Antifryseprotein i Escherichia coli RUC Nat Bach 1. Semester efterår 2012

Transkript

1 Antifryseprotein i Escherichia coli RUC Nat Bach 1. Semester efterår 2012 Gruppe 6: Michele Rasmussen, Farah Rasool & Sabrina Wielsøe. Vejleder: Johannes Lørup Johnsen 12

2 Abstrakt Antifryseprotein i Escherichia coli Denne afhandling omhandler antifryseproteiner og disses funktioner. Antifryseproteiner er naturlig forekommende i nogle dyre - og plantearter. Antifryseproteiner er i stand til at forhindre en krystallisation af vandmolekyler, og dermed få vand til at forblive på flydende form. Denne rapport er lavet i sammenhæng med eksperimentelt arbejde, for at undersøge muligheden om at udtrykke antifryseproteiner igennem en E. coli bakteriestamme. Denne bakteriestamme har fået antifryseprotein-genet implementeret fra billen Rhagium mordax. Disse genmodificerede E. coli bakterier er testet op imod en tilsvarende ikke-genmodificeret E. coli-stamme, hvor overlevelsen efter en kuldepåvirkning på -18 C grader blev målt til 5.7% uden antifryseproteiner og 7.0% med antifryseproteiner. Resultaterne fra eksperimentet tyder på, at bakterier med antifryseproteinet ikke kan konkluderes som værende mere tolerante over for frostgrader end bakterier uden denne funktion. Dette betyder, at det yderligere perspektiv om at få indsat antifryseproteiner i afgrøder ikke kan gøres ud fra det udarbejdet forsøg, der er blevet lavet her - men det kan være basis for en videreudvikling. Abstract Antifreeze protein in Escherichia coli The following article deals with antifreeze proteins and its function. Antifreeze proteins, are naturally synthesis in some animal- and plant species. Antifreeze proteins are capable of preventing a crystallization of water molecules, and therefore sustaining a liquid form. This article is written with the connection to experimental work that research the possibility of a strain E. coli bacterium can express a genesequence of antifreeze protein. The gensequence that is implanted is obtained from the beetle Rhagium mordax. These genemodified E. coli bacteria are tested up against an artifical E. coli strain, and the survival after a shock-cooling treatment to -18 C degress was measured to: 5.7% without antifreeze proteins and 7.0% with antifreeze proteins. The results of the experiment indicate that the bacteria containing the genesequence of antifreeze protein cannot be determined as more cold-tolerant than the artificial bacteria. This means that the perspective of implanting antifreeze proteins in plant is not interesting before further research with the bacteria. Side 1 af 60

3 Indhold Forord... 4 Indledning... 5 Problemformulering... 6 Semesterbinding... 6 Eu og prokaryoter... 7 Forsøgsbakterier (E. coli) Proteiner Strukturer Den primære struktur Den sekundære struktur Påvirkning af proteiner Antifryseproteiner og billen Rhagium mordax Antifryseproteiners Antifryseproteiner i planter Proteinsyntese i bakterier DNA Transskription og translation IPTG Fryseprocessen (Vands faseovergang til is) Kulde- og frysepåvirkning af cellen Kulde essentielle gener Metoder Hypotese: Eksperiment Resultatbehandling Resultater Side 2 af 60

4 Diskussion Resultater Forsøg Agerbrugssæsonen Konklusion Litteraturliste Appendiks Ordforklaring Side 3 af 60

5 Forord Dette projekt er lavet i løbet af 1. semester på den naturvidenskabelige bachelor linje på Roskilde Universitet. Processen, hvori vi har arbejdet os frem mod svaret på vores problemformulering, har været meget lærerig og spændende for os, men også til tider udfordrende. I løbet af projektet har vi stiftet bekendtskab med primærlitteratur, artikellæsning, laboratoriearbejde samt bearbejdelse af forsøgsresultater. I den forbindelse vil vi gerne sende en stor tak til de personer, som har stået klar med hjælp og vejledning, når vi har haft brug for det. Specielt vi vil gerne takke Dennis Friis for hans tid, tålmodighed samt hjælp til laboratoriearbejde og databehandling. Endvidere har vores vejleder Johanne Lørup været god til at guide os i den rigtige retning og været til stor hjælp i form af kritisk gennemlæsning af rapporten undervejs i forløbet. Inden gennemlæsning af rapporten vil vi gøre opmærksom på henvisninger i form af [1], som henviser til kilde 1. Billedhenvisninger vil være markeret med [B,1] Derudover er ord markeret med f.eks. 1, som er forklaret i ordlisten til sidst i rapporten. Og til sidst skal det nævnes, at der gennem rapporten er gjort brug af engelsk kommatering i henhold til de internationale standarder. Vores målgruppe er studerende på Natbach, som har et lettere kendskab til biologi. Formålet med projektet er, at belyse muligheden for udnyttelsen af antifryseproteiners egenskaber i bakterieceller, som et første trin på vejen til at kunne indsætte disse proteiner i afgrøder, og dermed evt. udvide agerbrugssæsonen. Vi håber, I vil finde rapporten interessevækkende og gavnlig. Side 4 af 60

6 Indledning Det er kendt, at insekter i kolde egne f.eks. i de tempererede klimabælter, kan overleve til trods for ekstremt lave temperaturer i forhold til deres frysepunkt. Dette skyldes, at de i gennem evolutionen har udviklet evnen til at danne antifryseproteiner (AFP). Disse proteiner hæmmer dannelsen af iskrystaller inde i f.eks. et insekt, så dets blod stadig cirkulerer, og hermed vil insektet overleve, når temperaturen er under frysepunktet. Det foregår på den måde, at AFP, som er kodet via organismens genom, genkender overfladen på iskrystaller og forhindrer en krystallisering i at finde sted ved at binde sig til disse. Denne antifrysefunktion gør det interessant at undersøge, hvorledes det kan lade sig gøre at overføre denne egenskab til bakterier, da det kunne give anledning til igen at overføre AFP til afgrøder. Dette ville hermed kunne afhjælpe manglen på fødevarer, som i takt med befolkning på jorden gradvist vokser, stiger tilsvarende. Derfor vil vores fokus ligge på at kunne udvide agerbrugssæsonen ved at gøre afgrøderne mere kuldetolerante ved brug af AFP. Denne rapport vil derfor indeholde følgende punkter, der skal være med til at give en grundlæggende forståelse og videre indsigt i emnet: - bakterieceller og plante-dyre celler og den benyttede forsøgsbakterie - proteiner og hvordan disse produceres i cellen - overgangen fra vand til is samt fryse- og kuldepåvirkning af cellen - eksperiment som er bygget op omkring en udformet hypotese - behandling af forsøgsdata - diskussionsafsnit, hvor eventuelle ændringer omkring forsøget samt videreudvikling af dette - konklusion på selve forsøget og problemformuleringen Udover dette vil rapporten indbefatte de nødvendige afsnit, der opfylder kravene omkring en rapport såsom et abstrakt, indholdsfortegnelse, litteraturliste, appendiks mm. HEJ Side 5 af 60

7 Problemformulering I hvilket omfang kan genmodificeret Escherichia coli bakterier udnytte AFP til at styrke deres kuldetolerance? Semesterbinding Første semesters semesterbinding på den Naturvidenskabelige Bacheloruddannelse lyder således: Anvendelse af naturvidenskab i teknik og samfund - Med naturvidenskab (redskab og anvendelse). Vores fokus ligger på, hvorvidt det er muligt at bruge naturvidenskaben som redskab til at udvide agerbrugssæsonen ved indsættelse af genet for antifryseproteiner i afgrøder, og dermed forhåbentligt gøre dem mere kuldetolerante. Såfremt dette er muligt, kunne det tænkes at åbne nye muligheder for at dyrke afgrøder flere gange i løbet af året eller blot at skubbe perioden for henholdsvis såning og høstning, hvorved udbyttet af sæsonen formodes at stige. Det stigende udbytte vil hjælpe til at optimere samfundet, herved op flydes semesterbinding. Side 6 af 60

8 Eu og prokaryoter Det er vigtig i forbindelsen med vores projekt at forstå de væsentlige forskelle på eu- og prokaryoter. Dette skyldes, at vi i vores eksperiment har gjort brug af bakterier, prokaryoter, som model for en evt. videre forskning i planteceller, eukaryoter. Prokaryoter er navnet for celler uden en kerne, da det kommer fra det græske ord pro, som betyder uden, og karyot med betydningen kerne. Eukaryote celler har en cellekerne, hvilket også kommer fra det græske, da eu betyder med. I denne kerne, som i naturvidenskaben kaldes for nukleus, findes organismens DNA. Da prokaryoter ikke har en cellekerne, ligger deres DNA frit i cytoplasmaet, og forekommer som en sammenrullet kromosomstruktur, der kaldes for nukleoidet. Prokaryoter er mellem μm, hvilket i forhold til eukaryoter på μm, er en del mindre. Denne størrelsesforskel giver et indblik i bl.a. hvorfor, at prokaryote celler ikke har samme kapacitet for avanceret systemer, som eukaryoter har. Dette gør, prokaryoten til en langt mere simpel celle. Prokaryote celler har en cellevæg. Cellevæggen ses også hos eukaryotiske planteceller, forskellen er dog at disse cellevægge består af cellulose, hvorimod bakteriers cellevæg indeholder polysaccharider og aminosyrer. Bag ved cellevæggen er der en cellemembran, som sørger for, at cytoplasmaet ikke diffunderer 1 ud af cellen. Det er i cytoplasmaet, at plasmider og ribosomer flyder rundt. Ribosomer er en del af DNA-syntesen, der er med til at modificere proteiner (Her henvises til Proteinsyntese i bakterier), men i bakterier foregår DNA-syntesen mere simpelt, end det er kendetegnet i eukaryoter. Grundet bakteriernes hurtige og enkle DNA-syntese er det fordelagtigt at bruge disse i laboratoriet på grund af den væsentlig hurtigere vækst end eukaryote celler. Endnu mere fordelagtigt er det, at prokaryoter kan bære deres DNA i form af plasmider. Plasmider er cirkulære DNA-sekvenser, som kun koder for få gener i bakterien, der har betydning for bakteriernes reproduktion [1]. På grund af simpliciteten af plasmidet, er det nemmer at manipulere med, når man ønsker af et bestemt gen bliver udtrykt via reproduktionen. I forhold til eukaryotiske celler har prokaryoter ikke pre-mrna-trinnet 2. Dette giver prokaryoterne en fordel ved, at de hurtigere kan dele sig, hvilket også er grunden til de ofte benyttes i laboratoriet. Side 7 af 60

9 Bakterien har overlevet gennem tiden ved at reproducere sig selv vha. binær fission. Binær fission sker ved, at bakterien deler sig i 2, hvorefter de deler sig til 4 og så videre. Deres vækst er dermed eksponentiel voksende, så længe de rette betingelser forekommer. Nogle prokaryoter kan dele sig hvert 20 minut; dette gælder blandt andet for E. coli, som vi har med at gøre. Den eksponentielle udvikling vil dog ikke kunne fortsætte til uendelighed, idet der eksisterer begrænsende faktorer såsom næring, metabolisk affald 3 og plads. De E. coli bakterier vi har med at gøre, har fået indsat genet for AFP i deres plasmider. For at disse AFP skal fungere optimalt, er det nødvendigt, at de kommer ud af cellen. Denne transport sker via vesikler, som er en form for beholdere, som bliver brugt til at indkapsle cellens produkter eller affaldsstoffer i form af f.eks. proteiner, og transporterer dem ud til cellemembranen. Denne transport kan finde sted, så snart proteinerne er syntetiseret og foldet. Antifryseproteiner bliver derfor indkapslet i vesikler, som transporterer proteinerne ud til cellemembranen og fusionere 4 med denne, da både vesiklen og membranen er lavet af det samme materiale. Idet vesiklen rør membranens overflade, dannes der et hul i membranens dobbeltlag af fosforlipider.(se figur 1) Når dette sker, vil proteinerne blive transporteret igennem membranen og ud af cellen. Figur 1. Her ses bl.a. transporten af proteiner ud af cellen via veskiler [B. 1] Nedenstående tabel er med til at opsummerer de vigtigste, ovenstående punkter og give et overordnet overblik over de væsentlige forskelle, der er mellem eu- og prokaryotiske celler. Side 8 af 60

10 Tabel 1. Skematisk oversigt over forskellighederne, der er mellem pro- og eukaryote [B. 2] Prokaryoter Eukaryoter Eksempler Bakterier, Archaea Svampe, planter, dyr Størrelse Ca μm Ca μm DNA Cirkulært kromosomer Lineære kromosomer Nukleus Ingen reel kerne Cellekerne med dobbeltmembran Protein Finder sted i cytoplasmaet Transskription i kernen, translation i syntese cytoplasmaet Organeller Pillus, flagel Mitokondrier, kloroplast, ER, flagel Komplekser Enkelt cellede, kolonier Fler/enkelt cellede, dyr organismer. Replication Binær fission Mitose, Meiose (f.eks. sædceller og æg celler) Figur 2. Illustration til forståelse af forskellen mellem pro- og eukaryote celler [B,3] Da bakterier er så simple mikroorganismer, og deres DNA ikke er beskyttet i form af en kerne, gør det dem nemmere at manipulere med. Dette er dermed en central årsag til, at der bliver brugt E. coli i forbindelse med eksperimentet. Side 9 af 60

11 Forsøgsbakterier (E. coli) Bakterien, vi arbejder med, hedder Escherichia coli E. coli. Dette er en naturlig forekommende bakterie, der opholder sig i tarmen hos både dyr og mennesker. E. coli er med til at bearbejde affaldsstoffer, og den menneskelige afføring består af 10 % colibakterier. Den naturlige forekomst gør det yderst nyttigt i vores forsøg, da den er let tilgængelig. [2] Det er dog ikke sådan, at vi selv har fremskaffet disse forsøgsbakterier på naturlig måde. E. coli har en stavformet struktur, som ofte ses hos bakterier. Når disse formerer sig under de mest optimale forhold, vil dette ske ved binær fission hvert 20. minut. Dette kan dog kun finde sted under ideelle laboratoriske forhold ved 35 C. Når bakterierne befinder i tarmen, deler cellerne sig kun hver time. E. coli er et yderst nyttigt redskab for dette forsøg, som har henblik på at gøre det muligt at overføre antifryseproteiner fra en organisme til en anden. Brugen af E. coli er selvfølgelig kun et trin på vejen til at muliggøre dette, men pga. bakteriens simple opbygning, lettilgængelige DNA og hurtige vækst, er det en god model for, hvordan den fremtidige genoverførsel kan se ud. [3] Ej Side 10 af 60

12 Proteiner Proteiner er nogle af de vigtigste molekyler for alle levende organismer. Ikke kun fordi de er fundamentale byggesten for organismer, men også fordi de har en styrende rolle i de fleste biologiske processer. Proteiner kan opdeles i flere grupper såsom enzymer, strukturproteiner og antistoffer 5. Disse er med til at sørge for, at kroppens sammenspil fungerer optimalt. Opbygningen af proteiner ligger gemt i cellens DNA. I DNA et findes der gensekvenser, som koder for sammensætningen af de specifikke proteiner. Alle de forskellige slags proteiner består af aminosyrer, som er kovalent 6 bundet sammen gennem peptidbindinger 7. Rækkefølgen af disse aminosyres bindinger har stor betydning for proteinets funktion. Aminosyrer består af en aminogruppe (NH 4 ) og en carboxylsyregruppe (COOH), hvoraf både dens aminogruppe og carboxylsyregruppe er bundet til det samme C-atom. Således at der er to pladser ledige. Den ene plads bliver taget af et hydrogenatom (H), og den fjerde plads bliver taget af proteinets radikal (betegnes R). Hver aminosyre har sin egen radikal, som er med til at udgøre forskellen på dem. Generelt indeholder et protein mellem 100 og 600 aminosyrer. (Se figur 3) Figur 3. Viser den molekylære struktur af en aminosyre, som består af en aminogruppe, en carboxylsyre og en radikal. [B.2] Som nævnt ovenover består proteiner af aminosyrer, som sammenholdes af peptidbindinger. Peptiderne i peptidbindingerne inddeles efter, hvor mange aminosyrer, de indeholder, f.eks. består tetrapeptid af 4 aminosyrer, som navnet også indikerer. Proteiner består ikke af nogle enkelte peptider, men af mange peptider, og derfor kaldes de også polypeptider. Side 11 af 60

13 Selve peptidbindingen fremkommer først, når to aminosyrer i et peptid binder sig. Bindingen dannes mellem carboxylsyregruppen i den ene aminosyre og aminogruppen i den anden aminosyre. Under processen fraspaltes der vand. (Se figur 4) Figur 4. viser en peptidbinding, som er en binding mellem to aminosyrer, hvorved aminogruppen i aminosyre 1 binder sig med syregruppen i aminosyre 2 ved fraspaltning af vand. Samtidig ses N og C-terminal for peptidbindingen. [B.4] Strukturer Der findes fire slags strukturer i proteinet, som danner de forskellige strukturelle aspekter i proteinet; Den primære -, den sekundære -, den tertiære - og den kvarternærestruktur. Det er dog kun den primær og sekundær struktur, som vil blive gennemgået i dette afsnit, da de sidstnævnte ikke er afgørende for AFP s funktion. Strukturen bestemmes af det gen, der koder for selve proteinet og den unikke rækkefølge af de forskellige aminosyrer, som proteinet indeholder. Aminosyresekvensen er afgørende for de resterende strukturer, da denne sekvens også vil have en bestemt form. Dog kan proteinet ændre form og funktion, hvis der forekommer en denaturering af proteinet (dette er forklaret i et nedenstående afsnit Påvirkning af proteiner). [4]. (Se figur 8). Den primære struktur Primær struktur er rækkefølgen af aminosyrer i proteinet, som også kan beskrives som, at den primære sekvens er opbygget af peptidbindinger, hvor den ene ende altid vil bestå af en Side 12 af 60

14 aminogruppe og den anden ende af en carboxylsyre. Herved siges, at aminogruppen er N- terminalen, fordi den består af NH 2, og C-terminalen er enden, hvorved carboxylsyren er bundet (kaldet efter COOH). (Se figur 5) Når et protein normalt syntetiseres, sker det fra N-terminalen til C-terminalen. Figur 5 viser aminosyresekvensen (nederst), som er kodet af 3 nukleobaser for hver aminosyre. Baserne findes som gener i et DNA. [B. 5] Den sekundære struktur Denne består af to forskellige strukturer: Den ene af de to er alfa-helixen, hvor proteinets rygrad, har en spiralform. Dette skyldes, at dens hydrogen-atomer er bundet til hver fjerde aminosyre gennem en hydrogenbinding 8. Hydrogenbindingen forekommer mellem den første carboxylgruppe i den ene aminosyre og aminogruppen på den femte aminosyre, således at der er et mellemrum på 4 aminosyre i hydrogenbindingen. (Se figur 6) Figur 6. viser spiralformet struktur kaldet alfa-helix, som er foldningen af en aminosyrekæde bestående af aminosyrerne, der er bundet sammen gennem hydrogenbindinger. [B. 6] Side 13 af 60

15 Den anden struktur, kaldet beta-sheets, er formet således, at dens rygrad er strakt helt ud, og polypeptidkæderne ligger parallelt eller antiparallelt ved siden af hinanden. For at sådan en struktur kan defineres, skal der mindst to polypeptidkæder til. Disse parallelle/antiparallelle polypeptidkæder er også bundet sammen gennem hydrogenbindinger, hvorved hver anden sidegruppe, som stikker vandret ud, kommer ud til hver sin side. (Se figur 7) Figur 7 viser den sekundære struktur af et protein, som har en beta-sheet foldning. Her ligger polypeptidkæderne enten parallelt (nederst) eller antiparallelt (øverst) og er bundet sammen gennem hydrogenbindinger. [B. 7] Påvirkning af proteiner Blot en lille ændring i primærstrukturen, såsom en erstatning af en aminosyre, kan påvirke proteinstrukturen og have en ødelæggende effekt på dets funktion. Når et protein syntetiseres, er det under bestemte forhold, som er et kendt miljø for proteinerne. Hvis der således i dette miljø forekommer en kemisk ændring, en ændring i temperaturen eller ph-værdien denatureres proteinet, dvs. at bindingerne opløses, og proteinet foldes ud, og dermed vil det ikke fungere. En ændring fra at proteinet forholder sig i et vandopløseligt miljø og overføres til en ikke-polær opløsning vil gøre, at proteinets hydrofobe aminosyrer bliver foldet udad, og dermed er i kontakt med væsken. Dette vil også have en ødelæggende effekt på proteinets funktion. En kemisk ændring vil gå ind og påvirker ionbindingerne 9, hydrogenbindingerne og svovlbroerne 10. Alle disse faktorer gør, at proteinstrukturen og proteinets funktion ødelægges, og dermed gør det Side 14 af 60

16 ubrugbart. Proteinets foldning kan dog renatureres dvs. at det kan foldes tilbage igen, så det vil bevare sin struktur og funktion, men kun hvis proteinet vender tilbage til sit oprindelige kendte miljø.[ 1] (Se figur 8) Figur 8. Viser proteinets foldning, når det denatureres, hvorved det mister sin struktur og foldes ud (højre side). Samtidig ses proteinets foldet struktur, hvor det ligger på en helt bestem måde (venstre side). [B. 8] Disse ovenstående punkter er med til at vise, at der ikke skal så mange ændringer i proteinets miljø til at forandre dets funktion. Når der derfor arbejdes med AFP, kan det give problemer i og med, at proteinet ikke normalt forekommer i den organisme, det bliver overført til. Der er derfor også taget højde for denne faktor under diskussionsafsnittet om resultaterne. Side 15 af 60

17 Antifryseproteiner og billen Rhagium mordax AFP er proteiner, som kan forhindrer krystallisationen af vandmolekyler, og hæmme isvækst på denne måde. Dette betyder, at AFP forskyder frysning af vand til under 0 C. Sagt på en anden måde, gør det det muligt for en substans at blive underafkølet og undgå at fryse til is. AFP har derimod ikke en effekt på smeltepunktet, da det vil forblive normalt. Den forskel, der skabes af disse proteiner, er kendt som fagtermet termisk hysterese. AFP kaldes i fagsprog for Termisk Hysterese Proteiner (THP). Forskydelsen af frysepunktet forårsaget af antifryse-proteiner er kendt som Termisk Hysterese Aktivitet. (THA). Ud fra denne aktivitet er de forskellige typer af AFP kategoriseret, som gør det muligt at inddele dem efter i hvor høj grad, de kan forskyde frysepunktet. (Se tabel 2) [5] Antifryseproteiner Fisk - AFP Insekt - AFP Plante AFP Termisk hysterese aktivitet 2.0⁰C 30.0⁰C 0.3⁰C (Forskydning af frysepunkt) Bindingspunkt Prismer Prismer/basalplan Prismer Formål Forhindre isdannelse Forhindre isdannelse Skabe små iskrystaller* Tabel 2. Tabel over de forskellige former for AFP s virkemåde. *Formålet for AFP i planter er ikke at sænke frysepunktet i samme grad, som AFP i fisk og insekter, men derimod at sikre der ved isdannelse skabe små iskerner frem for kompakt is [6], [B. 2] Billen Rhagium mordax (på dansk: blankplettet tandbuk) indeholder AFP, som har en effektiv termisk hysterese, således at det kan forskyde frysepunktet med 30 C. [7] Derimod kan AFP fra fisken kun sænke frysepunktet med 2 C. [8] Denne forskel skyldes formentligt det omkringliggende miljø. Saltvand hvori fisken lever vil aldrig opnå en lavere temperatur end -2 C derfor er det unødvendigt for fisken at kunne tolerere mere kulde end det. Til gengæld skal insekter kunne overleve temperaturer op mod -30 C hvilket afspejles i deres AFP s effektivitet. AFP i planter har samme opgave som AFP i fisk og insekter; sikre overlevelse til trods for lave temperaturer. Måde hvorpå de gør dette er dog forskelligt, mens AFP i fisk og insekter forsøger at Side 16 af 60

18 undgå en isdannelse, har AFP i planter til formål at sikre en kontrolleret isdannelse, da dette er mere fordelagtigt for planten. [6] Ved overflytning af AFP fra billen til en plante, vil planten kunne undgå isdannelse og derved er en fortsat vækst formentlig sikret. Billen Rhagium mordax har 7 isotyper dvs. at den indeholder 7 slags AFP. Fælles for disse isotyper er, at de har den samme funktion. Forskellen ligger i, at de har hver deres molekylærstruktur. Isotypen, vi har beskæftiget os med, er isotype 1 og kaldes RmAFP#1. RmAFP#1 består af forskellige aminosyrer som f.eks. alanin (findes i de fleste proteiner). Det påfaldende i dette protein er det høje indhold af threonin, som formodes at være den aminosyre, der binder sig til iskrystallens overflade. [9] RmAFP#1 indeholder i alt 135 aminosyrer. [10]. Grunden til, at vi kun benytter os af én isotype er, at forenkle vores eksperiment. Figur 9. Viser sekvensen af RmAFP#1 fra N- til C-terninalen [B.9] Side 17 af 60

19 Antifryseproteiners funktion Det følgende afsnit er skrevet ud fra kommunikation med vejleder Johannes Lørup. AFP virker ved faseovergangen fra flydende stof (vand) til fast stof(is). I denne process vil der, for vands vedkommende under normale omstændigheder, blive dannet hexagonale iskerner. En hexagonal iskerne har en sekskantet grundflade, hvorfra iskrystallen vil udvide sig både i bredden og i højden. En hexagonal iskerne er opdelt i flere facetter. Facetterne er opbygget i et basalplan og i flere prismer. Basalplanet er toppen af selve iskernen, mens prismer er siderne, der danner sekskanten. Dette er illustreret herunder: Figur 10. Formen på en hexgonal iskrystal, hvor siderne betegnes som prismer, mens grundfladen kaldes basalplan. [B.2] Side 18 af 60

20 AFP virker ved at binde sig til facetter af den hexagonale iskerne. De AFP som der er fundet i fisk, kan gennem deres strukturelle opbygning kun binde sig til prismefladerne på krystallen. Det betyder, at krystallen kun kan vokse ud fra basalplanet. Prismernes areal vil derfor vokse, hvorimod basalplanets areal formindskes. Dette fortsætter til krystallen ikke kan vokse mere, og der vil derfor kun blive dannet små krystaller i stedet for et isgitter, på grund af at disse krystaller er ude af stand til at gå i forbindelse med hinanden. (Se figur 11) Da AFP i fisk kun kan binde sig til prismerne, er det begrænset, hvor stor en effekt (THA), de har. Dette gør også, at de kun kan forskyde frysepunktet med 2 C. Når denne grænse er overgået, vil faseovergangen til is begynde til trods for tilstedeværelsen af AFP. Krystallerne, der dannes, når AFP kun kan sætte sig på prismerne, illustreres herunder. Figur 11. Illustrationen viser, hvordan en iskrystal vil udvikle sig når AFP bindes til prismerne. [B.2] AFP i billen (insekter) har i modsætning til AFP i fisk en sekundær struktur opbygget af beta- sheet, hvilket gør dem i stand til både at binde sig til basalplanet og prismerne. Dette betyder, at krystallen ikke har nogen mulighed for at udvide sig i nogen retning, hvilket gør den stabil og hermed hæmmes isvæksten væsentligt. Denne forskel på AFP har gjort det muligt for insektet at flytte frysepunktet 30 C, mens fisk kun er i stand til at flytte det 2 C. [11] Insekternes AFP er derfor mere effektivt end AFP fra fisk, da dets termisk hysterese aktivitet er højere. Der er flere forskellige teorier om, hvordan AFP virker helt præcist, og hvordan AFP binder sig til iskrystallerne. En af teorierne går på, at det er nogle bestemte aminosyrer fra AFP, der bindes til iskrystallernes planer, men det er endnu ikke fastlagt, hvordan det fungerer. En anden teori bygger på, at det er den hydrofobe del af proteinet, der sætter sig fast på iskrystallen. [10] Side 19 af 60

21 Antifryseproteiner i planter AFP, der forekommer i planteceller, virker ikke lige så effektivt, som AFP hos billen, da de kun kan flytte frysepunktet omkring 0.3 C. [12] Dette skyldes, at AFP fra planter har flere bindingssteder på iskrystallerne. De kan dermed danne forskellige krystalformer, f.eks. vil en høj koncentration af AFP danne en nåleformet iskrystal, imens der ved en lav koncentration vil blive dannet en hexagonal iskrystal [13]. AFP er blevet observeret i en række planter af forskellige arter. En af disse observationer er gjort på Secale cereale (vinterrug). Undersøgelser med vinterrug har vist, at de udnytter AFP i flere regioner af planten, og at det tilmed er forskellige isotyper af AFP, der findes i disse regioner. Nogle af disse regioner f.eks. åre og cellevæg, har et forhøjet indhold af AFP i forhold til den resterende del af planten. Plantens indhold af AFP inde i selve cellen, skyldes manglende signalpeptider 11, hvilket forhindrer AFP i at blive transporteret ud af cellen. Om dette skyldes evolutionær udvikling eller ufærdig proteinsyntese vides dog ikke endnu. [14] Side 20 af 60

22 Proteinsyntese i bakterier For forståelsen af bakteriers hurtige transskription og translation af deres DNA, samt baggrunden for brugen af IPGT i stedet for ren laktose, vil dette afsnit omhandle en overordnet gennemgang af DNA-syntese, samt en specificering af IPTG s effekt. DNA DNA s struktur er opbygget af grundenheder, som hedder deoxyribonukleotider også kaldet nukleotider. Disse nukleotider sidder som perler på en snor og er ofte koblet sammen i lange kæder. Der findes fire forskellige slags nukleotider i DNA afhængigt af, om den cykliske base er adenin, guanin, thymin eller cytosin. Disse fire nukleotider betegnes oftes med deres forbogstav; A, G, T og C. Rækkefølgen af disse nukleotider, som også kaldes DNA-sekvenser, er med til at afgøre arvemassen. [15] Nukleotiderne består af en sukkerdel, deoxyribose, hvortil der er bundet en fosfatgruppe og en kvælstofholdig base. Sukkergrupperne er bundet sammen med fosfatgrupperne, og denne sukkerfosfat-kæde udgør stamme-strukturen i DNA-strengen. DNA får derved en polaritet, dvs. to kemisk set forskellige ender, som benævnes 5'- og 3'-enden. De to DNA-strenge er antiparallelle, de løber derfor modsat hinanden, således at en 5'...3' DNA-streng baseparrer med en 3'...5' DNA-streng. Baseparrene er placeret i centrum, og sukker- og fosfatgrupperne snorer sig langs ydersiden. [15] Transskription og translation For at få en fornemmelse af hvad DNA-syntese og dens trin er, er der en let gennemgang af disse processer herunder, men herefter dykkes der ned i den mere avanceret del. Transskription og translation kan forstås således; fra DNA RNA protein. Principielt foregår dette på samme måde i både pro- og eukaryote celler, dog forgår translation og transskription adskilt i eukaryoter pga. cellekernens tilstedeværelse. Dette gør, at DNA-syntesen i prokayote celler kan ske hurtigere, da begge trin foregår i cytoplasmaet. Side 21 af 60

23 I eukaryoter skal mrna 12, som er produktet af DNA-transskriptionen først modificeres, for derefter at forlade cellekernen og komme ud i cytoplasmaet, hvor translationen af mrna et kan finde sted. Denne sammenfattende faktor er med til at forøge væksthastigheden hos prokaryoter. Den første del af DNA-syntesen betegnes som transskriptionen. Denne proces kan anses for dannelsen af en RNA-arbejdskopi, der kaldes mrna, der dannes ud fra DNA. Startsignalet for transskriptionen er en nukleotidsekvens, altså en sekvens på DNA et. Denne nukleotidsekvens hedder AUG, som koder for methionin. Stedet, hvor denne DNA-sekvens koder for starttransskription, kaldes promotoren. Dette er også stedet, hvor RNA-polymerasen binder sig, og derved angiver promotoren, hvilken retning RNA-polymerasen, som er et enzym, skal køre samt hvilken streng, der skal transskriberes. Der er nogle flere faktorer, der er afgørende for transskriptionen blandt andet tæt ved promotoren, er der en sektion på DNA-strengen, som kaldes operon. Operon er en klynge af gener, som bliver reguleret af en enkel operator; en operator er et segment af DNA, hvor aktive transskriptionsproteiner binder sig. Hyppigst taler man om lacoperon, som er dette segment af DNA mellem promotoren og klyngen af operon-gener. Disse områder på DNA-strengen er af afgørende betydning for DNA transskriptionen, da disse er med til at diktere, hvilke proteiner der skal produceres. Nu har RNA-polymerasen sat sig ved promotoren, og denne skal til at producere RNA, men før den kan dette, skal DNA-strengen klippes op, hvilket sker ved hjælp af restriktionsenzymer. Restriktionsenzymerne klipper strengen over ved hydrolyse 13, således DNA-sekvenserne ikke længere holdes sammen. RNA-polymerase anvender dermed den ene af de to DNA-strenge som en skabelon. Stopsignalet er ligeledes en nukleotidsekvens, der kaldes terminatoren. Der er dog flere nukleotidsekvenser, der kan kode for et stop-signal ligeså med start-signalet, men det er dog hyppigst AUG, der forekommer som kodende starter. [16] mrna syntetiseres altså af RNA-polymerase, hvorefter det transporteres af trna 14 (transfer RNA) og translateres af rrna 15, hvor det translateret produkt er et færdigt og funktionelt protein. Når denne syntese er færdig, vil proteiner enten flyde ud i cytoplasmaet, eller blive transporteret via en vesikel ud til cellemembranen og ud fra cellen. Dette er tilfældet med antifryseproteinerne. Det som kendetegner vesikler er deres evne til at kunne opbevarer ting f.eks. proteiner og enzymer. Side 22 af 60

24 IPTG E. coli bakteriers laktose-metabolisme afhænger af en specifik operon, det før omtalte lac-operon, som består af tre strukturgener kaldet lacz, lacy og laca. Disse gen-sekvenser koder for β- galaktosidase (hydrolase enzym, der spalter laktose til glukose og galaktose), laktosepermease (membranprotein, der hjælper med at få laktose transporteret ind i cellen) og thiogalactosid transacetylase (katalyserende enzym). Figur 12 viser et lac-operon gensekvens. [B. 10] Lac-operon sørger for de nødvendige nedbrydningsproteiner af laktose i cellen. Når der er laktose til stede, vil denne stimuli sætte gang i transskriptionen af lac-operon, disse proteiner, nedbryder laktosen, hvorved bakterien får energi, da laktose er føde for bakterien. Den strukturelle opbygning af IPTG ligner laktose. Af den grund vil IPTG igangsætte lac-operontransskriptionen, men da dette kun ligner laktose strukturmæssigt, vil det ikke blive nedbrudt. Derfor vil der hele tiden blive produceret AFP.[16] I og med at det er genmodificeret bakterier vi har med at gøre, betyder det, at deres gen er blevet manipuleret med. Lige præcis ved lac-operon området er der blevet indsat en gensekvens for AFP. Dette betyder, at når IPTG er til stede, vil der også blive produceret antifryseproteiner, som gerne skulle komme til udtryk, når bakterierne bliver frosset ned. En fordel ved IPTG i eksperimenter er, at da det ikke kan metaboliseres af E. coli, dvs. dets koncentration er konstant, hvilket er ganske praktisk, så man ikke er nødt til at tilføje næring til bakterierne i tid og utide. Dette er grundlaget for, at der benyttes IPTG som transskriptionsaktivator frem for laktose. Side 23 af 60

25 Fryseprocessen (Vands faseovergang til is) Når vand begynder at nærme sig de 0 C ved et normalt atmosfærisk tryk, som er på 1 atm, vil det begynde at fryse. Vand gennemgår derved en faseovergang fra flydende til fast. Fasediagrammet (Se figur 13) viser, hvilke betingelser vandet skal opfylde for at gå fra en fase til en anden. På figuren ved atm tryk og 0.01 C ses et trippelpunkt, hvor vand er både på fast-, flydende- og gasform, mens vand ved 1 atm og 0 C vil være fast eller flydende. Figur 13. Fasediagram, hvor de forskellige betingelser for de 3 tilstandsformer ses. man kan se hvornår vand går fra en fase til en anden. [B. 11] Faseovergang fra flydende til fast form er en exoterm førsteordens faseovergang dvs.. Dette betyder, at der afgives varme til omgivelserne, når vandet går fra flydende til fast form. Når vand er flydende, bliver hydrogenbindingerne brudt og gendannet hele tiden, men når vand begynder at fryse, bevæger molekylerne sig langsommere, og kan dermed ikke længere blive ved med at bryde hydrogenbindingerne. Hydrogenbindingerne er stabile, når vandet er krystalliseret, og hvert vandmolekyle er hydrogenbundet til 4 naboer [1]. Under denne faseovergang, når temperaturen sænkes mod 0 C, kommer vand ind i en krystalliseringsproces. Denne proces finder sted, når et tilstrækkeligt antal vandmolekyler har samlet sig i en klynge. Denne klynge vil på et tidspunkt nå en kritisk størrelse og blive til en iskerne. Når vand nærmer sig denne grænse, hvor vandmolekylerne er ved at danne iskerner, er man noget til det sted, hvor man siger, at vand danner kritisk nukleus. Kritisk nukleus er iskernedannelse, som vil fortsætte, indtil hele systemet er omdannet til is [17]. Side 24 af 60

26 Iskernedannelsen kan være homogen eller heterogen. Homogen kernedannelse er, hvor det kun er vandmolekylerne, som er til stede. Disse samler sig til en iskerne og starter en krystalliseringsproces. Heterogen kernedannelse sker, når der forekommer andre komponenter, som f.eks. ioner eller andre molekyler i vandet. [10] Disse stoffer er med til at fremme fryseprocessen. Vand som indeholder enzymer og reaktive salte, vil fraspalte disse ved frysning. Dermed stiger koncentration af enzymer og salte i det omkringliggende miljø, og kan medføre ændring af ph-værdi og ionstyrke. Den krystal, som dannes af vandet, er den mest almindelige krystal, som også findes i sne. Konstruktionen af denne krystal er en sekskant. Det er ikke den eneste iskrystalform, der findes. Der findes en lang række andre isstrukturer, som dannes under et andet atmosfærisk tryk eller ved meget lavere temperaturer. Den iskrystaldannelse der sker, når vandet fryser, gør at vand får en større volumen ved overgangen til is. Underafkølet vand er flydende til trods for temperaturen er under 0 C [18]. Det er dog en meget ustabil tilstand, da den mindste bevægelse eller partikel, der rammer vandet, kan få det til at krystallisere. [19] Vand skal være helt rent for at blive underafkølet, da den mindste urenhed kan starte krystalliseringsprocessen, som det også er nævnt ovenover. Side 25 af 60

27 I figur 13 kan man se, at vand kan være underafkølet ned til 36 C. Figur 13 er en oversigt som viser de forskellige tilstandsformer for vand ved tilhørende temperaturer. [B. 12] I vores eksperiment har vi både arbejdet med at underafkøle det medie med E. coli i og fryse det. Det er dermed vigtigt at forstå disse processer, da der er arbejdet med nedkøling af bakterier med indsat AFP. Side 26 af 60

28 Kulde- og frysepåvirkning af cellen Nedkølingsprocessen og variationen i temperaturen har afgørende rolle for antifryseproteiners effektivitet, da disse har forskellige frysepunktsforskydningstemperaturer. I planter med naturlige forekommende antifryseproteiner, er frysepunktet ikke særligt lavt i forhold til frysepunktet i fisk og insekter. Dette er kun omkring C. Det AFP vi beskæftiger os med, stammer som bekendt fra billen Rhagium mordax, som har vist sig at kunne fungere i sin vært ned til -30 C. Det tænkes at videre forskning med overførelse af AFP til planter, kunne optimeres ved benyttelse af vinterrug, da tidligere undersøgelser af vinterrugs frø vist har, at de kan fryses ned til en temperatur på -30 C, før de mest fatale skader i frøets membraner finder sted. [20] Denne funktion skyldes, at der sker modificerende ændringer i cellemembranen, som respons på disse ekstreme kuldeforhold. Ved en påvirkning af kulde ændres genekspressionen 16, hvilket medfører forandringer i cellemembranen, såsom koncentrationen af sukkerholdige forbindelser som f.ek.s glykoproteiner, der med til at holde membranen smidig og fleksibel, øges. Som nævnt i proteinafsnittet vil få ændringer gå ind forandre proteiners struktur, og dermed deres funktion, så denne kuldefaktor vil dermed være med til at ændre membranens proteinstruktur.[21]. Det er netop også vist, at det er i cellemembranen, de fleste skader sker under nedfrysning. [22] Det er derfor væsentligt, at planten har denne kuldemodificerende cellemembransfunktion, som forebygger skader i membranen Disse ændringer er også observeret i planten Dactylis glomeratas 17 frø, som blev kølet ned. Frøet befinder sig lige før spiring i en hård skal, som beskytter den mod omgivelserne. Denne skal kaldes for frøkappe og indeholder næring til plantens spiring. Inde i kappen er frøet i en dvaletilstand, og metabolismen er næsten gået helt i stå. Frøet kan ligge i lang tid i dvale, indtil at de rigtige betingelser er opfyldt for spiringen. [1]. Dette betyder, at frøet, som ligger i dvale, ikke kan spire i så ekstreme temperaturer på grund af manglende metabolisme. Man kunne ved dette eksperiment om planten Dactylis glomeratas frø observeres en stor forskel i, hvor mange steroler der var til stede i kappens membran. Side 27 af 60

29 Steroler er mest kendt som kolesterol og er en del af cellemembranen som sidder sammen med fosforlipider. Figur 14. billedet viser cellemembranen, som består af fosforlipider og membranproteiner. [B.13] Fordelingen af antallet af steroler i forhold til fosforlipider stiger markant under nedkøling i planter med denne kuldemodificerende membranfunktion. Det ses i andre planter med en stigning fra ratio pr. fosforlipid, hvorimod stigningen er fra pr. fosforlipid i den tidligere omtalte Dactylis glomerata.[21]. Disse resultater indikere, at evolutionen har påvirket nogle planter, så de er bedre til at leve i koldere egne, end andre. Det er dog vigtigt i denne sammenhæng at holde for øje, at det er 2 forskellige reaktioner, som sker under plantens nedkøling og frysning. Skader på planten under nedkøling ses ofte i planter fra varmere klimaområder end det tempereret bælte. Alt i mens læsioner på membranen under nedfrysning sker i alle planter. Disse skader er derfor delt op under 2 undergrupper: køle- og fryseskader. Skaderne, som membranen påføres under nedfrysning, er blevet undersøgt i vinterrug. Her kunne der ses 3 forskellige læsioner i cellemembranen: Expansion-induced lysis, som opstår mellem -2 C til -5 C, lamellar-to-hexagonal-ii phase transitions som opstår ved omkring -10 C, og fracture jump lesions som opstår ved -20 C. Vores interesse ligger i de mildere temperaturer dvs. expansion induced lysis. Denne læsion opstår, når frosten uden for cellen trækker vand ud af cellen, og får denne til at skrumpe. Når det yderste lag is på cellemembranen smelter, vil cellen optage det vand, og dermed udvide sig igen. Denne dehydrering 19 og hydration 20, er så hård for membranerne, at det skaber læsioner i dem og cellen dør af disse skader. [23] Side 28 af 60

30 Alt dette vil sige, at planter i køligere egne bedre kan ændre opbygningen og indholdet i cellemembranen, og dermed tilpasse sig til kulden, end planter fra andre klimabælter. Alle disse ændringer må have baggrund i, at genekspressionen skifter mønster, da denne sætter membranændringsprocesserne i gang. Sammenspillet mellem de gensekvenser, der har medvirkning til ændringen af membranen og antifryseproteinernes ekspression er en anden vigtig faktor. Ekspressionen af disse gener er derfor vigtige, da både antifryseproteinet og de klima tilpassende gener er nødvendige for planten for at overleve. På baggrund af de ovenstående faktor er det derfor ikke ligetil at få genmodificere planter til at udnytte antifryseprotein i sammenspil med planternes andre gener. Kulde essentielle gener Ekspression af kulderegulerende gener har været igennem flere undersøgelser. En af de fælles ting er brugen af transskriptionsfaktoren C-repeat (CRP). CRP spiller en afgørende rolle inden for hvilke gensekvenser, der bliver udtrykt. Denne transskriptionsfaktor 21 binder sig til en promoter, og sørger på den måde for at DNA et bliver aflæst. CRP er dermed den transskriptionsfaktor, som sørger for, at planternes gener, som koder for kulde- og frostrespons, bliver udtrykt, når omgivelserne er korrekte. Disse kulde- og frostgener kaldes DRE (Dehydration responsive element). Studier har vist, at sekvenser, der koder for DRE-generne, alle indeholder den samme nukleotid-sekvens svarende til: CCGAC [24]. Dette blev først opdaget i planten Arabidopsis,, men senere undersøgelser har vist, at det er samme CRP- og DRE-sekvens, der aktiveres i planteceller [24]. CCGAC har vist sig at blive aktiveret ved kuldepåvirkning og dehydrering. De transskriptionelle aktivatorer 22 CBF1/DREB1b, CBF2/DREB1c og CBF/DREB1a binder sig til CRP og DRE, og aktiverer disse transskriptionsfaktorer, der sætter gang i DNA-syntesen. For at denne proces kan finde sted og være succesfuld kræver det en nedkølingsfase og ikke direkte frost. [25] Hvis nedkølingen sker for hurtigt, kan der opstå frostskader eller kuldeskader i plantens cellemembraner. Ved lavere temperaturer vil molekylerne i membranen ikke bevæge sig med samme hastighed, som de ville ved høje temperaturer. Dette gør, at de fosforlipider og proteiner, som virker i membranen, har meget sværere ved at varetage de processer, således at cellen fungerer optimalt. Dette kan føre til, at Side 29 af 60

31 transporten af affaldsstoffer og andre stoffer over membranen vil gå i stå, da enten proteiner denaturerer eller membranen stivner på grund af kulden. [1] Dette er set i vinterrug. Vinterrugs fr kan overleve helt ned til -30 C, så længe de bliver kølet langsomt ned, så deres membraner ikke går i stykker. Nedkølingen har derfor betydning for et fremtidigt eksperiment, da det viser, hvor sarte planter er over for kulde. Planternes respons på kulden, er også styret via en lang række forskellige hormoner [1]. Om efteråret ses det, at bladene falder af træerne. Dette skyldes tildels balancen mellem de 2 hormoner Auxin og Ethylen bliver ændret. Auxin er en af de hormoner, der sørger for produktion af blade og den generelle vækst af planten. Ethylen er et modningshormon, som bliver produceret i en høj grad under klimatisk stress såsom varme, kulde, ekstrem vind osv. Når temperaturen falder drastisk, vil ethylen blive produceret i sådan en grad, at bladene vil begynde at falde af, og plantens vækst vil gå i stå. I rødderne sker der også en regulering af hormoner. Her viser det dog, at der sker et sammenspil mellem flere forskellige slags hormoner for at stoppe og øge væksten. Flere koncentrationer i forskellige dele af planten vil derfor starte flere slags processer i f.eks. rødderne, stigma og bladene [26]. Disse hormoner skal altså også involveres i sammenspillet mellem plantens egne antifryseproteiner, de indsatte genmanipuleret antifryseproteiner og plantens hormoner, for at få den fuldendte effekt. I og med at naturens fire årstider strækker sig over tolv måneder, og temperaturen ændres gradvist lige så gennem året uden de store udsving, er kulde- og frostpåvirkningen umiddelbart ikke den store udfordring. Den mest besværlige del af problematikken er at få udtrykt AFP vellykket i planter, da naturen allerede selv har taget hånd om problemstillingen omkring temperaturen. Genmodificering sker ved, at man indsætter et eller flere gensekvenser i tdna et (i vores tilfælde er det i bakteriernes plasmid). Når disse gensekvenser bliver udtrykt i cellen, vil antifryseproteinerne syntetiseres. I de bakterier, som er benyttet i vores eksperiment, er gensekvensen for antifryseproteinet indsat i forlængelse af den gensekvens, der koder for laktase, som er det enzym, der nedbryder laktose. Dette medvirker til at antifryseproteinet vil blive syntetiseret sammen med laktase. Vi kan sikre denne ekspression ved at aktivere laktase-gensekvensen. Side 30 af 60

32 Metoder Vi har i vores projekt valgt at udarbejde et forsøg for på den måde at finde frem til, hvorvidt antifryseproteiner gør bakterien E. coli mere kuldetolerant. I vores eksperiment har vi brugt to forskellige stammer af E. coli. Den ene af disse kolonier (HR012) har på forhånd fået tilsat genet fra Rhagium mordax, som koder for AFP, mens den anden koloni er en kontrolgruppe (HR003). Disse to kolonier kommer til at gennemgå samme proces. Bakterierne dyrkes i LB-medie, der fungerer som næring til bakterierne. Derudover opbevares prøverne i en inkubator. Inkubatoren sørger for at fastholde temperaturen ved 37 C, så bakterierne har de mest optimale vækstbetingelser, samtidig er der en konstant bevægelse, som sikre at bakterierne ikke klumper sammen, og dermed bliver ilt ikke bliver en begrænsende faktor. Bakterierne står ca. 24 timer under disse betingelser, som udgør de ideelle vækstforhold. I denne tid stiger koncentration af celler grundet celledeling i bakterierne. På anden dagen tilsættes der aktiveringsstoffet - IPTG - dette stof sikre at AFP produceres. For at sikrer at vækstraten forløber som den skal, foretages regelmæssig OD-målinger. OD-måling er et redskab, hvormed man kan bestemme mængden af celler i en prøve. Samtidig giver OD-målingen et billede af, hvorvidt cellerne er i vækstfasen eller ej. Dette gøres ved at udtage små prøver af den egentlige prøve og måle absorbansen hvert 30. minut ved hjælp af et spektrometer. OD- måling er dermed et vigtig redskab til at sikre, hvilke fortyndinger der skal foretages, inden kolonierne fryses ned og plades ud. De data, som overlevelsesprocenten bestemmes ud fra, er antallet af kolonier, der er vokset frem på agarplade hen over natten efter udpladning af 100 μl prøve på hver plade. Hypotese Vi formoder, at antifryseproteiner kan overføres til Escherichia coli bakterien, og dermed øge deres kuldetolerance. Side 31 af 60

33 Eksperiment I dette afsnit redegøres der for de overvejelser som er gjort i forbindelse med eksperimentet. Selve fremgangsmåden og protokollen kan ses i appendiks. Eksperiment og hypotese er udarbejdet ud fra den ovenstående empiri og problemformulering. Der er gennem projektet i alt lavet 3 eksperimenter; et pilotforsøg, eksperiment 1 og eksperiment 2, hvoraf der i denne rapport indgår data fra de to sidstnævnte. Pilotforsøget er brugt som pejlemærke for det egentlig eksperiment 1. Som udgangspunkt var ønsket at kunne stimulere en dag- og natcyklus for bakterierne, så det på den måde blev så virkelighedstro som muligt. Dette blev dog ikke gjort af flere forskellige årsager. Ved en gradvis nedkøling vil samtlige bakterier ikke have samme betingelser, da hele prøven ikke vil fryse samtidig. Ydermere vil optøning af prøverne være sværer at kontrollere, og bakterierne vil dermed have mulighed for at dele sig yderligere udenfor vores kontrol. Derudover var ønsket at teste bakterierne ved flere forskellige temperaturer. Udstyr i laboratoriet gjorde dog at dette ikke var muligt, da det kuldeskab, der er i stand til at regulere temperaturen, rystede for meget, så i stedet for at prøverne frøs til is, blev de underafkølet. I eksperiment 1 blev der frosset nogen prøver ned ved -18 C, mens andre blev underafkølet ved - 10 C, men på grund af fejl under udførelsen af fortyndingerne, kunne denne temperaturforskel ikke bruges til at konkludere noget om temperaturpåvirkningen. Ud fra de data som eksperiment 1 resulterede i, har det ikke været muligt at foretage en konkret databehandling, da spredningen på det aktuelle celletal for samme teoretiske koncentration var for stor, og der yderligere ikke var sammenhæng mellem de forskellige teoretiske koncentrationer og det forekommende antal celler på agarpladerne. På baggrund af dette blev eksperiment 2 udformet. Grundprincipperne i dette eksperiment er de samme som i de to foregående, men dette er dog forenklet og foretaget i en mindre størrelsesorden end eksperiment 1. Derudover er der kun frosset prøver ned til -18 C. Side 32 af 60