Ansøgning Denne ansøgning er møntet på et fuldt finansieret MD/PhD 5+4 stipendium. Jeg vil gerne begynde hurtigst muligt, da jeg begynder på 11. semester i forårssemesteret 2010, men med en forventet ansøgningsproces på 6-8 uger vil det være først være realistisk at få tildelt stipendiet pr. 1. marts 2010. På dette tidspunkt er jeg en måned inde i mit 11. semester. Men da jeg allerede, inden et evt. stipendium tildeles, vil forske, hvad der forventes under et MD/PhD 5+4 stipendium, vil dette ikke få indflydelse på min projektplan. Ligeledes vil det heller ikke påvirke min studieplan, da jeg også allerede på forårssemestret 2010 påbegynder deltidsstudium. Baggrund De seneste års forskning har gjort det klart, at der igennem graviditeten foregår en betydelig celletrafik over placenta[1-3]. Forekomsten af føtale celler i maters blod har haft interesse, siden den blev påvist i gravide kvinders blod i midten af 1950 erne [4] (dog først med sikkerhed i 1979 [5]), da disse celler kan danne basis for prænatal diagnostik uden invasiv procedure[6]. Det vil være en stor fordel i forhold til abortrisikoen, der er forbundet med invasiv diagnostik. Den føtomaternelle celletrafik har derfor været genstand for betydelig forskning, men det var først i slutningen af 80 erne, at en gruppe havde succes med at få genetisk information om fostret fra analyseret blod fra mater [7]. Det store gennembrud med en non-invasiv prænatal diagnostik er udeblevet, formentlig på grund af det lave antal celler[8]. På basis af estimeret antal samt målte halveringstider er det skønnet, at formentlig flere tusinde føtale celler passerer placentamembranen pr. minut, og at dette er stigende gennem graviditeten[9]. Men da halveringstiden er ganske kort (under 15 minutter), er der kun yderst få levende føtale celler i maters blod. Det er skønnet, at der findes 2-6 føtale celler pr. ml. blod i slutningen af første trimester [1-3]. Føtale celler i maters blod: Som nævnt har forekomsten af føtale celler i maters blod givet anledning til mange forsøg på at udvikle en metode til prænatal diagnostik baseret på disse celler. På grund af det lave antal af føtale celler i maters blod har langt de fleste strategier bygget på, at man begyndte med at berige maters blodprøve for føtale celler, idet sjældenheden ellers ville gøre det næsten umuligt at finde dem[10]. De tilbageblevne celler efter berigelsen, som fortsat for en meget stor del bestod af maters celler, blev herefter farvet for Y-kromosomet, og man søgte så efter Y-kromosom positive celler[11]. Det siger imidlertid sig selv, at metoden kun kan være anvendelig til prænatal diagnostik, hvis man finder en anden markør for føtalcellen end Y-kromosomet, idet metoden ellers ville være begrænset til kun at kunne bruges i situationer, hvor kvinden venter en dreng. En sådan ikke Y- kromosombaseret føtalmarkør ville typisk være farvning for et protein, der er specielt for den føtale celle, og som altså ikke findes i maters celler. Det har derfor til stadighed været et vigtigt punkt i metodeudviklingen, at man fik identificeret, hvilken type celle fra fosteret der findes i maters blod, idet dette ville kunne bane vejen for valg af et protein eller en mrna, der er specifik for denne celletype. Kendskab til hvilken type føtal celle, det drejer sig om, ville også gøre det langt lettere at berige maters blodprøve for den pågældende føtalcelle. De fleste forskergrupper har været henvist til at gætte på, hvilken føtalcelle det er, og herefter farve cellerne i maters blod med antistoffer specifikt rettet mod denne føtalcelle. Med denne strategi har forskellige grupper undersøgt maters blod for celler indeholdende føtale hæmoglobiner med tanke på, at det kunne være en føtal erythrocyt[12-15]. Den føtale erythrocyt har dog vist sig at være ekstremt sjælden[3, 16]. Herudover har man forsøgt at identificere dels føtale lymfocytter[10, 23], dels føtale trophoblaster[17-20]. Det har vist sig særdeles svært at udvikle en prænatal tilfredsstillende metode baseret på den føtale trophoblast, ligesom den føtale lymfocyt har vist sig uegnet til prenatal diagnostik[10-11, 19-22]. Professor Steen Kølvraa har, sammen med firmaet FCMB ApS, valgt en anden projektlinie, nemlig at finde den føtale celle i maters blod uden a priori kendskab til typen, men med en teknik, hvor den føtale celle er bevaret, så dens udseende, mrna-indhold og proteinindhold kan fastslås. Dette har hidtil ikke været muligt, da de metoder, man har haft til rådighed, ikke har været skånsomme nok. Det specielle ved FCMB ApS s design, er at en blodprøve udtaget fra en gravid kvinde, der venter et drengefoster, gennemgår en procedure, hvor de røde blodlegemer først fjernes og efterfulgt af moderat berigelse, udstrygning af tilbageblevne celler på et stort antal mikroskop-slides, fiksering af cellerne med henblik på bevarelse af morfologi, mrna og proteiner, og sluttelig farvning af cellerne for Y-kromosom. På grund af den relativt sparsomme berigelse for føtale celler,
som denne metode indebærer, vil der være en overordentlig stor mængde maternelle celler tilbage, hvorfor det vil være nødvendigt at gennemse et overordentlig stort antal præparater for at finde føtale celler. Dette er et uoverkommeligt arbejde at gøre i hånden, men der er i gruppen udviklet et effektivt system til at finde disse celler baseret på automatisk scanning i et mikroskopbaseret system. Med denne teknik har det været muligt at finde og isolere så mange føtale celler, at det har været muligt at fremstille et cdna bibliotek ud fra isoleret mrna fra føtale celler efter laser-mikrodisektions fjernelse af disse. Dette bibliotek er herefter analyseret med flere typer expressions-array, og gruppen har nu rimeligt pålidelige expressions-data for den føtale celle. På basis heraf har gruppen kunnet formulere velbegrundede hypoteser for, hvilken celletype det drejer sig om og ud fra disse hypoteser kunnet definere antistoffer, der entydigt kan identificere føtalcellen i maters blod. Disse antistoffer kan nu benyttes til dels specifik berigelse for føtale celler fra en blodprøve, dels til endelig identificering af føtale celler, uanset om der ventes en dreng eller en pige. Det har imidlertid i det hidtidige udviklingsarbejde vist sig, at gravide kvinder i uge 10-12 udviser en betydelig variation i antallet af føtale celler i blodet. Der er på nuværende tidspunkt ingen viden om, hvad denne variation skyldes, men muligheden for, at den er associeret til graviditetens tilstand, eller prædikterer videre forløb, kan ikke udelukkes. Det er tidligere vist, at kvinder, der bærer et trisomi-21-drengefoster eller et vækstretarderet foster samt præeklamsi hos mater har flere føtale celler pr. ml blod end kvinder der bærer på et normalt drengefoster [22-25]. Ligeledes er det vist, at gravide kvinder, hvor disse endnu ikke har udviklet præeklamsi eller fostret vækstretadering, men har abnorm Doppler sonografi, har forhøjede antal cirkulerende føtale erythroblaster [26]. Det samme resultat er set i en case hvor en kvinde med idiopatisk polyhydramnios har forhøjet føtale erythrocytter [27]. Alle disse sygdomme er associeret med abnorme strukturelle ændringer af placenta [11]. Formål Formålet med projektet er at etablere en metode til enkeltcellediagnostik på føtale celler fra maters blod og herunder at identificere variabler, der er associerede med antal føtale celler i maters blod, og belyse de bagvedliggende mekanismer. Projektet Projektet vil blive delt op i en række delprojekter: Delprojekt A: beskrivelse af normalområder for antal føtale celler i maters blod Antal føtale celler i maters blod i relation til gestationsalder bestemmes hver anden uge på 1) en gruppe kvinder, der har konciperet efter transferering af cryopreserverede embryoner i naturlig menstruationscyclus. Disse kvinder er karakteriseret ved et meget veldefineret gestationsalder, men har selvfølgelig alle et fertilitetsproblem, hvorfor vi også inkluderer 2) en gruppe normale gravide, som tidligere har haft ektopisk graviditet eller tidlig spontan abort. Disse kvinder kommer typisk til kontrolskanning i graviditetsuge 6, hvorfor rekrutteringen kan foretages allerede på dette tidspunkt. Middel- og median koncentration, spredning, konfidensinterval for antal føtale celler i maters blod bestemmes i graviditetsuge 12, da det er denne gestationsalder, der er mest relevant mht. prænatal diagnostik. Der inkluderes ca. 100 gravide kvinder, som kommer til nakkefoldsskanning i graviditetsuge 11+3 til 13+6. Da der på 20 af disse kvinder også bestemmes antal føtale celler i maters blod i uge 19 i forbindelse med andre delprojekter, vil det også være muligt at lave longitudinelle analyser af disse. Dag til dag variationen, samt døgnvariation bestemmes på en lille gruppe gravide. Delprojekt B: antal føtale celler i maters blod i relation til anamnestiske variabler Da der ikke findes litteratur om årsager til forskelle i antallet af føtale celler i maters blod hos raske gravide kvinder, er denne projektdel induktiv. Hypotesen er, at fysisk påvirkning af uterus samt faktorer, der fra epidemiologiske studier vides at påvirke fostret, kan påvirke antallet af føtale celler i maters blod: Generelle faktorer og antal føtale celler i maters blod belyses ved at bestemme relation til paritet, gestationsalder, BMI, BT, kost, rygning, alkohol, arbejdspladsforhold, brug af kosmetik, medicinforbrug, hyperemesis, stressniveau, sygdom inden for de sidste 2 uger.
Faktorer inden for de sidste 3 og 24 timer belyses i forhold til fysisk aktivitet, tryk på abdomen, coitus, motion, og cykling. Antal føtale celler i maters blod før eller efter gennemførsel af abdominal ultralydsskanning. Informationerne indhentes fra de 100 gravide kvinder, der også deltager i delprojekt A, der får bestemt antal føtale celler i maters blod i graviditetsuge 12, dels ved spørgeskema, dels ved telefoninterview. Af disse vil der på 10 kvinder med et særligt højt og 10 kvinder med et særligt lavt antal føtale celler i maters blod i uge 12 bestemmes antal føtale celler i uge 19, samtidig med at der indsamles anamnestiske informationer som i uge 12. Delprojekt C: antal føtale celler i maters blod og placentafunktion, sygdom hos foster samt immunologisk inkompatibilitet Vi ønsker at belyse tre forhold, der kan påvirke antallet af føtale celler i maters blod: udskillelse af føtale celler fra fostret, passage af føtale celler gennem placenta og nedbrydning af føtale celler i mater. Fostret: Fosterbiometrier i uge 12 og 19, nakkefold i uge 12 og kongenit sygdom hos barnet. Placentafunktion: PAPP-A og frit βhcg i uge 12, føtal vækst fra uge 12 til uge 19, cytokiner i maters blod i uge 12 og 19, placenta-volumen og blodflow i uge 19 ved 3D ultralydsskanning [28-29]. Senere placentasygdom: præeclampsi, vækstretardering, gestationsalder ved spontan fødsel, fødselsvægt, Apgar score. Nedbrydning af fosterceller i mater: auto antistoffer: ABO uforlig mellem mater og foster. Disse variabler indhentes fra 1) Astraia databasen, hvori alle graviditetsskanninger rutinemæssigt registreres, 2) Den århusianske fødselskohorte, hvori informationer om alle graviditeter og fødsler registreres af forskningsjordemødre, 3) 3D UL bestemmelse af placentavolumen i graviditetsuge 19 samt bestemmelse af føtale og maternelle placentaflow ved overlæge Olav Bjørn Petersen, 4) navlesnorsblod opsamlet umiddelbart efter fødslen. De 100 gravide kvinder fra delprojekt A, der får bestemt antal føtale celler i maters blod i graviditetsuge 12, deltager i dette delprojekt. Af disse vil kun 10 kvinder med særligt høje og 10 kvinder med særligt lave værdier i antal føtal celler i maters blod i uge 12 gennemgå de ekstra undersøgelser, der afviger fra normalt misdannelsesskanning i graviditetsuge 19 (3D ultralydsskanning af placenta samt cytokiner i maters blod i uge 19) og de immunologiske undersøgelser ved fødslen. Disse udvalgte kvinder er de samme som i delprojekt B, og der vil således også blive bestemt antal føtale celler i maters blod i uge 19 på disse. Delprojekt D: mekanismer bag og enkeltcellediagnostik på føtale celler i maters blod Som beskrevet i baggrundsinformationerne råder FCMB ApS over teknikker, der gør det muligt at isolere og undersøge populationen af cirkulerende føtale celler. En senere fase i projektet vil derfor involvere, at man - når der er fundet signifikante associationer prøver at belyse de bagvedliggende mekanismer gennem detaljerede analyser af de cirkulerende føtale celler. Det planlægges således at undersøge de føtale celler for relevante intracellulære komponenter. Undersøgelserne kan foretages dels ved in-situ-teknikker, dels ved molekylære analyser af laser-mikrosisektions fjernede føtalceller. Hvilke komponenter, der kan blive undersøgt for, vil til en vis grad afhænge af udfaldene af delprojekterne B og C, men på nuværende tidspunkt planlægges at undersøge de føtale celler for cytokin-respons, og lave enkeltcellediagnostik mht. bakterier og virus-genomer (hovedvejlederens amerikanske samarbejdspartnere råder over teknikker til at analysere for bakterie og virusgenomer på enkeltcelle-niveau - disse teknikker kan evt. stilles til rådighed for projektet, ligesom FCMB ApS råder over teknikker til at generere expressionsprofiler for udvalgte celler). Som en speciel ekstension planlægges det herudover at søge interessante intracellulære fund bekræftet ved tilstedeværelsen af tilsvarende komponenter i plasma fra mater. På et senere tidspunkt planlægges det at undersøge for lignende parametre på placentabiopsier i uge 12 fra udvalgte kvinder. Den ph.d. studerendes bidrag Den ph.d. studerende har været med til at udvikle protokollen og spørgeskemaer og vil desuden stå for indsamling af informationer om patienterne dels ved interviews, dels ved søgning i databaser og journaler. Den ph.d. studerende vil forestå udførelsen af laboratoriearbejdet i delprojekt D. Desuden vil den ph.d. studerende lave hovedparten af databearbejdningen og udarbejdelse af manuskripter mhp. publikationer. Det planlægges ligeledes, at den ph.d. studerende vil tage på et udlandsophold, formentlig på Perinatology Research Branch,
Wayne State University i Detroit eller Chicago, hvor den ph.d. studerende vil tilegne sig metoder til enkeltcellediagnostik og forsøge at afprøve disse på vores føtale celle. Laboratorieteknikker Metode til bestemmelse af antal føtale celler i maters blod er veletableret på FCMB ApS, Vejle, idet blodprøver dog forbehandles på forskningslaboratoriet, Gynækologisk Obstetrisk afdeling, Skejby. Hvad angår enkeltcelle-analyserne er immunhistokemiske og FISH-metoder etablerede. På Vejle Sygehus forefindes et PALM laser-mikrodissektionsudstyr og teknisk ekspertise i betjeningen af det. I firmaet FCMB ApS er der allerede flere gange etableret cdna biblioteker fra mikrodissekerede føtale celler. De øvrige molekylære teknikker beherskes på Vejle Sygehus. Den ph.d. studerende vil tilegne sig alle disse teknikker. Cytokinbestemmelse med xmap technology på Luminex100 platform Luminex foretages på Statens Serum Institut i samarbejde med David Hougaard. Disse blodprøver skal nedfryses meget hurtigt efter prøvetagningen, hvilket der er etableret logistik til på laboratoriet. Blodtypeserologi udføres i samarbejde med overlæge Niels Grunnet fra blodtypelaboratoriet. Statistik Det har ikke været muligt at foretage styrkeberegning, da der ikke findes foreløbige erfaringer mht. metodepræcision. Størrelsen af populationerne er derfor baseret på skøn samt hvad der er praktisk gennemførligt. Varians analyse, bivariable analyser og multivariable analyser vil blive anvendt. Relevant statistisk bistand vil blive indhentet ved behov, ved Institut for Biostatistik, Århus Universitet. Alle analyser vil blive udført ved hjælp af STATA software. Videnskabsetiske overvejelser Videnskabsetisk tilladelse til delprojekt A, B & C foreligger allerede. VEK projektnummer: S- 20070045. Såfremt det skønnes at delprojekt D vil involverer yderligere videnskabsetiske problemstillinger vil der indhentes relevant tilladelse. Hvis dele af enkeltcelle diagnostikken skal foretages i udlandet, skal der indhentes tilladelse hertil fra Registertilsynet. Da disse analyser i givet fald skal udføres af Jacob Mørup Schlütter selv, og da individidentificerbare data således ikke overdrages til andre, forventer vi ikke problemer med at opnå denne tilladelse. Perspektiver Nuværende prænatale diagnostiske metoder er ikke optimale. Nuværende screening for Down syndrom i første trimester har en sensibilitet på blot 90% og 3-4 % får foretaget en moderkagebiopsi, som medfører abortrisiko på ca. 1%. Det ville derfor være en stor fordel at udvikle en sikker non-invasiv sceenings metode til uge 12. Ph.d. projektet omhandler optimering af metode til non-invasiv diagnostik, udvikling af ny screeningsmetode dels ved non-invasiv enkeltcellediagnostik men også om antallet af føtale celler er prædiktor for graviditetsforløbet og kan derfor have stor indflydelse på fremtidig prænatal diagnostik. Økonomi Den ph.d. studerende løn og kursusafgift finansieres af Århus Universitets fuldt finansierede MD/PhD 5+4 stipendium. Projektet er et samarbejdsprojekt imellem Gynækologisk-Obstetrisk afdeling, Skejby Sygehus, Klinisk Genetisk afdeling, Vejle Sygehus, og firmaet FCMB ApS. Udgifterne til projektet afholdes for så vidt angår celletællingerne af FCMB ApS. Øvrige analyser og undersøgelser afholdes af de berørte afdelinger og evt. af eksterne fondsmidler. De økonomiske midler i FCMB ApS er stillet til rådighed fra investorkredse i Østjylland kanaliseret gennem Inventure Capital og Østjysk Innovation.
Juridiske forhold i relation til FCMB ApS Den ph.d. studerende indgår som projektdeltager på vegne af Skejby Sygehus i samarbejdsaftalen mellem Skejby Sygehus, Vejle Sygehus og FCMB ApS af 30. oktober 2009. Forhold omkring rettigheder til opfindelser og publicering reguleres således efter denne aftale. Det præciseres at alle rettigheder til opfindelserne som bruges og skabes hos FCMB ApS i projektet omkring isolering og identifikation af føtale celler ejes af FCMB ApS Jens Christian Djurhuus har på vegne af klinisk institut accepteret samarbejdsaftalen. Projektplan Start: februar 2010. Alle projektdeltagerne rekrutteres blandt gravide på Skejby Sygehus. Da Jacob Mørup Schlütter allerede har indhentet anamnestiske data og fået bestemt antal føtale celler i maters blod på 100 kvinder fra graviditetsuge 12, påbegyndes analyse af delprojekt B straks. Jacob Schlütter gennemfører STATA kursus så snart som muligt. Indtil da vil medvejleder Ida Kirkegaard bistå ham ved de statistiske analyser. Analyserne vil formentligt kunne gennemføres på 1 4 måneder. Inklusion af de øvrige gravide til delprojekt A påbegyndes umiddelbart og vil formentligt strække sig over 4 til 6 måneder. Den statistiske analyse kan formentligt gennemføres hurtigt, hvorfor publikationer fra delprojekt A og B kan påbegyndes i løbet af første år. 3D UL-skanning af projektdeltagerne i graviditetsuge 20 udføres løbende, efterhånden som de når denne gestationsalder. Analyse af navlesnorsblod udføres i samarbejde med overlæge Niels Grunnet, blodtypelaboratoriet, men selvfølgelig først i forbindelse med fødslen. De sidste projektdeltagere vil formentligt have født ultimo 2010, og den statistiske bearbejdning af data fra delprojekt C vil herefter kunne gennemføres i foråret 2011 mhp. færdiggørelse af publikationer fra del A, B og C i 2011. I slutningen af 2011 vil den studerende ligeledes fremlægge midtvejseksamen. Fra foråret 2012 vil den studerende begynde med arbejdet i laboratoriet mht. delprojekt D. Den ph.d. studerende vil kunne arbejde på Vejle Sygehus og på FCMB ApS s laboratorium. Her planlægges det på nuværende tidspunkt, at den studerende skal undersøge føtalcellerne for relevante intracellulære komponenter, der kunne ligge til grund for variationen samt forsøge at lave enkeltcellediagnostik mht. bakterier og virus genomer. I efteråret 2012 vil den ph.d. studerende gennemføre et udlandsophold, hvor den studerende vil kunne udvikle enkeltcellediagnostikken yderligere. Herefter vil bearbejdningen af data fra delprojekt D gennemføres med blik for en publikation i foråret 2013. I 2013 vil den studerende desuden udarbejde ph.d. afhandlingen. Litteraturliste: [1] Krabchi K, Gros-Louis F, Yan J, Bronsard M, Massé J, Forest J-C, Drouin R. Quantification of all fetal nucleated cells in maternal blood between the 18th and 22nd weekds of pregnancy using molecular cytogenetic techniques. Clin Genet 2001; 60(2):145-150. [2] Kilpatrick MW, Tedas T, Evans MI, Jackson LG, Antsaklis A, Brambati B, Tsipouras P. Autromated detection of rare fetal cells in maternal blood: Eliminating the false-positive XY signals in XX pregnancies. Am J Obstet Gynecol 2004; 190:1571-81. [3] Kølvraa S, Christensen B, Lykke-Hansen L, Philip J. The Fetal Erythroblast is Not the Optimal Target for Non-invasive Prenatal Diagnosis: Preliminary Results. J of Histochemistry & Cytochemistry 2005; 53(3):331-336 [4] Bromberg YM, Salzberger M, Abrahamov A. Transplacental Transmission of Fetal Erythrocytes with Demonstration of Fetal Hemoglobin in Maternal Circulation. Obstet Gynecol 1956;7(6):672-4. [5] Herzenberg LA, Bianchi DW, Schröder J, Cann HM, Iverson GM. Proc. Natl Acad Sci; 76: 1453-1455 [6] Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG et al. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I Data. Prenat Diagn 2002; 22:609-15. [7] Lo YMD, Patel P, Wainscoat JS, Sampietro M, Gillmer MDG, Fleming KA. Prenatal sexdetermination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989; 2(8676): 1363-5. [8] Hahn S, Chitty LS. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and future perspectives. Curr Opin Obstet Gynecol 2008; 20:146-151. [9] Hamada H, Arinami T, Kubo T, Hamaguchi H, Iwasaki H. Fetal nucleated cells in maternal peripheral blood: frequency and relationship to gestational age; Hum Genet 1993; 91(5): 427-32. [10] Bianchi DW. Fetal Cells in the maternal circulation: Feasibility for prenatal diagnosis. Br J Haematol 1999; 105(3):574-83.
[11] Bianchi DW, Lo Dennis YM. Fetomaternal Cellular and Plasma DNA Trafficking: the Yin and the Yang. Ann N Y Acad Sci 2001; 945:119-31. [12] Christensen B, Philip J, Lykke-Hansen L, Kølvraa S. Sensitivity and specificity of the identification of fetal cells in maternal blood by combined staining with antibodies against beta-, gamma- and epsilon-globin chains. Fetal Diagn Ther 2003; 18(6):479-84. [13] Choolani M, O Donnal H, Campagnoli C, Kumar S, Roberts I, Bennett PR, Fisk NM. Simulateneous fetal cell indentification and diagnosis by epsilon-globin chain immunophenotyping and chromosomal flourscence in situ hybridization. Blood 2001; 98:554-557 [14] Voullaire L, Ioannou P, Nouri S, Williamson R. Fetal nucleated red blood cells from CVS washings: An aid to development of first trimester non-invasive prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2001; 21:827-834. [15] Mesker WE, Ouwekerk-van Velzen MCM, Oosterwijk JC, Bernini LF, Globus MS, Kanhai HHH, Van Ommen GJB, Tanke HJ. Two-colour immunocytochemical staining of gamma(gamma) and epsilon (epsilon) type hemoglobin in fetal red cells. Prenant Diagn 1998; 18: 1131-1137 [16] Christiansen B, Philip J, Kølvraa S, Lykke-Hansen L, Hromadnikova I, Gohel D, Lörch T, Plesch A, Bang J, Schmidt-Jensen S, Hertz J, Djursing H. Fetal Cells in Maternal blood: A comparison of Methods for Cell isolation and Identification. Fetal Diagn Ther 2005; 20: 106-112. [17] Mueller UW, Hawes CS, Wright AE et al. Isolation of fetal trophoblast cells from peripheral blood of pregnant women. Lancet 1990; 336(8709):197-200. [18] Van Vijk IJ, Griffioen S, Tjoa ML, Mulders MAM, van Vugt JMG, Loke YW, Oudejans CBM. HLA-G expresseion in trophoblast cell circulating in maternal peripheral blood during early pregnancy. Am J obstet Gynecol 2001; 184:991-997. [19] Tjoa ML, Delli-Bovi L, Johnson KL, Bianchi DW. Antibodies to trophoblast antigens HLA-G, placenta growth factor, and neurod2 do not improve detection of circulating trophoblast cells in maternal blood. Fetal Diagn Ther 2007; 22(2):85-89 [20]Vona G, Beroud C, Benachi A et al. Enrichment, immunomorphological and genetic characterization of fetal cells circulating in maternal blood. Am J Pathol 2002; 160:51-58. [21] Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ et al. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 yeats postpartum. Proc Natl Acad Sci 1996; 93: 705-708. [22] Bianchi DW. Current knowledge about fetal blood cells in maternal circulation. J Perinat Med 1998; 26:175-185. [23] Krabchi K, Gadji M, Samassekou O, Grégoire MC, Forest JC, Drouin R. Quantification of fetal nucleated cells in maternal blood of pregnant women with a male trisomy 21 fetus using molecular cytogenetic techniques; Prenat Diagn 2006; 26:28-34. [24] Al-Mufti R, Lees C, Albaiges G, Hambley H, Nicolaides KH. Fetal cells in maternal blood of pregnancies with severe fetal growth restriction. Hum Reprod. 2000;15(1):218-21. [25] Holzgreve W, Ghezzi F, Di Naro E, Gänshirt D, Maymon E, Hahn S. Disturbed feto-maternal cell traffic in preeclampsia. Obstet Gynecol;91:669-72. [26] Al-Mufti R, Hambley H, Albaiges G, Lees C, Nicolaides KH. Increased fetal erythroblasts in women who subsequently develop pre-eclampsia. Hum Reprod 2000;15(7):1624-8. [27] Zhong XY, Holzgreve W, Li JC, Aydinli K, Hahn S. High levels of fetal erythroblasts and fetal extracellular DNA in the peripheral blood of a pregnant woman with idiopathic polyhydramnios: case report. Prenat Diagn 2000;20(10):838-41. [28] Hafner E, Philipp T, Schuchter K, Dillinger-Paller B, Philipp K, Bauer P. Second-trimester measurements of placental volume by three-dimensional ultrasound to predict small-for-gestational-age infants. Ultrasound Obstet Gynecol 1998;12(2):97-102. [29] Hafner E, Schuchter K, van Leeuwen M, Metzenbauer M, Dillinger-Paller B, Philipp K. Three-dimensional sonographic volumetry of the placenta and the fetus between weeks 15 and 17 of gestation. Ultrasound Obstet Gynecol 2001;18(2):116-20.