1.trimester doubletest analyseret og afprøvet på Immulite 2500 med henblik på overførsel fra Delfia Xpress

1.trimester doubletest analyseret og afprøvet på Immulite 2500 med henblik på overførsel fra Delfia Xpress eller 7. semester bachelorprojekt Afsluttet januar 2009 Udarbejdet af: Gülcan Kutluca Yilmaz Klinisk Biokemisk Afdeling, Glostrup Hospital Hovedvejler: Søren Frank Jørgensen Bivejledere: Britta Nielsen og Lotte Petersen Bioanalytikeruddannelsen København Professionshøjskolen Metropol Side 1 af 57

Begrebsdefinitioner hcg PAPP-A : Human Choriongonadotropin : Pregnancy-associated plasma protein A Trofoblastceller : forstadier til fosterceller, placenta er endnu ikke færdigudviklet. Placenta : moderkage Corpus luteum : er resterne af en follikel efter en ægløsning. Kaldes også for det gule legeme MOM : Multipel of median Time Resolved Fluorescense, TRF: tidsløs flourocense metode Non- disjunktion : manglende adskillelse af kromatiderne under mitosen Ovarier : æggestokke Akkuratesse : evnen til at give resultater, der er tæt på den sande værdi Inakkuratesse : er det modsatte af akkuratesse. Kaldes også for Bias (skævhed) Præcision : Apparatets evne til at ramme samme værdi Impræcision : Præcision udtrykt i tal IU/L : International Unit pr. Liter Bemærkning Bachelorprojektets praktiske del er blevet udført fælles med en anden bachelorstuderende. Rapporten starter på side 4. Side 2 af 57

Forord... 5 Resume... 6 Introduktion... 7 1.1 Indledning... 7 1.2 Problemformulering... 7 1.3 Hypoteser... 8 Kromosomafvigelser: Downs syndrom, Edwards syndrom og Pataus syndrom... 8 Human Choriongonadotropin... 8 Pregnancy-associated plasma protein A... 9 Analyse- og måleprincip for Immulite 2500... 10 Analyse- og måleprincip for Delfia Xpress... 11 MOM værdi... 12 Kvalitetskontrol... 13 1.4 Etiske overvejelser... 13 1.5 Metodevalg... 13 1.6 Afgrænsning... 15 2.1 Materialer og metoder... 15 2.2 Materialer... 15 Anvendt reagens på Delfia Xpress fra PerkinElmer... 15 Anvendt reagens på Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic... 16 2.3 Metoder... 16 Undersøgelsesdesign... 16 Præanalytiske procedurer... 16 3.1 Resultater... 20 Del 1: Kvalitetssikring med kontroller og pools... 20 Del 2: Eventuel signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver... 24 Del 3: Metodesammenligning mellem Delfia Xpress og Immulite 2500... 26 Del 4: Akkuratesseforsøg med Delfia Xpress kalibratorer... 27 Diskussion... 28 Del 1: Kvalitetssikring med kontroller og pools... 28 Interseriel impræcision... 29 Frit βhcg... 29 PAPP-A... 29 Pool... 30 Intraseriel impræcision... 31 Frit βhcg og PAPP-A... 31 Pools... 31 Delkonklusion for del 1... 31 Del 2: Eventuel signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver... 32 Delkonklusion del 2... 33 Del 3: Metodesammenligning mellem Delfia Xpress og Immulite 2500... 33 Delkonklusion på del 3... 34 Side 3 af 57

Del 4: Akkuratesse og impræcision på Immulite 2500... 34 Delkonklusion Del 4... 36 Del 5: Fordel og ulempe ved OSCAR princip for personalet og patienten... 36 Delkonklusion Del 5... 37 Opsummering... 37 Af hypoteser... 37 Af diskussion... 38 Konklusion... 38 Perspektivering... 39 Referenceliste... 40 Bilag 1:... 42 Bilag 2... 46 Bilag 3... 50 Bilag 4a... 51 Bilag 4b... 53 Bilag 4c... 55 Bilag 6... 57 Side 4 af 57

Forord En stor tak til mine tre vejledere, Søren Frank Jørgensen, Britta Nielsen fra Klinisk Biokemisk afdeling Gentofte hospital og Lotte Petersen fra Klinisk Biokemisk afdeling Glostrup hospital for en god vejledning gennem hele projektforløbet. Ligeledes vil jeg takke Sander Pyndt for at hjælpe til statistikken, samt for klinisk biokemisk afdeling, Glostrup Hospitalets personale for oplæring i de relevante apparaturer. En kærlig tak til familie og venner som har støttet mig igennem projektforløbet. Jeg vil også gerne takke min kollega og makker, Imrana P. Shahzadi, for et godt samarbejde til det praktiske laboratoriearbejde. Gülcan Kutluca Yilmaz Side 5 af 57

Resume På klinisk Biokemisk afdeling på Glostrup hospital anvendes Delfia Xpress til analysering af doubletest, P-Choriongonadotropin β -kæde; arb. stofk (frit β-hcg) og P-Pregnancy-associated plasma protein A; arb. stofk. (PAPP-A). Immulite 2500 analyserer serumprøver i både rutinen og i vagten. Baggrund: formålet med projektet er at undersøge om det er statistisk mulig at overføre analyseringen af doubletest fra Delfia Xpress til Immulite 2500. Delfia Xpress analyserer kun doubleprøver, mens Immulite 2500 analyserer dagligt prøver i rutinen. Personalet på klinisk biokemisk afdeling på Glostrup hospital vil få det nemmere med Immulite 2500, der allerede analysere flere prøver. Materialer og metoder: 76 serumprøver fra nygravide kvinder i 1. trimester er blevet anvendt til metodesammenligning mellem Delfia Xpress og Immulite 2500. Fremstillede kontroller og pools som kvalitetssikring blev analyseret inden serumprøver blev sat op. Der er blevet udført et forsøg med henblik på Immulites akkuratesse. Til dette er der anvendt kalibrator fra Delfia Xpress som blev analyseret på Immulite. Yderligere blev der udført pilotforsøg med henblik på en eventuel signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver. Resultater og beregninger: ud fra pilotforsøgene og metodesammenligning blev der udført dobbeltsidet parret t- test og lineær regression på metodesammenligning. Kontroller på Immulite 2500 samt pools på Delfia Xpress og Immulite 2500 er blevet analyseres med dobbeltbestemmelser, hvori inter- og intraseriel impræcision er blevet udregnet. Til akkuratesseforsøget blev Delfia Xpress kalibratorer analyseret 5 gange på begge apparater. Diskussion: pilotforsøgene viste ingen signifikant forskel på friske og optøede prøver. Derimod er der vist en signifikant forskel ved metodesammenligning af de to apparaturer. Den inter- og intraseriel impræcision på Immulites og Delfia Xpress kontroller og pools er beregnet og sammenlignet med FMFs krav. Det er dermed påvist at inter- og intraseriel på Delfia Xpress lever op til FMFs krav, mens for interseriel impræcision hos Immulites kontrol på frit βhcg middelniveau overskrider det tilladte afvigelse fra FMF. Også den intraserielle impræcision hos frit βhcg høj og middel kontrolniveauer overskrider. Konklusion: i dette projekt er Immulite 2500 afprøvet statistisk om en eventuel overførsel af doubletest fra Delfia Xpress. En overførsel af doubleprøver fra Delfia Xpress til Immulite 2500 kan ikke lykkedes. Side 6 af 57

Introduktion 1.1 Indledning Sundhedsstyrelsens rapport, fosterdiagnostik og risikovurdering, gav i 2004 nye retningslinjer indenfor føtal diagnostik i Danmark. Retningslinjerne omfatter at alle gravide skal tilbydes en risikovurdering for kromosomafvigelser som, Down-, Edwards- og Pataus syndrom, hos fosteret. Tilbuddet omfatter blodprøve og nakkefoldskanning i første trimester. [1] En risikovurdering sker på baggrund af forskellige faktorer. Disse faktorer er den gravides alder, koncentrationerne af frit βhcg og PAPP-A fra blodprøven, gestationsalder og nakkefoldens tykkelse. Med disse faktorer taget i betragtning omregnes værdierne til en multiples of median, MoM- værdien. Hvis risikoen er større end forholdet 1:350 tilbydes den gravide en moderkagebiopsi, og gælder som forsterdiagnostik. På Klinisk Biokemisk Afdeling, Glostrup hospital analyseres doubletest på apparatet Delfia Xpress. Glostrup hospital anvender One- stop Clinic Assesment of the risk, OSCAR, princippet. Princippet bygger på at den gravide får taget blodprøver og nakkefolscanning indenfor samme dag. Formålet med nærværende projekt er, at afprøve om Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic kan analyserer Delfia Xpress doubleprøver, i det Immulite 2500 dagligt analyserer prøver i rutinen mens Delfia Xpress benyttes til analysering af doubletests. Det vil derfor være en økonomisk fordel for afdelingen og nemmere for personalet på klinisk biokemisk afdeling, Glostrup hospital. Det engelske Fetal Medicine Foundation, FMF, stiller skarpe krav til apparaturernes statistik til risikovurdering. Det er få apparaturer, blandt andet Delfia Xpress fra Perkin Elmer, som er godkendt fra FMF til at analysere doubleprøver. Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic er ikke godkendt af FMF. Det er således interessant at undersøge om Immulite 2500 kan leve op til FMF s krav om impræcision og akkuratesse. 1.2 Problemformulering Er det muligt at flytte analyserne P-Choriongonadotropin beta-kæde; arb. stofk og P- Pregnancy-associated plasma protein A; arb. stofk., fra Delfia Xpress til Immulite 2500, og stadig bevare det acceptable kvalitetskrav for akkuratesse og impræcision? Hvilke fordele er der ved denne overflytning? Side 7 af 57

1.3 Hypoteser - Hypotese 1: Immulite 2500 kan køre analyserne β-hcg og PAPP-A hurtigere end Delfia Xpress - Hypotese 2: Der er ikke en statistisk forskel ved sammenligning af analyserne β-hcg og PAPP-A på Delfia Xpress og Immulite 2500 - Hypotese 3: Ved at analysere β-hcg og PAPP-A på Immulite 2500, er det økonomisk set besparende i forhold til at analysere på Delfia Xpress. Kromosomafvigelser: Downs syndrom, Edwards syndrom og Pataus syndrom Downs syndrom er den hyppigste kromosomafvigelse hos mennesket. Næst efter Downs syndrom er det Edwards og Pataus syndrom som fører til kromosomabnormaliteter. De to sidstnævnte kromosomafvigelser er langt mere sjældne og levetiden er ofte under 1 år. Det karakteristisk træk som fladt ansigt, stor tunge og skrå øjenspalter kendetegner Downs syndrom. En fjerdedel af børn med Downs syndrom er mental retarderet. Derudover har et barn med Downs syndrom en forhøjet risiko for leukæmi, hjertefejl og tilbagevendende infektionstilstande. Downs syndrom (trisomi 21), Edwards syndrom (trisomi 18) og Pataus syndrom (trisomi 13) kaldes opstår ved en ekstra kromosom henholdsvis på kromosom nummer 21, 18 og 13. [2] Børn der er født med trisomi 18 og 13 er som regel mental retarderet, døve og/ eller blinde og har ofte misdannelser i hjerte, hjerne, øjne og nyrer. Kromosomafvigelse hos de tre forskellige syndromer opstår ved en non- disjunktion af henholdsvis kromosom nr. 13, 18 og 21 under mitosen. [11] Kromatiderne fra kromosomet bliver fordelt ubalanceret i de nye døtreceller, så den ene dattercelle har 47 kromosomer, mens den anden har 45. En korrekt celledeling vil resulterer 46 kromosomer i hver celle. [3] [4] Human Choriongonadotropin Human Chorion Gonadotropin (hcg) er et glykoprotein som består af to subunits, α- og β- enhed. [8] Hormonet produceres og secerneres i de trofoblastiske celler fra placenta. Allerede i starten af graviditeten bliver placenta langsom dannet og virker som den overordnede endokrine kirtler, Side 8 af 57

hypothalamus og hypofysen. hcg har samme virkning som hypofysens LH, da begge hormoner stimulere lutealcellerne til producere progesteron og østrogener. hcg hormonets α- kæde er ens med hypofysens andre hormoner, blandt andet Thyreoidea Stimulerende Hormon (TSH), Luteiniserende Hormon (LH) og Follikel Stimulerende Hormon (FSH). Det er β- kæden som adskiller de forskellige hormoners struktur. I starten af graviditeten er det vigtigt at stimulere det gule legeme, corpus luteum, i ovarierne, så embryoet ikke afstødes. Det er hcg hormonets vigtigste funktion at vedligeholde og stimulere corpus luteum. hcg hormonet har stor lighed med LH hormonet. Derfor kan lutealcellers receptorer ikke kende forskel på de to hormoner og hcg hormonet kan reagere med LH hormonets receptorer på celleoverfladen. Hormonet transporteres ind i cellen ved hjælp af receptoren og påvirker proteinsyntesen til produktion af østrogener og progesteron. Østrogener og progesteron udvikler og stimulerer uterus til at holde på embryoet. [5] Hormonet er stigende op til 12. gestationsuge, men falder igen efter 12. uge under graviditeten og koncentrationen er meget lav frem til fødslen. [7] Der findes flere forskellige hcg strukturer og kan detekteres i urin og serum. Som biokemisk markør til bestemmelse af graviditet anvendes strukturer hvor β- kæden er frit tilstede hos hcg molekylet. [9] Pregnancy-associated plasma protein A Pregnancy Associated Plasma Protein A, PAPP-A, bliver produceret og secerneret under graviditeten i store mængder. PAPP-A findes også hos mænd og hos ikke - gravide kvinder. PAPP- A har en del vigtige funktioner i kroppen. Proteinet er blandt andet en protease og spalter derfor proteiner, vigtigst af dem er det vækstfaktoren, IGF. Det er derfor også en vigtig biokemisk markør for at se om fosteret lider af en form for abnormalitet. Lav PAPP-A hos den gravide vil betyde en lavere aktivitet af vækstfaktorer, som giver negativ effekt på vigtige processer i den tidlige placenta og senere placentavækst. Hos fostre med trisomi 13, 18 og 21 ser måleværdierne 40 % lavere sammenlignet med normale fostre i samme gestrationsalder (uge). [26] Side 9 af 57

Studier har vist at under graviditeten er PAPP-A bundet til et andet mindre protein eosinophil basic major protein, prombp. Når PAPP-A er bundet med prombp, hæmmes det enzymatiske aktivitet. [10] Yderligere er det PAPP-As funktion at medvirke til regulation og transport af glukose og aminosyrer til chorion villus, som næring til fosteret. Det er bevist at proteinet ikke findes i fostervandet, men bliver frigivet i det maternale serum. Koncentrationen fordobles hver 6. dag og når et plateau i ca. 14. gestrations uge. Analyse- og måleprincip for Immulite 2500 Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic er et apparat, der anvender fast-fase to-sidet kemiluminicens princip, altså, at apparaturet måler det udsendte lysintensitet fra antigen- antistof kompleks. Yderligere er analysen opbygget på en enzyme linket immunosorbent assay, ELISA metode. Til påvisning af frit β hcg og PAPP-A benyttes sandwich metoden. Til en sandwich metode, er der et overskud af polyklonalt enzymmærket antistofkonjugat. Dermed er det sikret, at antigener i serumprøven bliver fanget af både antistoffer som er coated på bead og antistofkonjugater. Detektering af PAPP-A/frit β hcg i serum hos Immulite 2500 Princippet bag analysen er følgende. I et reaktionskop tilsættes beads som er coated med IgG antistoffer og patientserum tilsættes. Antigenet, frit β hcg/ PAPP-A, som ønskes detekteret indgår i en reaktion med de coatede antistoffer under inkubation. Derefter tilsættes reagenset, som er et alkalisk fosfatasemærket antistofkonjugat. Reaktionskopperne er specielt fremstillet til vaskeprocedure. Under vaskeprocessen bliver reaktionskoppen slynget, så al ubundet materiale bliver vasket bort, mens bundet materiale bliver. Ved tilsætning af substrat sker der en reaktion, da enzymet, Alkalisk fosfatase, ændrer substratets struktur. Ved hydrolyse bliver substratet dephosphoryleret og produktet er negativt ladet og ustabil. Dermed udsendes fotoner. [20] Et luminometer detekterer prøveblandingen og sender de udsendte fotoner videre til en fotomultiplikator (PMT). PMT forstærker elektronerne og sender signalerne videre til Immulites software i form af counts pr. secunds (cps). Computeren udarbejder et svar. Der er et filter imellem luminometer og PMT. Formålet med filteret er at dæmpe for prøver der har et signal over 1000 cps. Dette skyldes fordi PMT er et følsomt udstyr og kan ikke nå at registrere alle indsendte elektroner. Filteret lader kun 1 % af elektronerne passere forbi. Side 10 af 57

Da metoden er sandwich metode skal det forstås at mængden antistofkonjugat som bliver bundet, er ligefrem proportionel med koncentration af frit β hcg/ PAPP-A i serum. Figur 1: viser de enkelte trin ved en sandwich metode hos Immulite 2500. Coated bead, serum og reagens blandingen inkuberes og vaskes. Ved tilsætning af substrat udsendes fotoner. Disse bliver detekteret i luminometer og forstærkes af PMT. Svar udgives til en computer der er koblet til Immulite. [23] Analyse- og måleprincip for Delfia Xpress Apparaturet Delfia Xpress benytter sig af princippet immunometrisk fluorescensmetode. Princippet bygger på at et antistof mærkes med en fluorochrom for at visualisere et bestemt antigen i prøvematerialet. [12] Princippet i fluorimetri er bygget op på, at molekyler i en opløsning absorberer lys og udsender fotoner. Absorption af lys sker i en kort bølgelængde. Det gør at molekylerne i opløsningen anslås, og kommer op i en højere energiniveau, men falder tilbage til grundtilstanden igen. Der sker en afgivelse af et energikvantum i form af varmeenergi. Ved afgivelse af varmeenergi udsendes lang bølgelængde og dermed fotoner. [13] Delfia Xpress benytter sig af Europium som fluorochrom og denne måles på en bølgelængde på 612 nm. Europium er et grundstof. [14] Detektion af PAPP-A/frit β hcg i serum på Delfia Xpress En reaktionskop coates der med et monoklonalt antistof, som er rettet mod frit β hcg / PAPP-A. Prøvematerialet og europiummærket monoklonalt antistof tilsættes. Det mærkede antistof er også specifikt rettet imod hcg/ PAPP-A. Frit β hcg / PAPP-A i prøvematerialet reagerer med de to antistoffer, idet antistofferne er rettet mod forskellige områder på frit β hcg / PAPP-A molekylet. Efter inkubationen, vaskes der for fjerne ubundet materiale fra reaktionskoppen. Tilsætning af Inducer-opløsningen dissocierer europiumioner fra det mærkede antistof og danner de frie Side 11 af 57

europiumioner. De frie europiumioner danner stærkt fluorescerende chelater med komponenter i Inducer-opløsningen. Fluorescenssignalet måles på en bølgelængde på 612 nm. Det afmålte fluorescenssignal er proportionelt med koncentrationen af frit β hcg/papp-a. Figur 2: viser kronologisk fremgang af prøvematerialet. [19] MOM værdi Koncentrationen af de biokemiske markører, PAPP-A og frit βhcg i første trimester, gestrationsalderen bestemt ved hjælp af nakkefoldscanning, den gravides alder, vægt og højde omregnes til Multipel of Median, MoM, som er en værdi til at beregne risikoen for at fosteret lider af trisomi 13, 18 og 21. Den beregnede MoM værdi fra den gravide sammenlignes med normalværdien. Normalværdien som benyttes skal være baseret på laboratoriets egne erfaring. [16] En lav koncentration af PAPP-A og en høj koncentration af frit βhcg øger risikoen for Downs syndrom i første trimester, mens lav koncentration af både PAPP-A og frit βhcg kan tyde på Edwards og Pataus syndrom. Dette er sagt ud fra de biokemiske markører, hvor de andre faktorer er ikke MoM værdien er uafhængig af gestrationsalderen og koncentrationens enhed. [16] medtaget. Side 12 af 57

Kvalitetskontrol Delfia Xpress På Delfia Xpress opsættes et 6 punkts kalibrering. [15] En kalibreringskurve fastlægges efter analysering af de 6 forskellige kalibreringsniveauer. Næstefter analyseres med kontroller. For hver kontrolniveau er der fastlagt en middelværdi ( x ) og spredning (SD) fra firmaets side. Der benyttes en acceptinterval som afdelingen har sat til x ± 2 SD. Hvis både kalibratorer og kontroller er fornuftige, kan man gå ud fra at patientprøvernes resultater er pålidelige. Udover de interne kontroller modtager Glostrup hospital hver måned eksterne kontroller. Eksterne kontroller analyseres og sammenlignes med andre hospitalers resultater i et samlet QC program, UKNEQAS. [16] Immulite 2500 På Immulite 2500 har firmaet, Siemens Diagnostic, fastlagt en kalibreringskurve fra firmaets side. Derfor justerer afdelingen efter denne kalibreringskurve. Efter en justering, analyseres kontroller før patientprøver kan analyseres på apparatet. [17] 1.4 Etiske overvejelser I projektet anvendes allerede rekvirerede doubleprøver, som bliver målt på Delfia Xpress. Resultaterne fra Delfia Xpress vil blive videresendt til den repræsentative afdeling af en erfaren bioanalytiker. De analysede serumprøver overtages og analyseres videre på Immulite 2500. Det vil ikke betyde noget for patienten, da resultater fra Immulite 2500 ikke videregives udenfor KBA. Da vores prøvemateriale er et biologisk materiale, og skal opfattes som potentiel smittefarligt, skal laboratoriets regler for hygiejne og håndtering af biologisk materiale overholdes. Patienternes personlige oplysninger vil blive anonymiseret. Al biologisk materiale bortskaffes som biologisk affald efter projektforløbet. 1.5 Metodevalg Til det praktiske laboratoriearbejde benyttes blodprøver fra nygravide kvinder fra 8. - 12. uge i graviditeten. Det praktiske forløb er blevet udført i samarbejde med en anden bioanalytikerstuderende. Side 13 af 57

Det forventes at opnå cirka 100 prøver, og dermed vil forsøget tage ca. 3-3½ uger, da der modtages ca. 10 prøver dagligt i hverdagene. Når prøverne er analyseret af en bioanalytiker på Delfia Xpress, vil vi analysere dem på Immulite 2500. Der analyseres først kontroller i dobbeltbestemmelse, og ligger disse indenfor de tilladte værdier, opsættes og analyseres prøverne. På klinisk biokemisk afdeling, Glostrup hospital, anvendes OSCAR, One Step Clinic for Assessment of Risk, princippet. [18] Med dette princip skal den gravide foretaget en blodprøve og nakkefoldsscanning samme dag. I dette projekt har vi valgt og koncentrere os om apparaturet, Immulite 2500s, akkuratesse, præcision og linearitet. Vi vil derfor også benytte statistikkens dobbeltsidet parret t-test. Vi vil undersøge akkuratessen, altså undersøge om analysens evne til at give resultater tæt på den sande værdi, hos Immulite 2500. På grund af tidsbesparelse og reagenser udføres først en pilotforsøg på Delfia Xpress og dernæst på Immulite 2500. Dette er for se om der er en eventuel signifikant forskel på friske og frosne serumprøver. Patientprøverne vil blive vurderet ud fra blandt andet dobbeltsidet parret t-test, da resultaterne er sammenhørende, altså fra samme population. Jeg vil benytte mig blandt andet af lineær regression og beregne regressionslinjen på Microsoft Excel. [21] Kontroller og pools analyseres op til 10 dage, hvilke betyder at den inter- og intraseriel impræcision kan beregnes. Interseriel impræcision udtrykker apparaturets analytiske variation over tidsperiode, dag-til-dag variation. Det er derfor vigtigt at interseriel impræcision ligger stabil og afvigelsen ikke overskrider afdelingens krav. Den intraserielle impræcision udtrykker variationen mellem de enkelte prøvers resultater, som regel indenfor samme dag. Kontrollerne hos Delfia Xpress bliver beregnet og det fundne inter- og intraseriel impræcision bliver sammenlignet med FMFs krav om inter- og intraseriel impræcision. Til akkuratesse, pilot- og patientprøveforsøge bliver spredning (SD) og afvigelse i procent (CV %) beregnet. Alle prøver får en specifik nummer, så der ikke sker en blanding af prøver og resultater. For eksempel første forsøgsdag og første prøve hedder A1, samme dag men anden forsøgsprøve kaldes A2, anden forsøgsdag og tredje prøve kaldes B3 osv. Dermed kan man altid vende tilbage til den pågældende prøve. Al patientmateriale og oplysning gemmes og offentliggøres ikke i rapporten. I dette projekt vil afsnittet vedrørende økonomi omfatte en cirka beregning af prisen pr. patientprøve. Da jeg ikke har detaljeret prisliste vil det kun få økonomiske aspekter blive diskuteret. Side 14 af 57

1.6 Afgrænsning På grund af besparelser af reagenser og tid er der blevet udført pilotforsøg på henholdsvis Delfia Xpress og Immulite. Resultater fra double prøverne, som er i forvejen analyseret på Delfia Xpress af en bioanalytiker bruges, frem for at analysere alle prøverne om. Vi har satset på cirka 100 patientprøver, men nøjes med 76 prøver. Det er på grund af tids- og reagensmangel. 2.1 Materialer og metoder Dette afsnit omfatter prøvematerialets behandling, apparaturliste og reagensliste. Der er et afsnit som handler om de anvendte statistiske tests og skemaer til beregning af akkuratesse, præcision og linearitet. 2.2 Materialer Prøvematerialer fra patienter I løbet af de tre ugers praktiske laboratorieperiode er der blevet opsamlet 76 patientprøver fra nygravide, mellem 8. 12. gestrationsuge. KBA Glostrup anvender OSCAR princippet, derfor skal prøverne centrifugeres hurtigt og analyseres på Delfia Xpress. Både Delfia Xpress fra PerkinElmer og Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic bruger serum til analyserne. Derfor skal en doubletest tages i et tørglas eller i et thrombinglas. EDTA og heparin glas må ikke benyttes, da blodet ikke koagulerer med disse. Patientprøven centrifugeres i 3000 omdr./ min i 10 minutter. inden de opsættes på Delfia Xpress. Fremstilling af pool Til fremstilling af pool er der brugt 10 serumprøver, som blandes sammen. Anvendt reagens på Delfia Xpress fra PerkinElmer Højrisiko kontrolniveau, 33,1 IU/L for frit βhcg og 0,486 IU/L for PAPP-A, Middelrisiko kontrolniveau, 53,5 IU/L for frit βhcg Lavrisiko kontrolviau, 102 for frit βhcg og 2,153 IU/L for PAPP-A Kalibrator, Inducer, Tracer, Penne og Buffer, til PAPP-A og frit βhcg Økonomi: det er oplyst fra afdelingen at prisen er 88 DKK. pr. test. Side 15 af 57

Anvendt reagens på Immulite 2500 fra Siemens Diagnostic Justering, frit βhcg og PAPP-A Høj (86,0 IU/L), middel (27,9 IU/L) og lav (6,0 IU/L) kontrollerniveauer, 10 nuncrør*3, til frit β hcg i 3 niveauer (konc. hhv.) Høj (2,03 IU/L) og lav (0,4 IU/L) kontroller, 10 nuncrør, til PAPP-A Reagenser og beads, PAPP-A og frit β hcg Multidiluent og hcg diluent, til fortynding Økonomi: kontroller og reagenser har kostet 12.665,85 kr. uden moms og 15.819,81 kr. med moms. Reagenser for en parameter indeholder 200 test. Det betyder at prisen er 79 DKK. pr. test. Eksterne kontroller på Delfia Xpress er ikke anvendt under praktisk periode, hvorfor de ikke indgår i forsøget og dermed er ikke skrevet i projektet. 2.3 Metoder Undersøgelsesdesign Af hensyn til læsevenlighed og struktur i rapporten er undersøgelsesdesign, resultater og diskussion navngivet fra del 1 til del 5. Kronologisk handler delafsnitterne om kvalitetssikring, pilotforsøge, metodesammenligning, akkuratesseforsøg og fordel & ulempe ved OSCAR princip. Under del 5 vil jeg kort inddrage om økonomien. Præanalytiske procedurer Blodprøver til en doubletest bliver taget i et glas uden tilsætning af kemikalier. Glas som indeholder thrombin anvendes, da thrombin forkorter koagulationstiden. Blodprøver centrifugeres, idet man ønsker at analysere serumprøver kvantitativt og bestemme koncentrationerne af PAPP-A og frit βhcg. Det er vigtigt at serumprøver ikke er hæmolyseret, lipæmisk eller er manglende koaguleret, da apparaterne ikke kan analysere prøven. Del 1: Kvalitetssikring med kontroller og pools Kontroller og justeringer til Immulite 2500 samt kalibratorer til Delfia Xpress er købt i pulverform. Det er bioanalytikeren som fortynder og udportionere disse. Side 16 af 57

Til både PAPP-A og frit βhcg kontroller tilsættes, efter firmaets vejledning, destilleret vand og henstilles, inden udportionering i små glas. Glassene mærkes med kontrol- label. I hvert glas er der kontrolmateriale nok til at dobbeltanalysere pr. dag. Indholdet i hver justeringsflaske til PAPP-A og frit βhcg genopløses efter firmaets vejledning. Justeringsflaskerne vendes forsigtig til hele pulveret er opløst og udportioners. På Immulite 2500 er der for begge parameter en høj og en lav justering. Udportioneret justeringer sættes i fryseren ved siden af kontrollerne. Kalibratorer hos Delfia Xpress fortyndes efter forskriften fra firmaet Perkin Elmer. Kalibratorerne er ikke frosset ned, da de blev anvendt samme dag de blev opløst til akkuratesseforsøget (se senere). Der blev udvalgt en kalibrator E. Det er oplyst fra firmaet at E vil give 0,50 IU/L for PAPP-A, mens for frit βhcg er der valgt E som er oplyst til 100 IU/L. Ifølge firmaerne Siemens Diagnostic og Perkin Elmer skal al fortyndet reagens henstilles mindst 30 minutter inden anvendelse. Kontroller, justeringer og kalibratorer er blevet henstillet i cirka 45 minutter for sikkerhedsskyld. De har stået i stuetemperatur og tæt lukket med låg, så en fordampning eller kontamineringsrisiko minimeres. Desuden er de blevet vendt 2-3 gange under henstilling, så pulveret kan blandes op med vandet uden at ødelægge materialet. Ved første gang skal justeringsværdierne indtastes på Immulite 2500. Også kontrolværdier indtastes, som omfatter middelværdien ( x ), spredningen (SD) og et acceptinterval på ± x 2SD. Til pool blandes ti tilfældige serumprøver og blandes godt inden disse udportioners og fryses ned. formålet med at fremstille pool er at finde ud af om der er forskel på kunstig fremstillet materiale, kontroller, biologisk materiale. Til fremstilling af pool er der ikke taget højde for koncentration af PAPP-A og frit βhcg. Del 2: Eventuel signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver Til pilotforsøget på Delfia Xpress opsamles 10 doubleprøver og centrifugeres ved 3000 omdr./min.i 10 minutter. Efter opstart af apparatet og analysering af kontroller samt godkendelse af kontrollerne, bliver patientprøverne analyseret. De friske serumprøver analyseres i rutinen af en bioanalytiker. Prøverne afpippeteres og overføres i et andet glas med et specifikt nummer. Side 17 af 57

Accession nummeret og det unikke nummer skrives ind i et skema, som ikke offentliggøres. Serum der er overført i et tørglas fryses ned til -20 ºC til næste dag. Prøverne optøes og velblandes inden de analyseres igen på Delfia Xpress. Resultaterne noteres ned i skema, der beregnes dobbeltsidet parret t- test (se bilag 1). Til pilotforsøget på Immulite 2500 anvendes 13 centrifugerede serumprøver. Inden serumprøverne kan opsættes skal Immulite 2500 opstartes hver morgen med daglig vedligeholdelse. Justeringer og kontroller opsættes og analyseres. Kontrollerne godkendes før patientprøver kan analyseres på apparatet. Alle kontroller analyseres i dobbeltbestemmelse, da det vil give en mere nøjagtig resultat, se diskussionsdelen. Serum overføres til et andet glas og mærkes med et nummer, hvorefter prøverne analyseres. Resultatet af de friske prøver noteres i et skema. Prøverne får låg på og nedfryses, til næste dag, på -20 ºC. De frosne prøver optøs og bliver blandet, inden de opsættes på apparatet. Der udføres en dobbeltsidet parret t- test. Beregninger og resultater noteres i skema (se bilag 1). Del 3: Metodesammenligning mellem Delfia Xpress og Immulite 2500 Ved 1. kørsel bliver justeringer opsat. Justeringsværdier indtastes for PAPP-A og frit βhcg inden de opsættes og analyseres. Kontroller og pool analyseres i dobbeltbestemmelse på Immulite 2500. Kontrollerne tjekkes for om de er indenfor acceptintervallet, x ± 2SD, som afdelingen har fastlagt. Optøede serumprøver bliver velblandet inden de analyseres på Immulite 2500, mens pool bliver opsat på Delfia Xpress til analysering. Resultater printes ud og noteres i skemaerne (se bilag 2). Del 4: Akkuratesseforsøg med Delfia Xpress kalibratorer Ud af Delfia Xpress 6 kalibratorer, udvælges en middel kalibratorniveau. En kalibrators koncentration er oplyst fra firmaet, derfor kan kalibrator benyttes til et forsøg med formål at beregne akkuratessen og impræcision. Kontrollerne opsættes og analyseres inden Delfia Xpress kalibratorer kan opsættes på Immulite 2500. Delfia Xpress kalibrator for PAPP-A og frit βhcg opsættes på Immulite 2500. Der bestilles 5 gentagne analyser og svar printes ud (se bilag 3). Side 18 af 57

Anvendt statistik Beregninger som middelværdi ( x ), spredning (SD) og variationskoefficient, samt dobbeltsidet parret t-test er beregnet vha. lommeregneren og Microsoft Excel. Dobbeltsidet parret t- test Det er samme serumprøver som analyseres på Delfia Xpress og Immulite 2500 og er parvis sammenhørende. Derfor er det relevant at benytte parret t-test, til eventuelt påvise en statistisk forskel. Signifikansniveauet sættes til 0,05, det vil sige 5 % risiko for falsk forkastelse af H 0 hypotesen også kaldes for α typefejl. Forkastes H 0 hypotesen, vil det betyde at der er statistisk forskel i analyseresultaterne på de to apparaturer. For at visualisere et eventuelt statistisk forskel tegnes en difference plot, XY plot og linier reggression. Reggressionslinien viser om der er en overensstemmelse mellem de to apparaturer. [27] Beregning af interseriel- og intraseriel impræcision, CV % For den inter- og intraserielle impræcision beregnes middelværdi, spredning og variationskoefficienten, altså afvigelsen. Det beregnede CV i procent sammenlignes med FMFs krav om interseriel- og intraseriel impræcision hos apparaturerne. Acceptable kvalitetskrav Fetal Medicine Foundation, FMF, har tilladt en bestemt afvigelse på apparaternes impræcision, afhængig af parameter og koncentration af parameter. Det er blandt andet formålet i projektet at afprøve Immulite 2500 og konkludere om Immulite 2500 lever op til det tilladte krav fra FMF. Tolkning af kontrolværdier på Delfia Xpress Delfia Xpress kontroller kaldes for lowrisk, mediumrisk og highrisk. Kontrollerne er navngivet efter risikogrupper for trisomi 13, 18 og 21. Derfor er highrisk en lav kontrolniveau (koncentration) mens det er det omvendte for lowrisk. Til gengæld for Immulite 2500s kontroller er der ingen ændring ved høj, middel og lav kontroller. Ved sammenligning af kontrollerne fra Immulite 2500 og Delfia Xpress, skal kontrollerne tydes således. For eksempel sammenlignes PAPP-A høj kontrolniveau på Delfia Xpress med Immulite 2500s lav kontrolniveau for PAPP-A. Side 19 af 57

3.1 Resultater Udover de 76 serumprøver der er analyseret på henholdsvis Delfia Xpress og Immulite 2500, er 10 serumprøver benyttet til fremstilling af pool og 10 serumprøver analyseret til pilotforsøg på Immulite. Del 1: Kvalitetssikring med kontroller og pools Interseriel impræcision beregnet ud fra Delfia Xpress kontroller Den interserielle impræcision på Delfia Xpress er bestemt ud fra de daglige kontroller der blev analyseret over en periode på to måneder. Delfia Xpress kontrolresultater er fra rutinens analyser. Til beregning af interseriel impræcision er spredningen og middelværdien beregnet. Delfia Xpress har to PAPP-A kontrolniveauer, henholdsvis høj og lav, mens frit βhcg har tre kontrolniveauer henholdsvis høj, middel og lav. Figur 3: kontrolværdierne er plottet ind i skemaet over flere dage. Figur 1 illustrerer de enkelte værdier. På den vandrette akse (x- aksen) er kontrolværdierne vist fra dag 1 og op til dag 24. Højrisiko kontrolniveau er faktisk lav kontrolniveau mens lavrisiko kontrolniveau er den høje kontrolniveau efter firmaets anvisning. Der ses ingen store sving i skemaet, hvilke viser at PAPP-A kontrollerne giver en meget stabil værdi. Side 20 af 57

Figur 4: viser, ligesom figur 1, de enkelte kontrolniveauers værdier over en tidsperiode på 28 dage (x- akse). Der er i alt 3 kontrolniveauer for frit β hcg. Læg mærke til at koncentrationen af frit β hcg og PAPP-A fra figur 3. Ud fra kontrollernes værdier over flere målinger i en periode, beregnes det interserielle impræcision, hvor det er afvigelsen i procent, CV %, som sammenlignes med FMF s krav om interseriel impræcision: Interseriel impræcision for PAPP-A, Delfia Xpress Høj kontrolniveau (2,153 IU/L) Lav kontrolniveau (0,446 IU/L) Beregnet CV % INTER 3,2 % 3,1 % FMFs krav til CV % INTER 6 % 6 % Tabel 1: Tabellen viser at den beregnede afvigelse i procent (CV %) fra Delfia Xpress er relativ lavere end den tilladte CV % fra FMF som er på 6 % for begge niveauer ved en konc. på hhv. 1,50 og 0,30 IU/L. Dette betyder at PAPP-A parameteret på Delfia overskrider ikke FMFs krav om interseriel impræcision. Koncentration af kontroller er oplyst fra firmaet. Interseriel impræcision for frit βhcg, Delfia Xpress Høj kontrolniveau (102 IU/L) Middel kontrolniveau (53,5 IU/L) Lav kontrolniveau (33,1 IU/L) Beregnet CV % INTER 2,7 % 2,9 % 2,7 % FMFs krav til CV % INTER 5 % 5 % 6 % Tabel 2: Tabellen viser de forskellige kontrolniveauers afvigelse i procent hos frit βhcg. Den beregnede CV % overskrider ikke FMFs krav om interseriel impræcision. FMFs interseriel impræcision krav er ud fra følgende koncentrationer: 85 IU/L for høj, 20 IU/L for middel og 8 IU/L for lavt niveau. En detaljeret beregning af interseriel impræcision er vedlagt som bilag 4a. Inter- og intraseriel impræcision beregnet ud fra Immulites kontroller Side 21 af 57

Figur 5 og 6: Figurerne viser værdierne af Immluites PAPP-A og frit βhcg kontroller i en periode på 10 dage. Ud af x- aksen er antal dage vist, mens y- aksen viser koncentrationen i IU/L. der Generelt ligger PAPP-A værdier stabile, mens frit βhcg svinger lidt, dog ikke værst. Inter- og intraseriel impræcision for PAPP-A, Immulite 2500 Høj kontrolniveau (2,03 IU/L) Lav kontrolniveau (0,4 IU/L) Beregnet CV % INTER 3,57 % 2,50 % FMFs krav til CV % INTER 6 % 6 % Beregnet CV % INTRA 2,45 2,78 FMFs krav til CV % INTRA 4 % 4 % Tabel 3: Tabellen viser det beregnede interseriel og intraseriel impræcision for høj og lav kontrolniveauer for PAPP-A. i tabellen er den beregnede inter- og intraseriel impræcision sammenlignet med FMFs krav. Ud fra CV % kan det bekræftes at PAPP-A lever op til FMFs krav. Inter- og intraseriel impræcision for frit βhcg, Immulite 2500 Høj kontrolniveau (86 IU/L) Middel kontrolniveau (27,9 IU/L) Lav kontrolniveau (6 IU/L) Beregnet CV % INTER 3,63 % 5,26 % 3,17 % FMFs krav til CV % INTER 5 % 5 % 6 % Beregnet CV % INTRA 5,04 4,87 3,30 FMFs krav til CV % INTRA 3 % 3 % 4 % Tabel 4: i denne tabel ses der en sammenligning på de tre kontrolniveauers CV % og FMFs krav på CV%. Middel kontrollen for frit βhcg lever dog ikke op til kravet om interseriel impræcision som FMF stiller, mens de andre værdier ligger en del lavere under grænsen, hvilke betyder at der er den tilladte afvigelse. En detaljeret beregning af af interseriel impræcision er vedlagt som bilag 4b. Inter- og intraseriel impræcision på pools fra Delfia Xpress og Immulite 2500 Pool er en sammenblanding af 10 patientserum. Pools er blevet udportioneret og frosset ned til -20º C og er uafhængig af koncentrationen af PAPP-A og frit βhcg. Alle pools er analyseret med dobbeltbestemmelser på begge apparaturer. Side 22 af 57

Figur 7: på venstre viser middelværdien for de enkelte pools. Ud fra figuren ses der næsten ingen afvigelse mellem de to apparaturers værdier. På x-aksen ses der pool numre analyseret over 9 dage. 1 pool pr. analyse sammen med kontroller og patientprøver. Figur 8: vises frit βhcg og middelværdien af de enkelte pools er plottet ind i figuren. Her kan det ses, ligesom i fig.5 at der næsten ingen variation. På x-aksen er det pool numre der er analyseret over 10 dage. Inter- og intraseriel impræcision på pool, Delfia Xpress og Immulite 2500 Delfia Xpress Immulite 2500 PAPP-A Frit βhcg PAPP-A Frit βhcg Beregnet CV % INTER 1,39 2,7 3,69 3,91 % FMFs krav til CV % INTER 6 5 6 5 % Beregnet CV % INTRA 1,61 1,31 4,47 1,73 % FMFs krav til CV % INTRA 4 3 4 3 % Tabel 5: Tabellen viser den beregnede inter og intraseriel impræcision på Delfia Xpress og Immulite 2500. Pools er analyseret i dobbeltbestemmelser. PAPP-A har en x = 1,299 på Delfia Xpress mens Immulite 2500 har x =1,21 IU/L. frit βhcg har en x =49,21 på Delfia Xpress mens Immulite 2500 har x = 54,67 IU/L. koncentration på parametrene fra pools aflæses på FMFs tabel og interseriel impræcision findes frem. FMF stiller krav til interseriel ved en PAPP-A konc. på 1,50 IU/L og frit βhcg på 20 IU/L. Ligeledes gælder det samme for intraseriel impræcision En detaljeret beregning af af interseriel impræcision er vedlagt som bilag 4c. Side 23 af 57

Del 2: Eventuel signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver Figur 9 og 10 begge figurer er fra pilotforsøg fra Delfia Xpress og er i hver sin figur for overskuelighed. Læg mærke til at koncentrationerne (IU/L) af PAPP-A og frit βhcg er anderledes (y-aksen). Der er benyttet 10 serumprøver som er nummeret fra 1 til 10 (x-aksen) Dobbeltsidet parret t-test PAPP-A Ved hjælp af Microsoft Excel er p- værdien beregnet til, p= 0,3995 med et signifikansniveau, α= 0,05. Det vil sige at hvis α < p = 0,3995, så er H 0 gældende. Det betyder ifølge parret t-test at der er en ingen signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver frit βhcg Igen ved hjælp af Excel er p-værdien beregnet til p= 0,4101 med et signifikansniveau, α= 0,05. Dvs. α < p= 0,4101 bliver H 1 forkastet og H 0 gælder. Ifølge parret t-test ses ingen signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver. Beregninger der er udført på lommeregner er vedlagt som bilag 1. Side 24 af 57

Figur 11 og 12: er begge søjlediagrammer som illustrerer et eventuelt forskel mellem friske og optøede serumprøver. Ser man på de enkelte prøver er der næsten ingen variation på koncentrationen (y- aksen). De 13 prøver er navngivet fra 1 til 13 (x-aksen) Dobbeltsidet parret t-test PAPP-A Ved hjælp af Microsoft Excel er p- værdien beregnet til, p= 0,3017 med et signifikansniveau, α= 0,05. Det vil sige at hvis α < p = 0,3017, så er H 0 gældende. Det betyder ifølge parret t-test at der er en ingen signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver frit βhcg: Igen ved hjælp af Excel er p-værdien beregnet til p= 0,8048 med et signifikansniveau, α= 0,05. Dvs. α < p= 0,8048 bliver H 1 forkastet og H 0 gælder. Ifølge parret t-test ses ingen signifikant forskel mellem frosne og friske serumprøver. Beregninger der er udført på lommeregner er vedlagt som bilag 1. Side 25 af 57

Del 3: Metodesammenligning mellem Delfia Xpress og Immulite 2500 Figur 13: Liniær reggession visualiser om der er overensstemmelse mellem de to apparaturer, Delfia Xpress og Immulite. På det vandrette akse er det koncentration i IU/L fra Delfia Xpress der er plottet ind i reggressionsskemaet, mens den lodrette er for Immulite. Delfia Xpress værdier er det gyldne standard i dette projekt. Den røde streg er den identiteslinjen, dvs. hvor y = x, altså at værdierne fra Delfia Xpress og værdierne fra Immulite 2500 er ideelle (ens). Den sorte streg er de resultater man har fået fra Delfia Xpress og Immulite 2500 ud fra analyserne. Ud fra reggressionslinjen, y = 0,7108x + 0,0362, mener jeg at der er en god overenstemmelse mellem apparaturerne, da hældningen ligger tæt på 1 og skæringen på 0 i forhold til identitetslinje med y = bx + a, hvor b=1 og a=0, altså y = x. Side 26 af 57

Figur 13: resultaterfra Delfia Xpress er sammenlignet med Immulite 2500 og plottet ind i figuren. Her ses koncentrationen af resultater fra Delfia Xpress i x- aksen og Immulite 2500 i y- aksen. Identitetslinjen er det linje der siger at der ingen forskel er på de enkelte værdier fra begge apparaturer, y = x Dobbeltsidet parret t-test PAPP-A Ud fra Excel har jeg fået en p- værdi på, p= 8,07717 10-14 med et signifikansniveau, α= 0,05. Det vil sige at hvis α > p = 8,07717 10-14, så er H 0 forkastet. Det betyder ifølge parret t-test at der er en signifikant forskel på de to apparaters analyseresultaterne hos PAPP-A. frit βhcg Igen ved hjælp af Excel er p-værdien beregnet til p= 1,97805 10-5 med et signifikansniveau, α= 0,05. Og hvis α > p= 1,97805 10-5 bliver H 0 forkastet og H 1 gælder. Det betyder ifølge parret t-test, at der er en signifikant forskel på de to apparaters analyseresultaterne hos frit βhcg. Beregninger der er udført på lommeregner er vedlagt som bilag 2. Del 4: Akkuratesseforsøg med Delfia Xpress kalibratorer Til akkuratesseforsøget er der anvendt kalibratorer fra Delfia Xpress som blev analyseret på både Delfia Xpress og Immulite 2500 5 gange. Akkuratessen er et udtryk på at ramme den sande værdi. På grund af materialemangel har vi valgt at analysere 5 gange. Akkuratessen er beregnet ud fra følgende formel: A% : (Xmålt Xsand) /Xsand 100% Antal analyse nr. DELFIA XPRESS IMMULITE PAPP-A IU/L FRIT βhcg IU/L PAPP-A IU/L FRIT β-hcg IU/L 1 2 3 0,914 A% = 8,6% 0,935 A% = 6,5% 0,893 A% = 0,7% 102,6 A% = 2,6% 102,8 A% = 2,8% 106 A% = 6% 2,62 A% = 162% 2,71 A% = 171% 2,69 A% = 169% 132 A% = 32% 131 A% = 31% 129 A% = 29% 4 0,923 106 2,76 131 Side 27 af 57

A% = 7,7% A% = 6% A% = 176% A% = 31% 5 0,894 A% = 0,6% 107,9 A% = 7,9% 2,49 A% = 149% 132 A% = 32% Oplyste værdier 1,00 100 1,00 100 x 0,912 105,06 2,65 131 A% af akkuratessen 8,82 5,06 165,4 31,0 CV % 3,35 % 5,25 % 3,94 % 0,94 % Tabel 6: viser de 5 gentagne analyser af det samme kalibrator for PAPP-A og frit βhcg. Ligeledes er de grå markerede bokse, akkuratessen beregnet i procent (A %). Der ses en stor inakkuratesse specielt hos PAPP-A målt på Immulite. En stor procentværdi betyder, at måleværdierne er langt fra den sande værdi. Gult markere er kalibratorernes koncentration som firmaet oplyser. Diskussion I dette afsnit vil resultaterne fra kvalitetssikring med analysering af kontroller og pools, pilotforsøgene og metodesammenligning mellem de to apparaturer, blive diskuteret. Jeg vil også diskutere de anvendte statistiske test, hvilket leder til en diskussion af akkuratessen på Immulite 2500. Endvidere vil jeg kort komme ind på økonomien for de to apparaturer. Del 1 handler om kvalitetssikring med kontroller og pools, Del 2 handler om pilotforsøgene, mens Del 3 handler om metodesammenligning mellem de to apparater, Del 4 om akkuratessen på Delfia Xpress og Immulite 2500 og endelig Del 5 kort forklaret om OSCAR princip samt inddragelse af økonomien Del 1: Kvalitetssikring med kontroller og pools Jeg vil kort nævne at afdelingen anvender to kontrolsystemer, interne og eksterne, som sikrer afdelingen at analysens akkuratesse og impræcision lever op til de fastsatte kvalitetskrav. De eksterne kontroller er ikke blevet benyttet i dette projekt, hvorfor jeg vælger ikke inddrage det. Afsnittet kvalitetssikring omfatter interseriel- og intraseriel impræcision på kontroller og pools på Delfia Xpress og Immulite 2500. Delfia Xpress kontroller er blevet analyseret i rutinen af en bioanalytiker i over flere måneder. Kontroller i rutinen bliver analyseret i enkeltbestemmelser, hvorfor der ikke kan udføres en Side 28 af 57

intraseriel impræcision på Delfia Xpress kontroller, men kun på pools fra Delfia Xpress i dette projekt. I dette afsnit vil jeg kort sammenligne kontrolmaterialet og pools med FMFs krav om inter- og intraseriel impræcision. Interseriel impræcision Frit βhcg Den interserielle impræcision er et udtryk for variation mellem dagene. Interseriel impræcision (CV % INTER) beregnes ved at dividerer SD med middelværdi af dobbeltbestemmelserne. På grund af besparelse af reagens og kontroller, har vi brugt resultater fra Delfia Xpress kontroller for frit βhcg og PAPP-A. Kontroller der blev analyseret i rutinen er blevet benyttet til beregning af interseriel impræcision (CV % INTER). Det beregnede CV % er blevet sammenlignet med interseriel impræcision fra FMF. Enkelte kontrolværdier for frit βhcg er blevet udtaget, fordi værdierne lå udenfor afdelingens tilladte acceptinterval på x ± 2SD. Det er kendt fra rutinen at frit βhcg kontroller fra Delfia Xpress tit ligger udenfor 2SD. De værdier der lå udenfor kontrolintervallet blev dog analyseret om i rutinen, se bilag 4a. FMF stiller krav til impræcision ud fra kontrollernes koncentration. For eksempel er det fastlagt fra FMF, at en frit βhcg koncentration på omkring 86 IU/L (høj kontrolniveau) må højst afvige 5 %. På tabel 1 og 2 er den beregnede CV % fra Delfia Xpress blevet sammenlignet med FMFs krav om interseriel impræcision. Det ses at Delfia Xpress kontroller for PAPP-A og frit βhcg lever op til FMFs krav, da det beregnede CV % er mindre end FMF s CV %. Den interserielle impræcision er også blevet sammenlignet med Immulite 2500s kontrollers CV %. I tabel 4 kan det ses, at middel kontrolniveau for frit βhcg har en CV % på 5,58 % mens FMF tillader en afvigelse på maksimum 5 %. Dermed er middel kontrolniveauets CV % for frit βhcg større end FMF s CV %. Det kan skyldes på grund af en outlayer, se bilag 4b. PAPP-A FMF stiller kravet til impræcision for PAPP-A på samme måde som for frit βhcg. Eksempelvis er det fastlagt fra FMF, at en PAPP-A koncentration på omkring 1,50 IU/L (høj kontrolniveau) må højst afvige 6 %. Side 29 af 57

Tabel 3 viser PAPP-A kontrollernes CV % hos Immulite 2500. CV % for den interserielle impræcision er langt under FMFs krav og det betyder at PAPP-A kontrollerne har en god interseriel impræcision hos Immulite, se tabel 3. Tabel 1 viser at PAPP-A kontroller på Delfia Xpress er indenfor de tilladte rammer for inteseriel impræcision, fastlagt af FMF. Pool Pool er biologisk materiale som blev fremstillet ved sammenblanding af serumprøver fra nygravide kvinder. I dette projekt er formålet med analysering af pool at sammenligne biologisk materiale med kunstig fremstillet materiale, som er kontrolmaterialet. Tabel 5 viser den interserielle impræcision i CV % sammenlignet med FMFs CV %. Ifølge FMFs krav er værdierne fra pool fornuftige og lever op til den interserielle impræcision. Der skal dog tages højde for at pool er en ukendt faktor, hvor den sande koncentration ikke kan fastlægges, selvom resultater fra Delfia Xpress er pålidelige kilde og betragtes som den gyldne standard. En anden bemærkning er, at pool ikke er inddelt i niveauer ligesom kontrollerne. Det er kun den ene koncentration fra pool der er kendt og sammenlignet med FMF. Pool fra Delfia Xpress har en x på 1,299 IU/L for PAPP-A og x på 49,21 IU/L for frit βhcg. Pool fra Delfia Xpress sammenlignes med kontrollerne fra Delfia Xpress. Delfia Xpress kontrol for PAPP-A højniveau har en middelværdi på 2,15 IU/L. Hvis middelværdierne på pools og kontrol sammenlignes, er kontrolniveauets koncentration af PAPP-A er dobbelt så høj end pool, hvorfor det også giver en højere CV % end hos pool. Ligeledes er det vist i tabel 5, at den interserielle impræcision på pools fra Immulite 2500 lever op til FMFs krav. Den interserielle impræcision på pools hos Delfia Xpress og Immulite 2500 er blevet sammenlignet med FMFs krav. Den afvigelse, som FMF tillader, er beregnet ud fra koncentrationer af PAPP-A og frit βhcg fra pool. Vores pools koncentration har været ukendt. Oprigtig ville det være bedre at gemme patientprøver med en bestem koncentration, for eksempel høj koncentration af frit βhcg og lav koncentration af PAPP-A og opblande 10 serumprøver. Koncentrationen ville stadig være ukendt, men man ville have en fornemmelse af koncentrationerne på paramenterne. Dermed kunne man på forhånd tage højde for den tilladte afvigelse. Side 30 af 57

Intraseriel impræcision Intraserielle impræcision giver et udtryk for variation mellem enkelte prøveresultater analyseret over samme dag. Den intraserielle impræcision (CV% INTRA ) bliver beregnet fra differencerne mellem dobbeltbestemmelserne. Dette betyder at hvis der er en stor difference mellem enkelte stikprøver der er blevet analyseret 1. gang og 2. gang vil det give en stor afvigelse. Frit βhcg og PAPP-A Den intraserielle impræcision fra Immulites kontroller er vist i tabel 3 og 4. Intraseriel impræcision er blevet sammenlignet med FMFs krav ligesom ved interseriel impræcision. Ifølge beregningerne og sammenligning kan det fortolkes fra tabel 3, at PAPP-A kontroller fra Immulite 2500 lever op til FMFs krav, idet PAPP-A kontrollers CV % er mindre end FMF s CV %. Derimod ses det i tabel 4, at frit βhcg har en CV % på 5,04 % for høj kontrolniveau, mens FMF tillader en afvigelse på højst 3 %. FMFs tilladte afvigelse på middel kontrolniveau for frit βhcg er på 3 %, mens middel kontrolniveauets CV % er beregnet til 4,87 %. Dermed er høj og middel kontrolniveauet overskredet kravet til intraseriel impræcision. En sådan afvigelse skyldes på grund af stor difference forskel, outlayer, mellem dobbeltbestemmelserne. For eksempel har der været enkelte outlayer for frit βhcg høj kontrolniveau, hvor differencerne er større end forventet. Blandt differencerne er de størst fundne på 3.4, 3.1 og 4.1. Det betyder at CV % INTRA er over det tilladte. Også frit βhcg middel kontrolniveau har en høj CV %. Se bilag 4b. Pools Pools fra Immulite 2500 og Delfia Xpress er vist i tabel 5. Det beregnede CV % lever op til FMFs krav, men igen, som nævnt i underafsnittet Interseriel impræcision er pools ikke delt op i høj, (middel) og lav koncentrationer, hvilket betyder at det er få værdier til at kunne sammenligne med FMF. Delkonklusion for del 1 Interseriel impræcision på Delfia Xpress kontroller lever op til FMFs krav. For Immulite 2500s kontroller, er den interserielle impræcision hos middel niveau for frit βhcg er højere end FMF tillader. Intraseriel impræcision på Delfia Xpress kontroller lever op til FMFs krav. Immulite 2500s frit βhcg middel- og høj kontroller lever ikke op til det tilladte intraseriel impræcision, som FMF har sat. Pools fra Delfia Xpress og Immulite 2500 er blevet sammenlignet med FMF. Pools lever op til FMFs krav om inter- og intraseriel impræcision. Side 31 af 57