Måleprogram - antibiotikaresistens i spildevand fra et sygehus og et boligområde

Transkript

1 Måleprogram - antibiotikaresistens i spildevand fra et sygehus og et boligområde Samarbejdsprojekt mellem Lynettefællesskabets Miljøgruppe og Statens Serum Institut Lynettefællesskabet I/S Statusrapport Februar 2004

2 Måleprogram antibiotikaresistens i spildevand fra et sygehus og et boligområde Agern Allé Hørsholm Tlf: Fax: Februar Web: bop@dhi.dk Klient Lynettefællesskabet I/S Klientens repræsentant Kaare Halse Projekt Måleprogram - antibiotikaresistens i spildevand fra et sygehus og et boligområde Projekt nr Forfattere DHI: Bodil Mose Pedersen, Ulf Nielsen, Claus Jørgensen Dato Februar 2004 Godkendt af Statens Serum Institut: Anette Hammerum, Dominique Monnet Gert Holm Kristensen Statusrapport BOP/CLJ ULN/ELS GHK Revision Beskrivelse Udført Kontrolleret Godkendt Dato Nøgleord Antibiotic resistens; Hospitals; Households; Monitoring programmes; Wastewater Klassifikation Åben Intern Tilhører klienten Distribution Lynettefællesskabet I/S: Statens Serum Institut: DHI: Kaare Halse Anette Hammerum, Dominique Monnet GHK-CLJ-ULN-BOP Antal kopier h:\bop\51816rapport.doc i DHI - Institut for Vand og Miljø

3 INDHOLDSFORTEGNELSE 1 BAGGRUND FORMÅL METODEBESKRIVELSE PRØVETAGNINGSSTEDER Renseanlæg Damhusåen Husholdninger Hvidovre Hospital ANALYSEPROGRAM OG ANALYSEMETODER Spildevandskarakterisering Spildevandsmængder og antibiotikakoncentrationer Opgørelse af antibiotikaforbrug Kvantitative resistensbestemmelser Kvalitative resistensbestemmelser MÅLEPROGRAM RESULTATER Spildevandskarakterisering Kvantitative resistensbestemmelser Koncentration af suspekte enterokokker og suspekte E. coli Sammenhæng mellem koncentration af resistente bakterier og antibiotikaforbrug Kvalitative resistensbestemmelser Ampicillin-resistente E. coli Gentamicin-resistente E. coli Erythromycin-resistente Enterococcus faecalis Vancomycin-resistente suspekte enterokokker KONKLUSION ANBEFALINGER REFERENCER...36 h:\bop\51816rapport.doc ii DHI - Institut for Vand og Miljø

4 BILAG A B C D E F G Protokoller til kvantitativ resistensbestemmelse Rådata fra kvantitativ resistensbestemmelse Antibiotikaforbrug og koncentrationer i spildevand Rådata for spildevandskarakterisering og analysemetoder Protokoller for kvalitativ resistensbestemmelse ATC-koder og antibiotika Gennemsnitlige bakterie- og antibiotikakoncentrationer h:\bop\51816rapport.doc iii DHI - Institut for Vand og Miljø

5 1 BAGGRUND Antibiotika er i de fleste europæiske lande den mest anvendte klasse af medikamenter, næst efter de almindelige smertestillende midler. Overdreven og i mange tilfælde forkert brug af antibiotika inden for human- og veterinærmedicin har medført en hurtig stigning i udbredelsen af antibiotikaresistente mikroorganismer. Mange af de ældre typer antibiotika er rent faktisk enten blevet ineffektive eller meget mindre pålidelige, end de førhen var. For eksempel er resistens over for penicillin som førhen blev foretrukket ved behandling af infektioner, der skyldes stafylokokker nu almindeligt udbredt i mange lande. Resistens over for antibiotika kan opstå ved mutationer i bakteriens DNA eller ved tilførsel af gener, der koder for antibiotikaresistens. Resistensgener kan overføres imellem bakterier indenfor samme art og nogle gange også imellem forskellige arter. Ved et stort forbrug af antibiotika øges selektionstrykket, og der vil derfor være en selektion af resistente bakterier, hvilket vil medføre, at det pågældende antibiotika ikke kan anvendes til behandling. Den mest alvorlige følgevirkning af resistens er fremkomsten af nye bakteriestammer, der er resistente over for flere antibiotika på samme tid (co-resistens). Disse multiresistente bakterier kan føre til behandlingssvigt, idet det ikke vil være muligt at finde antibiotika, der kan bruges til behandling. Ved behandling med antibiotika påvirkes patienternes tarmflora. De resistente tarmbakterier kan ledes ud i spildevandet via fæces. I dette projekt blev suspekte E. coli og suspekte Enterococcus spp. valgt som gramnegative henholdsvis grampositive indikatorbakterier. Derudover besidder både enterokokker og E. coli i høj grad evne til at opsamle resistensgener. Mange typer af antibiotika er stabile kemiske forbindelser, der ikke nedbrydes i kroppen, men forbliver aktive længe efter, at de er udskilt fra kroppen. Allerede på nuværende tidspunkt udgør antibiotika et væsentligt bidrag til det stigende problem med aktive medicinske stoffer, der cirkulerer i miljøet /3/. Som et led i at sikre et godt arbejdsmiljø for kloakarbejderne på renseanlæggene Lynetten og Damhusåen (RL og RD) har Lynettefællesskabet I/S ønsket at identificere og karakterisere mulige kilder til antibiotikaresistente mikroorganismer i spildevand fra renseanlæggenes oplande. Indledningsvis har Lynettefællesskabet gennemført et projekt: Forprojekt vedrørende regulering af medicinalvirksomheder og sygehuse Beslutningsgrundlag for spildevandsmålinger vedrørende Antibiotika og antibiotikaresistens samt hormonforstyrrende stoffer /1/. Undersøgelsesresultaterne viste, at der i den primære sundhedssektor i Lynettefællesskabets opland anvendes antibiotika svarende til 4,1 tons aktivt stof pr. år og ca. 1 tons aktivt stof pr. år på sygehusene. Typisk udskiller mennesker mellem 90 og 95% af det aktive stof med urin og fæces. Typiske repræsentanter for de mest anvendte antibiotikatyper i Danmark er ampicillin, tetracyclin, cefuroxim, erythromycin, sulfamethizol, vancomycin og decloxacillin. Ved hjælp af dyrkningsbaserede metoder kan koncentrationen af resistente bakterier i spildevand bestemmes. De største kilder til antibiotikaresistente bakterier forventes at være husholdninger og sygehuse samt virksomheder, der producerer antibiotika. I dette projekt koncentreres indsatsen om en kvalitativ og kvantitativ karakterisering af antibiotikaresistens i spildevand fra husholdninger og sygehuse samt i tilløbet til Renseanlæg Damhusåen. h:\bop\51816rapport.doc 1 DHI - Institut for Vand og Miljø

6 Miljøkontrollen i København igangsatte i begyndelsen af 2002 en undersøgelse af koncentrationen af antibiotikaresistente bakterier i spildevand før og efter tilledningen af spildevand fra Alpharma, der producerer vancomycin, polymycin, tobramycin m.fl. /2/. Bestemmelse af antibiotikaresistens i spildevand fra antibiotikaproducerende virksomheder indgår derfor ikke i dette projekt. Ved den nævnte undersøgelse blev det konkluderet, at der ikke var signifikante forskelle mellem koncentrationen af vancomycin-resistente bakterier i spildevandet opstrøms og nedstrøms udledningen af spildevand fra vancomycin-produktionen. Det totale antal vancomycin-resistente bakterier i spildevand indsamlet nedstrøms udledningen af spildevand fra vancomycin-produktionen var imidlertid højt. Undersøgelsen kunne ikke fastlægge, om de høje tal for vancomycin-resistente bakterier i spildevandet skyldtes udledning af spildevand fra vancomycinproduktionen, eller om vancomycin-resistente bakterier blev tilført med spildevand opstrøms fra. I øvrigt medførte udledning af spildevand fra vancomycin-produktionen ikke en stigning i koncentrationen af vancomycin-resistente bakterier i sedimentprøver fra kloaksystemet. I relation til viden om spredning og bekæmpelse af infektionssygdomme er det af interesse at udbygge viden om sammenhæng mellem tilstedeværelse af resistente bakterier i spildevand fra husholdninger og sygehuse og forbruget af antibiotika de på gældende steder. Da forbruget af antibiotika varierer over året både med hensyn til anvendte typer og mængder, er der en mulighed for, at der er en sammenhæng mellem forbruget af antibiotika og tilstedeværelsen af antibiotikaresistente bakterier dannet i relation til typen af anvendte antibiotika. De ovennævnte aspekter er søgt belyst ved gennemførelsen af dette projekt. Projektet er udarbejdet af en arbejdsgruppe nedsat af Lynettefællesskabets Miljøgruppe Arbejdsgruppen har haft følgende medlemmer: André Koefoed, Københavns Energi (formand), som pr. 1. december 2003 blev afløst af Jeanet Stagsted, Københavns Energi Morten Beha Pedersen, Hvidovre Kommune Iben Hoelgaard Frøkjær, Gentofte Kommune Henrik H. Thomsen, Frederiksberg Kommune Thomas Johannesen, Miljøkontrollen Kim Rindel, Lynettefællesskabet I/S DHI (Bodil Mose Pedersen og Claus Jørgensen) og Statens Serum Institut (Anette M. Hammerum og Dominique Monnet) har været tilknyttet arbejdsgruppen som konsulenter. h:\bop\51816rapport.doc 2 DHI - Institut for Vand og Miljø

7 2 FORMÅL Formålet med at gennemføre dette måleprogram har været at undersøge udledningen af resistente bakterier (Escherichia coli (E. coli) og enterokokker) fra et sygehus og et boligområde i oplandet til Renseanlæg Damhusåen og herunder: for fire udvalgte antibiotika (ampicillin, erythromycin, vancomycin og gentamicin) bestemme koncentrationen af resistente bakterier i spildevand fra et sygehus og et boligområde og sammenligne med bestemmelser i tilløbet til Renseanlæg Damhusåen (kvantitativ undersøgelse) at resistensbestemme udvalgte E. coli og enterokokker over for et bredt udsnit af antimikrobielle stoffer og antibiotiske vækstfremmere (kvalitativ undersøgelse af co-resistens) at sammenligne antibiotikaforbruget med forekomsten af antibiotikaresistente bakterier i spildevand fra husholdninger, sygehuse og ved tilløb til Renseanlæg Damhusåen De ovennævnte specifikke formål skal ses i relation til det overordnede formål, som indledende er at kortlægge, om sygehuse og/eller husholdninger er kilder til resistente bakterier. Såfremt der kan påvises en sammenhæng mellem antibiotikaforbruget og tilstedeværelse af antibiotikaresistente bakterier, skal der eventuelt via en risikovurdering tages stilling til behovet for regulering af antibiotikaforbruget og/eller tilledningen til kloaksystemet fra potentielle kilder i oplandet til renseanlæg. h:\bop\51816rapport.doc 3 DHI - Institut for Vand og Miljø

8 3 METODEBESKRIVELSE Kloakoplandet til Renseanlæg Damhusåen har et indbyggertal på ca , som er fordelt på seks kommuner (se tabel 3.1). Spildevandet, der fra disse kommuner ikke ledes til Renseanlæg Damhusåen, ledes enten til Renseanlæg Lynetten eller til Spildevandscenter Avedøre. Andelen af industrispildevand målt i PE, der tilføres Renseanlæg Damhusåen, udgør mindre end 5%. I oplandet er der kun ét hospital (Hvidovre Hospital). Der er ingen kendte virksomheder, der producerer antibiotika i kloakoplandet. Kilderne til antibiotika i spildevandet, der tilføres renseanlægget, kan derfor relateres til forbrug i husholdningerne og på Hvidovre Hospital. Dertil kommer, at der også er et forbrug af antibiotika på plejehjem og lignende institutioner. Antibiotika, der anvendes i veterinærsammenhæng herunder til kæledyr er ikke inkluderet i dette projekt. Tabel 3.1 Indbyggertal i kommuner som helt eller delvist leder spildevand til Renseanlæg Damhusåen. I tabellen er anført hvor stor en procentandel af indbyggerne i kommunerne, der leder spildevandet til Renseanlæg Damhusåen. Antal personer i kommune Antal personer i RD-opland Procentvis andel kommunen København ,9 Frederiksberg ,9 Københavns Amt ,9 Gladsaxe ,0 Rødovre ,5 Hvidovre ,5 Herlev ,4 I alt RD-opland Det overordnede mål for dette projekt er en mikrobiologisk karakterisering af 12 spildevandsprøver udtaget med en måneds mellemrum over et år fra et boligområde i Rødovre, fra Hvidovre Hospital og fra indløbet til Renseanlæg Damhusåen. Karakteriseringerne omfatter bestemmelse af koncentrationen af testorganismerne suspekte E. coli og suspekte enterokokker samt bestemmelse af koncentrationen af suspekte E. coli, der er resistente over for ampicillin og gentamicin og bestemmelse af koncentrationen af suspekte enterokokker, der er resistente over for erythromycin og vancomycin. Blandt de resistente E. coli og enterokokker udtages isolater, der undersøges for co-resistens, dvs. det undersøges, om de E. coli, der er resistente over for ampicillin og gentamicin, tillige er resistente over for seks andre antibiotika. Tilsvarende undersøges, om erythromycin- og gentamicin-resistente enterokokker er resistente over for seks andre antibiotika. Disse resistensbestemmelser udføres for at vurdere, om nogle af de undersøgte bakterier er multiresistente, hvilket kan føre til behandlingssvigt ved en eventuel infektion med disse. På sygehusene er der et højt forbrug af antibiotika, og de må på den baggrund forventes at være en væsentlig kilde til resistente bakterier på renseanlæggene /5/. Der er ingen kendte virksomheder i Renseanlæg Damhusåens opland, der producerer eller anvender antibiotika i produktionen. h:\bop\51816rapport.doc 4 DHI - Institut for Vand og Miljø

9 Af de fire valgte antibiotika, for hvilke der udføres kvantitative resistensbestemmelser, er der to antibiotika ampicillin og erythromycin der både anvendes i den primære sundhedssektor og på sygehuse. Derudover er der to antibiotika vancomycin og gentamicin der kun eller næsten kun anvendes på sygehuse. De to sidstnævnte antibiotika anvendes tillige i mindre omfang på plejehjem og lignende institutioner. Man skelner mellem naturlig og erhvervet resistens, hvor den naturlige resistens forekommer uafhængig af selektionstryk (antibiotikaforbrug). Co-resistente bakterier er bakterier, der er resistente over for mere end ét antibiotikum. Da co-resistente bakterier er normalt forekommende, betyder det, at anvendelse af et antibiotikum fører til selektion af flere antibiotikaresistensgener. Dannelse af antibiotikaresistente bakterier kan ske gennem overdreven brug af antibiotika, hvorved koncentrationen af antibiotika stiger i spildevand, og der kan herefter ske en favorisering ved naturlig selektion af de bakterier, der er resistente over for ét eller flere antibiotika. I spildevand, hvor både mikroorganismer og antibiotika er til stede, er der mulighed for dannelse af antibiotikaresistente bakterier ved spontan mutation og/eller ved genoverførsel mellem samme eller forskellige typer af bakterier. Baggrunden for den strategi, der er valgt i dette projekt, er at det er vanskeligt analysemæssigt at bestemme koncentrationen af antibiotika i spildevand. Derfor er det i stedet valgt at bestemme koncentrationen af antibiotika ud fra kendskab til de forbrugte mængder af antibiotika for kilder i kloakoplandet og bagefter beregne en forventet koncentration af relevante antibiotika i spildevandet. Koncentrationen af de relevante antibiotika sammenlignes derefter med koncentrationen af ampicillin- og gentamicinresistente suspekte E. coli samt koncentrationen af erythromycin og vancomycinresistente suspekte enterokokker. Dette sker ud fra en antagelse om, at der er en sammenhæng mellem koncentrationen af antibiotika og koncentrationen af resistente bakterier. Forbrug af antibiotika er indenfor de relevante typer af antibiotika opgjort for den primære sundhedssektor i oplandet til Renseanlæg Damhusåen og for Hvidovre Hospital. For boligområdet i Rødovre er antibiotikaforbruget opgjort på baggrund af det gennemsnitlige antibiotikaforbrug pr. person i Københavns Amt samt antallet af beboere. h:\bop\51816rapport.doc 5 DHI - Institut for Vand og Miljø

10 4 PRØVETAGNINGSSTEDER Måleprogrammet omfattede udtagning af spildevandsprøver tre steder: Boligområde i Rødovre Hvidovre Hospital Tilløbet på Renseanlæg Damhusåen Måleprogrammet startede d. 29. oktober 2002, hvorefter der med ca. en måneds mellemrum i en tolv måneders periode frem til d. 30. september 2003 blev udtaget spildevandsprøver ved de tre nævnte målepunkter. Analyseprogrammet og analysemetoder er beskrevet i kapitel 4. Prøverne blev alle tre steder hver gang udtaget på tirsdage. De kvantitative analyser blev gennemført på DHI, hvorefter prøverne om torsdagen i den samme uge blev fragtet til Statens Serum Institut (SSI), som udførte de kvalitative bestemmelser. 4.1 Renseanlæg Damhusåen Renseanlæg Damhusåen modtager i middel ca m 3 spildevand pr. døgn fra dele af Gladsaxe, Herlev, Rødovre, Hvidovre, Frederiksberg og Københavns kommuner (data fra 2002). Antallet af indbyggere i de enkelte kommuner er anført i tabel 3.1, hvor det også er anført, hvor mange indbyggere, der leverer spildevand til RD. Hvidovre Hospital er det eneste hospital i kloakoplandet, der afleder spildevand til Renseanlæg Damhusåen. Det vil sige, at antibiotika, der kun anvendes på sygehuse (vancomycin og gentamicin), og som er til stede i kloaksystemet, alene burde stamme fra Hvidovre Hospital. Hvis der identificeres vancomycin- og gentamicin-resistente bakterier i spildevandsprøverne fra tilløbet på RD, er det nærliggende at antage, at tilstedeværelsen kan henføres til udledningen af vancomycin og gentamicin fra Hvidovre Hospital. Spildevandsprøverne udtaget i tilløbet til Renseanlæg Damhusåen blev udtaget som flowproportionale døgnprøver. Prøvetagningen blev afsluttet den dag, hvor der blev udtaget stikprøver af spildevandet fra boligområdet i Rødovre og i fire afløb fra Hvidovre Hospital. Spildevandsprøverne på Renseanlægget Damhusåen blev udtaget af medarbejdere på renseanlægget, og efterfølgende blev prøverne analyseret på Lynettefællesskabets laboratorium for SS, BOD, COD, Total-N og Total-P. De anvendte standarder samt analyseresultaterne ved analyserne er præsenteret i bilag D. 4.2 Husholdninger Med hjælp fra Rødovre Kommune blev der udvalgt en rækkehusbebyggelse i kommunen, hvorfra der kunne udtages spildevandsprøver alene bestående af husspildevand. h:\bop\51816rapport.doc 6 DHI - Institut for Vand og Miljø

11 Rækkehusbebyggelsen er placeret omkring Borgmester G. Jensens Vej og er i øvrigt beliggende mellem Rødovre Parkvej mod syd og Lucernevej mod nord. Spildevandsprøverne blev udtaget i en brønd placeret ud for Borgmester G. Jensens Vej nr Spildevandet, der løber gennem brønden, stammer fra 306 hustande (december 2002) samt et centralvaskeri, en børneinstitution, en sportshal og nogle selskabslokaler. Det samlede årlige vandforbrug for boligområdet har Rødovre Kommune opgjort til ca m 3. Det samlede antal beboere i boligområdet blev opgjort til 613, dvs. at der var 2 personer pr. husstand. Fra den nævnte brønd blev der ved hver af de 12 prøvetagninger udtaget fem stikprøver med 10 minutters mellemrum. Den samlede prøve blev af Miljølaboratoriet Storkøbenhavn analyseret for spildevandsparametrene: SS, BOD, COD, Total-N og Total-P. De anvendte standarder ved analyserne samt analyseresultaterne er præsenteret i Bilag D. 4.3 Hvidovre Hospital Hvidovre Hospital har i alt seks udløb til det offentlige kloaknet på Kettegårds Allé. De fire af brøndene på Kettegårds Allé er knyttet til de fire sengehuse. Fra hver af de fire sengebygninger samles det sanitære spildevand i en pumpesump, hvortil der er knyttet to pumper, som starter, når niveauet i sumpen har nået en vis højde. Pumpesumpene i hver af de fire sengebygninger er placeret i tunneletagen og kan rumme ca. 2,1 m 3 (2 m x 1,5 m x 0,9 m). Ved hver udpumpning fjernes ned til et spildevandsniveau på ca. 0,2 m svarende til, at der er et restvolumen på 0,6 m 3 i pumpesumpen. Pumpernes kapacitet er ca. 1,8 m 3 /min. I dette restvolumen af spildevand er der gode betingelser (høj temperatur og høj koncentration af næringsstoffer samt antibiotikarester) for opformering af resistente bakterier. I de samme rum, hvor pumpesumpen for spildevand er placeret, er en opsamlingstank tilknyttet drænvandssystemet. Denne opsamlingstank er placeret under sengebygningerne. Om sommeren anvendes drænvandet til havevanding, og når havevanding ikke er nødvendig, ledes drænvandet til kloaksystemet. I 1997 var det samlede vandforbrug på Hvidovre Hospital m 3 /år. I 2001 var vandforbruget m 3, og i 2002 blev registreret et vandforbrug på m 3. Disse vandforbrug inkluderer vand til bl.a. vaskemaskiner og køkken. For to måledøgn (23. og 24. oktober 2002) var den gennemsnitlige udpumpede vandmængde fra sengehusene 320 m 3 /d svarende til ca. 75% af vandforbruget på Hvidovre Hospital. De tre af de fire brønde har tillige hvert et tilløb med spildevand fra laboratorieaktiviteter (kemiafløb) i de fire sengebygninger. Der har ikke være udtaget prøver af laboratoriespildevandet. Spildevandet i de to sidste af de i alt seks udløb indeholder spildevand fra køkkenfaciliteter, varmecentralen og øvrige driftsfaciliteter. Spildevand herfra har ikke været inkluderet i måleprogrammet. Størrelsen af spildevandsudledningen fra de fire sengeafsnit er opgjort ud fra pumpekapacitet og timetæller (okt. 2002). Ud fra registreringer af vandforbruget over et døgn h:\bop\51816rapport.doc 7 DHI - Institut for Vand og Miljø

12 (tirsdag) blev prøvetagningen fastlagt, således at der er blevet udtaget prøver om formiddagen, hvor det største vandforbrug finder sted. Der blev udtaget prøver fra hvert af de fire udløb fra hospitalets sengehuse. Fra hver brønd er udtaget to stikprøver. Prøvetagningerne blev så vidt muligt udført midt i forløbet af en udpumpning. På baggrund af vurderinger af forholdet mellem spildevandsmængderne fra de fire udløb (S1, S2, S3, S4, hvor S1 er placeret længst væk fra hovedindgangen) blev stikprøverne sammenblandet til én prøve i forholdet 2:2:1:1. Den sammenblandede prøve blev analyseret for COD, BOD, TN, TP og SS af Miljølaboratoriet Storkøbenhavn, og den kvantitative henholdsvis den kvalitative resistensbestemmelse blev udført af DHI og SSI. Temperaturen i spildevandet, hvorfra der blev udtaget prøver, varierede mellem 15 og 27 C med en middelværdi på 21,6 C. Samtlige temperaturmålinger udført på spildevandsprøver fra Hvidovre Hospital findes i Bilag D. h:\bop\51816rapport.doc 8 DHI - Institut for Vand og Miljø

13 5 ANALYSEPROGRAM OG ANALYSEMETODER Der har været udført kvantitative og kvalitative resistensbestemmelser som beskrevet og anbefalet i forprojektet og i projektbeskrivelsen /2, 4/. De kvantitative resistensbestemmelser omfattede to typer af testbakterier; suspekte E. coli og suspekte enterokokker samt fire antibiotika, hvoraf ampicillin og erythromycin anvendes både på sygehuse og i den primære sundhedssektor, og vancomycin og gentamicin), som udelukkende anvendes på sygehuse. Detaljer i arbejdsgangen for de kvantitative bestemmelser er beskrevet i afsnit 5.4 og Bilag A. De kvalitative resistensbestemmelser (co-resistens-bestemmelser) har omfattet de samme testbakterier som de kvantitative bestemmelser og er sket efter principperne vist i tabel 5.1. Tabel 5.1 Oversigt over testbakterier og bestemmelse af co-resistens. E. coli E. coli E. faecalis Resistens Ampicillin Gentamicin Erythromycin Co-resistens Ampicillin x Amoxicillin/Clauvulanat x x Chloramphenicol x x x Ciprofloxacin x x Erythromycin Gentamicin x x Kanamycin x Spectinomycin x x Streptomycin x x x Sulphamethoxazol x x Teicoplanin x Tetracyclin x x x Trimethroprim x x Vancomycin x Detaljer i arbejdsgangen for bestemmelse af co-resistens fremgår af Bilag E. Forundersøgelsen /2/ viste, at der i Danmark på daværende tidspunkt (marts 2002) ikke fandtes laboratorier, som umiddelbart kunne analysere for antibiotika i spildevand. Dette er baggrunden for, at den forbrugte mængde antibiotika er anvendt som udgangspunkt for beregning af antibiotikakoncentrationen i spildevandet, hvorfra der er udtaget prøver til analysering. 5.1 Spildevandskarakterisering De 12 sæt spildevandsprøver, der blev indsamlet ved boligområdet i Rødovre og i udløbene fra Hvidovre Hospital samt i tilløbet til RD, blev alle analyseret for SS, BOD, COD, Total-N samt Total-P. Med kendskab til koncentrationen af disse parametre er det muligt at vurdere, om spildevandet afviger i sammensætning fra almindeligt husspildevand. Da Renseanlæg Damhusåens kloakopland er fælleskloakeret, betyder det, at der i h:\bop\51816rapport.doc 9 DHI - Institut for Vand og Miljø

14 nedbørsperioder vil blive tilført større vandmængder til kloaksystemet, og dermed reduceres koncentrationen af de nævnte spildevandsparametre og mikroorganismer i de indsamlede prøver efter og under nedbør. 5.2 Spildevandsmængder og antibiotikakoncentrationer For at kunne give et overslag over koncentrationen af antibiotika i spildevandsprøverne, der er blevet analyseret for resistente suspekte E. coli og suspekte enterokokker er det nødvendigt at opgøre den vandmængde, som den forbrugte antibiotikamængde er opblandet i. Vandmængderne, der indgår i beregningerne af antibiotikakoncentrationerne, er opgjort ud fra en lang række forudsætninger, som er beskrevet i det følgende. På Renseanlæg Damhusåen registreres vandmængden i indløbet for hvert døgn. Ved de aktuelle beregninger er anvendt spildevandsmængden målt i det døgn hvor den flowproportionale døgnprøve blev udtaget. Den aktuelle antibiotikakoncentration er herefter beregnet som den forbrugte mængde antibiotika i renseanlægsoplandet pr. måned divideret med antal dage i måneden og døgnvandmængden. Den vandmængde, der i gennemsnit udpumpes fra Hvidovre Hospitals fire sengebygninger, er opgjort til 320 m 3 /d. Denne værdi er benyttet til at beregne den samlede vandmængde pr. måned, hvorefter hospitalets antibiotikaforbrug pr. måned er divideret med den månedlige spildevandsmængde. For boligområdet blev vandforbruget i 2001 opgjort til m 3 svarende til 88 m 3 /d. Dette er den vandmængde, som udledes til kloaksystemet pr. døgn, og den vandmængde der udtages prøver fra i tørvejrsdøgn. Da området er fælleskloakeret, vil vandmængden være større i døgn med nedbør. For at finde frem til den aktuelle døgnvandmængde er det gennemsnitlige vandforbrug, hvor der i dagene op til prøvetagningen har været nedbør, ganget med en faktor svarende til forholdet mellem tørvejrsvandmængden på Renseanlæg Damhusåen og vandmængden på den aktuelle prøvetagningsdag. Hvis belastningen på Renseanlæg Damhusåen har ligget under m 3 /d, betragtes døgnet som et tørvejrsdøgn, og dermed er vandmængden for boligområdet i Rødovre sat til 88 m 3 /d svarende til vandforbruget. Der vil være en række faktorer, som har indflydelse på antibiotikakoncentrationerne i spildevandet, men som det ikke er muligt i dette måleprogram at inddrage ved beregningerne af antibiotikakoncentrationerne i de aktuelle spildevandsprøver. Blandt de faktorer, der forventes at have størst betydning, kan nævnes, at: på Hvidovre Hospital og i boligområdet er der udtaget henholdsvis otte og fem stikprøver, som er blandet til en prøve, der er analyseret. Stikprøverne er udtaget inden for en halv til en hel time, og blandprøven er således ikke repræsentativ for et helt døgn der på Hvidovre Hospital og i boligområdet vil være variationer i spildevandsmængden over døgnet. Flowet forventes ud fra erfaringer at være størst om formiddagen, hvor prøverne er udtaget. Det betyder lavere koncentrationer af forurenende stoffer og mikroorganismer i spildevandet udskilningen af aktiv stof (antibiotika) via faeces og urin varierer for de forskellige typer af antibiotika, ligesom den udskilte antibiotikamængde også vil variere over h:\bop\51816rapport.doc 10 DHI - Institut for Vand og Miljø

15 døgnet og fra person til person. Typisk ligger udskilningsgraden mellem 70 og 80% af den indtagne mængde antibiotika forbruget af antibiotika vil variere over måneden. Her er regnet med et gennemsnitlig døgnforbrug for den måned, hvori spildevandsprøverne er udtaget (Prøverne udtaget d. 6. maj 2003 er dog relateret til april) 5.3 Opgørelse af antibiotikaforbrug Data for antibiotikaforbrug kommer fra Lægemiddelstyrelsen /8/. For de antibiotika, hvor forbruget fra Lægemiddelstyrelsen er opgivet som Definerede Døgn Doser (DDD) pr indbyggere pr. døgn, er disse omregnet til gram aktiv stof. Den anvendte inddeling af antibiotika svarer til Anatomical Therapeutic Chemical (ATC-klassifikationen) /2/. Der er opstillet tabeller over det månedlige forbrug af relevante antibiotika fra oktober 2002 og til og med september 2003 (se Bilag C). Tabellerne i Bilag C dækker henholdsvis boligområdet i Rødovre, Hvidovre Hospital og Renseanlæg Damhusåens opland. I Bilag C er der tillige vist beregnede koncentrationer af aktiv stof i de indsamlede spildevandsprøver. Disse koncentrationer er beregnet på baggrund af opgjorte spildevandsmængder i prøvetagningsdøgnene. For boligområdet i Rødovre blev antallet af indbyggere som nævnt i afsnit 4.2 opgjort til 613 personer i november Det samlede antibiotikaforbrug (i gram aktiv stof) er beregnet for indbyggerne i boligområdet ud fra 613 personer og det gennemsnitlige forbrug af antibiotika målt som DDD pr indbyggere pr. døgn i den primære sundhedssektor i Københavns Amt. Det månedlige antibiotikaforbrug på Hvidovre Hospital kendes ikke, men det er muligt at give et estimat for dette forbrug, idet det månedlige forbrug for de enkelte antibiotika er kendt for samtlige sygehuse i Hovedstadens Sygehusfællesskab. Desuden kendes Hvidovre Hospitals andel af det årlige forbrug af antibiotika på samtlige sygehuse i Hovedstadens Sygehusfællesskab. Antallet af indbyggere i Frederiksberg Kommune og forbruget af antibiotika på Frederiksberg Hospital indgår ikke i beregningerne. Det gennemsnitlige antal DDD pr indbyggere pr. døgn på sygehusene i Hovedstadens Sygehusfællesskab (ekskl. Frederiksberg Sygehus) er omregnet til gram aktiv stof, og Hvidovre Hospitals procentvise årlige andel er på månedsbasis multipliceret med antibiotikamængden. Renseanlæg Damhusåen modtager spildevand fra dele af Københavns Kommune, Frederiksberg Kommune samt dele af Herlev, Gladsaxe Hvidovre og Rødovre kommuner. De fire sidstnævnte kommuner ligger alle i Københavns Amt. Hvidovre Hospital er også placeret i renseanlægsoplandet. Andelen af spildevand der kommer fra de nævnte kommuner beregnet ud fra indbyggertal er vist i tabel 3.1. For Københavns Kommune Frederiksberg Kommune og de fire kommuner i Københavns Amt er befolkningsandelen, der leverer spildevand til Renseanlæg Damhusåen, beregnet til henholdsvis 24,9%, 27,9% og 12,9%. Ud fra disse andele, det totale antal indbyggere i kommunerne samt det gennemsnitlige antal DDD pr indbyggere pr. døgn anvendte i primærsektoren er forbruget i gram aktiv stof pr. måned beregnet. Hertil er lagt forbruget af antibiotika i gram aktiv stof på Hvidovre Hospital. h:\bop\51816rapport.doc 11 DHI - Institut for Vand og Miljø

16 Tabel 5.2 viser det årlige antibiotikaforbrug beregnet ud fra månedsopgørelserne præsenteret i Bilag C. Disse månedsopgørelser er udarbejdet efter principperne beskrevet ovenfor. Ved de kvantitative resistensbestemmelser blev anvendt ampicillin, erythromycin, vancomycin og gentamicin, der henholdsvis tilhører antibiotikagrupperne pencicilliner med udvidet spektrum, macrolider, glycopeptider og aminoglycosider. I bilag F er vist en oversigt over sammenhængen mellem de antibiotika, der er indgået i co-resistensundersøgelserne og de tilhørende ATC-koder, der er benyttet ved opgørelse af forbruget af antibiotika, som er relevant i forhold til resistensudvikling hos henholdsvis enterokokker og E. coli. Tabel 5.2 Årligt antibiotikaforbrug opgjort i relation til de tre prøvetagningssteder. Antibiotikum ATC-koder Antibiotikagruppe Årligt forbrug g/år Boligområde Hvidovre RD opland i Rødovre Hospital*) Ampicillin/-Penicillin J01CA Penicilliner med udvidet spektrum 482, (13%) Erythromycin J01FA Makrolider 506, (2,7%) Vancomycin J01XA Glycopeptider 0, ,4 (97%) 571,6 Gentamicin J01G Aminoglycosider 0,608 34,3 (7,1%) 341,5 Teicoplanin, Streptomycin J01A Tetracycliner 171,9 463,6 (0,6%) Kanamycin Tetracyclin Cepholothin J01DA Cefalexin og 2,93 42,4 (4,9%) 872,0 Cefalotin Sulphamethoxazol Sulfonamid Sulfonamid 360, (16%) (total) Trimethroprim Trimethroprim Trimethroprim 43, (20%) (total) Ciprofloxacin J01MA Fluoroquinoloner 43, (19%) *) I parentes er angivet Hvidovre Hospitals procentvise andel af antibiotikaforbruget i RD s opland. Forbruget af vancomycin og gentamicin incl. teicoplanin sker kun i forbindelse med behandling på sygehuse og institutioner. Imidlertid er forbruget på Hvidovre Hospital også højt, når det gælder penicilliner med udvidet spektrum, sulfonamid, trimethroprim samt flouroquinoloner, hvis der sammenlignes med forbruget i den primære sundhedssektor. 5.4 Kvantitative resistensbestemmelser De kvantitative bestemmelser er udført ved spredning af prøven på agarplader med og uden antibiotika som beskrevet i forprojektet /2/. Protokoller er vist i Bilag A. Princippet i metoden er illustreret i figur 5.1. Prøven og fortyndinger af prøven f.eks ganges fortynding til 10 6 ganges fortynding spredes ud på agarplader (figur 5.1b), som er tilsat det eller de antibiotika, der ønskes testet. Som kontrol spredes ligeledes prøve og fortyndinger af prøven ud på agarplader uden antibiotikum. Pladerne inkuberes i varmeskab. Antallet af bakterier, der vokser op på agarpladerne tilsat antibiotikum, angiver, hvor mange resistente bakterier der er i prøven. Antallet af bakterier, der vokser op på agarpladerne uden antibiotikum, angiver det totale antal bakterier, der er i prøven. (figur 5.1c). h:\bop\51816rapport.doc 12 DHI - Institut for Vand og Miljø

17 For at bestemme enterokokker spredes prøven på Slanetz & Bartley Agar. Slanetz & Bartley Agar er selektiv for enterokokker, dvs. det indeholder stoffer, som hæmmer næsten alle andre bakterier end enterokokker. Da hæmningen af andre bakterier ikke er 100%, vil man normalt sikre sig, at de bakterier, der vokser op, er enterokokker ved at gennemføre yderligere tests. Af praktiske (= økonomiske) årsager gennemføres ikke en verifikation, hvilket medfører, at en del af de bakterier, der tælles, muligvis ikke er enterokokker. a) Uden antibiotika Med antibiotika 2 døgn ved 37 C b) Foto: Jørgen Hansen, DHI c) Figur 5.1 Skitse af metode til bestemmelse af resistens ved spredning af prøven på agar med antibiotika. Antallet af bakterier, der vokser op på pladen, angiver, hvor mange resistente bakterier der er i prøven. Andelen af resistente bakterier kan beregnes ved at sammenligne med kontrollen uden antibiotika. Resultatet gælder kun for de bakterier, der er i stand til at vokse på den anvendte agar. For at bestemme antallet af E. coli spredes prøven på MLS-agar. MLS-agar er selektiv for coliforme bakterier, og sammen med den høje inkubationstemperatur (44 C) medfører det, at det hovedsageligt er E. coli, der vokser op. Her gælder det også, at man ikke kan være helt sikker på at alle de bakterier, der vokser op, er E. coli. Derfor vil betegnelserne suspekte Enterokokker eller suspekte E. coli blive anvendt i denne rapport, med mindre der er udført supplerende tests for at bekræfte identiteten af bakterierne. Der er kun udført supplerende tests på de bakterier, der er anvendt til bestemmelse af co-resistens. På alle lokaliteter er der undersøgt resistens over for ampicillin, erythromycin, vancomycin og gentamicin. Valget af antibiotika er foretaget således, at to af dem kun anvendes på sygehusene (vancomycin og gentamicin), mens de to øvrige både anvendes på sygehuse og i den primære sundhedssektor. Endvidere er de valgt for at få en ligelig h:\bop\51816rapport.doc 13 DHI - Institut for Vand og Miljø

18 fordeling mellem antibiotika, der er aktive over for E. coli, og antibiotika, der er aktive over for enterokokker. Agar- og antibiotikakoncentrationer fremgår af tabel 5.3. Tabel 5.3 Antibiotika, der indgår i de kvantitative resistensbestemmelser. Antibiotika Anvendelse Testbakterie Agartype Antibiotika i agar [µg/ml] Ampicillin Sygehuse og Suspekte E. coli EMB (Difco) 30 primærsektor Erythromycin Sygehuse og Suspekte Slanetz 4 (16) primærsektor enterokokker Vancomycin Sygehuse Suspekte Slanetz 16 enterokokker Gentamicin Sygehuse Suspekte E. coli EMB (Difco) 10 På grund af isolation af erythromycin-følsomme Enterokokkus faecium fra agarplader med 4 µg/l erythromycin blev der fra den 6. maj 2003 gennemført test med 16 µg/l, som er leveret fra SSI til DHI. Endvidere er der gennemført kontrol af metoden ved at sprede resistente og følsomme bakteriestammer på Slanetz og MLS-agar. 5.5 Kvalitative resistensbestemmelser På SSI blev der isoleret tre E. faecalis isolater fra erythromycin Sanetz-pladerne fra hvert prøvetagningssted hver måned (hvis dette var muligt). De tre isolater blev speciesidentificeret som E. faecalis ved PCR (se Bilag E). Isolater blev efterfølgende resistensbestemt over for følgende antibiotika: erythromycin, gentamicin, kanamycin, streptomycin, teicoplanin, tetracyclin og vancomycin (Se tabel 5.1) ved MICbestemmelser i mikrotitreplader som beskrevet i Bilag E). Ligeledes blev der forsøgt isoleret tre enterokokker fra Slanetz s agar-pladerne med vancomycin fra hvert prøvetagningssted hver måned. Dette var dog ikke muligt. Der blev tilsvarende forsøgt isoleret tre gentamicin-resistente E. coli og tre ampicillinresistente E. coli fra EMB agar-pladerne indeholdende henholdsvis gentamicin og ampicillin fra hvert prøvetagningssted hver måned. E. coli isolaterne blev species-identificeret ved hjælp af API-strips (som indeholder forskellige forgæringsmedier, se Bilag E). Isolaterne blev efterfølgende resistensbestemt over for følgende antibiotika: ampicillin, amoxicillin/clavulanat, chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin, spectinomycin, streptomycin, sulphamethoxazol, tetracyclin og trimethroprim. h:\bop\51816rapport.doc 14 DHI - Institut for Vand og Miljø

19 6 MÅLEPROGRAM RESULTATER Rådata fra måleprogrammet er præsenteret i bilag B, C og D, der indeholder følgende data: Bilag B: Kvantitative resistensbestemmelser Bilag C: Antibiotikaforbrug Bilag D: Spildevandskarakterisering Resultaterne fra den kvalitative bestemmelse af co-resistens er præsenteret i bearbejdet form i afsnit Spildevandskarakterisering Spildevandskarakteriseringen omfattede analyser for COD, BOD, Suspenderet stof (SS), Total-N og Total-P i samtlige 36 spildevandsprøver 12 prøver fra hvert prøvetagningssted. Minimum- og maksimumkoncentrationer for hver parameter er vist i tabel 6.1, og i figurerne 6.1, 6.2 og 6.3 er vist tidsserieafbildninger for koncentrationer af BOD, SS og Total-N målt ved de tre prøvetagningssteder. Generelt viste karakteriseringen at spildevandet i middel var mest koncentreret i afløbet fra Hvidovre Hospital og mindst koncentreret fra boligområdet i Rødovre (tabel 6.1). Det er paradoksalt, at koncentrationen af eksempelvis BOD følger de samme periodevise svingninger som ses for spildevandet fra boligområdet i Rødovre. Spildevandet fra boligområdet indeholder som nævnt vand fra overfladeafstrømning i nedbørsperioder, og dette vil betyde en fortynding og dermed lavere stofkoncentrationer i spildevandet efter nedbør. Spildevandet fra Hvidovre Hospital er derimod ikke påvirket af nedbør, og derfor er koncentrationen i spildevandet mere ensartet (mindre standardafvigelser) for de enkelte parametre. Det har derfor været overvejet, om der kan være analysetekniske forklaringer på sammenfaldet i koncentrationssvingningerne for specielt BOD og COD). Tabel 6.1 Minimum- og maksimumkoncentrationer målt i spildevandsprøver fra de tre prøvetagningssteder. Parameter Boligområde i Rødovre Hvidovre Hospital Renseanlæg Damhusåen Miljøstyrelsen mg/l Min. Max. Middel Min. Max. Middel Min. Max. Middel /7/ SS BOD COD Total-N 9, , , ,5 69 Total-P 0,98 20,6 8,5 9,82 16,1 12, ,3 13 Der var dog markante forskelle mellem boligområdet og hospitalet, hvor koncentrationerne af Total-N og Total-P i slutningen af måleperioden steg kraftigt i spildevandet fra boligområdet (se figur 6.3). Dette skyldes dels en lang tørkeperiode uden tilførsel af vand fra overfladeafstrømning og indsivning og dels bidrag af Total-P fra vaskemidler anvendt i det vaskeri der er tilknyttet boligområdet. h:\bop\51816rapport.doc 15 DHI - Institut for Vand og Miljø

20 BOD mg/l Rødovre Hvidovre Hosp. RD Hussp.v. Det er væsentligt at bemærke, at prøverne fra boligområdet og Hvidovre Hospital er udtaget som stikprøver, mens prøverne på Renseanlæg Damhusåen er udtaget som døgnprøver. Sammenligning mellem variationer i stofkoncentrationerne i prøverne fra boligområdet og Renseanlæg Damhusåen er derfor vanskeligt, idet målingerne fra boligområdet er et øjebliksbillede, mens prøverne fra Renseanlæg Damhusåen afspejler et helt døgn. Figur 6.1 Koncentration af BOD i spildevand fra boligområde i Rødovre, Hvidovre Hospital og tilløbet til Renseanlæg Damhusåen (RD). Middelkoncentration for BOD i husspildevand er 300 mg/l /7/. Variationerne i stofkoncentrationerne i spildevandet fra hospitalet forventes at være et udtryk for de variationer, der forekommer i spildevandet som følge af varierende belastning og som følge af sedimentation i opsamlingstanken, hvorfra spildevandet pumpes ud til kloaksystemet. Sedimentation kan resultere i lavere koncentration specielt i starten af et udpumpningsforløb, mens koncentration af partikelbundne stoffer vil stige mod slutningen af et udpumpningsforløb. h:\bop\51816rapport.doc 16 DHI - Institut for Vand og Miljø

21 SS mg/l Rødovre Hvidovre Hosp. RD Hussp.v. Figur 6.2 Koncentration af SS (suspenderet stof) i spildevand fra boligområde i Rødovre, Hvidovre Hospital og tilløbet til Renseanlæg Damhusåen (RD). Middelkoncentration for SS i husspildevand er 260 mg/l /7/ mg N/l Rødovre Hvidovre Hosp. RD Hussp.v. Figur 6.3 Koncentration af Total-N i spildevand fra boligområde i Rødovre, Hvidovre Hospital og tilløbet til Renseanlæg Damhusåen (RD). Middelkoncentration for husspildevand er 69 mg/l /7/. h:\bop\51816rapport.doc 17 DHI - Institut for Vand og Miljø

22 Figur 6.3 viser, at koncentrationen af Total-N stiger i spildevandet fra boligområdet i tørkeperioden fra juli til september Figur 6.4 viser endvidere sammenhængen mellem koncentrationen af BOD i spildevandet og døgnvandmængden i tilløbet til renseanlægget. Stofkoncentrationen falder, når spildevandsmængden i nedbørssituationer er høj, omvendt er stofkoncentrationen høj, når tilløbsvandmængden i tørkeperioder er lav. mg BOD/l m 3 /dag Figur 6.4 Sammenhæng mellem koncentration af BOD i tilløbet til Renseanlæg Damhusåen (y-aksen) og tilløbsvandmængden (x-aksen). Kurve for eksponentiel sammenhæng er indsat. De væsentligste resultater af spildevandskarakteriseringen er, at: hospitalsspildevandet generelt er mere koncentreret med hensyn til alle de målte parametre (COD, BOD, T-N, T-P, SS) end normalt husspildevand /7/ og spildevandet fra boligområdet i Rødovre (se tabel 6.1) Der er store variationer i stofkoncentrationerne (op til en faktor 24 for SS) i spildevandet afledt fra boligområdet. Dette kan skyldes, at der er store døgnvariationer i vandforbruget, og set over året er der store variationer i tilførslen af vand fra overfladeafstrømning og indsivende vand til kloaksystemet Spildevandskarakteriseringen skal betragtes som indledende. Kun flowproportionale døgnprøver ved de tre prøvetagningssteder kan forventes at resultere i en korrekt kemisk karakterisering af spildevandets sammensætning 6.2 Kvantitative resistensbestemmelser Koncentration af suspekte enterokokker og suspekte E. coli Figur 6.5 viser resultatet af bestemmelserne af suspekte enterokokker på de tre lokaliteter. Det ses, at koncentrationen svinger næsten 100 gange over perioden. Ved indløbet til Renseanlæg Damhusåen er der fundet mellem 4,2 x 10 3 og 3,0 x 10 4 CFU/ml. Det svarer til antallet af suspekte enterokokker i indløbet til Spildevandscenter Avedøre, hvor der er fundet mellem 6,1 x 10 3 og 3,6 x 10 4 CFU/ml (angivet ved de vandrette stiplede linier i figur 6.5), og i Usserød Renseanlæg, hvor der er fundet mellem 1,4 x 10 4 og 3,1 x 10 4 CFU/ml /1/. Koncentrationen af suspekte enterokokker i spildevandet h:\bop\51816rapport.doc 18 DHI - Institut for Vand og Miljø

23 fra Rødovre og især Hvidovre Hospital ligger generelt højere end på RD, hvilket tyder på, at der sker henfald eller fortynding på spildevandets vej til RD Antal Enterokokker [CFU/ml] okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Figur 6.5 Antallet af suspekte enterokokker i spildevand fra boligområde i Rødovre ( ), Hvidovre Hospital (x) og Renseanlæg Damhusåen ( ). Til sammenligning er resultater fra målinger på Spildevandscenter Avedøre præsenteret ved de vandrette stiplede linier. Figur 6.6 viser koncentrationen af suspekte E. coli. Generelt er koncentrationen af suspekte E. coli højere end koncentrationen af suspekte enterokokker. I indløbet til Renseanlæg Damhusåen er der fundet mellem 2,6 x 10 4 og 1,1 x 10 5 suspekte E. coli pr. ml. Det svarer til koncentrationen af termotolerante coliforme bakterier i indløbet til Spildevandscenter Avedøre, hvor der er fundet mellem 2,3 x 10 4 og 4,9 x 10 4 pr. ml, og i Usserød Renseanlæg, hvor der er fundet mellem 4,9 x 10 4 og 3,3 x 10 5 pr. ml (angivet ved de vandrette stiplede linier i figur 6.5) /1/. Igen er der tendens til, at koncentrationen er højere i spildevandet fra boligområdet i Rødovre og Hvidovre Hospital. Det er således den samme tendens, sås for koncentrationen af spildevandsparametrene målt i prøverne fra henholdsvis boligområdet i Rødovre og Hvidovre Hospital. h:\bop\51816rapport.doc 19 DHI - Institut for Vand og Miljø

24 Antal E. coli [CFU/ml] okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Figur 6.6 Antallet af suspekte E. coli i spildevand fra boligområde i Rødovre ( ), Hvidovre Hospital (x) og Renseanlæg Damhusåen ( ). Til sammenligning er resultater fra målinger på Usserød Renseanlæg præsenteret ved de vandrette stiplede linier. For at undersøge, hvor stor usikkerhed der er på analyserne inden for dagen, er der gennemført dobbeltbestemmelse på spildevandet fra Hvidovre Hospital. Resultaterne af dobbeltanalyserne af suspekte E. coli og resistente suspekte E. coli ses i figur 6.7. Det ses, at forskellen mellem dobbeltbestemmelserne er lille set i forhold til udsvingene mellem prøvetagningsdagene. Det kan derfor konkluderes, at den analytiske usikkerhed inden for dagen kun spiller en lille rolle for tolkningen af data. Dobbeltbestemmelserne af suspekte enterokokker viste lignende resultater. h:\bop\51816rapport.doc 20 DHI - Institut for Vand og Miljø

25 Antal E. coli [CFU/ml] okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Figur 6.7 Tabel 6.2 Antallet af suspekte E. coli ( ), ampicillin-resistente suspekte E. coli ( ) og gentamicinresistente suspekte E. coli ( ) i spildevand fra Hvidovre Hospital. Analyserne er gennemført i dublikat for at undersøge, hvor stor den analytiske usikkerhed er inden for dagen. Gennemsnitlig koncentration (cfu/ml) af suspekte E. coli og suspekte enterokokker samt de tilsvarende gennemsnitlige koncentrationer af resistente bakterier fra de tre lokaliteter. Suspekte E. coli Total Ampicillin-resistens Gentamicin-resistens [cfu/ml] [cfu/ml] % [cfu/ml] % Hvidovre Hospital ,18 Boligområde i Rødovre ,5 4* 0,01* Renseanlæg Damhusåen ,05 Enterokokker pr. ml Total Erythromycin-resistens Vancomycin-resistens [cfu/ml] [cfu/ml] % [cfu/ml] % Hvidovre Hospital Boligområde i Rødovre Renseanlæg Damhusåen * Gennemsnit af de sidste 4 måneder. Der blev ikke observeret gentamicin-resistente bakterier de første 8 måneder i boligområdet. ** Vancomycin-resistente bakterier på Slanetz agar med vancomycin var ikke enterokokker, men bestod af naturligt resistente bakterier, formentlig Proteus spp. eller Leuconostoc spp. h:\bop\51816rapport.doc 21 DHI - Institut for Vand og Miljø

26 6.2.2 Sammenhæng mellem koncentration af resistente bakterier og antibiotikaforbrug Hypotesen bag dette projekt har været, at der er en sammenhæng mellem forbruget af antibiotika relateret til de enkelte målepunkter og koncentrationen eller andelen af resistente bakterier. De anvendte antibiotika er udvalgt således, at to antibiotika (vancomycin og gentamicin) kun anvendes på sygehuse, og to antibiotika (ampicillin og erythromycin) både anvendes på sygehuse og i den primære sundhedssektor. Det var derfor forventet, at vancomycin- og gentamicin-resistente bakterier hovedsageligt ville blive fundet i spildevandet fra hospitalet, og eventuelt også i spildevandet fra renseanlægget, mens ampicillin- og erythromycin-resistente bakterier ville blive fundet i spildevandet fra alle tre lokaliteter. Middelværdier af koncentration af antibiotika og resistente bakterier Resultaterne af de kvantitative bestemmelser af resistente bakterier er opsummeret og sammenlignet med forbruget af antibiotika i bilag G. I tabel 6.2 ses en reduceret tabel uden angivelse af antibiotikaforbrug og uden standardafvigelser. Vancomycin er ikke medtaget, da der ikke blev fundet vancomycin-resistente suspekte enterokokker. Tabellen viser, at den højeste koncentration af resistente bakterier og den højeste procentvise andel af resistente bakterier er fundet i spildevandet fra Hvidovre Hospital, og de laveste er fundet i spildevandet fra Rødovre. Det er værd at bemærke, at der ikke blev fundet gentamicin-resistente suspekte E. coli de første 8 måneder i Rødovre. Det stemmer godt med, at forbruget af gentamicin er meget lavt. 100 Erythromycin Andel af resistente bakterier [%] ,1 0,01 Gentamicin RØD RD Ampicillin HH 0,001 0,0001 0,001 0,01 0, Antibiotikakoncentration [mg/m3] Figur 6.7 Sammenhæng mellem den beregnede teoretiske koncentration (mg/m 3 ) af antibiotika i spildevandet og andelen (%) af resistente bakterier. angiver andelen af ampicillin-resistente suspekte E. coli og koncentrationen af ampicillin, angiver andelen af gentamicin-resistente suspekte E. coli og koncentrationen af gentamicin, X angiver andelen af erythrimycinresistente suspekte enterokokker og koncentrationen af erythromycin. De største symboler angiver resultater fra Hvidovre Hospital. De mindste symboler angiver resultater fra Rødovre, mens de mellemstore symboler viser resultater fra Renseanlæg Damhusåen. h:\bop\51816rapport.doc 22 DHI - Institut for Vand og Miljø

27 Figur 6.7 viser sammenhæng mellem den beregnede teoretiske koncentration af antibiotika i spildevandet og andelen af resistente bakterier. Bemærk, at akserne er logaritmiske. På figuren har hvert antibiotikum sit symbol. De største symboler repræsenterer Hvidovre Hospital, de mellemste Renseanlæg Damhusåen, og de mindste repræsenterer boligområdet i Rødovre. Figuren viser generelt, at jo højere antibiotikakoncentrationen er, desto højere er andelen af resistente bakterier. Hvis resistensen for hvert antibiotikum betragtes, ses det endvidere, at både andelen af resistente bakterier og koncentrationen af antibiotika er højest for Hvidovre Hospital. I spildevandet fra Rødovre er koncentrationen af ampicillin og gentamicin og andelen af resistente bakterier det laveste. For erythromycin er der ikke væsentlige forskelle mellem Rødovre og RD. Sammenhæng vurderet på baggrund af årstidsvariation For at gennemføre en egentlig statistisk analyse af sammenhængen mellem årstidsvariationen i antibiotikaforbruget og årstidsvariationen i koncentrationen af resistente bakterier er det nødvendigt at have målinger over 5 år. Derfor er sammenligningen i dette projekt foretaget ved en visuel vurdering af kurverne for forbrug og resistens. Undersøgelserne viser, at der muligvis er sammenhæng mellem variationen i antibiotikaforbrug og variation i forekomsten af resistente bakterier i nogle tilfælde, men der et ikke opnået resultater, der påviser en entydig sammenhæng. Herunder vises eksempler på resultater, hvor der kan være sammenhæng, og resultater uden synlig sammenhæng. % Ampicillin resistente E. coli [CFU/ml] okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Koncentration [µg/l] %RD-Ecoli A+ [Peni udv spektrum RD] Figur 6.8 Sammenligning af ampicillin-resistens i spildevand fra indløb til Renseanlæg Damhusåen og forbrug af penicilliner med udvidet spektrum i oplandet til Renseanlæg Damhusåen. Resistensen ( ) er angivet som den procentvise andel af suspekte E. coli, der er resistente over for ampicillin. Forbruget (X) er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i vandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet i oplandet, ender i spildevandet. h:\bop\51816rapport.doc 23 DHI - Institut for Vand og Miljø

28 På figur 6.8 ses en sammenligning af ampicillin-resistens i spildevand fra indløbet til Renseanlæg Damhusåen og forbrug af penicilliner med udvidet spektrum (J01CA) i oplandet til Renseanlæg Damhusåen. Resistensen er angivet som den procentvise andel af suspekte E. coli, der er resistente over for ampicillin. Forbruget er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i vandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet i oplandet, ender i spildevandet. Begge kurver har et sinusformet forløb med sammenfaldende maksima og minima. Der er således tegn på, at det samlede forbrug af penicillin med udvidet spektrum er med til at genere ampicillin-resistente suspekte E. coli. Koncentration [µg/l] eller %-del erythromycin resistente Enterokokker okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Figur 6.9 Sammenligning af erythromycin-resistens i spildevand og forbruget af erythromycin på Hvidovre Hospital. Resistensen ( ) er angivet som den procentvise andel af suspekte enterokokker, der er resistente over for erythromycin. Forbruget (X) er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i vandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet på hospitalet, ender i spildevandet. Figur 6.9 viser en sammenligning af erythromycin-resistens i spildevand og forbruget af erythromycin på Hvidovre Hospital. Resistensen er angivet som den procentvise andel af suspekte enterokokker, der er resistente over for erythromycin. Forbruget er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i spildevandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet på hospitalet, ender i spildevandet. Forbruget er højt i november, januar og april og lavere i de øvrige måneder. Det højeste forbrug var som forventet om vinteren, men det er ikke højt i alle vintermånederne. Når man sammenligner procentdelen af erythromycin-resistente suspekte enterokokker med forbruget af erythromycin, er det interessant at observere, at de to kurver svinger sammen fra februar til september. Ligesom for koncentrationen af ampicillin-resistente suspekte E. coli eksisterer der tilsyneladende en sammenhæng mellem variationerne i koncentrationen af erythromycinresistente suspekte enterokokker ved Hvidovre Hospital og den beregnede koncentration af erythromycin. h:\bop\51816rapport.doc 24 DHI - Institut for Vand og Miljø

29 Koncentration [µg/l] eller %-del gentamicin resistente E. coli okt-02 dec-02 feb-03 apr-03 jun-03 aug-03 Prøvetagningsdato Figur 6.10 Sammenligning af gentamicin-resistens i spildevand og forbruget af gentamicin på Hvidovre Hospital. Resistensen ( ) er angivet som den procentvise andel af suspekte E. coli, der er resistente over for gentamicin. Forbruget (X) er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i vandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet på hospitalet, ender i spildevandet. Figur 6.10 viser en sammenligning mellem gentamicin-resistens i spildevand og forbruget af gentamicin på Hvidovre Hospital. Resistensen er angivet som den procentvise andel af suspekte E. coli, der er resistente over for gentamicin. Forbruget er angivet som en teoretisk beregnet koncentration i vandet under antagelse af, at alt antibiotika, der er udskrevet på hospitalet, ender i spildevandet. Forbruget af gentamicin viser sig mod forventning, at være højest i sommermånederne. Resistensen over for gentamicin har toppe i december 2002, februar 2003 og juni Der synes derfor ikke at være nogen umiddelbar sammenhæng mellem forbrug og resistens for gentamicin, når man betragter variationen over året. h:\bop\51816rapport.doc 25 DHI - Institut for Vand og Miljø

30 Tabel 6.4 Oversigt over alle sammenligninger mellem årstidsvariationen af resistens og antibiotikaforbrug. Sammenligninger er fortaget visuelt på kurver, hvor forbrug og resistens er plottet sammen. Forbruget er angivet enten som en teoretisk beregnet koncentration under antagelse af, at alt udskrevet antibiotika ender i spildevandet eller som det opgjorte forbrug. Resistensen er udregnet enten som koncentrationen i spildevandet (CFU/mg BOD) eller som den procentvise andel af resistente bakterier. Ja angiver, at der kan ses en mulig sammenhæng i årstidsvariation mellem forbrug og resistens. Nej tilsyneladende ingen sammenhæng mellem årstidsvariationer i antibiotikaforbrug og andel af resistente bakterier. Temporal sammenhæng Forbrug [g pr. måned] Ampicillin Suspekte E. coli Penicilliner, udvidet spektrum Suspekte E. coli Gentamicin Suspekte E. coli Aminoglycosider Suspekte E. coli Koncentration Procent Koncentration Procent Koncentration Procent Koncentration Procent Renseanlæg Damhusåen nej ja nej ja ja ja nej nej Boligområde i Rødovre nej nej nej nej nej nej nej nej Hvidovre Hospital nej nej nej nej nej nej nej nej Temporal Korrelation Koncentration [µg/l] Renseanlæg Damhusåen nej ja nej ja ja nej ja nej nej Boligområde i Rødovre nej ja nej ja nej nej nej nej Hvidovre Hospital nej nej nej nej nej nej nej nej Temporal sammenhæng Forbrug [g pr. måned] Erythromycin Suspekte Ent. Makrolider Suspekte Ent. Koncentration Procent Koncentration Procent Renseanlæg Damhusåen nej nej nej nej Boligområde i Rødovre nej nej nej nej Hvidovre Hospital ja ja ja ja Temporal sammenhæng Koncentration [µg/l] Renseanlæg Damhusåen nej nej nej nej Boligområde i Rødovre nej nej nej nej Hvidovre Hospital ja ja ja ja h:\bop\51816rapport.doc 26 DHI - Institut for Vand og Miljø

31 Tabel 6.4 viser en oversigt over alle sammenligninger mellem årstidsvariationen af resistens og antibiotikaforbrug. Sammenligninger er fortaget visuelt på kurver, hvor forbrug og resistens er plottet sammen. Forbruget er angivet enten som en teoretisk beregnet koncentration under antagelse af, at alt udskrevet antibiotika ender i spildevandet eller som det opgjorte forbrug i gram. Resistensen er udregnet enten som koncentrationen i spildevandet (CFU/mg BOD) eller som den procentvise andel af resistente bakterier. Ja angiver, at der kan ses en mulig sammenhæng mellem forbrug og resistens. I tabellen angiver fed skrift, at vurderingen afhænger af, om man sammenligner resistensen med forbrug beregnet som en koncentration i spildevandet eller som det samlede forbrug i oplandet. Kursiv skrift angiver, at vurderingen afhænger af, om man sammenligner resistensen med forbruget af det anvendte antibiotikum eller med forbruget af gruppen af antibiotika, der kan forårsage den målte resistens. Tabel 6.5 Opsummering af resultater præsenteres i Bilag 4. Data viser antal sammenligninger, hvor der tilsyneladende er en sammenhæng mellem antibiotikaforbrug og antibiotikaresistens. Der blev i alt udført 72 sammenligninger, heraf 48 for suspekte e coli og 24 for enterokokker. Suspekte E. coli Suspekte enterokokker Sum (Amp+, Gen+) (Eryt+) Renseanlæg Damhusåen 7/16 0/8 7/24 = 29% Boligområde i Rødovre 2/16 0/8 2/24 = 8% Hvidovre Hospital 0/16 8/8 8/24 = 33% Sum 9/48 = 19% 8/24 = 33% 17/72 = 24% I alt er det muligt at foretage 72 sammenligninger mellem resistens og antibiotikaforbrug. I Bilag 4 er en oversigt, hvor resultatet af visuel vurdering af sammenhængene er vist. Overordnet set er der observeret en mulig sammenhæng i 17 af 72 sammenligner mellem forbrug og resistens svarende til 24% (tabel 6.4). Der ses oftest sammenhæng mellem forbrug og resistens i spildevandet fra Hvidovre Hospital, når det gælder enterokokker og mest sjældent i spildevandet fra Rødovre. Topscoren er resistens hos suspekte enterokokker i spildevandet på Hvidovre Hospital, og bundskraberen er resistens hos suspekte E. coli på Hvidovre Hospital og suspekte enterokokker på Renseanlæg Damhusåen og boligområdet. Når man betragter resistente E. coli, observeres der ofte sammenhæng mellem forbrug og den procentvise andel af resistente E. coli, mens der kun i ét tilfælde er sammenhæng mellem forbrug og koncentrationen af resistente E. coli. For de resistente suspekte enterokokker er resultaterne ens, uanset om man sammenligner forbruget med koncentrationen af suspekte enterokokker eller med den procentvise andel af resistente suspekte enterokokker. I tre tilfælde er der forskel på, om resistensen sammenlignes med antibiotikaforbrug udtrykt som den beregnede koncentration eller forbrug udtrykt i absolutte mængder (gram). Når resistens over for ampicillin sammenlignes med forbruget af ampicillin og forbruget af penicilliner med udvidet spektrum målt i gram, ses der ingen sammenhæng i modsætning til, når man sammenligner med forbruget opgjort som en koncentration i spildevandet. Det modsatte gør sig gældende for gentamicin-resistens i spildevandet ved renseanlægget. h:\bop\51816rapport.doc 27 DHI - Institut for Vand og Miljø

32 Der findes de samme sammenhænge mellem resistens og forbrug for ampicillin og Penicilliner med udvidet spektrum henholdsvis erythromycin og Makrolider. Derimod ses der oftere sammenhæng mellem gentamicin-resistens og forbruget af gentamicin end med forbruget af Aminoglycosider. 6.3 Kvalitative resistensbestemmelser De kvalitative resistensbestemmelser blev udført for at undersøge, om bakterierne var resistente over for andre antibiotika end dem, de var selekteret på, og formålet var således at undersøge, om selekterede bakterier var multiresistente, hvilket vil medføre, at infektioner med de nævnte bakterier vil være svære at behandle. Alle steder blev der udtaget tre isolater fra hvert udtagningssted hver måned, hvis dette var muligt. Dette kan muligvis medføre en skævhed i dataopgørelsen, idet de samme kloner (typer) muligvis er overrepræsenteret Ampicillin-resistente E. coli Der blev isoleret tre ampicillin-resistente E. coli fra hvert af de tre prøvetagningssteder hver måned (tabel 6.6). Co-resistens til gentamicin sås kun i prøver fra Hvidovre Hospital samt fra Renseanlæg Damhusåen. Dette stemmer godt overens med, at dette antibiotikum kun bruges på sygehusene. Fra alle tre prøvetagningssteder var der ofte co-resistens til streptomycin, sulphamethoxazol, tetracyclin og trimethroprim. Disse isolater har den samme resistensprofil, som den der ses i E. coli isolater fra urinvejsinfektioner, og det er derfor forventeligt, at coresistens af denne type findes i spildevand. Tabel 6.6 Ampicillin-resistente E. coli med co-resistens til andre antibiotika. Boligområde i Rødovre Hvidovre Hospital 1 Renseanlæg Damhusåen Total 2 Amoxicillin/Clavulanat 1/36 (3%) 1/36 (3%) 0/36 (0%) 2/108 (2%) Chloramphenicol 4/36 (11%) 4/36 (11%) 5/36 (14%) 13/108 (12%) Ciprofloxacin 2/36 (6%) 0/36 (0%) 4/36 (11%) 6/108 (6%) Gentamicin 0/36 (0%) 3/36 (8%) 2/36 (6%) 5/108 (5%) Spectinomycin 3/36 (8%) 6/36 (17%) 2/36 (6%) 11/108 (10%) Streptomycin 26/36 (72%) 25/36 (69%) 23/36 (64%) 74/108 (69%) Sulphamethoxazol 23/36 (64%) 25/36 (69%) 22/36 (61%) 70/108 (65%) Tetracyclin 24/36 (67%) 17/36 (47%) 17/36 (47%) 58/108 (54%) Trimethroprim 19/36 (53%) 8/36 (22%) 18/36 (50%) 45/108 (42%) 1 Tælleren i brøken er antal resistente isolater, og nævneren er det undersøgte antal prøver (3 pr. måned i 12 måneder). Procenten er udregnet udfra brøken. 2 Tælleren i brøken er antal resistente isolater, og nævneren er det undersøgte antal prøver (3 steder x 3 pr. måned i 12 måneder). Procenten er udregnet udfra brøken Gentamicin-resistente E. coli Der blev isoleret tre gentamicin-resistente E. coli fra alle tre prøvetagningssteder hver måned, hvis det var muligt. I tilløbet til Renseanlæg Damhusåen var dette dog ikke muligt i oktober 2002, november 2002 og januar Det var heller ikke muligt at finde tre isolater fra Hvidovre Hospital i oktober 2002, januar 2003 og maj h:\bop\51816rapport.doc 28 DHI - Institut for Vand og Miljø

33 I boligområdet i Rødovre blev der fundet gentamicin-resistente E. coli i juni, juli og september Der sås co-resistens til streptomycin og sulphamethoxazol for alle gentamicin-resistente E. coli fra Hvidovre Hospital samt co-resistens til ampicillin i 96% af isolaterne. Coresistens til streptomycin og sulphamethoxazol er også meget udbredt i isolater fra RD. 89% af isolaterne er også resistente over for tetracyclin. I boligområdet blev der fundet gentamicin-resistente E. coli i juni, juli og september Disse isolater var generelt mere følsomme end isolater fra hospitalet og renseanlægget. Syv ud af de otte isolater var resistente over for tetracyclin. Co-resistens til sulphamethoxazol og trimethroprim var også meget udbredt. Generelt er disse gentamicin-resistente E. coli isolater ikke ønskelige. De vil være svære at behandle, hvis de skulle give infektioner, idet de ofte er multiresistente. Tabel 6.7 Gentamicin-resistente E. coli med co-resistens til andre antibiotika. Boligområde i Rødovre Hvidovre Hospital Renseanlæg Damhusåen Total Ampicillin 1/8 (12,5%) 27/28 (96%) 22/28 (79%) 50/64 (78%) Amoxicillin/Clavulanat 0/8 (0%) 3/28 (11%) 3/28 (11%) 6/64 (9%) Chloramphenicol 2/8 (25%) 14/28 (50%) 12/28 (43%) 28/64 (44%) Ciprofloxacin 0/8 (0%) 8/28 (29%) 5/28 (18%) 13/64 (20%) Spectinomycin 2/8 (25%) 23/28 (82%) 12/28 (43%) 37/64 (58%) Streptomycin 4/8 (50%) 28/28 (100%) 24/28 (86%) 56/64 (88%) Sulphamethoxazol 5/8 (63%) 28/28 (100%) 23/28 (82%) 56/64 (88%) Tetracyclin 7/8 (88%) 12/28 (43%) 25/28 (89%) 44/64 (69%) Trimethroprim 5/8 (63%) 2/28 (7%) 16/28 (57%) 23/64 (36%) Erythromycin-resistente Enterococcus faecalis Der blev isoleret tre E. faecalis isolater fra de tre udtagningssteder hver måned, hvis det var muligt (tabel 6.8). I boligområdet blev der kun isoleret 24 isolater. Tabel 6.8 Erythromycin-resistente E. faecalis med co-resistens til andre antibiotika. Boligområde i Rødovre Hvidovre Hospital Renseanlæg Damhusåen Total Chloramphenicol 12/24 (50%) 14/34 (41%) 20/34 (59%) 46/92 (50%) Gentamicin 4/24 (17%) 12/34 (35%) 10/34 (29%) 26/92 (28%) Kanamycin 15/24 (63%) 27/34 (79%) 25/34 (73%) 67/92 (73%) Streptomycin 20/24 (83%) 24/34 (71%) 28/34 (82%) 72/92 (78%) Teicoplanin 0/24 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/92 (0%) Tetracyclin 20/24 (83%) 28/34 (82%) 34/34 (100%) 82/92 (89%) Vancomycin 0/24 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/92 (0%) I Danmark bruges ampicillin i kombination med enten vancomycin, teicoplanin eller gentamicin til behandling af Enterokok-infektioner. Der blev ikke observeret coresistens til vancomycin og teicoplanin. I 28% af isolaterne var der co-resistent til gentamicin. Dette er uheldigt, idet der vil være tilfælde, hvor Enterokok-infektioner ikke vil kunne behandles med en kombination af ampicillin og gentamicin. h:\bop\51816rapport.doc 29 DHI - Institut for Vand og Miljø

34 Der sås ofte co-resistent til tetracyclin, streptomycin, kanamycin samt chloramphenicol. Ingen af disse stoffer bruges normalt til behandling af Enterokok-infektioner. Men de gener, der koder for antibiotikaresistensen, kan muligvis overføres til andre bakteriearter, hvor disse stoffer bruges til behandling af infektioner Vancomycin-resistente suspekte enterokokker Det var ikke muligt at finde vancomycin-resistente enterokokker på Slanetz-pladerne med vancomycin. Væksten på pladerne var enten laktokokker, Proteus spp. eller Leuconostoc spp. Dette er positivt, idet vancomycin bruges til behandling af multiresistente enterokokker på sygehuse. Frygten for stigende udbredelse af vancomycinresistente enterokokker er specifikt nævnt i /5/. h:\bop\51816rapport.doc 30 DHI - Institut for Vand og Miljø

35 7 KONKLUSION Dette projekt blev sat i gang med det formål at gennemføre en indledende kortlægning af potentielle kilder til forekomsten af resistente bakterier (E. coli og enterokokker) i kloaksystemer og tilløb til renseanlæg. De potentielle kilder, der har været undersøgt, er Hvidovre Hospital og et boligområde i Rødovre. Spildevandet fra de nævnte kilder ledes til Renseanlæg Damhusåen, og tilløbet til renseanlægget har ligeledes været undersøgt for tilstedeværelse af resistente bakterier. Det overordnede formål er at mindske risikoen for infektion med resistente bakterier i forbindelse med kloakarbejde og mindske spredningen af antibiotikaresistente bakterier i miljøet. Undersøgelserne af resistente bakterier har været udført i forhold til fire udvalgte antibiotika, der anvendes på sygehuse (vancomycin, gentamicin, erythromycin og ampicillin) og i den primære sundhedssektor (erythromycin og ampicillin). Koncentrationen af det totale antal suspekte E. coli og suspekte enterokokker samt antallet af resistente E. coli og enterokokker blev bestemt i spildevandsprøver fra de nævnte lokaliteter. Der har været udtaget spildevandsprøver med ca. 1 måneds mellemrum fra oktober 2002 til september For den samme periode er antibiotikaforbruget, som er relateret til de tre lokaliteter, blevet opgjort månedsvis, hvorefter udviklingen i forekomsten af antibiotikaresistente suspekte E. coli og suspekte enterokokker er blevet sammenlignet med udviklingen i forbruget af antibiotika. Derudover er forekomsten af co-resistens i relation til de fire nævnte antibiotika og 10 andre antibiotika blevet undersøgt i de indsamlede prøver. Overordnet kan det i relation til analyseresultaterne fra de tre lokaliteter Hvidovre Hospital, boligområdet i Rødovre og Renseanlæg Damhusåen konkluderes, at sygehuset er den mest betydende enkeltkilde til antibiotika og antibiotikaresistente E. coli og enterokokker i spildevand, der tilføres Renseanlæg Damhusåen. Fundet af gentamicinresistente E. coli i sygehusspildevandet og spildevandet fra tilløbet til Renseanlæg Damhusåen er bekymrende set i relation til infektionsbekæmpelse hos patienter. Afløbssystemet på sygehuset er en potentiel kilde til opformering af resistente bakterier. Andelen af ampicillin- og erythromycin-resistente bakterier var mindre i spildevandet fra boligområdet end i spildevandet fra sygehuset. Det samlede forbrug af de to nævnte antibiotika er større i den primære sundhedssektor end på sygehuset, men på grund af, at kilderne er så spredte, vil en regulering af spildevandet ikke være operationel. På Renseanlæg Damhusåen er spildevandet tilsyneladende påvirket af afledningen af gentamicin-resistente E. coli afledt fra sygehuset. På baggrund af de beregnede koncentrationer af antibiotika i tilløbet til Renseanlæg Damhusåen bør der gennemføres en tilnærmet risikovurdering for udvalgte antibiotika. Mere specifikt har måleprogrammet og bearbejdningen af resultaterne ført til følgende konklusioner: Stikprøvetagning, som blev anvendt i måleprogrammet, er utilstrækkelig ved karakterisering af kilder til antibiotikaresistente bakterier. Der skal anvendes flowproportionale døgnprøver, når resultaterne fra analyserne skal anvendes til sammenligning af koncentrationen af resistente bakterier i spildevandsprøverne med h:\bop\51816rapport.doc 31 DHI - Institut for Vand og Miljø

36 antibiotikaforbruget. Prøvetagningen kan forbedres yderligere ved at tage flere døgnprøver inden for den periode, hvor antibiotikaforbruget opgøres Spildevandskarakteriseringen viste, at spildevandet fra sygehuset i middel var det mest koncentrerede, men også det mindst varierende i sammensætning med hensyn til alle de målte parametre (suspenderet stof, BOD, COD, Total-N og Total-P). Variationerne i spildevandssammensætningen var størst i spildevandet fra boligområdet Opgørelserne af vandmængderne udledt fra boligområdet og hospitalet skete på baggrund af vandforbrug, pumpeydelser (hospitalet) og vurderinger af nedbørens indflydelse på den hydrauliske belastning (boligområdet) Boligområdet omfattede 613 personer, og døgnvandmængden var mellem 88 og 307 m 3 /d. Hvidovre Hospital har 835 sengepladser og en døgnvandmængde på ca. 320 m 3 /d fra behandlingsafsnittene. Antallet af indbyggere i Renseanlæg Damhusåens opland var , og døgnvandmængden varierede mellem og m 3 /d Udledningsforholdene for spildevandet på Hvidovre Hospital medvirker til gunstige vækstbetingelser for bakterier (høj temperatur og høj koncentration af næringsstoffer). Spildevandsmængden, der er tilbage i pumpesumpen efter udpumpning til det offentlige kloaksystem, forventes at være med til at opretholde en bakteriekultur med høj koncentration af resistente bakterier I middel var koncentrationen af enterokokker højest i spildevandet fra Hvidovre Hospital sammenlignet med koncentrationerne ved de to andre lokaliteter. Koncentrationen af E. coli var i middel højest i spildevandet fra boligområdet Andelen af erythromycin-resistente suspekte enterokokker udgjorde ved hospitalet ca. 50%, mens andelene i boligområdet og på Renseanlæg Damhusåen var henholdsvis 20% og 24% Andelen af ampicillin- og gentamicin-resistente E. coli var tydelig størst i spildevandet fra Hvidovre Hospital henholdsvis 36% og 0,18% Koncentrationen af ampicillin-resistente E. coli var i middel den samme i spildevandet fra boligområdet og i spildevandet fra Renseanlæg Damhusåen Når middelværdierne af antibiotikaforbrug over hele året sammenlignes med middelværdierne af koncentrationen af resistente bakterier eller andelen af resistente bakterier over hele året, er det tydeligt, at der er højere forekomst af resistente bakterier, når forbruget er højt Det var ikke muligt at finde vancomycin-resistente enterokokker. Dette må betragtes som positivt, idet vancomycin er et vigtigt antibiotika til behandling af multiresistente enterokokker Ved projektets start var der en forventning til, at det ville være muligt at påvise en sammenhæng mellem årstidsvariationer i antibiotikaforbruget og andelen af resistente bakterier i spildevandsprøverne. Målinger i spildevandet ville i så tilfælde være et brugbart alternativ til analysering af fæcesprøver fra mennesker, og dermed ville det være nemmere at følge udviklingen i en eventuel sammenhæng mellem antibiotikaforbrug og udviklingen i tilstedeværelsen af antibiotikaresistente bakterier. Med det foreliggende datagrundlag er det imidlertid ikke muligt at påvise en entydig sammenhæng mellem årtidsvariationer i forbruget af antibiotika og koncen- h:\bop\51816rapport.doc 32 DHI - Institut for Vand og Miljø

37 trationen eller andelen af resistente bakterier i spildevandsprøverne, men især i datagrundlaget for Renseanlæg Damhusåen er der dog en indikation af en sammenhæng mellem andelen af ampicillin-resistente E. coli og den beregnede koncentration af penicilliner med udvidet spektrum i spildevandet Mulige årstidsmæssige sammenhænge mellem forbrug af antibiotika og andelen af resistente bakterier ses tydeligst på Hvidovre Hospital for enterokokker. Bestemmelser af co-resistens viste, at ampicillin-resistente E. coli, der tillige var resistente over for gentamicin, ikke blev fundet i boligområdet, men var til stede i tre prøver fra Hvidovre Hospital og i to prøver fra Renseanlæg Damhusåen. Gentamicin anvendes kun på sygehuse, og derfor var det i overensstemmelse med forventningerne, at der ikke blev fundet ampicillin-resistente E. coli med co-resistens til gentamicin i spildevandet fra boligområdet Af de 12 prøver fra henholdsvis Hvidovre Hospital og Renseanlæg Damhusåen var der ni prøver fra hvert sted, der indeholdt gentamicin-resistente E. coli. Gentamicinresistente E. coli blev isoleret fra spildevandet fra boligområdet, men dog kun i tre af de 12 prøver Generelt er gentamicin-resistente E. coli isolater ikke ønskelige, idet infektioner med denne type organismer er svære at behandle på grund af, at bakterierne ofte er multiresistente De beregnede koncentrationer i spildevandet af ampicillin, erythromycin og gentamicin varierede for de tre lokaliteter mellem henholdsvis 0,3-114 µg/l, 6,4-27 µg/l og 0,0007-0,28 µg/l. I alle tilfælde var antibiotikakoncentrationerne højest i spildevandet fra Hvidovre Hospital. Ved antibiotikakoncentrationer over 0,01 µg/l skal der ifølge vejledningen om miljørisikovurdering af lægemidler til human brug inden autorisation til markedsføring /10/ gennemføres en miljørisikovurdering. Gennem en tilnærmet risikovurdering er det muligt at udpege de antibiotika med størst risiko, og de sygehuse der er de største kilder i Lynettefællesskabets opland. Dette arbejde skal udføres med henblik på ved hjælp af renseteknologi at reducere belastningen med antibiotikaresistente bakterier og antibiotika fra sygehusenes afløb h:\bop\51816rapport.doc 33 DHI - Institut for Vand og Miljø

38 8 ANBEFALINGER Den gennemførte undersøgelse skal betragtes som indledende i forhold til at kunne træffe endelige beslutninger om, hvilke aktiviteter (hygiejniske forholdsregler) og/eller hvilke tekniske faciliteter (renseteknologier) der skal etableres for at undgå spredning af antibiotikaresistente bakterier med spildevand fra potentielle kilder (sygehuse, institutioner). Da sygehusene er identificeret som de største kilder til belastningen med antibiotika og antibiotikaresistente bakterier, er anbefalingerne centreret omkring mulighederne for at reducere spredningen herfra. Umiddelbart foreslås gennemført en tilnærmet risikovurdering for antibiotika afledt fra sygehusene. Risikovurderingen skal bruges til at identificere de udledninger af antibiotika, der er størst risiko ved at udlede og efterfølgende identificere relevante renseteknologier i forhold til at reducere udledningen af antibiotika fra sygehusene. Anbefalingerne indeholder derfor forslag, som på sigt skal føre til en mindsket risiko for spredning med antibiotikaresistente bakterier i miljøet og mindsket risiko for infektion med antibiotikaresistente bakterier ved kloakarbejde, arbejde på renseanlæg og på sygehuse. Anbefalingerne er i øvrigt baseret på måleprogrammets resultater og konklusioner vedrørende prøvetagning, indretning af afløbssystemer på sygehuse, sammenhængen mellem koncentrationen af antibiotikaresistente bakterier og forbrugte mængder af antibiotika samt konstateret co-resistens. Som opfølgning på den gennemførte undersøgelse anbefales følgende aktiviteter: Tilnærmet risikovurdering i Lynettefællesskabets opland I den aktuelle undersøgelse er der gennemført beregninger af forbruget af antibiotika i relation til de enkelte kilder og for hele oplandet til Renseanlæg Damhusåen. Der er tillige udført beregninger af koncentrationen af antibiotika i spildevandet ved målepunkterne. Det anbefales, at disse beregninger suppleres med en tilnærmet risikovurdering for antibiotika, der forbruges på sygehusene. Risikovurderingen gennemføres efter princippet om, at hvis forholdet PEC/NPEC er større end 1 for de enkelte antibiotika, er der en potentiel risiko ved afledning. PEC (Predicted Environmental Concentration) svarer tilnærmelsesvis til de data for antibiotikakoncentrationer, der i dette projekt er beregnet for spildevandet. PNEC (Predicted No Effect Concentration) kan beregnes ud fra litteraturværdier for MIC 50 (minimum koncentration for hæmmende effekt over for pathogene bakterier). Disse beregninger vil identificere, om antibiotika er til stede i potentielt problematiske koncentrationer, dvs. om den pågældende kilde (sygehus) er et hot spot Katalog over renseteknologier På baggrund af en tilnærmet risikovurdering sker der en udpegning af de antibiotika, der potentielt er knyttet den største risiko til. Med udgangspunkt i et litteraturstudium opstilles et katalog over renseteknologier, der kan inaktivere de pågældende antibiotika og resistente bakterier h:\bop\51816rapport.doc 34 DHI - Institut for Vand og Miljø

39 Afløbssystemer, der giver gunstige vækstbetingelser for resistente bakterier På Hvidovre Hospital er afløbssystemet konstrueret således, at der skabes gunstig betingelser for opformering af resistente bakterier. Det anbefales, at der gennemføres en kortlægning af afløbssystemerne på sygehuse i Lynettefællesskabets opland med henblik på at vurdere udbredelsen af uhensigtsmæssige afløbssystemer. På den baggrund kan opstilles anbefalinger om, hvordan man alene ud fra konstruktionsmæssige ændringer kan forhindre/reducere opformering af resistente bakterier Information om brug af antibiotika Reduktion i spredning af antibiotika og resistente bakterier bør tillige ske gennem information på sygehusene og i den primære sundhedssektor. Læger, sygeplejersker og øvrigt sundhedspersonale samt patienter skal informeres om hygiejniske forholdsregler og håndtering af antibiotika, der kan reducere afledningen Mulige fremtidige analyser for antibiotika Måleprogrammet har tillige ført til identifikation af områder, hvor der mangler viden af mere basal karakter, og som på sigt kan føre til forberede renseteknologier samt forbedret anvendelse og håndtering af antibiotika. I det gennemførte måleprogram er der regnet konservativt i forhold til koncentrationsniveauerne for antibiotika i spildevand. For at opnå større viden om de antibiotikakoncentrationer, der i spildevand adskiller følsomme og resistente bakterier, vil det være relevant at undersøge sammenhængen mellem forbrug af antibiotika, antibiotikakoncentrationer og koncentrationer af resistente bakterier. Hidtil har analysetekniske vanskeligheder været begrundelsen for ikke at analysere for antibiotika i spildevand. Et analyseprogram for antibiotika og resistente bakterier i spildevand fra potentielle antibiotikakilder vil kunne give vigtige informationer i forhold til renseteknologier, der kan begrænse udledningen af resistente bakterier og/eller antibiotika Undersøgelse af dannelse af resistens Antibiotikaresistente bakterier i spildevand kan stamme fra mennesker, der har udskilt bakterierne via urin og fæces, eller de kan opstå ved spontan mutation eller genoverførsel, og efterfølgende kan der ske en naturlig selektion af de antibiotikaresistente bakterier. Bestemmelse af forholdet mellem antallet af de antibiotikaresistente bakterier i spildevandet, der stammer fra mennesker, og antallet der er fremkommet på baggrund af høj koncentration af antibiotika i spildevandet, vil være et vigtigt led i karakteriseringen af kilderne. Resultatet af en sådan karakterisering vil have betydning for vurderingen af, om der primært bør ske en reduktion af de udledte mængder af antibiotika, eller der primært bør ske en reduktion i tilførslen af resistente bakterier til kloaksystemet Typebestemmelse Typebestemmelser og kortlægning af DNA-profiler for udvalgte bakteriestammer vil kunne anvendes til at afgøre, hvorvidt resistente bakterier fra potentielle kilder specifikt kan genfindes på renseanlægget, som modtager spildevandet. h:\bop\51816rapport.doc 35 DHI - Institut for Vand og Miljø

40 9 REFERENCER /1/ Miljøstyrelsen Smitstoffer i spildevand. Miljøprojekt nr. 800, 2003 /2/ Lynettefællesskabet I/S: Forprojekt vedrørende regulering af medicinalvirksomheder og sygehuse; Beslutningsgrundlag for spildevandsmålinger vedrørende: Antibiotikaresistens; Hormonforstyrrende stoffer. Rapport marts 2002 /3/ Danish Environmental Protection Agency, Occurrence and fate of antibiotic resistant bacteria in sewage. Environmental Project No. 722, 2002 /4/ Lynettefællesskabet I/S: Måleprogram antibiotikaresistens i spildevand fra sygehuse og boligområder. Samarbejdsprojekt mellem Tungmetalstyregruppen og Statens Serum Institut. Oplæg, september 2002 /5/ /6/ Sundhedsministeriets Miljømedicinske Forskning: Debatforum for miljø og sundhed, November 1997 /7/ Miljøstyrelsen 1997: Miljøfremmede stoffer i husholdningsspildevand. Miljøprojekt 357, 1997 /8/ Lægemiddelstyrelsen. Antibiotika månedstabeller. Accessed 1. december 2003 /9/ WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology. ATC/DDD Index Accessed 1. december 2003 /10/ The European Agency for Evaluation of Medical Products. Note for Guidance on Environmental Risk Assessment of medical Products for Human Use. Draft. July 2003 h:\bop\51816rapport.doc 36 DHI - Institut for Vand og Miljø

41 BILAG h:\bop\51816rapport.doc 37 DHI - Institut for Vand og Miljø

42 BILAG A Protokoller til kvantitativ resistensbestemmelse h:\bop\51816rapport.doc 38 DHI - Institut for Vand og Miljø

43 Protokol for bestemmelse af resistens mod ampicillin og gentamicin hos suspekte E. coli Definition Suspekte "E. coli" defineres som kolonier på EMB-agar (Oxoid) efter inkubation ved 44 C ± 0,5 C i timer. Der foretages ikke yderligere verifikation. Reagenser: Pepton-saltvand (ISO8199:1988) Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g, ph justeret til 7,0 ± 0,2 EMB agar med og uden antibiotika. Agar tilsættes 25 mg/l af fungicidet pimaricin for at hæmme vækst af svampe. Udførelse Der modtages spildevandsprøver fra WPT i flasker. Flaskerne er ikke helt fyldte. Der laves 10-folds fortyndingsrække. Der spredes 1 ml ufortyndet prøve på 14 cm plade samt 0,1 ml i dublikat på fortyndinger. Der spredes 1 ml ufortyndet prøve på 14 cm plader samt 0,1 ml i dublikat på fortyndinger, hvor agar er tilsat ampicillin (30µg/ml) eller gentamicin (10µg/ml). Prøve fra Hospital analyseres dobbelt. Andelen af suspekte E. coli, der vokser på agar med antibiotika, beregnes. Plader gemmes og leveres til SSI. h:\bop\51816rapport.doc 39 DHI - Institut for Vand og Miljø

44 Protokol for bestemmelse af resistens mod vancomycin og erythromycin hos suspekte enterokokker Definition Enterokokker defineres her som bakterier, der ved 44 C ± 0,5 C kan vokse på Slanetz & Bartley Agar (Oxoid). Reagenser: Pepton-saltvand (ISO8199:1988) Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g, ph justeres til 7,0 ± 0,2 Slanetz & Bartley (Oxoid) med og uden antibiotika. Udførelse Der modtages spildevandsprøver fra WPT i flasker. Flaskerne er ikke helt fyldte. Der laves 10-fold fortyndingsrække. Der spredes 1 ml ufortyndet prøve på 14 cm plader samt i dublikat 0,1 ml på fortyndinger. Der spredes 1 ml ufortyndet prøve på 14 cm plade samt 0,1 ml i dublikat på fortyndinger, hvor agar er tilsat vancomycin (16 µg/ml) eller erythromycin (4 µg/ml). Prøve fra Hospital analyseres dobbelt. Alle kolonier, der vokser frem, tælles. Andelen af suspekte enterokokker, der vokser på agar med antibiotika, beregnes. Plader gemmes og leveres til SSI. h:\bop\51816rapport.doc 40 DHI - Institut for Vand og Miljø

45 BILAG B Rådata fra kvantitativ resistensbestemmelse h:\bop\51816rapport.doc 41 DHI - Institut for Vand og Miljø

46 Suspekte E. coli (CFU pr. ml) Tilløb RD Dato RD-E. coli RD-E. coli A+ RD-E. coli G , Boligområde Dato Rød-E. coli Rød-E. coli A+ Rød-E. coli G , , , , , , , Hvidovre Hospital Dato HH-E. coli HH-E. coli A+ HH-E. coli G , , A+ = Ampicillin-resistente G+ = Gentamicin-resistente 0,1 ~ ikke detekteret h:\bop\51816rapport.doc 42 DHI - Institut for Vand og Miljø

47 Suspekte enterokokker (CFU/ml) Tilløb RD Dato RD-Ent RD-Ent E+ RD-Ent V Boligområde Dato Rød-Ent Rød-Ent E+ Rød-Ent V Hvidovre Hospital Dato HH-Ent HH-Ent E+ HH-Ent V ej Enterokker E+ = Erythromycin-resistente V+ = Vancomycin-resistente h:\bop\51816rapport.doc 43 DHI - Institut for Vand og Miljø

48 BILAG C Antibiotikaforbrug og koncentrationer i spildevand h:\bop\51816rapport.doc 44 DHI - Institut for Vand og Miljø

49 Rødovre - Husspildevand Parameter Oktober November December Januar Februar Marts Maj Maj Juni Juli August September 29-Okt Nov Dec Jan Feb Mar Maj Maj Jun Jul Aug Sep-03 SS BOD COD Total-N , Total-P 4 3,15 9,41 0,98 11,2 9,55 6,16 1,8 10,6 8,15 16,1 20,6 Vand m 3 /d DHI Nedbør døgnet før Nedbør 3 døgn før J01A gr 17,05 15,54 14,07 15,58 13,86 15,44 13,72 14,18 13,83 10,84 12,50 15,32 J01CA gr 43,35 42,94 46,47 50,21 46,82 45,74 37,19 37,18 32,64 28,94 31,19 40,02 J01DA01+03 gr 0,31 0,14 0,20 0,20 0,41 0,39 0,18 0,31 0,15 0,21 0,26 0,17 Sulfonamid (total) gr 31,79 30,62 29,99 31,38 26,51 29,19 28,74 30,21 29,91 29,09 31,43 31,38 Trimethoprim (total) gr 3,95 3,39 3,64 3,57 3,27 3,54 3,53 3,58 3,78 3,58 3,74 3,85 J01FA gr 47,42 46,10 47,64 49,54 46,88 45,04 39,98 36,87 36,85 30,75 37,11 41,90 J01G gr 0,09 0,02 0,07 0,10 0,06 0,03 0,03 0,00 0,07 0,01 0,03 0,10 J01MA gr 3,77 3,20 3,61 3,86 3,26 3,65 3,02 3,14 3,50 3,59 4,03 4,35 J01XA gr 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 J01A mg/m 3 3,309 3,080 4,321 1,951 4,538 4,848 2,543 1,490 4,314 3,390 4,582 5,805 J01CA mg/m 3 8,414 8,509 14,268 6,284 15,329 14,365 6,894 3,906 10,179 9,050 11,432 15,159 J01DA01+03 mg/m 3 0,060 0,028 0,060 0,024 0,133 0,124 0,033 0,033 0,048 0,065 0,095 0,066 Sulfonamid (total) mg/m 3 6,170 6,066 9,208 3,927 8,679 9,167 5,328 3,173 9,327 9,098 11,523 11,886 Trimethoprim (total) mg/m 3 0,766 0,672 1,119 0,447 1,070 1,113 0,654 0,376 1,179 1,118 1,371 1,459 J01FA mg/m 3 9,203 9,134 14,629 6,200 15,349 14,146 7,412 3,873 11,491 9,616 13,603 15,872 J01G mg/m 3 0,018 0,003 0,022 0,012 0,018 0,009 0,006 0,000 0,022 0,005 0,011 0,036 J01MA mg/m 3 0,732 0,633 1,109 0,483 1,066 1,145 0,560 0,330 1,091 1,121 1,476 1,646 J01XA mg/m 3 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 E. coli cfu/ml E. coli J01CA+ cfu/ml E. coli J01G+ cfu/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0, Ent cfu/ml Ent J01FA+ cfu/ml Ent J01XA+ cfu/ml h:\bop\51816rapport.doc 45 DHI - Institut for Vand og Miljø

50 Hvidovre Hospital Parameter Oktober November December Januar Februar Marts Maj Maj Juni Juli August September 29-Okt Nov Dec Jan Feb Mar Maj Maj Jun Jul Aug Sep-03 SS BOD COD Total-N Total-P 12 9, ,7 12,1 13,1 11,5 14,4 16,1 14,5 16,1 12,8 Vand m 3 /d Vand m3/mdr J01A gr 88,22 20,38 53,39 46,68 50,00 41,09 30,86 19,90 63,68 20,52 13,13 15,77 J01CA gr 2241, , , , , , , , , , , ,36 J01DA01+03 gr 4,30 4,05 5,83 0,75 5,33 2,28 5,58 0,25 4,55 5,26 0,00 4,25 Sulfonamid (total) gr 2957, , , , , , , , ,60 733,45 710,19 772,04 Trimethoprim (total) gr 434,63 340,40 348,24 374,21 337,88 414,16 332,74 321,83 428,33 52,65 30,91 52,14 J01FA gr 603,77 573,43 734,90 570,44 550,80 433,38 723,03 313,70 372,88 227,04 124,42 201,88 J01G gr 2,27 2,57 2,45 0,65 1,31 0,41 3,21 2,14 2,25 4,62 6,97 5,42 J01MA gr 775,45 695,28 775,34 620,51 574,17 587,24 699,37 523,21 625,98 221,83 132,18 230,68 J01XA gr 41,65 49,44 59,39 60,62 52,39 51,62 64,81 62,20 64,84 11,63 21,44 13,36 J01A mg/m 3 8,893 2,123 5,382 4,706 5,581 4,143 3,215 2,006 6,633 2,069 1,323 1,643 J01CA mg/m 3 225, , , , , , , , , , , ,663 J01DA01+03 mg/m 3 0,434 0,422 0,588 0,075 0,595 0,229 0,582 0,025 0,474 0,530 0,000 0,443 Sulfonamid (total) mg/m 3 298, , , , , , , , ,416 73,937 71,592 80,420 Trimethoprim (total) mg/m 3 43,814 35,458 35,105 37,723 37,710 41,750 34,661 32,443 44,617 5,307 3,116 5,432 J01FA mg/m 3 60,864 59,732 74,082 57,504 61,473 43,688 75,316 31,623 38,841 22,887 12,543 21,029 J01G mg/m 3 0,229 0,267 0,247 0,066 0,146 0,041 0,335 0,216 0,234 0,466 0,703 0,565 J01MA mg/m 3 78,170 72,425 78,159 62,552 64,082 59,198 72,851 52,743 65,207 22,362 13,325 24,029 J01XA mg/m 3 4,198 5,150 5,987 6,111 5,847 5,204 6,751 6,270 6,754 1,172 2,162 1,392 E. coli cfu/ml E. coli J01CA+ cfu/ml E. coli J01G+ cfu/ml 3,5 7, ,5 43 Ent cfu/ml Ent J01FA+ cfu/ml Ent J01XA+ cfu/ml h:\bop\51816rapport.doc 46 DHI - Institut for Vand og Miljø

51 Renseanlæg Damhusåen Parameter Oktober* November* December Januar Februar Marts Maj Maj* Juni Juli August September 29-Okt Nov Dec Jan Feb Mar Maj Maj Jun Jul Aug Sep-03 SS BOD COD Total-N Total-P Vand m 3 /d DHI J01A gr 7093, , , , , , , , , , , ,18 J01CA gr 18659, , , , , , , , , , , ,51 J01DA01+03 gr 68,97 54,02 68,61 47,01 107,79 60,68 66,30 53,15 176,90 37,65 83,09 47,80 Sulfonamid (total) gr 14498, , , , , , , , , , , ,84 Trimethoprim (total) gr 1601, , , , , , , , , , , ,48 J01FA gr 18490, , , , , , , , , , , ,08 J01G gr 52,29 22,33 35,43 33,97 22,42 18,11 10,33 23,59 32,03 23,68 25,68 41,67 J01MA gr 3090, , , , , , , , , , , ,51 J01XA gr 41,65 49,83 59,45 63,96 56,03 58,80 68,30 62,20 64,84 11,75 21,44 13,36 J01A mg/m 3 1,911 1,880 3,624 2,513 3,985 4,215 3,257 1,052 2,551 2,557 4,078 4,498 J01CA mg/m 3 5,027 5,227 11,790 7,655 14,920 11,760 8,390 2,555 6,424 6,901 9,778 11,546 J01DA01+03 mg/m 3 0,019 0,015 0,040 0,017 0,066 0,035 0,034 0,008 0,075 0,020 0,061 0,032 Sulfonamid (total) mg/m 3 3,906 3,642 7,435 4,960 7,332 7,291 6,007 1,985 5,590 5,919 8,845 7,979 Trimethoprim (total) mg/m 3 0,431 0,400 0,886 0,536 0,873 0,889 0,757 0,230 0,667 0,605 0,859 0,840 J01FA mg/m 3 4,981 5,056 10,811 6,829 10,895 10,106 8,285 2,346 6,372 6,456 10,556 10,957 J01G mg/m 3 0,014 0,006 0,020 0,012 0,014 0,010 0,005 0,004 0,014 0,013 0,019 0,028 J01MA mg/m 3 0,833 0,760 1,542 1,064 1,567 1,665 1,360 0,423 1,280 1,318 2,170 1,940 J01XA mg/m 3 0,011 0,014 0,034 0,023 0,035 0,034 0,035 0,010 0,028 0,006 0,016 0,009 E. coli cfu/ml E. coli J01CA+ cfu/ml E. coli J01G+ cfu/ml , Ent cfu/ml Ent J01FA+ cfu/ml Ent J01XA+ cfu/ml * by pass pga. Nedbør h:\bop\51816rapport.doc 47 DHI - Institut for Vand og Miljø

52 BILAG E Protokoller for kvalitativ resistensbestemmelse h:\bop\51816rapport.doc 48 DHI - Institut for Vand og Miljø

53 BILAG D Rådata for spildevandskarakterisering og analysemetoder h:\bop\51816rapport.doc 49 DHI - Institut for Vand og Miljø

54 Rødovre - Husspildevand Parameter Oktober November December Januar Februar Marts April Maj Juni Juli August September Middel MST 29-okt nov dec jan feb mar maj maj jun jul aug sep-03 SS mg/l BOD mg/l COD mg/l Total-N mg/l , ,5 69 Total-P mg/l 3,88 3,15 9,41 0,98 11,2 9,55 6,16 1,8 10,6 8,15 16,1 20,6 8,5 13 Vand m 3 /d * * Vandforbrug Hvidovre Hospital Parameter Oktober November December Januar Februar Marts April Maj Juni Juli August September Middel MST 29-okt nov dec jan feb mar maj maj jun jul aug sep-03 SS mg/l BOD mg/l COD mg/l Total-N mg/l ,3 69 Total-P mg/l 11,9 9, ,7 12,1 13,1 11,5 14,4 16,1 14,5 16,1 12,8 13,1 13 Vand m 3 /d 320 Renseanlæg Damhusåen Parameter Oktober* November* December Januar Februar Marts April Maj* Juni Juli August September Middel Tilløb okt nov dec jan feb mar maj maj jun jul aug sep-03 SS mg/l BOD mg/l COD mg/l Total-N mg/l ,8 34,2 Total-P mg/l ,3 7 Vand m 3 /d h:\bop\51816rapport.doc 50 DHI - Institut for Vand og Miljø

55 BILAG E Protokoller for kvantitativ resistensbestemmelse h:\bop\51816rapport.doc 51 DHI - Institut for Vand og Miljø

56 Identifikation af enterokokker ved multiplex PCR Formål: At identificere E. faecium, E. faecalis, E. gallinarum og E. casseliflavus ved multiplex PCR ud fra R. L. Poulsen et al. APMIS 107, , 1999 og Dutka-Malen S., et al. JCM, 1995 januar, p Materialer, udstyr og kemikalier Materialer Udstyr Kemikalier og reagenser Eppendorfrør, 1,5 ml safelock Latex-handsker MicroAmp, 200 µl (PCR-rør) PCR holder Pipettespidser med filter Mixer PCR LAFbænk PCR pipetter PCR-maskine Gel doc 2000 dntp- mix 10x PCR Buffer II, 25 mm MgCl 2, Taq polymerase Primere Markør GeneRuler 100 bp ladder plus Destilleret-H 2 O E. faecium BM4147 E. faecalis V583 E. gallinarum ATCC E. casseliflavus ATCC Fremgangsmåde: Dag 1 Udså kontrolstammerne BM4147 (E. faecium), V583 (E. faecalis), ATCC (E. gallinarum) og ATCC (E. casseliflavus) og prøvestammerne på hver 1 stk. relevant agarplade og inkubér ved 37 C natten over. Dag 2 Fremstil template-dna af stammerne. For at sikre tilstrækkelig Mastermix fremstilles til en prøve mere end det aktuelle antal prøver (4 kontrolstammer + 2 vandprøver + antal prøver + 1 ekstra) (notér på Bilag 2). Kontrolstammer samt 1 vandprøve skal med i hvert eneste opsæt, der laves. Fremstil Mastermixet. Fordel 45 µl Mastermix i hvert 200 L MicroAmp rør. Tilsæt 5,0! L template-dna til hvert rør efter tabel 5. Luk rørene. Det første og sidste rør tilsættes 5,0! L destilleret H 2 O i stedet for template og lukkes. Sæt rørene i PCR-maskinen. Maskinen indstilles til at køre nedenstående program. Kørslen i PCR-maskinen tager ca. 1 time og 45 minutter. h:\bop\51816rapport.doc 52 DHI - Institut for Vand og Miljø

57 Programnavn: vanco1 1 hold 10 cykler 25 cykler 1 hold 1 hold 5 min. ved 94 C 15 sek. ved 94 C 15 sek. ved 92 C 7 min. ved 72 C ved 4 C 30 sek. ved 55 C 30 sek. ved 55 C 30 sek. ved 72 C 30 sek. ved 72 C Analysér 17 µl PCR- produkt blandet med 3 µl Loadingbuffer på en 2% agarosegel ved 100 Volt. Medtag markør. Farv gelen 30 minutter i Ethidiumbromidfarvebad og affarv derefter i 10 minutter. Fotografer gelen. Resultatbehandling: PCR kørslen godkendes, hvis kontrolstammerne og vandprøven falder ud som vist i nedenstående skema. Hvis billedet afviger for bare én af brøndene, gentages kørslen. Prøve Bakterie nr. 16S + / - ddl. E. faecium + / - ddl. E. faecalis + / - vanc1 + / - vanc2/3 + / - dh 2 O E. faecium BM E. faecalis V E. gallinarum ATCC E. cassiliflavus ATCC Båndslængde 16S 708 bp ddl E.faecium 550 bp ddl E.faecalis 941 bp vanc1 329 bp vanc2/3 448 bp Billedet til højre viser eksempel på kørsel med en vandprøve, de fire kontrolstammer og 15 prøver. h:\bop\51816rapport.doc 53 DHI - Institut for Vand og Miljø