Påvirkning af Kvaliteten på Na-citrat og Lithiumheparin Stabiliseret Plasma, ved Ændring af Centrifugeringsforhold

Transkript

1 PROFESSIONS BACHELOR PROJEKT BIOANALYTIKERUDDANNELSEN Påvirkning af Kvaliteten på Na-citrat og Lithiumheparin Stabiliseret Plasma, ved Ændring af Centrifugeringsforhold The Impact on Quality of Sodium and Lithium-heparin Stabilized Plasma, by Changing the Centrifugation Conditions Kamilla Bech Mikkelsen Ba11s109 Dato: 16. december 2014 University College Syddanmark UC Vejleder: Kit Stryhn Klinisk Biokemisk Afsnit, Sydvestjysk Sygehus Esbjerg Klinisk vejleder: Else Bjerregaard Opgavens omfang: anslag med mellemrum

2 Forord Denne undersøgelse er udarbejdet på Klinisk Biokemisk Afsnit, Sydvestjysk Sygehus Esbjerg, i perioden 28. oktober 6. november 2014, i forbindelse med professionsbachelorprojekt for bioanalytikeruddannelsens modul 14 ved University College Syddanmark. Undersøgelsen, og den udarbejdede rapport, henvender sig primært til det kliniske afsnit for biokemi, og til bioanalytikere med interesse for projektets problemfelt. I denne forbindelse skal der lyder en stor tak til de ansatte i KDA (klinisk diagnostisk afsnit), for deres hjælp med indsamling af prøvemateriale til undersøgelsens udførelse, samt til de ansatte i KBA (klinisk biokemisk afsnit) for deres hjælp og tålmodighed i forbindelse med analysering af prøvemateriale i laboratoriet. Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr af 16/12/2013 kap. 5, Dato underskrift Side 2 af 63

3 Abstrakt Påvirkning af Kvaliteten på Na-citrat og Lithium-heparin Stabiliseret Plasma, ved ændring af centrifugeringsforhold Mikkelsen Kamilla Bech, Bjerregaard Else(KV), Stryhn Kit (UCV) Klinisk Biokemisk Afsnit, Sydvestjysk Sygehus, Esbjerg Baggrund: Svartid er et ofte berørt emne i det biokemiske speciale, da det er en kritisk parameter for laboratoriets effektivitet og kvalitet. I dag er størstedelen af laboratoriers analyser defineret som højhastighedsanalyser, med EDB-systemer til hurtig rapportering af analysesvar. Det er primært den præanalytiske prøvebehandling der sænker svartiderne. Centrifugering er en tidskrævende procedure i den proces. Dette projekt har til formål, at undersøge de forskellige forhold ved centrifugering og muligheden for at forkorte processen, uden at forringe kvaliteten af plasma, og evt. skabe et fælles centrifugeringsprogram for udvalgte prøverør. Metode og Materiale: Undersøgelsen er opdelt i tre delforsøg, med 24 frivillige, formodet raske testpersoner i hvert forsøg. Delforsøg 1 har til formål at undersøge muligheden for nedsættelse af centrifugeringsdriftstiden fra 10 til 7 minutter på Na-citrat- og lithium-heparinrør. Delforsøg 2 har til formål at undersøge hvorvidt det er muligt at nedsætte decelerationstiden på Na-citratrør, til koagulations undersøgelser, uden ophvirvling af trombocytter og bibeholdelse af trombocytfattigt plasma. Delforsøg 3 har til formål at undersøge, om kvaliteten af plasma ved centrifugering af Nacitratrør, forbedres ved at øge g-påvirkningen fra 2000 g til 2500 g. Resultater: Delforsøg 1 viste at man kunne nedsætte driftstiden til 7 minutter for lithium-heparinrør, men ikke Na-citratrør uden at påvirke parameteren P-Trc. Delforsøg 2 viste at decelerationstiden på 1:23 minutter, var egnet til opretholdelse af trombocytfattigt plasma. Delforsøg 3 viste det er muligt at nedsætte centrifugeringsdriftstiden til 7 minutter, hvis man øger g-påvirkningen til 2500 g på Nacitratrør. Konklusion: På bagrund af undersøgelsens fund, kan et fælles centrifugeringsprogram lyde på 7 minutters driftstid ved 2500 g, med en decelerationstid på 1:23 minutter. Dette vil betyde en reducering af KBA s nuværende centrifugeringsprogram på 13:17 minutter til 8:23 minutter, en reducering på 4:54 minutter, uden at påvirke de udvalgte parametre P-Ery, P-Trc og H-index, og dermed opretholde kvaliteten af plasma. Side 3 af 63

4 Indholdsfortegnelse Introduktion... 6 Baggrund... 6 Formål... 8 Problemformulering... 9 Målformulering... 9 Teoretisk grundlag... 9 Blodets bestanddele Erytrocytter Trombocytter Plasma Centrifugering Metode og Materiale Analytiske forhold for Sysmex XE Analyse princip for B-Erytrocytter og B-Trombocytter Analytiske forhold for Architect c Analyseprincip for hæmolyse Udvælgelse af testpersoner Prøvemateriale og prøvetagning Beregning af antal prøver Mærkning af prøvetagningsrør Kriterier for analyseudvælgelse Undersøgelsens design Kvalitetssikring Litteraturstudie Etiske overvejelser Dataindsamling og holdbarhed Databehandling Side 4 af 63

5 Resultater Delforsøg Delforsøg Delforsøg Miniforsøg: placering i centrifuge Diskussion Statistiske resultater Intern validitet Ekstern validitet Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag 1a Resultatskemaer - Delforsøg Bilag 1b - Resultatskemaer Delforsøg Bilag 1c Resultatskemaer Delforsøg Bilag 2 probitplots Side 5 af 63

6 Introduktion Baggrund På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA), Sydvestjysk Sygehus (SVS) blev der sidste år, i forbindelse med opførelsen af et nyt laboratoriehus, opkøbt og implementeret en fuldautomatisk laboratorieløsning. Denne løsning omfatter implementering af et rørpostsystem, til transport af prøver mellem selve sygehuset og det nye laboratoriehus, samt et automatisk transportbånd, kaldet flexlab. Flexlab omfatter et modul til registrering og sortering af prøver, hvorefter de omdeles via transportbånd, til deres præanalytiske og analytiske apparaturer. Efter endt analysering varetager flexlab også den postanalytiske proces, ved at arkiverer prøvematerialet i et tilhørende klimaskab. Denne fuldautomatiserede laboratorieløsning bevirker en standardisering af præanalyse, analyse og postanalysen, og gør det muligt at forbedre kvalitetssikring af håndtering og svartider på analyserne(1). Svartid er et emne der ofte berøres indenfor det biokemiske speciale. Specielt i forhold til et laboratorie som KBA på SVS, hvor der dagligt udføres både fremskyndede og livsvigtige analyser(2). Svartid på KBA-SVS er defineret som følgende: svartid er det tidspunkt hvor svaret er til rådighed (analysesvar godkendt), minus tidspunktet for prøvetagningen(1). Dette er en kritisk parameter for laboratoriers effektivitet og kvalitet(3). Ud over svartid, er begrebet turnaround tid, også en faktor der bør nævnes. Turnaround tid defineres fra når prøven er registreret på flexlab, til det er godkendt og kan findes i KBA s EDB-system Analyser Management System (AMS). I dag er størstedelen af laboratoriets analyser automatiserede, og defineres som højhastighedsanalyser, hvor den totale analysesvartid fra prøvetagning til rapportering af analysesvar til rekvirenten, kan være så kort som minutter(4). Der er fremsat en række kvalitets mål for svartider ved KBA, og ifølge disse bestræbes det, at mindst 90 % af fremskyndede prøver fra morgenrunden, har svartider der er mindre end 2,5 time. Derudover bestræbes det, at 90 % af de resterende fremskyndede prøver, har svartider på mindre end 2 timer. I forhold til livsvigtige prøver bestræbes det, at 90 % af prøverne har en svartid på mindre end én time(5). Disse kvalitetsmål bliver hvert år evalueret af Ledelsen for Klinisk biokemisk og immunologisk afdeling (KBI). I Ledelsens Evaluering for KBI 2013, fremgår en evaluering af opfyldelsen af disse kvalitetsmål. I Side 6 af 63

7 tabel 1 og 2 fremgår svartiderne for to udvalgte analyseparametre, der omfatter svartiderne på analyseapparaturerne Architects C16000 moduler, samt STA-R evolution(6). Fælles for disse analyseparametre er, at de er opkoblet til Flexlab og at centrifugering er en del af den præanalytiske behandling, forud for deres Analysering(7,8). Tabel 1: Den procentvise opfyldelse af KBA s kvalitetsmål i forhold til svartider fra for analysen P-KFTT. S-TAR evolution P-KFTT Livsvigtige Fremskyndet Morgen Fremskyndet Øvrige < 1 time (%) < 2,5 time (%) < 2 timer (%) ,4 95,9 89, ,2 97,1 91, ,5 92,5 86,1 Tabel 2: Den procentvise opfyldelse af KBA s kvalitetsmål i forhold til svartider fra for analysen P-K. P-K Livsvigtige < 1 time (%) Architect C1600 Fremskyndet Morgen < 2,5 time (%) Fremskyndet Øvrige < 2 timer (%) ,7 94,4 93, ,5 94,0 93, ,9 91,6 89,6 Svartiderne er udledt fra et andet af KBA s EDB systemer, kaldet BCC(6). En stor del af disse Analyseparametre overholder KBA s kvalitetsmål i , mens nogle enkelte ligger lige under de 90 %. Fælles for de to parametre er, at der ses et markant fald fra hvor implementeringen af flexlab finder sted, hvor især P-KFTT og er at fremhæve, da den falder til 65,5 % (livsvigtig, <1 time), hvilket er markant under kvalitetsmålene(6). Det er påfaldende at dette fald ses efter denne implementering, men om det betyder at svartiderne rent faktisk er forværret, eller om det skyldes den forbedrede standardisering af analysegangen, der gør det nemmere at overvåge svartider, er svært at vurdere på nuværende tidspunkt. Dog fremgår det af ledelsens evaluering der var forventet dårligere svartider end i 2012, på baggrund af flere indkøringsproblemer i forbindelse med implementeringen(6). Side 7 af 63

8 Med fremkomsten af højhastighedsanalyser, automatiserede laboratorieløsninger og EDB systemer til svarafgivelse, er det primært den præanalytiske prøvebehandling det sænker svartiden(4). Centrifugering er en markant flaskehals i den præanalytiske behandling(3). Der er 3 centrifuger opkoblet til flexlab. Alle centrifuger centrifugerer med en driftstid på 10 min, ved 21 C, ved 2000 g(9). De Kemiske prøver der analyseres på Architect C og I moduler, centrifugeres i centrifuge 1 og 2 hvor de decelererer kraftig i 0:45 minutter, inden centrifugen stopper. På centrifuge 3 centrifugeres der primært prøver til koagulationsundersøgelser. Decelerationstiden på centrifuge 3 er 3:17 minutter(9). Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) anbefaler, at koagulationsanalyser skal fortages på trombocytfattigt plasma (P- Trc< /L)(10), hvorfor den lange decelerationstid, for at undgå ophvirvling af trombocytter i plasma. Forskellen i centrifugeringsprogrammerne gør, at der i travle perioder i forbindelse med analysering af morgenrundens prøver, samt analysering af indsendte prøver fra Praksislæger, opstår kø ved centrifugerne, specielt centrifuge 3. Der er indstillet en delaytid, for hvor længe centrifugen må vente med at starte, fra den første prøve er placeret, for at undgå at prøverne ikke står i en længerevarende venteposition, i ikke travle perioder. For en almindelig rutineprøve er denne tid 12 minutter, og hvis prøven er prioriteret som en hasteprøve, er delaytiden kun 2 minutter. Dette bevirker imidlertid, at centrifugerne ofte er nødsaget til at starte uden at være fyldte. Dette projekt har til formål at undersøge de forskellige forhold ved centrifugering, og muligheden for at forkorte centrifugeringsfasen, og hvis det er muligt, skabe en fælles centrifugeringsprogram for udvalgte prøver. Dette vil eventuelt kunne hjælpe til nedsættelse af de nuværende svar-og turnaroundtider, samt opfyldning af de fremlagte kvalitetsmål for KBA, SVS. Formål Formålet med undersøgelsen er, at undersøge hvorvidt det er muligt, at reducere driftstiden på 10 minutter, samt at reducerer decelerationstiden på 3:14 minutter på centrifugerne af typen Hettich Rotixa 50RS, uden at påvirke udvalgte parametre på Na-citrat og lithium-heparin stabiliseret blod. Der indstilles tilnærmelsesvis identiske centrifugeprogrammer, i forhold til centrifuge 1, 2 og 3 der er tilknyttet flexlab, disse anvendes som reference. Side 8 af 63

9 Problemformulering Hvordan påvirkes udvalgte parametre i plasma, hvis drifts- og decelerationstid på centrifugen, Hettich Rotixa 50RS, reduceres? Målformulering Følgende parametre blev udvalgt: P-Erytrocytter (lithium-heparin gel-rør), P-Trombocytter (Nacitratrør), samt hæmolyseindeks på alle prøvetagningsrør. Undersøgelse nr. 1: Effekten på udvalgte parametre ved reducering af driftstid på centrifugen fra 10 til 7 min, ved 2000 g Efter centrifugering analyseres udvalgte parametre. Hæmolyseindex analyseres både før og efter henstand i 8 timer, til kontrol af hæmolyserede erytrocytter i plasma. Dette kontrolleres for at undersøge, om der er flere erytrocytter der hæmolyserer end ved referenceprøven. 8 timer er valgt, da der inden for denne tidsramme kan efterbestilles analyser. Formålet med undersøgelsen er, at undersøge om reducering af driftstiden for centrifugering af lithium-heparin- og Na-citratrør, har betydelig effekt på de udvalgte parametre i plasma. Undersøgelse nr. 2: Effekten på P-Trombocytter ved forskellige decelerationstider, ved centrifugering i 10 minutter, ved 2000 g. Formålet med undersøgelsen er at undersøge forskellige, decelerationstider for centrifugering af Na-citratrør, hvor trombocytfattigt plasma bibeholdes. Undersøgelse nr. 3: Effekten på P-trombocytter ved centrifugering i 7 minutter ved hhv. 2000g og 2500 g, med decelerationstid 3:14 minutter. Formålet med undersøgelsen er, at undersøge om den øgede centrifugalkraft har betydelig effekt på opnåelsen af trombocytfattigt plasma på Na-citratrør. Undersøgelsen laves kun på centrifuge 1, da vi i løbet af projektet har opdaget en systematisk fejl på centrifuge 2. Teoretisk grundlag I dette afsnit præsenteres den for området aktuelle viden. Dette omfatter bestemte bestanddele af blodet, der har betydning i forhold til centrifugeringsfasen, og udarbejdelse af metodeafsnittet og de analytiske forhold. Derudover redegøres der for selve centrifugeringsfasen, og de parametre projektets undersøgelse beskæftiger sig med. Side 9 af 63

10 Blodets bestanddele Blod består af celler og blodplasma, og kan betragtes som værende flydende bindevæv, med funktionen at tilføre kroppens celler nærring og borttransportere affaldsstoffer(11). I det klinisk biokemiske speciale, udføres der biokemiske, hæmatologiske og molekylærbiologiske analyser på forskellige bestanddele af blodet(12). Erytrocytter Erytrocytter har en diameter på ca. 8 µm(13). Erytrocytters hovedopgave, er at transporterer kuldioxid og ilt til og fra lungerne. Denne funktion er knyttet til indholdet, af det ilt-bindende stof hæmoglobin, der udgør 33 % af cellens masse, og giver blodets dets røde farve. Hæmoglobin er et protein, bestående af 4 polypeptidkæder, der er bundet til en jernholdig hæm-del i reduceret form (ferroform), da den oxiderede form ikke er i stand til iltbinding.(11) Erytrocytter udgør mere end 99 % af kredsløbets blodceller. I erytrocytten forgår processer som glykolyse og andre enzymprocesser, derfor har cellen et højt indhold af komponenter der også findes i plasma. Det er derfor vigtigt at cellen ikke lyserer, da man ikke er interesseret i at have falsk forhøjede svar, i forbindelse med de kemiske analyseresultater. Hæmolyse vil have stor betydning for analyserne P-Laktatdehydrogenase (LD), P-Kalium (K), P-Aspartat- Aminotransferase (ASAT), mens det vil have lidt mindre betydning for P-Alanin- Aminotransferase (ALAT) og P-Magnesium (MG). Det store indhold af proteiner i erytrocytter, vil også kunne resulterer i et ekstra bånd i proteinelektroforese. Hæmoglobinets røde farve kan interferere med fotometriske analyser, samt hele erytrocytter i plasma vil også påvirke de fotometriske analyser.(13,14) Hæmolyse opstår for det meste under selve prøvetagningen, eller den efterfølgende prøvebehandling. Hæmolyse er en hyppig præanalytisk variabel, og ofte årsag til at en given prøve kasseres, hvorfor det er vigtigt, at sikre sig at projektets prøvebehandling ikke forårsager hæmolyse.(14,15) Trombocytter Trombocytter er små membranomkransede afsnøringer, fra store kerneholdige celler kaldet megakaryocytter, og har derfor ikke selv nogen kerne og er kun ca. 3-4 µm i diameter(13,16). Trombocytter spiller en væsentlig rolle i den primære hæmostase, og ved vedligeholdelse af kar-endothelet, ved at udskille pladederiveret vækstfaktorer der fremmer reparationsprocesser(11,13). Normalt vil trombocytter ikke have tendens til at klæbe til hinanden eller karvægge, men når de aktiveres vil de svulme op og få en uregelmæssig form, Side 10 af 63

11 med talrige cytoplasmatiske udløbere, der gør dem klæbrige og i stand til at udtømme vesikler til blodbanen, indeholdende hæmostatiske komponenter(11,13). I trombocyttens membran optræder der i det indre lipidlag, en række fosfolipider, der ved aktivering kan eksponeres på det ydre lipidlag. Her kan fosfolipider danne komplekser med Ca 2+. Komplekserne muliggør interaktion med koagulationsfaktorene(16 18). Ved koagulationstest anbefaler CLSI derfor, at analyserne fortages på trombocytfattigt plasma (< /L)(10), for at undgå interferens med den fosfolipide overflade, på de aktiverede trombocytter, for bedre at kunne styre koagulationsprocesserne. Ved koagulationsundersøgelser opsamles prøvematerialet i 0,109 M bufferet Na 3 Citrate (tilsvarende 3,2 % Na 3 Citrate). Dette antikoagulans fungerer ved at danne komplekser med Ca 2+. Ved dannelse af disse komplekser, inhiberes koagulationskaskaden og aktivering af trombocytter(19). Ved koagulations undersøgelser som P-KFTT, P-APTT, P-AT, P- FIBG mv. tilsætter man reagenser der bl.a. indeholder kalcium, trombin og fibrinogen, der kan aktiverer trombocytterne og påvirke undersøgelsen/analysen. Plasma Over halvdelen af blodet udgøres af plasma. Plasma består af vand med NaCl og osmotisk aktive partikler, til opretholdelse af det osmotiske tryk. Nærringstoffer og affaldsstoffer transporteres via plasmaet til og fra kroppens væv og celler. Der findes et stort antal proteiner i plasmaet, der også bridrager til opretholdelsen af det osmotiske tryk, da de ikke kan passerer kapillærvæggen. Dette gør, at proteinkoncentrationen er væsentlig højere i plasma end i vævsvæsken, og derfor skabes der osmotiske kræfter, der er i stand til at suge væske fra vævene og over i blodbanen og dermed opretholde blodplasmavolumen(13). Plasmaproteinerne fungerer som transportproteiner for stoffer der ikke er vandopløselige, som lipider, lægemidler og hormoner. Koagulationsfaktorerne, antistoffer, komplementfaktorer, samt andre stoffer, der hjælper med bekæmpelse af mikroorganismer, findes også i plasma(13). I dette projekt anvendes plasma fra Na-citrat og lithium-heparin stabiliseret blod. Side 11 af 63

12 Centrifugering De kemiske samt koagulationsanalyserne, kræver centrifugering forud for analysering, da de foretages på plasma. Efter endt prøvetagning vil fuldblodsprøven, tilsat antikoagulans, under henstand sedimentere spontant, denne proces forgår langsomt, da sedimentation forgår pga. tyngdekraftens påvirkning, da blodlegemer har en større massefylde end plasma/serum, vil de bundfalde med tiden. De røde blodlegemer vil pakke sig i bunden af glasset, mens de leukocytter og trombocytter vil ligge sig som en buffycoat ovenpå. Over buffycoat og røde blodlegemer vil plasmaet befinde sig, dette er illustreret på figur 1(20). Tyngdekraftens påvirkning forgår ved én g. I en centrifuge har man muligheden for, at øge g-påvirkning ved at slynge prøven, og dermed fremskynde sedimentationsprocessen. Centrifugeringseffekten (a) er afhængig af det antal omdrejninger centrifugen foretager pr. minut (n), samt radiussen fra centrifugens centrum (r). Den relative centrifugerings effekt kan beregnes ud fra følgende formel(14,21): a = ((11, cm 1 min 2 ) n 2 r)g Ifølge CLSI skal der centrifugeres ud fra de retningslinjer producenten anbefaler for deres produkter(22). Til dette projekt anvendes lithium-heparinrør med gel, hvor producenten, Becton, Dickinson and Company (BD), anbefaler at rørene centrifugeres ved g i 10 minutter(19). Derudover anvendes der Na-citratrør, hvor det anbefales at der centrifugeres i minutter ved g for at opnå trombocytfattigt plasma(19). På SVS, KBA har man valgt at centrifugere alle prøver ved 2000 g i 10 minutter, dog har man valgt at have en længere decelerationstid for Na-citratrør til analyse af koagulationstest, for at undgå ophvirvling at trombocytter fra buffycoat, der kan interferere med analyseresultaterne. Temperaturen i centrifugen er vigtig for at opnå en god separation. Temperaturen i centrifugen skal ifølge BD være C(19). Ifølge CLSI skal temperaturen befinde sig omkring C(21). På SVS centrifugerer man ved 21 C. Figur 1: således fordeler blodets bestanddele sig i en blodprøve tilsat antikoagulans. de røde blodlegemer nederst, efterfulgt af buffycoat og plasma. Side 12 af 63

13 Metode og Materiale I perioden hvor projektet udføres, foretages en Driftstest på flexlabs tre Hettich centrifuger, hvorfor det ikke var muligt at anvende disse til projektet. I stedet anvendes to separate centrifuger af typen Hettich Rotixa 50RS. Der findes imidlertid nogle forskelle mellem de to typer af centrifuger, i forbindelse med deres opsætning af decelerationstider. Forud for projektets udførelse, undersøges derfor decelerations-indstillingerne for flexlabs centrifuger og de i projektet anvendte centrifuger, med henblik på at skabe sidestillende centrifugeringsprogrammer. Længste og korteste decelerationstid der anvendes på flexlab er henholdsvis 3:17 og 0:45 minutter. På Hettich Rotixa 50RS vil den længste decelerationstid være 3:14 minutter, imens den korteste vil være 1:23 minutter. I forbindelse med delforsøg 3, blev to mellemlæggende decelerationstiden valgt på henholdsvis 1:54 og 2:31 Minutter. Analytiske forhold for Sysmex XE-5000 Sysmex XE-5000 er et automatiseret hæmatologisk analyseapparatur, til måling og differentiering af blodets indhold af celler, derfor måles der normalt på etylen-diamin-tetraacetat(edta) - stabiliseret fuldblod(23). I dette projekt er vi interesseret i at måle på antallet af trombocytter og erytrocytter i plasma, efter at prøverne er blevet centrifugeret ved forskellige centrifugeringsprogrammer, for at sikre kvaliteten af centrifugeringsfasen, og optimal sedimentering af prøverne. Analyse princip for B-Erytrocytter og B-Trombocytter På Sysmex XE-5000 anvendes analyseprincippet hydrodynamisk fokusering og impedans (ledningsevne princip), til kvantificering af B-Erytrocytter (RBC) og B-Trombocytter (PLT). I manuel mode aspireres ca. 130 µl prøvemateriale til samtlige hæmatologiske analyser på Sysmex. Ud af de 130 µl, aspireres 4 µl blod via prøveventilen til RBC/PLT-kanalen. Her fortyndes de 4 µl med 1,9960 ml CELLPACK, for at opnå en fortynding på 1:500. Herefter sendes den fortyndede prøve til prøvekammeret. Her presses 11,7 µl af den fortyndede prøve langsomt frem til RBC/PLT detektoren, hvorefter den presses gennem prøverøret i detektoren, der er centralt placeret foran aperturen. På begge sider af aperturen findes elektroder. Samtidig presses 2,1 ml Sheath Reagens i en højere hastighed rundt om prøverøret og gennem aperturen. Sheath reagenset sørger for at cellerne passerer aperturen enkeltvis, og herefter Side 13 af 63

14 føres væk, så de samme celler ikke at blive talt mere end én gang princippet ses på figur 2(24). Figur 2: figuren viser cellernes vej gennem aperturen, og den elektriske modstand afhængig af cellens størrelse. En strøm af sheath reagens sørger for at cellerne passerer enkeltvis. Ledningsevneprincippet består i hvilke ændringer, en blodcelle (RBC,PLT) giver i den elektriske modstand, der holdes på en konstant niveau, når de passerer aperturen, i overensstemmelse med Ohm s lov, der beskriver sammenhængen mellem spænding, strøm og modstand. RBC og PLT befinder sig i en elektrolytopløsning, der passerer gennem aperturen. Når en celle passerer, vil den omkringværende opløsning fortrænges, og dette vil medfører en større modstand mod de to elektroder, afhængig af cellens størrelse. Alle celler i den fortyndede opløsning passerer enkeltvis elektroderne, og da der anvendes en kendt prøvevolumen, vil data omkring denne volumen, kunne omsættes til data omkring antal celler pr. liter blod.(23) Analytiske forhold for Architect c1600 Architect c16000 er et åbent, fuldautomatisk klinisk kemisystem, der tester prøverne ved hjælp af potentiometriske og fotometriske analysemetoder(25). I dette projekt måles hæmolyseindex på samtlige prøver, for at sikre kvaliteten af både de præanalytiske og analytiske processer. Analyseprincip for hæmolyse Plasma kan indeholde en mængde af hæmoglobin fra hæmolyse, forhøjet bilirubin (I), samt turbiditet (lipæmi)(26). Disse komponenter kan påvirke klinisk kemiske analyser. ARCHITECT c- system indeholder software, der via en række forskellige bølgelængder udleder indexværdier, for hver eller enkelte af de ovenstående interfererende stoffer(26). I det efterfølgende beskrives de forskellige trin i den fotometriske reaktion. Side 14 af 63

15 Først opsuges prøvemateriale via prøvepipettoren, som derefter dispenseres til en cuvette i position 1. I position 2 vil reagenspipettoren aspirerer reagens i form af isotonisk Saline (0,85-0,90 % NaCl) der dispenseres til cuvetten. I position 4 blandes reagens og prøvemateriale via blandingsenheden. I position inkuberer blandingen og fotometeret foretager fotometriske aflæsninger, hver gang cuvetten passerer fotometerpositionen, hvor lampen er lokaliseret. Til at måle de tre interferenssubstanser, måler systemet absorbansværdier for fire bølgelængdepar der ses i tabel 3. Ved hjælp af de relevante fotometriske målinger, samt matematiske beregninger, bestemmes den relative interferenskoncentration. I position bortskaffes reaktionsblandingen og cuvetten rengøres. Tabel 3: de 4 bølgelængdepar, der danner baggrund for absorbansmåling og bestemmelse af interferenssubstanserne: hæmolyse, ikterus, og lipæmi. Bølgelængde (nm) Par Par Par Par Udvælgelse af testpersoner Fælles for de tre delforsøg gælder det at der anvendes frivillige, formodet raske testpersoner, Da de analyserede parametre i projektet ikke danner grundlag for klinisk relevans i forhold til testpersonerne og selve projektet. Der ingives mundtligt informeret samtykke jf. sundhedsstyrelsens Bekendtgørelse om information og samtykke og om videregivelse af helbredsoplysninger mv (27). inklusionskriterierne for testpersonerne omfatter således raske mænd og kvinder der frivilligt indvilliger i mundtlig informeret samtykke(27), derfor befinder de anvendte testpersoner sig i alderen >18 år. Eksklusionskriterierne omfatter kun personer der ikke selv er i stand til at indgå mundtlig informeret samtykke. Prøvemateriale og prøvetagning Til projektet anvendes kun korrektfyldte prøverør. Der benyttes BD Na-citratrør, 2,7 ml (0.109M bufferet Na-citrat svarende til 3,2 % Na 3 citrat) med lot nr (19), samt BD Lithium-heparinrør, 3,0 ml med separerende gel, med lot nr (19). Blodprøvetagningen foretages under projektet af de samme to personer, der er godkendt i prøvetagningsproceduren jf. uddannelsesplan prøvetagning Esbjerg(28). Side 15 af 63

16 Venepunkturen udføres med en kanyle af typen, BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set med 21G (grøn) med lot nr jf. instruksen for blodprøvetagning(29). Instruksen for blodprøvetagning er udarbejdet ud fra CLSI s anbefalinger; Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard Sixth Edition(30). På baggrund af disse anbefalinger udføres hver venepunktur med kortvarig og løs stase (max 1 minut). Da der udføres venepunktur med en sommerfuglekanyle med slange, anvendes et umærket spildglas før projektets prøveglas fyldes, for at opnå korrekt fyldning af prøverøret(29 31). Et fyldt spildglas er også nødvendigt, når Trc er den eneste parametre der analyseres på, for at undgå evt. aktiverede trombocytter i prøveglasset, i forbindelse med den primære hæmostase, som beskrevet i det teoretiske grundlag under Trombocytter.(30). Rækkefølgen af prøverør i projektet er ifølge CLSI som følgende: Na-citatrør og derefter lithiumheparinrør(30). Efter prøvetagningen vendes prøverne forsigtigt, mindst 10 gange, på en prøvemixer af typen Bie & Berntsen A/S, Mixer 440 fra Swelab Instrument(29). Fra Lithium-heparinrør hældes plasma fra det primære prøverør til et sekundært prøverør. Dette er muligt pga. den mellemliggende gel der separerer cellekomponenter og plasma efter centrifugering(19), projektet udtaler sig derfor om kvaliteten af hele plasmavolumen ved hvert prøverør. Ved Na-citratrør bliver 500 µl plasma fra plasmaoverfladen i røret overført, via en pipette af typen Finnpipette Digital µl til et sekundært prøverør. Pipetten føres 0,5 cm under plasmaoverfladen, hvorefter opsuget udføres. Projektet udtaler sig derfor kun om dette område af plasma i Na-citratrør. Eksklusionskriterier for prøvematerialet omfatter teknisk besværlige prøvetagninger, der indbefatter vener der ruller eller kollapser, tykke venevægge og opståen af hæmatomer, da disse vil medføre at indstikket ikke forløber glat og dermed vil hæmostasen, og koagulationskaskaden aktiveres, hvilket kan påvirke projektets resultater(14). I forbindelse med teknisk besværlige prøvetagninger vil der ofte opstå hæmolyse, som beskrevet i det teoretiske grundlag Erytrocytter. Derfor er det bestemt at hæmolyse der overstiger 0,25 g/l (SI-units), i overensstemmelse med KBA s instruks for hæmolysevurdering(32), eksluderes fra projektet, med mindre at hæmolyse er påvist på flere prøver, der har undergået samme præanalytiske behandling, da dette vil kunne være årsag til hæmolysen. Måling af P-Trc i citrat har en begrænset holdbarhed som beskrevet i det teoretiske afsnit Trombocytter, hvis P-Trc ikke analyseres inden der er gået en time, vil prøven blive ekskluderet. Side 16 af 63

17 Beregning af antal prøver Til bestemmelse af det kritiske antal prøver der bør anvendes til projektet, med 95 % sandsynlighed, anvendes Westgards online-beregner. Til udførelse af beregningen anvendes følgende værdier, biologisk variation (CV w ), intermediære præcision (I %), og BIAS (B %). Fra Westgard er ovennævnte værdier udledt og ses I tabel 4. Tabel 4: skematiseret oversigt over biologisk variation, intermediær præcision og BIAS. til beregnings af det kritiske antal prøver for parametrene B-Ery og B-Trc. CV w I % B % B-Ery B-Trc Med anvendelse af de oplyste værdier i tabel 4, i onlineberegneren, oplyses det at der bør anvendes 17,1 prøver i forhold til B-Trc og 11,47 prøver i forhold til B-Ery. På baggrund af disse oplysninger, samt KBA s krav til metodesammenligning(33) er det blevet valgt at der i hvert opnået niveau skal anvendes mindst 20 prøver, i tilfælde af nødvendig ekskludering af prøver, øges dette til 24 prøver pr. opnået niveau i hvert delforsøg. Mærkning af prøvetagningsrør Til delforsøg 1, anvendes 2 lithium-heparinrør og 2 Na-citratrør (primære prøvetagningsrør), der alle opmærkes på forhånd med håndskrevne prøvenumre. I tabel 5 ses en oversigt prøvemærkningssystemet. A1, B1, C1 og D1 stammer derfor fra den samme testperson, således er prøverne parrede i forsøget. Endnu et hold sekundære prøverør, mærkes ligeledes på forhånd med identiske numre, i forhold til de primære prøverør. Fra det primære prøverør A1, afpipetteres prøvematerialet til det sekundære prøverør der ligeledes er nummereret A1. Tabel 5: skematiseret oversigt over opmærkning af prøver i delforsøg 1. Centrifugerings driftstid 10 min. Centrifugerings driftstid 7 min. Testperson A B C D Natriumcitratrør Lithiumheparinrør Natriumcitratrør Lithiumheparinrør 1 A1 B1 C1 D1 2 A2 B2 C2 D2 3 A3 B3 C3 D3 A B C D 24 A24 B24 B24 B24 Side 17 af 63

18 Til delforsøg 2, anvendes 4 Na-citratrør (primære prøvetagningsrør). Primære og sekundære prøverør mærkes ligeledes på forhånd, med identiske håndskrevne prøvenumre som ved delforsøg 1. I tabel 6 ses en oversigt over prøvemærkningssystemet. Tabel 6: skematiseret oversigt over opmærkning af prøver i delforsøg 2. Natriumcitratrør Testperson E F G H Deceleration 3:14 min Deceleration 2:30 min Deceleration 1:53 min Deceleration 1:23 min 1 E1 F1 G1 H1 2 E2 F2 G2 H2 3 E3 F3 G3 H3 E F G H 24 E24 F24 G24 H24 Til delforsøg 3 anvendes 2 Na-citratrør (primære prøvetagningsrør). Primære og sekundære prøverør mærkes ligeledes på forhånd med identiske, håndskrevne prøvenumre som ved delforsøg 1 og 2. I tabel 7 ses en oversigt over prøvemærkningssystemet. Tabel 7: skematiseret oversigt over opmærkning af prøver i delforsøg 3. Natriumcitratrør Testperson I J 2000 g 2500 G 1 I1 J1 2 I2 J2 3 I3 J3 I J 24 I24 J24 Kriterier for analyseudvælgelse Med det teoretiske grundlag som udgangspunkt, vælges de for projektet, interessante analyseparametre i forhold til problemformuleringen. Dette omfatter P-Ery, P-Trc og H-Index. Måling af P-Ery omfatter lithium-heparinrør, imens måling af P-Trc omfatter Na-Citratrør. H- index måles på alle projektets prøver med forskellige formål. Na-citratrør anvendes primært til koagulationsanalyser. Som beskrevet i det teoretiske grundlag anbefales det af CLSI, at antallet af trombocytter i plasma ikke må overstige 10 10^9/L. For at sikre kvaliteten af Na-citrat stabiliseret plasma, under projektets delforsøg anvendes derfor parameteren P-Trc, der analyseres på Sysmex XE Side 18 af 63

19 Lithium-heparinrør med gel anvendes på KBA-SVS til kemisk analyseudredning. Gelen separerer de cellulære komponenter fra plasma. Dette er væsentligt for at undgå kontaminering fra de nedcentrifugerede celler, i forbindelse med deres metaboliske processer der ikke standses in vitro, og kan interfererer med parametre i plasma som fx P-Kalium og P-Glukose(19). Det er væsentligt at centrifugeringsfasen opnår komplet adskillelse af celler og plasma. Da Erytrocytter som beskrevet i det teoretiske grundlag udgør 99 % af kredsløbets celler, er P-Ery anvendt som parameter, til at kontrollerer kvaliteten af separeringen via centrifugering på lithium-heparinrør med gel. Hæmolyseindex måles på samtlige prøver i projektet. I forbindelse med Na-citratrør til koagulationsundersøgelse, anvendes hæmolyseindex til kontrol af prøvetagningen. Hæmolyse fremkaldt via en teknisk besværlig prøvetagning, kan aktiverer den primære hæmostase og trombocytter. I forbindelse med lithium-heparinrør måles hæmolyse både efter 0 og 8 timer, for at sikre at alle erytrocytter er passeret gennem gelen og ikke bevirker hæmolyse i plasma, både i forbindelse med prøvetagning og den præanalytiske behandling, samt henstand hvor efterbestilling af yderligere analysekvantiteter er muligt alt efter den givne parameters holdbarhed(34). Undersøgelsens design Undersøgelsen er kvantitativ undersøgelse, der er delt op i 3 delforsøg. Hvert delforsøg er baseret på parrede data. Da analysen P-Trc kun er holdbar en time(35), var det ikke muligt at opsamle, behandle og analyserer alt prøvematerialet til det enkelte delforsøget af én omgang, derfor blev hvert delforsøg inddelt i 4 identiske faser, til opretholdelse af prøvematerialets holdbarhed. I tabel 8, 9 og 10 vil hvert enkelt delforsøg blive beskrevet. Side 19 af 63

20 Delforsøg 1 Tabel 8: skemaet viser en oversigt over delforsøg 1 s prøvetagning, håndtering af prøverør og analysering af prøver fra 6 testpersoner(1 fase). Denne procedure gentages 4 gange, så der opnås 24 testpersoner i alt. Delforsøg 1 Centrifugerings driftstid Blodprøvetagning Centrifugering Afpipetteringen Analysering på Sysmex XE-5000 Apparatur nr. 1 Analysering på Architect c16000 Apparatur nr. 1 Analysering på Architect c16000 Apparatur nr. 1 6 testpersoner deltager i blodprøvetagning. Fra hver testperson fyldes 2 Na-citratrør og 2 lithium-heparinrør. Hver prøve vendes mindst 10 gange på en prøvemixer. (24 prøver i alt) 1 Na-citrat og 1 lithium-heparinrør, fra hver testperson, centrifugeres i 10 minutter på centrifuge 1. (12 prøver)(referencegruppe) 1 Na-citrat og 1 lithium-heparinrør, fra hver testperson, centrifugeres i 7 minutter på centrifuge 2. (12 prøver)(testgruppe) Na-citratrør: via en pipette (Finnpipette Digital µl) der føres 0,5 cm under plasmaoverfladen, opsuges og afpipetterers der 500 µl fra primær til sekundær prøveglas. Lithium-heparinrør: plasma hældes fra det primære prøverør til det sekundære prøverør. Først analyseres plasma fra Na-citratrør for P-Trc. Herefter analyseres plasma fra lithiumheparinrør for P-Ery. På samtlige prøverør foretages der en måling af interfererende stoffer (Hæmolyse, Ikterus, og Lipæmi) Efter 8 timers henstand af lithium-heparin plasma, måles der igen H-index på disse prøver. Der noteres starttidspunkt for prøvetagning, til overholdelse af holdbarhed af P-Trc i Na-citratplasma på en time. fælles deceleration: 3:14 minutter Fælles g-påvirkning: 2000 g Fælles temperatur: 21 C Prøverne analyseres via den manuelle aspirations pipette på Sysmex XE efter endt analysering af P-Trc, noteres sluttidspunkt for analysering. Lithium-heparin plasma opbevares tildækket med parafilm under henstandstiden og vendes inden analysering. Side 20 af 63

21 Delforsøg 2 Tabel 9: skemaet viser en oversigt over delforsøg 2 s prøvetagning, håndtering af prøverør og analysering af prøver fra 6 testpersoner(1 fase). Denne procedure gentages 4 gange, så der opnås 24 testpersoner i alt. Delforsøg 2 centrifugerings decelerationstid Blodprøvetagning Centrifugering Afpipetteringen Analysering på Sysmex XE-5000 Apparatur nr. 1 Analysering på Architect c16000 Apparatur nr. 1 6 testpersoner deltager i blodprøvetagning. Fra hver testperson fyldes 4 Na-citratrør. Hver prøve vendes mindst 10 gange på en prøvemixer. (24 prøver i alt) Fra hver testperson behandles de 4 prøverør således: 1 Na-citratrør decelereres i 3:14 minutter. På centrifuge 2. (referencegruppe) 1 Na-citratrør decelereres i 2:31 minutter. På centrifuge 1. (testgruppe) 1 Na-citratrør decelereres i 1,54 minutter. På centrifuge 2. (testgruppe) 1 Na-citratrør decelereres i 1:23 minutter. På centrifuge 1. (testgruppe) Na-citratrør: via en pipette (Finnpipette Digital µl) der føres 0,5 cm under plasmaoverfladen, opsuges og afpipetterers der 500 µl fra primær til sekundær prøveglas. Det afpipetterede plasma analyseres for P- Trc. På samtlige prøverør foretages der en måling af interfererende stoffer (Hæmolyse, Ikterus, og Lipæmi) Der noteres starttidspunkt for prøvetagning, til overholdelse af holdbarhed af P-Trc i Na-citratplasma på en time. Fælles driftstid: 10 minutter. Fælles g-påvirkning: 2000 g Fælles temperatur: 21 C Prøverne analyseres via den manuelle aspirations pipette på Sysmex XE efter endt analysering af P-Trc, noteres sluttidspunkt for analysering. Side 21 af 63

22 Delforsøg 3 Tabel 10: skemaet viser en oversigt over delforsøg 3 s prøvetagning, håndtering af prøverør og analysering af prøver fra 6 testpersoner(1 fase). Denne procedure gentages 4 gange, så der opnås 24 testpersoner i alt. Delforsøg 3 Centrifugerings g-påvirkning Blodprøvetagning 6 testpersoner deltager i Centrifugering Afpipetteringen Analysering på Sysmex XE-5000 Apparatur nr. 1 Analysering på Architect c16000 Apparatur nr. 1 blodprøvetagning. Fra hver testperson fyldes 2 Nacitratrør. (12 prøver) Hver prøve vendes mindst 10 gange på en prøvemixer. 1 Na-citratrør centrifugeres ved 2000 g på centrifuge 1. (referencegruppe) 1 Na-citratrør centrifugeres ved 2500 g på centrifuge 1. (testgruppe) Na-citratrør: via en pipette (Finnpipette Digital µl) der føres 0,5 cm under plasmaoverfladen, opsuges og afpipetterers der 500 µl fra primær til sekundær prøveglas. Det afpipetterede plasma analyseres for P-Trc. På samtlige prøverør foretages der en måling af interfererende stoffer (Hæmolyse, Ikterus, og Lipæmi) Der noteres starttidspunkt for prøvetagning, til overholdelse af holdbarhed af P-Trc i Nacitratplasma på en time. Fælles driftstid: 7 minutter fælles deceleration: 3:14 minutter Fælles temperatur: 21 C Prøverne analyseres via den manuelle aspirations pipette på Sysmex XE efter endt analysering af P-Trc, noteres sluttidspunkt for analysering. Side 22 af 63

23 Kvalitetssikring For at standardisere fremkomsten af analyseresultater, blev det valgt at analysering af udvalgte parametre skulle foretages på samme analyseapparatur, gennem hele projektets udførelse. For analysering af P-Trc og P-Ery blev Sysmex XE-5000 analyseapparatur nr. 1 valgt. For analysering af H-index blev Architect c16000 analyseapparatur nr. 1 valgt. Sysmex XE-5000 Til dokumentation for kvalitetssikring, for de i undersøgelsen udvalgte hæmatologiske parametre, analyseres interne kontroller til bestemmelse af den interserielle præcision. Den interne kontrol består af tre niveauer (L1, L2 og L3). I en 20 dages perioden fra den , hvor analysering af projektets prøver fandt sted, blev værdierne for de interne kontroller noteret, for henholdsvis B-Trc og B-Ery. På baggrund af disse værdier blev der beregnet en middelværdi, standardafvigelse (SD), og CV % der ses i henholdsvis tabel 11 og 12. Tabel 11: interseriel præcision for B-Trc. B-Trc L1 L2 L3 Middelværdi (10 9 /L) ,75 Standardafvigelse (10 9 /L) 2 5,40 5,11 CV % 3,5 2,4 1,0 Tabel 12: interseriel præcision for B-Ery B-Ery L1 L2 L3 Middelværdi (10 12 /L) 2,32 4,37 5,26 Standardafvigelse (10 12 /L) 0,02 0,03 0,03 CV % 0,9 0,7 0,6 KBA har opsat kvalitetsmål for den interserielle præcision (CV %) for både B-Ery og B-Trc(36), disse kvalitetsmål er identiske med Westgaard s anbefalinger(37). For B-TRC skal CV % være mindre end 4,6 %. For B-Ery gælder det at CV % skal være mindre end 1,6 %. For både B-Trc og B-Ery gælder det, at de overholder de fastsatte krav til interne kontroller. I figur 3, 4 og 5 er de noterede B-Trc kontroller i perioden illustreret i diagrammer. Her ses det at kontrollerne ikke falder uden for 2 SD i perioden, derfor er projektets resultater acceptable, og er ikke behæftet med tilfældige fejl. Side 23 af 63

24 Intern kontrol L1 - B-Trc 10^9/L Dage 67 10^9/L 56 10^9/L 45 10^9/L Figur 3: fordeling af kontrollen L1 i en 20 dages periode. de blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer Mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. Intern Kontrol L2 - B-Trc 10^9/L Dage ^9/L ^9/L ^9/L Figur 4: fordeling af kontrollen L2 i en 20 dages periode. De blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. 600 Internkontrol L3 - B-Trc 10^9/L Dage ^9/L ^9/L ^9/L Figur 5: fordeling af kontrollen L3 i en 20 dages periode B-Trc. De blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer Mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. Side 24 af 63

25 For B-Ery gælder det ligeledes at kontrollerne ikke falder uden for 2 SD i perioden, derfor er disse resultater heller ikke behæftede med tilfældige fejl. Kontrolværdierne for B-Ery er illustreret i figur 6, 7 og 8. 2,5 Intern Kontrol L1 - B-Ery 10^12/L 2,4 2,3 2, ,46 10^12/L 2,34 10^12/L 2,22 10^12/L Dage Figur 6: fordeling af kontrollen L1 i en 20 dages periode for B-Ery. De blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. Intern Kontrol 2L - B-Ery 10^12/L 4,7 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 4, Dage 4,63 10^12/L 4,41 10^12/L 4,19 10^12/L Figur 7: fordeling af kontrollen L2 i en 20 dages periode for B-Ery. de blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. Intern Kontrol 3L - B-Ery 10^12/L 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5, Dage 5,55 10^12/L 5,29 10^12/L 5,03 10^12/L Figur 8: fordeling af kontrollen L3 i en 20 dages periode for B-Ery. de blå streger illustrerer 2SD, den røde streg illustrerer mean. KBA s krav til Mean og 2SD ses til højre i diagrammet. Side 25 af 63

26 Den intraserielle præcision blev i forbindelse med projektets udførelse, også vurderet for både P-Ery og P-Trc. Da Trc og Ery i forbindelse med projektet måles på plasma, til vurdering at centrifugeringskvaliteten, findes cellerne i et lavt niveau i prøvematerialet. Det er derfor interessant at se, om analysen lever op til kvalitetsmålene i dette lave måleområde. En tilfældig prøve blev målt 10 gentagne gange, af den samme analytiker, på det samme apparatur. Resultaterne ses i tabel 13. Tabel 13: målinger til vurdering af den intraserielle præcision. Her gælder det at der er så få vaiabler som muligt. Analysering nr. Analytiker Dato P-Ery P-Trc 1 KBM , KBM , KBM , KBM , KBM , KBM , KBM , KBM , KBM , KBM ,00 20 Herefter blev der beregnet middelværdi, SD og CV %, disse ses i tabel 14. Også her overholdes de af KBA og Westgaard fastsatte krav, på en CV % der ikke overstiger 4,6 % for P-Trc og 1,6 % for P-Ery (36,37). Tabel 14: skematiseret oversigt over middelværdi, standardafvigelse og CV % på den i intraserielle præcision. P-Ery P-Trc Middelværdi 0, /L 20, /L Standardafvigelse 0, /L 0, /L CV % 0,0 % 3,4 % Til dokumentation for den eksterne kvalitetskontrol, anvendes resultaterne for den sidst analyserede eksterne kontrol, fra Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for laboratorier i sundhedssektoren (DEKS), der ses i figur 9, der også opfylder de forelagte krav til CV % som nævnt ved den interserielle præcision. Denne kontrol anvendes for at opnå en uafhængig kontrol af laboratoriets kvalitet, og dermed sikre sig at analyseresultaterne ikke er behæftede med systematiske fejl. Derudover anvendes den eksterne kontrol, til at sikre opfyldelse af Side 26 af 63

27 præsentationsprøvning ved akkreditering jf. pkt. 5,6 Kvalitetssikring af undersøgelsesprocedure i DS/EN ISO 15189(38). Figur 9: til venstre ses den sidst analyserede eksterne kontrol fra Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for B-Trc. Til Højre ses den samme kontrol for B-Ery. Begge kontroller lever op til de fastsatte krav. Der udføres kalibrering i sammenhold med laboratoriets rutine. Dette gøres af en servicetekniker fra Sysmex 1 gang årligt eller, efter behov(39). Sidste kalibrering blev foretaget d uden anmærkninger, der blev derfor ikke foretaget justeringer på apparaturet. Architect c1600 der udføres ikke kontrol i forbindelse med måling af Hæmolyse. I forbindelse med måling af interfererende substanser, måles der forinden på en blindprøve bestående af Saline (sterilt saltvand), denne prøve benyttes som referenceprøve. Formler for index-værdierne er indkodet i Architect c Systems software. Kalibration i forbindelse med denne protokol med Saline, er ikke nødvendig(26). Litteraturstudie I perioden juni 2014 december 2014 er der udført en systematisk litteratursøgning i databasen PubMed(40). De valgte publikationstyper, der er anvendt i projektet, tager udgangspunkt i problemstillingen, samt relevante emner indenfor håndtering af Side 27 af 63

28 prøvemateriale, i de præanalytiske og analytiske processer. Søgningerne er fortaget via MeSHdatabasens søgefunktion i PubMed, samt direkte i Pubmed. Følgende søgeord er blevet anvendt: Preanalytical variability Interference Specimen preparation/handle Hemolysis Turnaround time Centrifugation Coagulations testing Rapid centrifugation Laboratory testing Plasma samples Errors stat testing Ud fra disse søgeord fremkom flere brugbare publikationer, med relevans for projektets underbyggelse. Valgte artikler er udvalgt ud fra flere søgekriterier som nyeste litteratur, tilgængelighed, og publikationstype. Ud fra fundet relevant litteratur, er der fortaget kaskadesøgning, via PubMed databasen funktion lignende artikler. Etiske overvejelser Flere etiske overvejelser blev gjort i forbindelse forsøget og planlægningen heraf. Som kommende bioanalytiker er jeg allerede nu klar over, at bioanalytikerfaget bliver påvirket af store forandringer, i en tid hvor teknologien har vundet stort indpas, i de kliniske laboratorier rundt om på landets sygehuse. Dette sker på baggrund af det øgede fokus, der er kommet på patienten, og et optimeret patientforløb. Dette projekt tager udgangspunkt i den præanalytiske behandling af blodprøver. Præanalyse er et begreb, vi som bioanalytikerstuderende, gennem vores uddannelse har beskæftiget os meget med, og har lært vigtigheden af netop denne fase. Som beskrevet i baggrunden for dette projekt, er den præanalytiske behandling en flaskehals i forbindelse med analysering at blodprøver, hvilket resulterer i forlængede turnaround og Side 28 af 63

29 svartider. Dette projekt tager udgangspunkt i optimering af den præanalytiske fase, med håb om at kunne forkorte turnaround og svartid, med henblik på at kunne forbedre patientforløb. Projektet er blevet udført på bagrund af detaljeret planlægning, hvor jeg og resten af Bachelorgruppen (BG), har fået lov at bruge vores faglighed, ansvarlighed, kvalitetsbevidsthed og professionalisme, vi har tilegnet gennem uddannelsen og de kliniske forløb, og vi har arbejdet i fællesskab og benyttet os af hinandens kompetencer. Jeg kan derfor mærke at uddannelsen har lært mig, at værdsætte de 5 grundlæggende værdier der danner grundlag for bioanalytikeres fagetik(41). Etiske overvejelser blev gjort i forbindelse med valg af forsøgspersoner til projektet. Valget stod mellem patienter eller frivillige formodet raske testpersoner. BG valgte at anvende raske testpersoner på baggrund af forsøgets design, der stiller store krav i forhold til prøvematerialets holdbarhed, hvilket resulterer i et tidspres fra prøvetagning til analysering. Med valget at testpersoner frem for patienter, kunne BG stille krav omkring tid og sted for blodprøvetagningen, for at mindske den tid der går med transportering af prøverne. Det ville ikke kunne lade sig gøre med patienter, på grund af de fysiske forhold på SVS, hvor patienterne ikke befinder sig på samme matrikel som laboratoriet, og at det ville være etisk korrekt at møde patienten, og ikke omvendt. En anden årsag til valget af testpersoner ligger i prøvematerialet. Det er for forsøget ikke relevant, at have prøvemateriale inde eller udenfor bestemte områder af normalområdet, da der ikke måles på klinisk relevante parametre i projektet. Derfor faldt valget på formodet raske testpersoner, på baggrund af et ønske om normal differentiering af blodceller. Derudover vil det ikke være etisk forsvareligt at tage op til 4 ekstra prøverør på en svækket patient, når dette ikke er relevant for projektet. Videnskabsetisk komite (VEK) har ingen krav om tilladelsessøgning til udførelse af projekter til kvalitetsoptimering.(42) Ligeledes stiller VEK ingen krav om tilladelsesansøgning ved benyttelse af frivillige raske testpersoner.(42) Dataindsamling og holdbarhed Dataindsamling til delforsøg 1 foregår i uge 44, den 29/10/ /10/2014. Dataindsamling til delforsøg 2 foregår i uge 45, den 3/11/2014 4/11/2014. Dataindsamling til delforsøg 3 foregår ligeledes i uge 45 den 5/11/2014 6/11/2014. Tabel 15 viser en oversigt over Side 29 af 63

30 starttidspunkt for blodprøvetagning, og sluttidspunkt for analysering for alle tre delforsøg. Både prøvetagning og analysering udføres udelukkende af BG s medlemmer. Hvert delforsøg er som beskrevet i afsnittet undersøgelsens design, opdelt i 4 faser (6 testpersoner pr. fase) for at opretholde holdbarheden på én time for trombocytter i Na-citratrøret(35). Forud for prøvetagningen, indsamles 6 frivillige testpersoner blandt de ansatte og studerende i KDA. Tidspunkt for prøvetagning og analysering er dermed den samme for hver testperson i denne gruppe på 6 testpersoner. I tabel 15 ses at tiden fra prøvetagning til analysering, ikke overstiger én time, dermed overholdes holdbarheden af trombocytter. Tabel 15: skematiseret oversigt over tider for prøvetagning og analysering til de tre delforsøg til opretholdelse af Trombocytter i citrat på én time. Delforsøg 1 - Driftstid Delforsøg 2 - deceleration Delforsøg 3 g-påvirkning Start - Prøvetagning Slut - Analysering Start - Prøvetagning Slut - Analysering Start- Prøvetagning Slut - Analysering Test- Dato Tid Tid Dato Tid Tid Dato Tid Tid personer 1 29-okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov okt nov nov Side 30 af 63

31 der opstod ingen teknisk besværlige prøvetagninger, eller andre forhold, der danner grundlag for ekskludering af prøvemateriale. Dermed opretholdes n=24 i hvert niveau af hvert delforsøg. I tabel 16 ses tider for analysering af H-index på lithiumheparinrør efter prøvetagning og efter 8 timers henstand. Tabel 16: skematiseret oversigt over tider for blodprøvetagning og analysering efter 8 timers henstand fra prøvetagningstidspunktet, på lithium-heparinrør. Blodprøvetagning Analysering 8 timers henstand Testpersoner Dato Tid Tid 1 29-okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt okt Alle delprocesser i undersøgelsens tre delforsøg er udført af BG selv. Processerne blev udført under standardiserede forhold, i overensstemmelse med forsøgsplanen og KBA s instrukser for prøvetagning, og håndtering af prøvemateriale både præanalytisk, analytisk og postanalytisk. Herved minskes risikoen for at behæfte dataindsamlingen med tilfældige og systematiske variationer. Side 31 af 63

32 Databehandling Til vurdering samt illustrering af data benyttes X/Y-plots og søjlediagrammer. Disse anvendes til at skabe et overblik over de fremkomne data, samt afsløring af strukturer, man ikke ville opdage ellers. Til opsummering af illustrationerne beregnes der middelværdi og SD(43). Data er ydermere behandlet efter den deskriptive statistisk for normalfordeling af data. Dette gøres via probitplot for de relevante parametre i undersøgelsen. Et probitplot udarbejdes ved at sorterer data med mindste først. Herefter tildeles et rang numre. Hvert rangnummer omsættes nu til en sandsynlighed efter formlen: P = P er lig sandsynligheden, n er lig antallet af målinger, og R er lig rangnummeret. Herefter beregnes fraktilen i den normerede normalfordeling til hver sandsynlighed, via kommandoen i Excel kaldet NORMINV. Efterfølgende plottes resultaterne fra forsøget ind på X-aksen, med fraktilerne på Y-aksen. Danner plotsne en tilnærmelsesvis ret linje, kan data antages at være normaltfordelt(43). Differensplot anvendes til at vurdere differensen mellem to metoder. Dette gøres ved at udregne middelværdier for resultaterne af de to metoder, og herefter beregnes differensen mellem middelværdierne. Middelværdierne indsættes på x-aksen og differensen på y- R n+1 aksen(43). Databearbejdet er udført i Microsoft Excel Resultater De i undersøgelsen fremkomne analyseresultater er skematisk illustreret for henholdsvis delforsøg 1, 2 og 3, se bilag 1a, 1b og 1c. Side 32 af 63

33 Delforsøg 1 Figur 10 illustrerer målingerne af P-Trc på 48 Na-citratrør, efter centrifugering på henholdsvis 10 minutter (referencegruppe), og 7 minutter (testgruppe) Resultater delforsøg 1 - P-Trc P-Trc 10^9/L min 10 min målinger Figur 10: X/Y-plot for måling af P-Trc på Na-citratrør, efter centrifugering i henholdsvis 7 og 10 minutter. Den blå streg angiver grænsen for trombocytfattigt plasma Data for måling af P-Trc undersøges for normalfordeling via et probitplot der ses i figur 11 og 12, for både referencegruppen og testgruppen. Fraktil 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000-0,500-1,000-1,500-2,000 Probit plot - 10 minutter y = 0,9603x - 1,1604 R² = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 P-Trc 10^9/L Figur 11: figuren viser et probitplot til visualisering af normalfordeling for måling P-Trc ved referencegruppen på Na-citratrør i delforsøg 1. X-aksen afspejler differencerne på målingerne, med dertilhørende fraktiler på Y-aksen. En tilnærmelsesvis ret linje indikerer normalfordeling. Side 33 af 63

34 2,00 1,50 1,00 0,50 probit plot - 7 minutter y = 0,0714x - 1,4902 R² = 0,9253 fraktil 0,00-0,50-1,00-1,50-2, P-Trc 10^9/L Figur 12: figuren viser et probitplot til visualisering af normalfordeling for måling P-Trc ved testgruppen på Na-citratrør i delforsøg 1. X-aksen afspejler differencerne på målingerne, med dertilhørende fraktiler på Y-aksen. En tilnærmelsesvis ret linje indikerer normalfordeling Differencen mellem referencegruppen og testgruppen i forhold til parameteren P-Trc visualiseres ved hjælp af et differensplot som ses på figur Differensplot P-Trc - delforsøg 1 Differens af P-Trc ref. og P-Trc test (P-Trc 10^9/L) Middelværdi af P-Trc ref. og P-Trc test (P-Trc 10^9/L) Figur 13: figuren viser et differensplot for parameteren P-Trc for delforsøg 1, ved centrifugeringsdriftstid i 7 og 10 minutter. X-aksen afspejler middelværdien af målingerne for referencerøret og testrøret, hvor Y-aksen afspejler differencerne herimellem. H-indeks-værdierne for Na-citratrør for både referencegruppe og testgruppe er illustreret i søjlediagrammet i figur 14. Side 34 af 63

35 0,30 0,25 0,20 H-index - Na-citatrør - delforsøg 1 g/l (SI-units) 0,15 0,10 0,05 0,00-0,05-0,10-0, Målinger min. 7 min. Figur 14: søjlediagrammet viser H-index-værdierne på Na-citratrør for både referencegruppe (10 minutter) og testgruppe (7 minutter). Målinger findes på X-aksen og H-index-værdien findes på Y-aksen. Den orange streg angiver grænsen fra ingen til svag hæmolyse. H-indeks-værdierne for lithium-heparinrør for både referencegruppe og testgruppe er illustreret i søjlediagrammet i figur 15. 0,30 0,25 0,20 H-index - Lithiumheparinrør - delforsøg 1 g/l (SI-units) 0,15 0,10 0,05 10 min. 7 min. 0, målinger 1-24 Figur 15: søjlediagrammet viser H-index-værdierne på lithium-heparinrør for både referencegruppe (10 minutter) og testgruppe (7 minutter). Målinger findes på X-aksen og H-index-værdien findes på Y-aksen. Den orange streg angiver grænsen fra ingen til svag hæmolyse. H-indeks-værdierne for lithiumheparinrør for både referencegruppe og testgruppe efter 8 timers henstand er illustreret i søjlediagrammet i figur 16. Side 35 af 63

36 0,3 H-index - 8 timers henstand - Delforsøg 1 g/l (SI-units) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 10 min. 7 min målinger 1-24 Figur 16: søjlediagrammet viser h-index-værdierne på lithium-heparinrør efter 8 timers henstand, for både referencegruppe (10 minutter) og testgruppe (7 minutter). Målinger findes på X-aksen og H-index-værdien findes på Y-aksen. Den orange streg angiver grænsen fra ingen til svag hæmolyse. Til opsummering af resultaterne for henholdsvis P-Trc, P-Ery og H-index for samtlige prøverør er der beregnet middelværdi og SD. Disse værdier ses i tabel 17. Tabel 17: tabellen viser middelværdi og SD for alle parametre i delforsøg 1 ved både 7 og 10 minutters driftstid. Delforsøg 1 beregnede værdier 10 minutter 7 minutter Middelværdi SD Middelværdi SD P-Trc - 10^9/L H-index - g/l SIunits 0,01 0,02 0,00 0,01 P-Ery - 10^12/L 0,00 0,00 0,00 0,00 H-index - g/l SIunits 0,07 0,02 0,04 0,02 H-index henstand g/l SI-units 0,07 0,02 0,05 0,02 Delforsøg 2 figur 17 illustrerer resultaterne for P-Trc ved decelerationstiderne 2:31 og 1:23 minutter på i alt 48 Na-Citratrør. Side 36 af 63

37 12 Resultater - delforsøg 2 - P-Trc 10 8 P-Trc 10^9/L :23 02: målinger 1-24 Figur 17: X/Y-plot for måling af P-Trc på Na-citratrør, efter deceleration på henholdsvis 2:31 og 1:23 minutter. Den blå streg angiver grænsen for trombocytfattigt plasma. figur 18 illustrerer resultaterne for P-Trc ved decelerationstiderne 3:14 (referencegruppe)og 1:54 minutter på i alt 48 Na-Citratrør. 25 Resultater - delforsøg 2 - P-Trc P-Trc 10^9/L målinger 1-24 Figur 18: X/Y-plot for måling af P-Trc på Na-citratrør, efter deceleration på henholdsvis 1:54 og 3:14 minutter. Den blå streg angiver grænsen for trombocytfattigt plasma Side 37 af 63

38 Ovenstående resultater er ligeledes blevet undersøgt for normalfordeling via probitplot der findes i bilag 2. Differencen mellem decelerationstiden 2:31 og 1:23 minutter, i forhold til parameteren P-Trc visualiseres ved hjælp af et differensplot som ses på figur 19. Differens mellem P- Trc(1:23) og P- Trc(2:31) (10^9/L) Differensplot - Deceleration 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Midderværdi for P-Trc (1:23) og P-Trc (2:31) (10^9/L) Figur 19: figuren viser et differensplot for parameteren P-Trc for delforsøg 2, ved decelerationstiderne 2:31 og 1:23 minutter. X-aksen afspejler middelværdien af målingerne for referencerøret og testrøret, hvor Y-aksen afspejler differencerne herimellem. H-index værdierne for samtlige decelerationstider er illustreret i figur 20. 0,30 H-index - delforsøg 2 0,25 g/l (SI-units) 0,20 0,15 0,10 0,05 3:14 min 2:31 min 1:54 min 1:23 min 0,00-0, måling 1-24 Figur 20: Søjlediagrammet illustrerer H-index-værdierne for samtlige decelerationstider i delforsøg 2. Målinger findes på X- aksen og h-index-værdien findes på Y-aksen. Den orange streg angiver grænsen fra ingen til svag hæmolyse. Side 38 af 63

39 Til opsummering af resultaterne for P-Trc og H-index for samtlige prøverør, er der beregnet middelværdi og SD. Disse værdier ses i tabel 18. Tabel 18: tabellen viser middelværdi og SD for både P-Trc og H-index, ved samtlige decelerationstider i delforsøg 2. P-Trc 10^9/L H-index g/l SI-units Delforsøg 2 beregnede værdier 3:14 minutter 2:31 minutter 1:54 minutter 1:23 minutter Middelværdi SD Middelværdi SD Middelværdi SD Middelværdi SD ,00 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 Delforsøg 3 Figur 21 illustrerer resultaterne for parameteren P-Trc, ved g-påvirkning på henholdsvis 2000 g og 2500 g, med en driftstid på 7 minutter, på i alt 48 Na-Citratrør. 12 Resultater delforsøg 3 - P-Trc 10 8 P-Trc 10^9/L G 2500 G målinger Figur 21: X/Y-plot for måling af P-Trc på Na-citratrør, efter g-påvirkningen på henholdsvis 2000 g og 2500 g, med en driftstid på 7 minutter. Den blå streg angiver grænsen for trombocytfattigt plasma. Ovenstående data er undersøgt for normalfordeling via probitplot, der ses i bilag 2. Differencen mellem g-påvirkningen på henholdsvis 2000 g og 2500 g, ved en driftstid på 7 minutter, i forhold til parameteren P-Trc, visualiseres ved hjælp af et differensplot som ses på figur 22. Side 39 af 63

40 6 Differensplot - G-Påvirkning - delforsøg 3 Differens af P-Trc (2000g) og P-Trc (2500g) (10^9/L) Middelværdi af P-Trc (2000g) og P-Trc (2500g) (10^9/L) Figur 22: figuren viser et differensplot for parameteren P-Trc for delforsøg 3, ved g-påvirkningen på henholdsvis 2000 g og 2500 g, med en driftstid på 7 minutter. X-aksen afspejler middelværdien af målingerne for referencerøret og testrøret, hvor Y-aksen afspejler differencerne herimellem. H-index værdierne for samtlige Na-citratrør i delforsøg 3 er illustreret i figur 23. 0,30 H-index - delforsøg 3 0,25 0,20 g/l (SI-units) 0,15 0,10 0, g 2500 g 0,00-0, Aksetitel Figur 23: Søjlediagrammet illustrerer H-index værdierne for samtlige prøverør i delforsøg 3. Målinger findes på X-aksen og hæmolyseindex-værdien findes på Y-aksen. Den orange streg angiver grænsen fra ingen til svag hæmolyse. Til opsummering af resultaterne for P-Trc og H-index for samtlige prøverør i delforsøg 3, er der beregnet middelværdi og SD. Disse værdier ses i tabel 19. Side 40 af 63

41 Tabel 19: tabellen viser middelværdi og SD for både P-Trc og H-index, ved henholdsvis 2000 g og 2500 g, med en driftstid på 7 minutter, i delforsøg 2. Delforsøg 3 beregnede værdier 2000 g 2500 g Middelværdi SD Middelværdi SD P-Trc 10^9/L H-index g/l SIunits 0,01 0,02 0,01 0,03 Miniforsøg: placering i centrifuge På bagrund af delforsøg 1 og 2, gjorde BG nogle observationer, i forhold til systematiske mønstre ved centrifugering på centrifuge 2. Disse observationer dannede grundlag for et miniforsøg, i forhold til prøvernes placering i centrifugen. På figur 24, 25 og 26, ses forskellige placeringer af Na-citratrør i henholdsvis 1 og 2 racks. Figur 24: i figuren ses 4 Na-citratrør og deres placering i to racks Tabel 20: tabellen viser resultaterne for måling af P-Trc for de 4 Na-citratrør i figur 23. Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve /L /L /L /L Racks i figur 24 og 25 fungerer som modvægt for hinanden. Racket i figur 26 centrifugeres for sig selv, med tilsvarende modvægt. De tre racks gennemgår centrifugering i 7 minutter ved 2000 g, med deceleration på 3:14 minutter, ved 21 C. Herefter analyseres samtlige glas i deres nummererede rækkefølge for P-Trc på Sysmex XE Resultaterne for P-Trc i forhold til placering af prøver i figur 24 ses i tabel 20. Side 41 af 63