere abnormale analyseresultater, og er fastsat ved inddragelse af såvel analytisk-, præanalytisk-, interindividuel- samt intraindviduel biologisk variatio. 5 Hæmolyse indvirkning på analysesvar Erytropoiesen finder sted i knoglemarven og reguleres af et glykoprotein, erytropoietin. De nydannede celler kaldes retikulocytter, som er runde med uregelmæssig membran og indeholder kernerester. De forlader knoglemarven efter to dage og bliver så til erytrocytter. Erytrocytter er kerneløse celler i blodet, der indeholder det iltbindende hæmoglobin. Det er jernindholdet, som giver blodet dets røde farve. Erytrocytten er bikonkav, og cellemembranen er meget elastisk. Den elastiske cellemembran bevirker, at den kan skifte form. Erytrocytterne lever i 120 dage og transporterer ilt og kuldioxid rundt i blodet. 1 Blodets indehold af erytrocytter er ca. 5 x 10 12 /l. 6 9

Ordet hæmolyse er en sammensætning af de latinske ord hemo, der betyder blod, og lysis som betyder sprængning. 7 Dvs. der sker ødelæggelsen af cellemembranen og frigivelse af intracellulære komponenter fra erytrocytterne, herunder hæmoglobin. Der sker således en frigivelse ud i det omliggende plasma. Ved ordet hæmolyse forstås der således en nedbrydning af erytrocytterne. Den øvre grænse for fri hæmoglobin i plasma er 20 mg/l, mens den øvre grænse i serum er 50 mg/l. Man taler om synlig hæmolyse, når der er mere end 0,3 g/l fri hæmoglobin (8) Hæmolyse kan skyldes forskellige årsager, men i denne afhandling vil der være fokus på hæmolyse i forbindelse med prøvetagningen. I forbindelse med prøvetagning kan der opstå flere fejl i forløbet. Årsager til forringelse af blodprøvens kvalitet, der er forbundet med blodprøvetagningen, kan være: 1) Valg af forkert kanylestørrelse. Dette er beskrevet Arndt al (9)., hvis studie blandt andet peger på, at hæmolysedannelse påvirkes af nålens størrelse. 2) Skrøbelige vener: Ved brist af vene, kan koagulation have indflydelse på graden af udvikling af hæmolyse (8). Nedbrydelse af celler fører til frigivelse af interacellulære komponenter. 3) Traumatisk blodprøvetagning 8. At have haft en stase til at lukke kredsløbet lokalt i for lang tid, vil have kraftig indvirkning på bl.a. koncentrationen af ioner, især kalium. 4) Underfyldte glas anses som en anden årsag til dannelse af hæmolyse (2), set ud fra at erytrocytter er påvirkelige af osmotiske kræfter, og ved vedvarende undertryk i et prøveglas, vil det blandt andet lede til frigivelse af frit hæmoglobin (10). Dette sker ved at erytrocytten kan opnå en pigget yderside, der til dels bliver permeabel. 5) Tidsintervallet fra prøvetagning til analysen har en betydning for hæmolysen. Dette er blandt andet påvist ved et forsøg udført af Arndt (9) og Boyanton et al. (11) Tidsintervallet er også beskrevet ved Boink et al 12, hvor tiden fra prøvetagning til selve præbehandlingen bør være sket inden 1 time. I dette tilfælde en separation ved centrifugering. Dette skrevet ud fra PH afhængige prøver som ioniseret calcium prøver, der vil få et påvirket ph niveau. Derfor vil det være vigtigt at prøven holdes i en given ph opløsning, hvor trykudligning er en faktor der bør undlades. Trykudligning vil være det samme som at tilføre frisk ilt til prøven, hvorved dens ph-niveau ændres. Hvis der tilføres tilstrækkeligt ilt til prøven, kan ph værdien ændres så meget, at der ikke længere kan foretages en ph korrigeret bestemmelse af prøvens analyt. Ud fra ovenstående punkter kan man se, at flere forskere og producenten BD Vacutainer, har forsøgt at finde løsninger på de faktorer, der er årsag til in vitro hæmolyse. 10

Hæmolyse påvirker analyseresultaterne på tre forskellige måder. 1) Frigivelse af celle-indholdet til plasma (2) Således vil en frigivelse af fx kalium til plasma give et falsk forhøjet analysesvar i forhold til det reale kalium i patienten. 2) Spektral interferens (8) : I forbindelse med hæmolyse frigives hæmoglobin direkte til plasmaet, hvor det direkte interfererer med målingen. Der måles på samme bølgelængde, som hæmoglobin har absorptionsoptimum ved. 3) Indirekte interferens (8) : Erytrocytterne indeholder mange enzymer mm. Disse stoffer kan gå direkte ind og reagere med selve reagenset, der benyttes ved analyser. En ønsket virkning bliver ændret, hæmmet eller helt udebliver. Hæmolyse bevirker, at værdien af en række komponenter falder, hvor andre stiger. Lippi et al. (8) og Yucel et al 13 fremlægger, at der ved hæmolyse sker en underestimering af natrium, mens der sker en overestimering af kalium. Normalværdien for kalium ligger meget stramt mellem 3,5-4,4 mmol/l for voksne. Faregrænsen for voksne er allerede defineret ved < 3,0, >6,0 mmol/l. 5 Såvel hyperkaliæmi som hypokaliæmi er yderst farlige og kan medføre arytmier, der i værste fald kan føre til hjertestop. En forkert værdi af kalium i en blodprøve kan derfor have fatale konsekvenser for patienten. Det er en velkendt fejlkilde i hverdagens praksis, at analyseresultater kan blive fejlfortolket pga. hæmolyse. Disse reaktioner kan i betydelig grad påvirke mange biokemiske analyser. Dette er blevet beskrevet værende gældende for bl.a. plasma laktatdehydrogenase (LD) og plasma kalium, der begge påvirkes i positiv retning(8,14) Koseoglu et al (14). har udgivet en artikel som undersøger hæmolyse in vitro. Forsøget blev udført på 16 raske frivillige deltagere. Der blev taget en venøs blodprøve, hvor man brugte (VACUETTE, Greiner Labortechnik, Tyskland). Der blev taget flere glas, hvor graden af den mekaniske påvirkning var forskellig. Der blev set på en række komponenter, hvor der bl.a. indgik plasma koncentration for LD samt kalium. Det interessante var, at parametrene LD og kalium, var de mest påvirkelige af hæmolyse. Dette har bl.a. været en af grundene til de udvælgelser af komponenter, som jeg foretog. Hvis der var målbare sammenhæng mellem hæmolyse, og de analysesvar der blev fundet, skulle der i følge Koseoglu et al. (14) være de mest målbare ændringer for disse to parametre, LD og Kalium. 11

Af ovenstående fremgår det, at hæmolyse har stor indflydelse på det endelige analyseresultat, som laboratoriet videregiver til den behandlende læge. Dermed har hæmolyse også en konsekvens for patienten. Ofte kræves der en ny blodprøve, som medfører smerte for patienten. Ikke mindst forsinker det igangsættelsen af relevant behandling og oftest en forlængelse af indlæggelsen. De foregående punkter er derfor meget beskrivende for, hvorfor en korrekt blodprøvetagning er afgørende for et korrekt analyseresultat. Ud fra Koseoglu et al. (14), er det beskrevet, hvorledes hæmolyse har større indvirkning på nogle parametre end andre. Nogle prøver bør derfor ikke altid afvises, på trods af en visuel identifikation af hæmolyse. På den anden side så kan en ikke-visuel (usynlig) hæmolyse have en betydning på det endelige prøveresultat. Derfor er en standardiseret måling af et parameter et ønsket tiltag for at komme hæmolyserede prøver i forkøbet. Ved at have en standardiserede måde at afklare hæmolysens grad, allerede på et præanalytisk niveau, vil det være muligt at komme hæmolyserede prøver i forkøbet, så analyser ikke bør køres om, eller i værste fald at skulle tage en ny prøve. Måling af hæmolyse indeks sker allerede på FS, der er med til at afgøre, om et analyseresultat er for påvirket af hæmolyse (15). For analyseaparaterne MODULAR og ABL, der er blevet benyttet i denne afhandling, bestemmes hæmolyse på hver deres måde. Ved ABL er der en visuel bestemmelse af den ansvarlige bioanalytiker, der selv tager stilling til graden af hæmolyse, ud fra tre forskellige grader af hæmolyse: let, moderat eller udpræget hæmolyse. Dette ses på et billede, hvor de 3 grader er vist. For prøver på MODULAR, sker der en kvantitativ bestemmelse ved måling. Dette er herved ikke en subjektiv vurdering af de enkelte. Analyseapparaternes metoder Analyseapparater, der blev benyttet i dette projekt, var SYSMIX, MODULAR samt ABL. Analyseapparatet, der blev benyttet til at måle værdierne for leukocytter, erytrocytter, hæmoglobinniveau samt trombocytter, var SYSMEX. Hæmoglobinniveau blev målt som koncentration i mmol/l, ved hjælp af fotometri. Erytrocytter og trombocytter blev målt som antalskoncentration i antal/l, ved hjælp af ledningsprincip. Leukocytter blev ligeledes målt i antal/l, dette ved flowcytometri. 12

Det analyseapparat, der blev brugt til at måle kalium, natrium, laktatdehydroginase samt hæmolysegraden, var MODULAR. Kalium og natrium blev målt i koncentrationen mmol/l ved hjælp af potentiometri. Dette skete efter en fortyndingsfaktor på 1:31. Laktatdehydrogenase blev målt ved fotometri som enzymaktivitet i units/l. Hæmolyseindeks måles ligeledes ved fotometri. Ionisered calcium blev bestemt på analyseapparatet ABL. Dette måler i mmol/l ved potentiometri. Disse målinger er desuden ph korrigeret. De 3 ovenstående analyseapparater vil blive nærmere præsenteret nedenunder. SYSMEX (16) Et apparat der måler hæmatologiske værdier, som er analyser inden for det lægefaglige speciale, der beskæftiger sig med blodet og dets sygdomme. Her vil de forskellige celler i blodet blive bestemt, både i antalskoncentrationer samt disses størrelser. Desuden kan blodprocenten også blive bestemt ved dette apparatur. Dette apparat består af 3 hoveddele: Prøverne sættes i racks. Efter påsættelse føres racksne automatisk til opsugning position. Et afpasset volumen prøvemateriale suges op og sendes til den del af analyseaparatet, der udfører de mulige analyser. Ved afsluttet analyse sendes racket ud til et aftagningsbord. Der kan vælges imellem forskellige analysepakker, alt efter hvor omfattende udredning der er for den enkelte blodprøve. Ved dagligt brug af analyseapparatet køres alt automatiseret, således at eneste manuelle tiltag er påsætning og aftagning af prøvemateriale. Ellers gå alt pr. automatik, hvor fremføring og tilstrækkelig opblanding inden analyse sker standardiseret. Ud fra hver prøves barcode vil der automatisk indhentes informationer omkring hvilke analyser, der skal udføres for pågældende prøve. Dette sker ud fra bcc, det overordnede computersystem for alle de blodprøver, der skal og er taget. Alle prøver, der skal analyseres, indgår i analyseprofiler opsat på SYSMEX. Når en analyse er bestilt, analyseres denne samt de andre analyser der er i den gældende profil. Resultaterne visualiseres til slut ved et display på IPU-skærmen. Prøver kan også analyseres ved manuel metode, hvilket benyttes i praksis når prøvevolumen er kritisk lav, eller når andet prøvemateriale afviger fra EDTA fuldblod. På SYSMEX bliver erytrocytterne og trombocytterne bestemt ved ledningsevne, leukocytterne ved flowcytometri og hæmoglobinnivieau ved fotometri. Nedenfor vil disse metoder bliver beskrevet nærmere. Hvert analyseprincip finder sted i hver deres del af apparatet. For at hvert volumen 13

prøvemateriale, der sendes rundt i analyseapparatet, er repræsentativt for den prøve det er taget fra, sørger apparatet for, at hver prøve er tilstrækkeligt opblandet. Efter en ønsket mængde prøvemateriale er taget fra prøven, bliver det ført til hver analyses målekammer, til hver deres sted i SYSMEX. 1) Ledningsevneprincip (16) : Dette begreb dækker over i hvor høj grad, der kan ledes strøm via et materiale. I dette eksempel kommer erytrocytterne og trombocytterne til at fremstå enkeltvis, da der i målecellen tilføres sheatvæske, som med specielle egenskaber (viskositet og hastighed) får selve prøvematerialets celler til at fremstå enkeltvis i selve målepunktet, en aperture. En lille åbning, hvor celler, alt efter deres størrelse, kommer til at yde dårligere lednigsevne i forskellig grad. En cellemembran består i høj grad af fedt, som er en dårlig leder. Ved at cellerne passerer aperturen i en fast fart, vil spændingen variere alt efter cellens volumen, form samt orientering under passagen. På det tidspunkt, hvor der ikke er en celle i apeturen, vil der teoretisk set ikke være modstand til stede. Denne modstand beregnes ved hjælp af Ohms lov, der beskriver sammenhængen således: E(spændingen) = R(modstand) x I(strømstyrke) Ud fra denne ligning kan det ses, at hvis modstanden øges og strømstyrken holdes konstant, vil spændingen stige. Der kan herved bestemmes antal celler og disses størrelser. 2) Flowcytometri 16 : Det er en teknik der undersøger cellefunktion på et enkeltcelle-niveau. Der foretages målinger af alt fra to til flere forskellige egenskaber på enkelt celler, når de passerer igennem en laserstråle. Denne metode har en høj følsomhed med selektivitet. 3) Fotometri: 16 I SYSMEX benyttes fotometri ved bestemmelse af SLS(dodecyl natriumsulfat). Ved at ilte Fe 2+ til Fe 3+, vil der blive dannet methæmoglobin som vil reagere med de negativt ladede laurylsulfationer og danne SLSmethaæmoglobin. Dette stof vil have et absorptionsmaksimum ved 535 nm. Af tekniske årsager benyttes dog bælgelængden ved 555 nm. Dette punkt er defineret som et andet godt absorptionspunkt for bestemmelse af dette stof, hvilket bliver brugt til bestemmelse af hæmolysegraden. MODULAR 17 Apparatet består i hele sin opbygning af følgende punkter(17) : 14

- Core unit: Transporterer prøverne automatisk rundt i analyseaparatet, samt kører prøverne igen ved fejl eller anden grund til, at et analysesvar ikke er accepteret. - Control unit: En computer, hvor brugeren kan styre indtrumentfunktionerne. Denne er tilkoplet en host, hvor alt data bliver vist og lagret. - I denne afhandling er der 2 analysemoduler, der bliver fremhævet o ISE o P modulet Prøverne i dette forsøg blev bestilt manuelt og herefter analyseret fuldt automatisk. P Modulet: Når et reack er fremført til P modulet, bliver prøvens omfang detekteret, og det optagede volumen bliver aspireret. Det bestilte prøvevolumen bliver nu aspireret og placeret i en kyvette. Denne tilsættes reagenser undervejs og til sidst føres videre til fotometret. Efter lyset har passeret kyvetten, rammer lyset fotometret og et fraktionsgitter, der spreder lyset i dets bølgelængder. Herved måles hvilke lysintensiteter, der er nedsat eller til dels mangler. Dette er et udtryk for, hvilke dele af lysets bølgelængder, der er blevet absorberet i kyvetten. De 12 forskellige fotodioder kan afmåle intensitet og omregne dette til, hvilke absorbanser der kan være nedsat eller mangle. Bølgelængde bliver individuelt målt. Ved de 2 programmerede bølgelængder, for hver individuelle analyt, bliver resultaterne sendt videre til den endelige udregning af det enkelte parameters værdi. Slutproduktet af en reaktion absorberer lyset bedst ved en specifik bølgelængde. Ved at benytte en bølgelængde ud over den specifikke absorbans bølgelængde for et stof, kaldet bikromatisk aflæsning, kan der undgås interferens, der ses ved måling på en bølgelængde. Dette mindsker interferens af måling og øger den fotometriske opløsnings egenskaber (17). Ved bestemmelse af LD sker der en rate analyse, der fortages ved 34 målinger, hvor 2 af disse benyttes til at udregne resultatet for en reaktion. Disse 2 målepunkter bliver udført mens reaktionen stadig forløber, en tidligt i forløbet og en sent. Der måles absorbansændringer pr. tid. Denne absorbansændring kan indsættes i ligningen for kalibreringskurven, og herved omregnes til en værdi for analytten. Dette er modsat endepunkts beregninger, hvor der er fastlagt en startmåling samt en slutmåling, hvor en reaktion er løbet til ende (17). 15

Hæmolyse indeks bliver målt ved hjælp af fotometri, hvor en værdi for absorberet lys måles og denne intensitetsændring omregnes til en absorbans ved hjælp af en formel. Denne formel korrigerer for det lys, der bliver absorberet ved overlappende interferens. Molekylet lipæmi har tæt på samme absorptionsoptimum som ved hæmolysens målepunkt. ABL (18) Ved analyseaparatet ABL, bestemmes ioniseret calcium ved det potentiometriske princip. Dette princip bygger på en koncentrationsbestemmelse og bestemmes ud fra et elektrisk respons (potentiale), en elektrokemisk celle, består af 2 elektroder. De 2 elektroder er forbundet via et voltmeter. Den ene elektrode er i måleopløsningen, hvor den anden elektrode, benævnt referenceelektroden, er i en kendt opløsning. Det elektriske potentiale i analytten kan nu bestemmes ved hjælp af nernst s ligning. Omregningen af en given koncentration i analytten, sker automatisk i analyseaparatet ABL. MATERIALE & METODER Design I projektet blev der taget tre prøver. Disse tre var henholdsvis et underfyldt trykudlignet glas, et underfyldt ikke trykudlignet glas samt den rekvirerede prøve. Den rekvirerede prøve blev helt fyldt. De to underfyldte prøver blev forsøgt ligeligt fyldt. De tre glas blev taget af samme prøvetager og blev foretaget ved samme indstik. De to underfyldte prøver blev ens behandlet gennem det præanalytiske forløb, analytisk forløb samt notering af analysesvarene. Den eneste forskel på disse to prøver var således, at den ene havde været trykudlignet og den anden ikke. Den rekvirerede prøve fulgte laboratoriets andre prøver af etiske årsager. For at alle 3 prøver skal kunne sammenlignes, var det nødvendigt for mig at overholde de gængse retningslinier for analyseforskrift og holdbarhed. Materiale For at foretage de nødvendige undersøgelser til besvarelsen af problemformulering er følgende materiale anvendt: Kanyle 16

- BD Vacutainer Safety-Lok TM Blood Collection Set with Pre-Attached Holder - Ref: 368654 Alkoholswap - 82 % ethanol - Lot: 020813 Prøveglas - BD Vacutainer K 3 EDTA-glas Ref: 368270, Med violet prop. - BD Vacutainer Li-heparin-glas Ref: 368496, Med grøn prop. - BD Vacutainer Gel and clotactivator glas Ref: 368498, Med gul prop. Centrifuger - For prøver til MODULAR Hettich zentrifugen, Rotina 48 Program: 2000G, ved 20ºc i 10min - For ABL Hettich zentrifugen, Universal 320R Program: 2500G, ved 20ºc I 15min Blodvender - Triomix AB Serie nr: 12267, Triolab Analyseapparatur - Forsøgs del. 1 - SYSMEX XE-5000 - Forsøgs del. 2 - MODULAR Analytics, modulerne P800 samt ISE900, Roche Hitachi - Forsøgs del. 3 ABL 800 Flex Dataindsamling Indsamling af analysematerialet er sket på sengeafdelingen og ambulatoriet på Sygehus Lillebælt, Fredericia, i periode d. 3. oktober 2014 til d. 19. november 2014. Der var fokus på, om personer havde fået bestilt en af de 3 delforsøgs analyser. Efter at patienterne havde givet mundtligt samtykke til, at der bliv udtaget ekstra analysemateriale, blev der foretaget prøvetagning efter retningslinjerne for blodprøvetagning for FS. Ved udvælgelse af patienter der deltog i forsøget, var der følgende kriterier. 17

Inklusionskriterier: - over 18 år - givet mundtligt samtykke - afdelingen/ambulatorier har bestilt følgende prøver på patienten: leukocytter, erytrocytter, trombocytter, hæmoglobin, natrium, kalium, LD og ioniseret calcium. Eksklusionskriterier: - alder under 18 år - patienter der ikke gav mundtligt samtykke - Prøver der ikke nåede at blive analyseret samme dag, de blev taget - Manglende sporbarhed, dette værende såvel mangel på mærkning som forkert anmærket. Ved prøvetagning var der bl.a. fokus på: - at stasen ikke måtte sidde på i mere end 1 minut. - at prøverne til dette projekt blev taget efter, at de rekvirerede prøver var blevet taget. - At prøverne blev vendt grundigt, men forsigtigt. De tre prøver, der blev taget i dette projekt, blev særskilt mærket, så de kunne identificeres fra hinanden. Den rekvirerede prøve blev helt fyldt, som retningslinjerne foreskriver. De 2 underfyldte prøver blev forsøgt ligeligt fyldt ud fra en forud afmærket fyldningsgrad. Under forsøget bidrog op til flere medarbejdere, der alle blev instrueret i, hvilke prøver der skulle tages, samt de ekstra prøver til dette forsøg. De underfyldte projektprøver blev centrifugeret sammen. Dette skete efter maksimalt 4 timers henstand. MODULAR prøver blev centrifugeret på: - Hettich zentrifugen, Rotina 48 2000G i 10min ved 20ºc ABL prøver blev centrifugeret på: - Hettich zentrifugen, Universal 320 R 2500G i 15 min ved 20ºc. SYSMEX prøver blev ikke centrifugeret. Disse skulle dog vendes tilstrækkeligt inden analyse. 18

Alle prøver blev forsøgt analyseret samme dag, som de blev taget. Dette ville gøre resultaterne mest sammenlignelige med de rekvirerede prøver, da disse blev analyseret samme dag, de blev taget. Fremgangsmåderne for analyse på analyseapparaterne vil blive gennemgået separat nedenfor ved hver delundersøgelse. Delforsøg 1 I dette forsøg var der fokus på analyse af følgende: - leukocytter - erytrocytter - hæmaglobin - trombocytter Prøvemateriale blev indsamlet i BD Vacutainer EDTA glas, med undertryk. SYSMEX prøver blev forsøgt fyldt til en fyldningshøjde, svarende til 2,0 cm fra bunden. Disse analyser blev fortaget på analyseapparatet SYSMEX XE-5000. Prøverne blev analyseret manuelt, både m.h.t. fremføring og vending, der herved sikrer ensartede prøver. Ved at undlade vending af prøven, vil det føre til sedimentering af prøvens komponenter, altså en opdeling af prøvens komponenter. At udtage prøvemateriale fra en prøve, der er sedimenteret, vil således ikke længere være repræsentativ for prøvens værdier. Der blev manuelt valgt, hvilke analyser der skulle foretages. I dette forsøg blev der valgt program 1, CBC, programmet målte komponenterne leukocytter(wbc), erytrocytter(rbc), hæmoglobin (HGB), trombocytter(plt) og 2 andre ikke blev benyttet i denne sammenhæng. Delforsøg 2 I dette forsøg var der fokus på analyse af følgende: - kalium - natrium - laktatdehydrogenase (LD) - hæmolysegraden 19

I delforsøget blev der brugt BD Vacutainer Grønt-glas. Prøvematerialet er her plasma, hvor der i prøvetagningsglasset er tilsat Li-hiparin for at bevare koagulationsfaktorer. MODULAR prøver blev forsøgt fyldt til en fyldningshøjde svarende til 3,5 cm fra bunden. Prøverne blev analyseret på apparatet MODULAR Analytics. Modulerne, der blev brugt, var p800 og ISE 900. P800 blev brugt til bestemmelse af hæmolysegraden, samt prøvens værdier for LD. ISE900 modulet blev brugt til bestemmelse af kalium og natrium. De underfyldte glas har ingen stregkode. Derfor sker udvælgelse af alle analyser manuelt. Dette sker ved at indtaste, hvilket rack prøven står i, samt positionen i dette rack. Ud over dette vælges de enkelte analyser. Natrium- og kaliumanalyse samt hæmolyse bliver udført på alle prøver. I tilfælde af at LD analysen var bestilt på den rekvirerede prøve, skulle dette parameter også tilvælges. Delforsøg 3 I dette forsøg var der fokus på analyse af følgende: - ioniseret calcium I delforsøget blev der brugt BD Vacutainer Gult-glas. Med clot aktivator samt gel til separation. Prøvematerialet er her serum, hvor koagulationsfaktorerne er opbrugt. ABL prøver blev forsøgt fyldt til en fyldningshøjde svarende til 3,5 cm fra bunden. Prøverne blev manuelt bestilt og analyseret automatisk. Den anvendte maskine var ABL 800 FLEX. Her blev værdierne bestemt ved hjælp at potentiometri. ETIK Der blev taget ekstra prøver fra de personer, der allerede havde fået rekvireret en af de i forsøget indgåede analyser. Disse ekstra prøver blev først taget efter mundtligt samtykke til at medvirke i forsøget. Ved at gøre dette overholdt jeg de etiske problemstillinger, der kunne opstå, hvis jeg kom til at påvise abnormale værdier ved personer, der ikke allerede havde fået bestilt en given analyse. Rutineprøver fulgte af etiske årsager laboratoriets gang, da nogle prøver kunne være af livstruende karakter, og derfor ikke kunne vente 4 timer på at blive analyseret. 20

LITTERATURSØGNING Gennem denne afhandling er der hentet grundlæggende litteratur om mennesket og dets fysiologi, samt gennemgået de lærebøger, der omhandlede menneskets anatomi og fysiologi. Afhandlingen tog sit udgangspunkt i anbefalinger fra producenten BD Vacutainer. Der blev kaskadesøgt på producentens poster, der ved deres projekt blev fremstillet. Dette for at tage udgangspunkt i den viden, producenten havde tilegnet sig. For at kunne perspektivere disse artikler, blev der efter søgt artikler på PubMed samt på UCSyds biblioteks hjemmeside. Dette skete med søgeordene free full tekst, hemolysi rewiew, vacuum hemolysis, blood sample, sample hemolysis, underfilled tubes, factors, leading to, hemolysis, influens, influense on blodmarkers, recommendations for bloodsampling, insufficient volumen, latent tubes with vacuum, venting tubes, haemolysis an overview of the leading cause, ionized calcium centrifugation. DATABEHANDLING OG STATISTIK Til denne afhandling med 3 delforsøg, blev der i alt taget 126 blodprøver. Hvis det alle var prøver der blev inkluderet, ville der være over de 120 analysesvar. Dette ville være en acceptabel analysegruppe, men til disse prøver dækker over 3 forskellige delforsøg. Efter eksklusionskriterier, der alle er beskrevet i bilagene for hvert data sæt, var der for SYSMEX forsøget 41 personer, forsøget med MODULAR 33 personer og endelig ABL der dækker over 18 personer. Dette er relativt få analyseresultater at lave forsøg over, hvilket gør at der ikke vil kunne drages sikre konklusioner på alle sæt; men de kan alle pege i en retning af, om producenten BD har fremsat meningsfulde retningslinier. Af disse sæt har det ikke været nødvendigt at ekskludere hele sæt nu de parrede underfyldte glas var markeret på forhånd. Disse tal vil fortsat kunne indgå i statistisk beregning af de indbyrdige afvigelser, men til sammenligning med den rekvirerede prøve er det et nedslag i antal medvirkende. Grunde til at disse ikke kunne leve op til kriterierne, som blev fastsat inden projektet gik i gang. Dette dækker også over manglende registrering af faktiske ting ved selve prøvetagningen. Der er desuden taget blodprøver, hvor der er analyseret de gældende parametre. Det gælder for de ekstra prøver, der blev taget til dette forsøg. Disse prøver var ikke tilsigtet den gældende analyse, f.eks. en LD analyse. Dette betyder, at der ikke er en formodet sand værdi at sammenligne med, i form af den rekvirerede prøve. Her vil der ikke kunne laves sammenligning mellem A og C prøven, 21

men det er dog muligt at inddrage analyseresultaterne i det ene delforsøg, hvor der stilles de to underfyldte prøveglas over for hinanden. Ved at have et stort sæt data, er det muligt at bruge statistik for at finde overblik ved deskriptiv statistik og konkluderende statistik. Desuden skal man afklare, om data er normalfordelt, da dette er en forudsætning for en række statistiske metoder Til dette formål benyttes et Probit-plot (19), altså et plot, hvor man afbilder fraktiler overfor hinanden. Der laves et plot med målingerne ud af x-aksen og de tilsvarende teoretiske fraktiler på y-aksen. Hvis dette giver noget som ligner en ret linje, er der tale om en normalfordeling. Hvis data er normalfordelt gælder det, at medianen er lig med middelværdien. I denne afhandling er der ved udregning og fremstilling af Probit-Plots blevet påvist, at data er normalfordelt, og det er defineret, at data er parret. Der er således tale om parret normalfordelt data. Dette medfører, at der videre kan afklares, om de parrede sæt data har ens værdi set ud fra puljernes middelværdier. En afklaring af dette kan blive bevist ved en parret T-test 20. Her vil der blive undersøgt, hvorvidt middelværdierne i to populationer kan antages at være identiske. En forudsætning for t-test er, at data er normalfordelt, hvilket blev bevist ved brug af probit-plots. En grund til at der er brug for statistik til at udregne dette, skyldes at begrebet variation er gældende for analyser. Selv om der analyseres på den samme prøve og dette på samme analyseapparat, vil man opnå forskellige værdier. Dette er også gældende selv ved samme operatør. At der fremkommer forskellige værdier kan skyldes flere faktorer: - Måleusikkerhed, der kan deles op i to faktorer (21) o Tilfældig variation, der som ordet beskriver, varierer tilfældigt. o Systematisk variation, hvor afvigelsen altid er den samme. En tilfældig variation kan beskrives som en skydeskive, hvor der ikke rammes plet, så der hele tiden er afvigelser i forskellige retninger. En systematisk variation kan beskrives, som at der heller ikke rammes plet, men at disse værdier altid varierer med den samme afvigelse fra plet. Hvis der er tilstrækkelig høj præcision for analyseapparatet, vil disse målinger samle sig i det samme punkt, men med den afstand fra det, der kan betegnes som den sande værdi, betydende den eksakte værdi. 22

Ved statistisk beregning med en parret t-test vil der kunne afklares om afvigelserne for de målte prøver er tilfældige afvigelser, eller om der er tale om statistisk signifikant afvigelse. 19 Efter afklaring af hvilken type data man har, kan der opstilles en nul-hypotese. En hypotese kan vurderes ved, at man undersøger om de observerede data er forenelige med, eller er i modsætning til hypotesen. Til afklaring af hypotesen, benyttes t-testen, med udregning af p-værdien. P-værdi udtrykker sandsynligheden for at finde det observerede estimat eller estimater, der er mere afvigende fra det forventede, hvis nul-hypotesen var sand. Hvis p-værdien er > 0,05 (> 5 %) så accepteres hypotesen, dvs. værdien er ikke signifikant. Hvis p-værdien derimod er under 0,05 så forkastes hypotesen dvs. 19 RESULTATER Resultaterne i denne afhandling er bygget op omkring tre delforsøg, hvor man ser på forskellen mellem et normalt forløbet prøvetagningsglas, der efter forskriften er helt fyldt (A), over for et underfyldt, ikke trykudlignet glas (C). Desuden ses også på forskellen mellem det underfyldte, trykudlignede glas (B) i forhold til det underfyldte, ikke trykudlignede glas (C). Delforsøg 1 Først anvendes et probit-plot for at se om data er normalt fordelt. Resultater for probit-plot ses i figur 1-8 for henholdsvis leukocytter, erytrocytter, hæmoglobin og trombocyteter. På X-aksen ses de rangerede analysesvar, hvor de parrede tal er trukket fra hinanden. På Y-aksen ses den fraktil, de forskellige analysesvar ville blive omsat til, i en hypotetisk normalfordeling. Hvis resultatet er noget, som ligner en ret linje, er der tale om en normalfordeling (se figur 1-8). Der ses først på glas A og C og derefter på glas B og C. 23

Fraktill Fraktill Fraktil Fraktil Fraktil Fraktil 3 2 Probit-plot A-C (leukocytter) R² = 0,9596 3 2 Probit-plot B-C (leukocytter) R² = 0,9264 1 0-0,5 0-1 0,5 1 1,5-2 Serie1 Lineær (Serie1) 1 0-1 -2 0 50 100 Serie1 Lineær (Serie1) -3 Data dif. rang. -3 Data dif. rang. Figur 1 og 2: Probit Plot for leukocytter. Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. 4 2 Probit-plot A-C (erytrocytter) -4 Data dif rang. R² = 0,9415 0-0,2-0,1 0-2 0,1 0,2 Serie1 Lineær (Serie1) 4 2 Probit-plot B-C (erytrocytter) 0-0,1-2 0 0,1 0,2-4 Data dif rang.l R² = 0,8868 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 3 og 4: Probit Plot for erytrocytter. Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. Probit-plot A-C (Hgb) 0-1 -0,5 0-2 0,5 4 2-4 Data dif rang. R² = 0,9029 Lineær (Probit plot A-C HgB) 4 2 Probit-plolt B-C (Hgb) 0-0,4-0,2-2 0 0,2 0,4-4 Data dif rang. R² = 0,8185 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 5 og 6: Probit Plot for Hgb = hæmoglobin. Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. 24

Fraktil Fraktil 4 2 Probit-plot A-C (trombocytter) 0-100 0-2 100-4 Data dif rang. R² = 0,918 Probit plot Plt A-C Lineær (Probit plot Plt A-C) Probit-plot B-C (trombocytter) 3 2 1 0-40 -20-1 0 20-2 -3 Data dif rang. R² = 0,9659 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 7 og 8: Probit Plot for trombocytter. Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. Ud fra ovenstående ses, at der er tale om normalfordelte data, hvorfor man kan anvende T-test til beregning af p-værdien. α = 0,05 H0 =µ P > α : H0 = µ H1 µ Når p-værdien er fundet kan man vurdere, hvorvidt der er tale om en signifikant forskel. Hvis p- værdien er over alfa, vurderes de 2 populationer at være ens rent statistisk, hvis p derimod er under alfa, vil det vurderes, som at de to populationer er forskellige. Som beskrevet i boksen herover. Tabel 1: p-værdi og signifikans niveau. Analyse p- værdi Signifikant forskel A-C B-C A-C B-C Leukocytter 0,004567 0,83457 Signifikant Ikke signifikant SYSMEX Erytrocytter 0,04749 0,05073 Signifikant Ikke signifikant Hæmoglobin 0,00000158 0,309 Signifikant Ikke signifikant Trombocytter 0,489 0,9799 Ikke signifikant Ikke signifikant 25

Fraktil Fraktil Ud fra tabel 1 ses, at der er signifikant forskel mellem glas A-C for analyseværdier for leukocytter, erytrocytter og hæmoglobin. For B-C ses, at der ikke er signifikant forskel for nogle af analyserne overhovedet. Dette gælder desuden også værdien mellem A-C ved trombocytter. Det vil sige, at for de underfyldte glas, er der ud fra resultaterne ikke nogen forskel på, om der udlignes tryk. Dette er også gældende for værdierne mellem et fyldt glas (A) og det underfyldte ikke trykudlignede glas (C), for trombocytter. Der er derimod fundet forskellige analyseresultater for et fyldt glas over for de underfyldte glas, hvor der ikke udlignes tryk. Dette gælder ved bestemmelse af leukocytter, erytrocytter og hæmoglobin. Delforsøg 2 Først anvendes en Probit Plot for at se, om data er normalt fordelt. Resultater for Probit-Plot ses i figur 9-16 for henholdsvis kalium, natrium, LD og hæmolyse. På X-aksen den rangerede differens mellem de parrede målinger. og på Y-aksen ses den hypotetiske værdi de forskellige analyseresultaters differens ville svare til i en hypotetisk normalfordeling.. Resultatet er noget som ligner en ret linje, og dermed er der tale om en normalfordeling. Der ses først på glas A og C og derefter på glas B og C. Probit-plot A-C (Kalium) 1,5 0,5 0-2 -1-0,5 0 1-1 R² = 0,7594 Serie1 Lineær (Serie1) Probit-plot B-C (Kalium) 3 2 1 0-0,4-0,2-1 0 0,2 0,4-2 R² = 0,8745 Probitplot B- C Lineær (Probitplot B-C) Data dif rang. -1,5-3 Data dif rang. Figur 9 og 10: Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. 26

Fraktil Fraktil Fraktil Fraktil Fraktil Fraktil 3 2 1 0-5 0 5 10-1 -2 Probit-plot A-C (Natrium) -3 Data dif rang. R² = 0,9187 Probitplot A- C Lineær (Probitplot A-C) 3 2 1 0-4 -2-1 0 2 4-2 Probit-plot B-C (Natrium) -3 Data dif rang. R² = 0,9303 Probitplot B- C Lineær (Probitplot B-C) Figur 11og 12: Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. 2 1,5 1 0,5 Probit-plot A-C (LD) 0-20 -0,5 0 20-1 Data dif rang. R² = 0,9741 Probitplot A-C Lineær (Probitplot A-C) Probit-plot B-C (LD) 0-40 -20 0-1 20 2 1-2 -3 Data dif rang. R² = 0,9505 Probitplot B-C Lineær (Probitplot B-C) Figur 13 og 14: Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. Probit-plot A-C (hæmolyse) 2 1,5 1 0,5 0-5 -0,5 0 5 10-1 -1,5 Data dif rang. R² = 0,9815 Serie1 Lineær (Serie1) Probit-plot B-C (hæmolyse) 3 2 1 0-10 -1 0 10-2 -3 Data dif rang. R² = 0,9311 Probitplot B-C Lineær (Probitplot B-C) Figur 15 og 16: Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. 27

Ud fra ovenstående figurer kan man se, at disse data ligeledes er normalfordelt, hvorfor det igen er muligt at anvende t-test til beregning af p-værdien og vurdering af signifikansniveauet. Resultatet af t-test ses ud fra tabel 2. Ud fra tabel 2 ses, at analyseprøver A-C for kalium og natrium samt B-C for LD har en p-værdi under 0,05. Tabellen viser således, at analyseprøverne A-C, det fyldte glas over for det underfyldte ikke trykudlignede glas, ved bestemmelse af kalium og natrium, er signifikant afvigende. Disse prøvers analysesvar for LD og hæmolyse er ikke signifikant afvigende. Mellem de underfyldte glas ses at bestemmelse for LD er den eneste analyse, som findes signifikant afvigende. Tabel 2 Analyse p- værdi Signifikant forskel A-C B-C A-C B-C Kalium 0,003173 0,655 Signifikant Ikke signifikant MODULAR Natrium 0,016967 0,80295 Signifikant Ikke signifikant LD 0,80295 0,016967 Ikke Signifikant signifikant Hæmolyse 0,131 0,131 Ikke Ikke signifikant signifikant Delforsøg 3 Først anvendes en Probit-Plot for at se, om data er normalt fordelt. Resultater for Probit-Plot ses i figur 17 og 18 for calcium. På X-aksen ses den rangerede differens mellem de parrede målinger. På Y-aksen ses den hypotetiske værdi de forskellige analyseresultaters differens ville svare til i en hypotetisk normalfordeling. Resultatet er noget som ligner en ret linje, og dermed er der tale om en normalfordeling. Der ses først på glas A og C og derefter på glas B og C. 28

Fraktil Fraktil Probit plot A - C (Calcium) 2 1 0-0,1-1 0 0,1-2 -3 Rang. dif Data R² = 0,9147 Probit plot A - C Lineær (Probit plot A - C) Probit plot B-C (Calcium) 2 1 0-0,05-1 0 0,05-2 -3 Rang. dif DATA R² = 0,7968 Probit plot B-C Lineær (Probit plot B-C) Figur 17 og 18: Der kan tilnærmelsesvis trækkes en ret linie igennem, hvorfor data vurderes normalfordelt. Ovenstående Probit-Plot viser, at der er tale om normalfordelte data, hvorfor T-testen igen kan anvendes til beregning af p-værdien og vurdering af signifikans niveauet. Tabel 3. Analyse p- værdi Signifikant forskel A-C B-C A-C B-C ABL Calcium 0,198 0,831 Ikke signifikant Ikke signifikant Ud fra tabel 3 ses, at p-værdierne ligger over 0,05. Således er der ikke tale om signifikans dvs. hypotesen H0 accepteres. Det vil sige, at der ikke er påvist forskel imellem de ioniserede calcium resultater mellem de fyldte glas over for underfyldte ikke trykudlignede glas. DISKUSSION Der foreligger flere retningslinjer/anbefalinger for blodprøvetagning for at sikre, at eventuelle uhensigtsmæssigheder ikke får kliniske konsekvenser. FS har i sine retningslinjer beskrevet, at de underfyldte glas skal trykudlignes for at forebygge hæmolyse-dannelsen. Producenten af prøvetagningsglas BD-Vacutainer anbefaler derimod, at man undlader trykudligning, da denne øger risikoen for hæmolyse. 29

Korrekt blodprøvetagning er afgørende for et korrekt analyseresultat. Uhensigtsmæssigheder kan få konsekvenser for patienten. Ofte er der behov for en ny blodprøve, som medfører ubehag for patienten og ikke mindst forsinker igangsættelsen af en relevant behandling, samt medfører større udgifter. Flere forskere og prøveglas -producenter har forsøgt at finde løsninger på de faktorer, der forårsager hæmolyse. Mange har set på, om fx nålens størrelse, størrelsen af prøveglas, fyldningsgrad, trykudligning, stase og tidsintervallet fra prøvetagning til analysen har betydning for hæmolysedannelsen. Sharp et al. (22) og Dugan et al. (23) har fundet, at nålens størrelse kan have betydning, hvorimod Marcus et al (4) påviser, at der ikke er nogen sammenhæng mellem nålens størrelse og hæmolysegraden. Arndt et al 9 og Boyanton et al (11) ser på tiden fra prøvetagning til analysen. Status på området er, at der generelt er stor uenighed om, hvordan prøver bør tages og håndteres. Formålet med denne afhandling er at afklare, hvorvidt fyldningsgraden og trykudligning har nogen indvirkning på analysesvar på forskellige måleparameter. Resultaterne i denne afhandling er bygget op omkring tre delforsøg, hvor man ser på forskellen mellem underfyldt, trykudlignet glas (B) og et underfyldt, ikke trykudlignet glas (C). Desuden ser jeg på forskellen mellem et fyldt glas (A) og et underfyldt, ikke trykudlignet glas (C). Sammenligning mellem glas B og C: Når man ser på resultater i denne afhandling, kan man ud fra delforsøg 1 se, at der ikke er nogen forskel, uanset om man trykudligner eller ej for de underfyldte glas. Ud fra delforsøg 2 finder man ligeledes, at der overvejende ikke er nogen forskel uanset om trykudligning finder sted. Den eneste analyse som afviger her er LD, som findes signifikant afvigende. Dette kan skyldes dels få analyseprøver (da tallet ligger tæt på 0,05). Et større antal analysesvar ville muligvis have vist det samme, som for de øvrige analyseprøver. Koseoglu et al 14 viser i deres forsøg, at LD er meget følsom for hæmolyse. Samme konklusion kan drages ud fra delforsøg 3. Samlet set må man konkludere, at denne afhandling finder frem til, at der ikke er signifikant forskel på dannelsen af hæmolyse uanset om de underfyldte glas trykudlignes eller ej. 30