Genekspression. GENEKSPRESSION side 1

Transkript

1 Genekspression 2006 GENEKSPRESSION side 1

2 Indholdsfortegnelse Kapitel Proteinsyntese... 3 Regulering af gener i E. coli Transskription hos eukaryoter Eukaryot genregulering Efterbehandlig af RNA Translation Færdiggørelse af proteiner Kapitel DNA biblioteker Kapitel Produktion af rekombinant protein Kapitel Metoder til undersøgelse af genekspression Western blotting Northern blotting RT-PCR Microarrays Reporter vektorer GENEKSPRESSION side 2

3 Kapitel 1 Proteinsyntese Transskription DNA-molekylerne indeholder koderne for samtlige proteiner, som en celle fremstiller. DNA indeholder samtidig de koder, der bestemmer, hvornår det enkelte protein skal produceres. Desuden indeholder DNA koderne for de forskellige RNA-typer. Opskriften på en enhed herunder et protein kaldes et gen. Kodens alfabet er rækkefølgen af nukleotider i DNA-molekylet. I tilknytning til ethvert gen findes en eller flere basesekvenser, der fungerer som regulerende områder på DNA-strengen. Disse regulerende basesekvenser afgør, hvornår proteinet skal fremstilles. DNA molekylet deltager ikke i selve proteinsyntesen. Koden på DNA-molekylets ene streng aflæses, og der fremstilles en RNA-kopi af DNA-strengen. Denne proces kaldes transskriptionen. Når der transskriberes proteinkoder kaldes det dannede RNA mrna ( = messenger RNA = budbringer RNA). Ved transskriptionen kopieres af et udsnit af DNA-molekylet til et enkeltstrenget mrna-molekyle (fig. 1.1).. Figur 1.1 Transskription RNA er en kopi af den kodende streng. RNA produceres ved at RNA-polymerase aflæser templatestrengen. Således produceres RNA fra 5 -enden. GENEKSPRESSION side 3

4 Det er enzymet RNA-polymerase, der opbygger RNA-sekvensen. RNA-polymerase: bruger enkeltstrenget DNA som skabelon opbygger RNA-strengen i retningen 5 >3 bruger OH-gruppen på 3-C i det foregående nukleotid til at bygge videre på bruger nukleotid-triphosphater som byggesten og samtidig energileverandør. (RNA-polymerase bruger ribonukleotidtriphosphater til opbygning af RNA) opbygger en RNA-streng, hvori der indbygges nukleotiderne adenosin, guanidin, cytosin og uracil. Transskriptionen forløber i tre veldefinerede faser: 1. Initiering Her sætter RNA-polymerase sig fast på DNA-molekylet i det regulerende område af genet. Og det er først og fremmet i den fase at reguleringen af genet finder sted. 2. Elongeringen I denne fase opbygges RNA. Dette sker i det område af DNA-molekylet, der kaldes strukturgenet, her findes proteinopskriften 3. Terminering transskriptionen afsluttes. Transskription hos prokaryoter Et prokaryot mrna indeholder ofte opskrifter på flere proteiner, således at syntesen af disse proteiner foregår under samme kontrolenhed. En sådan opbygning kaldes et operon De proteiner, der udtrykkes i et operon, hører sammen. F. eks. skal en bakterie bruge ti enzymer til syntesen af aminosyren histidin. Generne for alle ti enzymer transskriberes på den samme lange mrna. Prokaryot RNA-polymerase Prokaryoter har kun en slags en RNA-polymerase (fig. 1.2), der står for syntesen af de tre forskellige slags RNA (mrna, trna og rrna). RNA-polymerase består dels af core enzyme (kan oversættes til central eller kerneenzym), der består af mindst 5 subunits, Når transskriptionen begynder tilknyttes desuden endnu en subunit, der kaldes (sigma) Det samlede kompleks kaldes RNA-polymerase holoenzym. -subunit indeholder dele af enzymets aktive site og udgør sammen med et DNAbindende område, der danner en kløft i enzymet, som kan rumme ca. 16 basepar. - subunits er vigtige for opretholdelse af molekylets struktur, og samarbejder med mange af de andre proteinfaktorer, som er nødvendige for transskriptionen. -polypeptidet ved man endnu ikke så meget om. GENEKSPRESSION side 4

5 Figur 1.2 RNA-polymerase-holoenzym fra Thermus aquaticus Initiering af konstitutive gener Det er afgørende for hele proteinsyntesen, at det er de rigtige dele af DNA-strengen, der transskriberes. Der er derfor indbygget nukleotidsekvenser i DNA-strengen, der angiver hvor transskriptionen skal begynde. Sådanne sekvenser kaldes promotorer. En promotor befinder sig på 5 siden af transskriptionens startsted på den kodende streng. Sådanne sekvenser siges at befinde sig upstream for startstedet. Hvis en sekvens befinder sig downstream betyder det at det findes på 3 side, det kan både være downstream startsstedet, men også downstream et helt gen. Nukleotidsekvensen i en promotor er et vigtigt element for hvor ofte et gen transskriberes. Den mest almindelige promotor i E. coli består af to områder. Det ene område kaldes 35 området og ligger 35 basepar i 5 retningen (på den kodende streng) fra startstedet, det andet område kaldes TATA-boksen, det ligger 10 basepar upstream fra startstedet (fig. 1,3). Sekvenserne i promotorerne er eksempler på konsensussekvenser. En konsensussekvens er en sekvens, der fremkommer ved sammenligning af sekvenser med samme funktion fra forskellige organismer. De nukleotider der forekommer hyppigst vil da udgøre konsensussekvensen. GENEKSPRESSION side 5

6 NNNTTCACANNNNNNNNNNNNNNNNNTATAATNNNNNN NNN Figur. 1.3 Promotor-områder hos E.coli. +1 angiver den første base, der transskriberes. De negative tal angiver antallet af basepar hen til startstedet. Den før base er i 90% af de analyserede startsteder en purin altså A eller G. De markerede sekvenser udgør promotor-områderne og startstedet for transskriptionen Det er meget sjældent, at der er total overensstemmelse mellem de faktisk forekommende sekvenser og konsensussekvenser, men jo større overensstemmelse, der er mellem en given sekvens og konsensussekvensen jo stærkere er promotoren. 70 I E. coli binder den variation af -faktoren, der kaldes sig specifikt til promotoren i fig Der er andre variationer af, der bindes til andre promotorer, der dog ofte har en lighed med såvel 35 som TATAAT. En ikke reguleret (konstitutiv) transskription i E. coli vil foregår på følgende måde (fig. 1.4): RNA-polymerase holoenzym bevæger sig på langs af det dobbeltstrengede DNA. Enzymet har en vis affinitet for dobbeltstrenget DNA, sådan at enzym og dobbeltstrenget DNA hele tiden bindes til hinanden, men frigøres igen øjeblikkeligt. Således scanner enzymet DNA-strengen. Når RNA-polymerasen rammer et promotorområde bindes det til DNAstrengen og danner et lukket kompleks ved hjælp af -faktoren. Dette lukkede kompleks finder transskriptionens startsted og begynder at syntetisere mrna. Det er en langsom proces, bl.a. tager det tid at åbne det dobbeltstrengede DNA. På dette tidspunkt ændres hele kompleksets konformation og der smeltes ca. 18 bp. Når DNA-strengen er åbnet syntetiseres der ved hjælp af RNA-streng. -faktoren en kort -subunit frigøres og erstattes med andre proteinfaktorer og elongeringen fortsættes. GENEKSPRESSION side 6

7 Figur 1.4 Initieringen af transskriptionen i et konstitutivt E. coli-gen RNA polymerase holoenzym binder nonspecifikt til DNA Holoenzymet søger efter en promotoer på DNA-strengen Når promotoren er fundet danne holoenzym og promotoer et samlet kompleks. Der sker en konformationsændring fra det lukkede til et åbent kompleks, som danner en transkriptionsboble på initieringsstedet, og der syntetiseres den kort RNA-streng subunitten dissocierer fra coreenzymet og RNA-polymerasen frigør sig fra promotorområdet. Andre proteiner, bl.a. NusA binder sig til polymerasen og eleongeringen går i gang. (Horton et all. (2002): Biochemistry, Prentice Hall) GENEKSPRESSION side 7

8 Regulering af gener i E. coli. Imidlertid er der mange gener, som kun udtrykkes når cellerne har brug for det. Der findes derfor mange forskellige komplicerede systemer til regulering af proteinsyntesen. Proteinsyntesen kan reguleres både ved transskription og translation, men det er langt det mest økonomiske for cellerne at regulere på transskriptionsniveau. De fleste beskrevne reguleringer er da også regulering af transskription. lac-operon Cellerne har mange forskellige strategier, der benyttes i reguleringen af generne. En af de bedst beskrevne er reguleringen af produktionen af de proteiner, som E. coli har brug for, når den eneste tilgængelige carbonkilde er lactose. I lac-operonnet benytter cellen sig desuden af flere reguleringsformer, så det er et godt eksempel, hvordan et gen kan reguleres såvel positivt, som negativt. En colibakterie har brug for tre proteiner, når den skal optage og nedbryde lactose og andre -galactosider. Proteinet lactosepermease indbygges i cellemembranen og fungerer som transportør af galactosider ind i cellen. Lactosepermease kodes af genet lacy. Når lactosen er kommet ind i cellen skal det hydrolyseres og det klares af enzymet -galactosidase, som kodes af genet lacz. laci lacz lac Y laca P I P la O 1 O 2 t Figur 1.5 Organisering af generne, som koder for de proteiner, som er nødvendige for omsætningen af lactose. De kodende områder for de tre proteiner lac Z, lacy og laca danner tilsammen lac-operonnet og transskriberes sammen fra en enkelt promotor (P lac ). Genet, der koder for repressorproteinet laci er placeret opstrøms for lac-operonnet og har sin egen promotor (P i ). Repressoren laci bindes til operatorområderne O 1 og O 2. t betegner det område, hvor transskriptionen afsluttes. Lactosepermeasen transportere også -galactosider, som ikke kan hydrolyseres af - galactosidase, dem tager enzymet thiogalactosid transacetylase sig af. Thiogalactosid transacetylase kodes af laca. Disse tre gener er under kontrol af den samme promotor og sådan et arrangement af gener kaldes et operon. Der er endnu et gen involveret i reguleringen af lac-operonnet, nemlig laci, som koder for et protein, lac-repressor-proteinet, der binder sig til lac-promotoren, og forhindre lac-operonnet i at blive udtrykt. Figur 1.4 viser hvordan generne er organiseret. Funktion af lac- repressor lac-repressor har en svag promoter. Det indebærer, at det er sjældent at proteinet produceres og der er derfor kun ca. 10 repressor-proteinmolekyler i en colibakterie. Til GENEKSPRESSION side 8

9 gengæld har molekylet en meget høj affinitet til operator området O 1 (fig. 1.6). lacrepressoren bindes både til O 1 og O 2 og danner derved en sløjfe med DNA-strengen. O 1 befinder sig i promotorområdet og O 2 findes i den kodende sekvens. Af og til bindes både repressor og RNA-polymerase til promotoren samtidig (fig. 1.5). Det vil sige at så længe repressoren sidder fast forhindres transskriptionen. Men når repressoren af og til slipper, går RNA-polymerasen straks i gang med at transskribere og proteinerne til nedbrydning af lactose dannes. Men processen forsættes ikke, et nyt repressormolekyle, er straks parat til at overtage. Resultatet er dog at bakterierne altid har en ganske lille mængde af disse genprodukter Figur 1.6 Den normale tilstand for lac-promotoren, når der ikke er lactose til stede. lac. repressoren forhindre at RNA-polymerasen kan transskribere lac-genet. (Horton et all. (2002): Biochemistry, Prentice Hall) Hvis er lactose tilstede i substratet vil repressoren dramatisk formindske sin affinitet til O 1 og O 2. Man siger at genet induceres. Lactosen vil blive transporteret ind i cellen vha. af de få lactosepermease molekyler, der findes og inde i cellen vil lactosen blive hydrolyseret af -galactosidasen, som jo altid findes i små mængder. -galactosidasen vil desuden omdanne nogle lactosemolekyler til GENEKSPRESSION side 9

10 stoffet allolactose (fig. 1.7) og det er dette stof, der er inducer for lac-genet. Allolactosen binder sig til repressorproteinet, som ændre sin struktur, så det ikke længere kan binde til O 1 og O 2, og der er derefter åbent så RNA-polymerasen kan transskribere genet. Den situation vil opretholdes, så længe der er lactose i substratet. I fig. 1.9 ses en skematisk fremstilling af forløbet. Figur 1.7 Lactoses omdannelse til allolactose Allolactose er ikke den eneste inducer af lac-operonnet. Isopropyl- -D-thiogalacopyranosid (IPTG)(fig. 1.8) er en kraftig inducer af genet, og det er dette stof man benytter sig af, når man skal inducere lac-operonnet i genteknologiske undersøgelser. IPTG kan ikke nedbrydes af bakterieceller, så det fungerer som en permanent inducer, når først det er tilsat substratet Figur 1.8 Isopropyl- -D-thio-galacopyranosid (IPTG) cis- og trans-elementer Begreberne cis og trans er to almindelig bruget genetiske udtryk. For at forklare dem kan man bruge lac-genet som eksempel. Genets promotorer og enhancer områder, som befinder sig på den DNA-streng, hvor også genet findes er cis-elementer i forhold til GENEKSPRESSION side 10

11 transskriptionen af lac-genet. Repressoren I kommer så at sige et andet sted fra. Et sådant stof, som kan diffundere gennem cellens cytoplasma, men som alligevel har indflydelse på transskriptionen kaldes et trans-element. Figur 1.9 Skematisk fremstilling af induktionen af lac-genet camp regulatorisk aktiveret transskription Imidlertid er tilstedeværelsen af lactose ikke den eneste betingelse for at lac-genet udtrykkes på fuld styrke. Der må heller ikke være glucose til stede, for glucose er det carbohydrat som foretrækkes af colibakterierne. Denne form for nedregulering kaldes katabolisk repression, og det er en metode, som regulerer mange gener, der udtrykker metaboliske enzymer. lac-promotoren er i sig selv en ret svag promoter, dvs. RNA-polymerasen har ikke særlig stor affinitet til den. Men det findes der et protein, der kan råde bod på, det hedder CAP (catabolisk activator protein). For at CAP kan virke som aktivator er det nødvendigt, at der er camp (cyklisk AMP) i cellerne. camp dannes, når cellerne ikke har adgang til glucose. CAP i forbindelse med camp danner et molekyle med stor affinitet til mange metaboliske proteiners promotorer og altså også lac-promotoren. Når GENEKSPRESSION side 11

12 dette kompleks sætter sig på en promotor forøger det promotorens affinitet til RNApolymerase, og transskriptionshastigheden forøges mange gange. For lac-genet gælder at der fremstilles 50 gange så meget produkt når genet er aktiveret af CAP-cAMP komplekset, som hvis der både var glucose og lactose i substratet. Repressorproteinet I og CAP-cAMP-reguleringer er begge eksempler på genreguleringer, hvor det er proteiner, der er involverede. Når et protein binder sig til DNA som repressorprotein I og derved forhindre transskriptionen er der tale om en negativ regulering, og proteinet kaldes altså en repressor. Når et bundet protein aktiverer transskriptionen er det en positiv regulering og et sådant protein kaldes en aktivator, som CAP-cAMP. I begge tilfælde er de regulerende protein er allosteriske, dvs. de kan ændre konformation hvis de bindes til et andet molekyle en ligand. I fig er beskrevet fire forskellige strategier for regulering af transskriptionen vha. regulatoriske proteiner. Lac-operonnet betjener sig af (c) og (a) Figur 1.10 Fire forskellige strategier ved hjælp af regulatoriske proteiner. GENEKSPRESSION side 12

13 I genteknologien anvendes flere forskellige promotorer, når proteiner skal udtrykkes i værtsorganismer. Et udvalg af disse promotorer vil blive behandlet i kapitel 3. Elongering Ved afslutning af initieringen danner RNA-polymerasen kompleks med DNA-strengen. Herefter forgår elongeringen og dermed dannelsen af RNA, som vist i fig Terminering I områder af DNA-strengen med mange GC-nukleotider går RNA-polymerasen langsommere frem end i områder, hvor der er en jævn fordeling af nukleotider. Det skyldes, at det er sværere at bryde hydrogenbindingerne mellem G og C end mellem A og T. I sådanne områder kan elongeringen gå helt i stå og dette kan destabilisere transskriptionsboblen. Hvis sekvensen tillige udviser en dyade symmetri (fig. 1.11) og dermed foranlediger at det nysyntetiserede RNA danner et hårnålesving destabiliseres transskriptionsboblen yderligere. Hårnålen efterfølges ofte af en række U er og da bindingerne mellem en række A er i DNA og en række U er i RNA er relativt svage destabiliseres transskriptionsboble, DNA-RNA strengene frigøres fra hinanden, komplekset går i stykker og transskriptionen ophører. -A-T-C-G-C-G-G-C-N-N-N-G-C-C-G-C-G-G-U-U U N N N C G G C G C G C C G C G A T G U U Figur 1.11 Dyade symmetri og hairpin (hårnål) Hos prokaryoter findes desuden en lidt mere kompliceret terminering, hvor en proteinfaktorer (rho) medvirker til termineringen. binder sig til specifikke sekvenser på RNA-strengen. bevæger sig på RNA-strengen hen imod transskriptionskomplekset, hvor det hjælper RNA-polymerasen til at afslutte transskriptionen. GENEKSPRESSION side 13

14 Transskription hos eukaryoter I modsætning til prokaryoter er eukaryote celler differentierede, og det kræver at genudtrykket er forskelligt i de forskellige væv. Eukaryote celler udtrykker derfor forskellige gener, som er specifikke for de forskellige væv. F. eks. udtrykkes generne for hæmoglobin og -subunit kun i de røde blodlegemer. Evnen til at tænde og slukke for et gen er således af afgørende betydning for at cellerne opretholder deres egenart. Generne i eukaryoter er ikke organiserede i operon som i prokaryote, hvert enkelt gen skal således have sine egne regulatoriske elementer. RNApolymeraser i eukaryoter I prokaryoter eksisterer der en RNA-polymerase, som udfører al transskription. I eukaryoter er der tre specialiserede RNA-polymerase i cellekernen: RNA-polymerase I, som transskriberer de store ribosomale RNA-molekyler, RNA-polymerase II, som transskriberer mrna og RNA-polymerase III, som transskriberer de små RNAmolekyler f. eks. trna. Desuden har både mitochondrier og chloroplaster hvert deres eget RNA-polymerase. De tre nukleære RNA-polymeraser er komplekse proteiner, der består af mange subunits. Adskillige af disse er fælles for alle tre polymeraser. Fælles for de tre polymeraser i alle eukaryote organismer er i øvrigt at de består af 2 store subunits og 7-12 små. Ingen af de tre RNA-polymeraser er i stand til selv at binde sig til DNA og starte transskriptionen. Der kræves altid hjælpeproteiner- generelle transkriptionsfaktorer hvoraf nogle er nødvendige for at danne initieringskomplekset. Histoner I eukaryoter er DNA-strengene organiseret i en kromatinstruktur, hvor det dobbeltstrengede DNA er vundet op omkring histoner. Den form for organisering kendes ikke i prokaryoter. Kromatinen kan være så tæt pakket at der ikke er adgang til transskriptionsfaktorene. Det er bl.a. acetylering af histoner, der afgør hvor tæt kromatinen er pakket (fig 1.12). Enzymet histonacetyltransferase (HATS) sætter acetylgrupper på visse lysinrester i histoner. Det resulterer i at mængden af positive ladninger formindskes, hvilke svækker bindingerne mellem DNA og histoneproteinerne. Resultatet er, at den tætte struktur løsnes og der bliver mulighed for transskriptionfaktorerne til at binde sig til DNAstrengen. Der forskels for tiden intenst i forholdet mellem transskriptionsfaktorer og acetylering Methylering I eukaryoteceller er det nødvendigt at der er slukket for bestemte gener enten i lang tid eller for altid, i og med at cellerne er forskellige og ikke alle celler har brug for alle proteiner. Methylering er en af flere måder, hvorpå et gen kan nedreguleres i eukaryoter. Det er karakteristisk at et H på 5 C-atomet i cytosin er substutieret med en methylgruppe (fig. 1.13). Methylgruppen stikker ud af dobbeltspiralen og forstyrre således ikke hydrogenbindingerne mellem de to kæder. GENEKSPRESSION side 14

15 I promotorområder i slukkede gener er en stor del af cytosinet methyleret. Det foranlediger at transskriptionsfaktorerne ikke kan komme til og dermed transskriberes generne ikke. Desuden er kromatinet tæt pakke og histonerne er ikke acetyleret. I befrugtede æg er DNA kun methyleret i ringe omfang. Methyleringen sker i løbet af fosterudviklingen og den er med til at skabe differentiering Figur DNA er viklet om omkring histoner. De DNA-områder, der er methyleret er tæt pakket, og transskriptionsfaktoreren har ikke adgang. Når histonkomplekset acetyleres åbnes der adgang for transskriptionsfaktorerne. Figur 1.13 Methylering af cytosin GENEKSPRESSION side 15

16 Eukaryot genregulering Når forudsætningerne for transskriptionen således er tilvejebragt i kromatinen kan RNA-polymerase komme til og herfra ligner den eukaryote transskription den prokaryote, selv den stadig er mere kompliceret. De forskellige proteiner, som kontrollerer den eukaryote genekspression kaldes proteinfaktorer. Skønt initeringen er kompleks har mange eukaryote gener en fælles promotersekvens, som består af en TATA-boks, der befinder sig i området fra transskriptionsstart, en CCAAT-boks (i -75 området), samt et område med gentagne GC sekvenser (i 90 området). I fig er en oversigt over almindelige RNA-polymerase II transskriptionsfaktorer, som denne promotor benytter sig af. I fig findes en skematisk oversigt over i hvilken rækkefølge faktorerne samles til et funktionelt RNA-polymerase-initieringskompleks i forbindelse med TATA-boksen og i fig ses en model af RNA-polymerase initieringskomplekset. Når transskriptionen er påbegyndt fraspaltes adskillige af transskriptionsfaktorerne, således, at det er et mindre kompleks, der udfører transskriptionen. Faktor TFIIA TF2B TFIID TBP TFIIE TFIIH TFIIF RAP 30/74 karakteristik binder til TFIID, kan bindes til TFIID ved fravær af DNA bindes til RNA-polymerase II RNA-polymerase II s initieringsfaktor TATA-bindende protein subunit af TFIID Bindes til RNA-polymerase II Nødvendig for initiering, har helicase aktivitet Binder til RNA-polymerase II THIIF s to subunits Figur 1.14 Et udvalg af RNA-polymerase transskriptionsfaktorer GENEKSPRESSION side 16

17 TATA THIID TATA TFIIA TFIIB TATA RNA-polymerase II TATA TFIIF TATA TFIIE TFIIJ TFIIH Figur 1.15 Skematisk beskrivelse af dannelsen af et RNA-polymerase II transskriptions-initieringskompleks ovenpå en TATA-boks. Først bindes TFIID, hvorpå de andre faktorer og RNA-polymerase efter tur sætter sig på plads. Den vinklede pil angiver transskriptionsstart. GENEKSPRESSION side 17

18 Fig Model af RNA-polymerase initieringskompleks. (Horton et all. (2002): Biochemistry, Prentice Hall) Den ovenstående beskrivelse passer kun for nogle gener. Hvis der er brug for et højt eller skiftende transskriptionsniveau, gør cellen nogle gang brug af enhancere. En enhancer (en forstærker) er en nukleotidsekvens, der kan ligge langt væk fra promotorområdet, men som interagerer med promotoren via specifikke transskriptionsfaktorer (fig. 1.17). De proteiner, der er bundet til promotorområdet er de generelle transskriptionsfaktorer, mens enhancerernes proteiner er specifikke, hver enhancer har sin egen specielle basesekvens og binder derfor kun til specielle proteiner. Mange af reguleringsproteinerne kan indgå i forskellige reguleringskomplekser, hvor nogle komplekser er aktiverende og andre er hæmmende for udtrykkelse af de på gældende gener. Det er derfor ikke de enkelte faktorer, der har en virkning, men snarere det samlede proteinkompleks. Ligesom der der findes enhancerområder for et givent gen langt fra genet findes der på samme måde silencer sekvenser, der hæmmer genekspression. GENEKSPRESSION side 18

19 promotor enhancer Generelle transkriptionsfaktorer Specifikke transskriptionsfaktorere Kodende region enhancer Fig 1.17 Enhancer og promotor interaktion Andre eksempler på transskriptionel regulering SP1 TATA promotoren er en konsensussekvens for mange forskellige promotorer, men det er ikke den eneste. En anden er sekvensen GGGCGG, som har sine egne proteinfaktorer. Proteinfaktoren SP1 binder sig til sekvensen GGGCGG. Sekvensen er konstitutiv og regulerer udtrykket af mange af de proteiner, som altid udtrykkes eukaryote celler, de såkaldte housekeeping gener. SP1 findes i alle celletyper. Et glutaminrigt domæne i SP1 bindes specifikt til en proteinfaktorer (TAF ), der har vist sig at være en del af TFIID. Ved hjælp af TAF begynder RNA-polymerasens opbygning som vist i fig Steroidhormoner. Steroidhormonerne er fedtopløselige og kan diffundere gennem cellemembraner og i cellerne reagere med receptorer. Nogle hormoner f. eks. tyroidhormonerne reagerer direkte med proteinefaktorer, der er bundet på DNA et. Ved fraværet af tyreoidhormon fungerer disse som repressorer, og når hormonet bindes til receptorerne forvandles proteinfaktorerne til aktivatorer. For andre hormoner gælder, at receptorererne befinder sig i cytoplasmet, hvor de er bundet til en repressor. Når hormonet befinder sig i cellen ændres receptoren og kan bindes til specifikke responselementer på DNA-molekylerne, hvor de virker som aktivatorer s. fig GENEKSPRESSION side 19

20 Figur 1.18 Aktivering af et steroidinduceret hormon. Der findes yderligere beskrevet en række faktorer og her skal kun nævnes STATproteinet, som phosphoryleres via interne reaktioner, som et respons på signlamolekyler, der sætter sig på overfladen af cellen. Ved denne phosphorylering aktiverer STAT forskellige gener. Elongering foregår som i prokaryoter Terminering Ligesom prokaryoter har eukaryoter specifikke signaler for afslutning af transskriptionen. Det synes kun at være DNA-sekvenser, der har betydning for termineringen. Efterbehandlig af RNA RNA bliver bearbejdet efte,r det er transskriberet. En undtagelse herfra er prokaryot mrna, som translateres så snart der er plads til et ribosom i på det voksende RNA. Her vil vi nøjes med at beskrive bearbejdningen af eukaryot mrna. Generne i eukaryot DNA indeholder en del sekvenser, som ikke genfindes i den færdige mrna. Sådanne sekvenser kaldes intron, mens sekvenser, der genfindes i mrna, kaldes exons. Både exons og introns transskriberes. Det dannede RNA kaldes hnrna (heteronukleært RNA), hnrna undergår flere forskellige processer. Allerede før transskriptionen er færdig, placeres en CAP i 5 enden af den voksende RNA-kæde. En CAP indeholder en GTP, der er bundet til 5 enden med en usædvanlig 5-5 binding (fig 1.1). GENEKSPRESSION side 20

21 Fig, enden af den færdige eukaryote mrna. Under transskriptionen påsættes en GTP i en særlig omvendt position på 5 enden af mrna. Denne struktur kaldes en CAP. Der sættes en methylgruppe på 2-OH i den første nukleotid. Der kan desuden sættes yderligere en methylgruppe på i det andet nukleotid. CAP-strukturen hjælper mrna på plads i ribosomet. mrna forsynes ved slutningen af transskriptionen med en poly-a hale i 3 enden. Det er en sekvens af A er der påsættes af et specifikt enzym. Signalet til polyadenylering er konsensussekvensen AAUAAA. Polyadenyleringen forlænger livet for mrna i cytoplasma. Efter polyadenyleringen skæres de forskellige intronområder helt præcist ud, og exonområderne splejses sammen (fig og 1.21). Det er bestemte sekvenser i selve RNAmolekylet, der afgør, hvor skæringen skal foregå, og det er komplekser af proteiner og snrna (small nuclear RNA), der katalyserer processen. snrna/protein-komplekserne kaldes splicosomer fig Figur 1.20 Skematisk oversigt over RNAsplicing GENEKSPRESSION side 21

22 Figur 1.21 Udskæring af intron Splicing processen af snrn, som betyder små nukleære ribonukleoproteiner. Hermed er mrna færdig til at blive transporteret til cytoplasmaet, hvor det danner grundlag for proteinsyntesen. GENEKSPRESSION side 22

23 Translation Opbygningen af proteinet foregår i den proces, der kaldes translationen. Her oversættes basesekvensen i mrna til aminosyresekvensen i proteinet. Der indgår følgende elementer i translationen: trna mrna ribosomer den genetiske kode trna og den genetiske kode trna transporterer aminosyrerne hen til ribosomerne, hvor de sættes sammen til polypeptidkæder. De forskellige trna er fuldstændig specifikke, idet de hver især kun bærer en bestemt aminosyre (fig 1.23). Alle trna molekyler har en række fælles egenskaber: De er enkeltstrengede og indeholder mellem 73 og 93 ribonukleotider. 3 enden slutter altid med sekvensen CCA 3. Aminosyrerne aktiveres, idet der dannes en esterforbindelse mellem aminosyrens carboxylsyre-gruppe og den endestillede 3-OH-gruppe på 3 adenosin. Cirka halvdelen af baserne i trna baseparrer internt i molekylet. Der er dog fire gruppe, hvor der ikke finder baseparring sted. Disse fire grupper danner fire løkker: D-loop, T C-loop (udtales t-psi-c), den variable arm og anticodon, hvor samlingen mellem mrna og trna finder sted. På fig er vist, hvordan en basesekvens på tre nukleotider på trna baseparrer med tre komplementære nukleotider på mrna. Disse nukleotider på trna er placeret i den løkke, der kaldes anticodon. En sekvens med tre base på mrna oversættes til en og kun en aminosyre. En sådan sekvens kaldes en codon. En codon på mrna baseparrer altså med anticodon på trna. I fig ses den genetiske kode, som er oversættelsesnøglen fra tre baser til en aminosyrer De tre baser, der udgør en codon, kan konbineres på 64 forskellige måder. Heraf bruges tre som stopsignal i translationen. De 61 øvrige codon kan alle oversættes til aminosyrer. Da der kun er 20 forskellige aminosyrer betyder det at de fleste aminosyrer kan kodes af mere end en codon. Codon AUG oversættes til aminosyren methionin og er samtidig startsignal for translationen. GENEKSPRESSION side 23

24 GENEKSPRESSION side 24 Figur 1.22 Translationen. 1) Ribosomets mindste del (lille subunit) sætter sig ud for den AUGsekvens på mrna, som er nærmest ved på 5 enden. 2) Et trna-molekyle, med anticoden UAC, som er komplementær til AUG-sekvensen på mrna, og som i den anden ende er bundet til aminosyren methionin sætter sig fast på mrna. 3) Ribosomets største halvdel (store subunit) sætter sig hen over trna et, og det samlede ribosom er nu klar til at begynde translationen. 4) Et trna molekyle, med anticoden GGA. sætter sig i ribosomets hulhed. Det er komplementært til sekvensen 5 CCU3 på mrna. Dette trna bærer aminosyren prolin. De to aminosyrer kobles sammen af enzymer, der befinder sig i ribosomet. 5) Sådan fortsætter translationen, indtil ribosomet møder et stopsignal, her UGA, hvortil der ikke findes nogen komplementær trna. Translationen stopper og ribosomet falder af mrna-strengen.

25 Figur Generel opbygning af trna s sekundære struktur. trna er et enkeltstrenget molekyle, der på de angivne områder baseparrer med sig selv. På den måde får molekylet sin sekundære»kløverbladsstruktur«.. Første position (5'-enden) Anden position U C A G Tredje position (3'enden) U C A G Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Val Ala Glu Gly G Figur 1.24 Den genetiske kode. En codon er en sekvens i mrna på tre baser, som koder for en aminosyre. Skemaet skal læses så basen i venstre søjle angive den første base, i midterfeltet er angivet anden base og sidste søjle angiver af sidste base i en codon. F. eks. oversætte sekvensen GUU til aminosyren Val. Der er tre forskellige codon, som er stopkoder, idet der ikke findes nogen trna med en tilsvarende anticodon. AUG er speciel, idet den både fungerer som startsignal og som kode for aminosyren methionin. Der er 64 mulige kombinationer af de fire baser (4 3 ), men kun 20 aminosyrer. Som det ses i skemaet har de fleste aminosyrer flere forskellige codon. F. eks. vil sekvenserne GUU, GUC, GUA og GUG alle resultere i, at aminosyren valin indbygges i polypeptidkæden. Tyr Tyr stop stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Cys Cys stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly U C A G U C A G U C A G U C A GENEKSPRESSION side 25

26 Ribosomer Ribosomer er molekylære maskiner, der fremstiller proteiner ud fra opskrifterne i mrna. Ribosomer, der ikke arbejder, er delt i to partikler: lille subunit og store subunit, der begge findes som fri partikler i cytoplasmaet. Store subunit er forsynet med to hulheder, der begge kan indeholde en trna. Vi bruger her de engelske udtryk P-site og A-site. Faktisk viser nyere forskning, at der er yderligere en hulhed med plads til en trna, denne hulhed kaldes E-site, den er ikke vist på illustrationerne, men det er via E-sitet at trna ledes bort fra ribosomet. Ribosomernes funktion er den samme i prokaryoter og eukaryoter, men størrelsen er forskellig. Lille subunit hos prokaryote er et kompleks, der består af 21 proteiner og et RNA molekyle. Den kaldes også 30S rrna. Store subunit er et kompleks, der består af 2 RNA-kæder og 32 proteiner, Den kaldes 50S rrna. Hos eukaryoter er store subunit 60 S og består af 3 RNA-kæder og lille subunit er 30 S og består af en RNA kæde, som er større Initiering af translation i prokaryoter Ligesom ved transskriptionen deles translationsprocessen i tre dele: initiering = begyndelse på processen, elongering = forlængelse og terminering = afslutning. Initieringen af proteinsyntesen begynder med at translationskomplekset samles ved begyndelsen af den kodende sekvens i mrna. Translationskomplekset består af de to ribosomale subunits, mrna, et initiator trna-molekyle og adskille proteinfaktorer. Det er kritisk for fremstilling af det korrekte protein at translationen begynder med på det rigtige codon. Der er tre læserammer (se boks 1) i mrna, men kun den ene er den rigtige. Proteinsyntesen begynder på AUG, men startstedet kan ligge mange nukleotider downstream på mrna, og det behøver ikke engang være det første AUG på strengen. Hvis ikke man ved, hvor translationen begynder, er der mulighed for at fremstille tre forskellige polypeptider af nedenstående mrna: Boks 1.1 A G G U U A U U U G C A U U C C C C A G G U U A U U U G C A U U C C C C Ser Leu Leu Ala Phe Pro A G G U U A U U U G C A U U C C C C Gly stop A G G U U A U U U G C A U U C C C C Val Ile Cys Ile Leu Man bruger udtrykket at man har en åben læseramme, når man ikke ved hvilken af de tre muligheder, der giver det funktionelle protein GENEKSPRESSION side 26

27 Umiddelbart up-stream det første AUG findes en purinrig sekvens på mrna et, som er komplementær til en pyrimidinrig sekvens på 3 enden af den lille subunit. Konsensussekvensen hedder Shine-Delgarno-sekvensen, den er vist på fig Når klonede gener skal udtrykkes i prokaryoter, er det nødvendigt at sørge for, at Shine- Delgarno-sekvensen befinder sig umiddelbart upstream for translationsstart. Figur 1.25 Shine-Delgarno sekvensen i E. coli mrna. (a) Ribosomebindingstedet ved 5 enden af mrna for adskillige E. coli proteiner. Shine-Delgarno sekvensen findes umiddelbart upstream for initieringscodon. (b) Den komplementære baseparring mellem 3 enden af lille subunit (16S rrna) og 5 enden af mrna sørgre for den korrekte læseramme for initieringen. Dannelsen af initiationskomplekset i prokaryoter behøver initieringfaktorer udover mrna og ribosom. Den første aminosyre er en methionin, med en formylgruppe, placeret på en normal trna Met Når translationskomplekset er samlet vandrer komplekset hen over mrna-strengen med 3 nukleotider ad gangen (fig. 1,26) GENEKSPRESSION side 27

28 Figur 1.26 I elongeringsprocessen vokser polypeptidkæden. a) Et ribosom umiddelbart efter initieringen. P-sitet er optaget af en met-trna, A-sitet er tomt. b) Et ladet trna molekyle sætter sig fast i ribosomet. Anticodon i dette trna baseparrer med den codon, der findes umiddelbart ud for A-sitet. Her er den næste codon UUU, hvilket er koden for phenylalanin. c) Der dannes en peptidbinding mellem methionin og phenylalanin. Met-tRNA er nu ikke længere ladet med sin aminosyre og forlader P-sitet. d) phe-trna rykker ind i P-sitet. Herefter er A-sitet tomt, som det var i a). I det videre forløb vil et trna-molekyle med den rigtige anticodon sætte sig i A-sitet, her er det en leu-trna, der sætter sig fast og næste aminosyre bliver altså leucin. Elongeringen fortsætter på samme måde, indtil ribosomet når et stopsignal. Initiering af translation i eukaryoter Det aktive translationssystem samles i flere trin. Først dannes initieringskomplekset. Den lille subunit forbinder sig med 5 cap-enden af mrna, en særlig initerings-trna Met binder sig dernæst til startcodon AUG og til den lille subunit. Der medvirker adskillige proteinfaktorer i denne samling og der bruges energi, idet et GTP-molekyle bindes til komplekset. Når den store subunit til sidst bindes til komplekset hydrolyseres GTP til GDP og proteinfaktorerne frigøres. Initeringen ligner således den prokaryote initiering, hvor forskellen dels er antallet af proteinfaktorer dels den første trna. I prokaryote er den første aminosyre en methionin, med en formylgruppe, placeret på en normal RNA Met, mens det i eukaryoter er en speciel initirings-rna Met, der bærer en normal metioninrest. GENEKSPRESSION side 28

29 Translationen skrider derefter frem som i fig 1.26 Færdiggørelse af proteiner Både hos prokaryoter og eukaryoter gennemgår proteinerne ofte en yderligere bearbejdning efter translationen. Proteinerne skal foldes til de endelige tertiære strukturer, der skal dannes -S S- broer, polypeptidkæder skal sættes sammen i kvarternære strukturer og i nogle tilfælde skal visse aminosyrer ændres kemisk. Færdiggørelsen af prokaryote proteiner De fleste proteiner dannes i prokaryoter på polyribosomale komplekser, der befinder sig frit i cytoplasmaet. Selve foldningen af proteiner begynder, så snart de første aminosyrer dukker frem fra ribosomerne. Formylgruppen, som sider på den første methionin, fjernes som regel i samme øjeblik proteinets N-terminal frigøres fra ribosomet af et specielt enzym deformylase. Nogle proteiner er beregnet til eksport ud af cellen. Hos gram-negative bakterier er der også den mulighed, at proteinets endestation er det periplasmatiske rum. I begge tilfælde skal proteinet passere cellemembranen, men den er almindeligvis ikke gennemtrængelig for proteiner. Prokaryoter løser problemet ved at syntetisere proteinet igennem cellemembranen som vist i fig Det polyribosomale kompleks fæster sig til cellemembranen. Den første del af aminosyresekvensen har en sekvens der gør, at det voksende polypeptid går igennem det dobbelte lipidlag, og at det efterhånden vokser ude gennem membranen. Figur 1.27 Translation med samtidig transport af proteinet igennem cellemembranen. De første aminosyrer udgør signalsekvensen, som har stor affinitet til membranen. Ved hjælp af signalsekvenser fæstes det ribosomale kompleks til cellemembranen og proteinet syntetiseres ud gennem membranen. Signalsekvensen klippes derefter af vha. et enzym. Færdigørelse af Eukaryote proteiner Eukaryote celler har mange organeller, som alle har brug for proteiner. Cellerne har derfor udviklet en række forskellige sorteringsmekanismer, så proteinerne kommer hen, hvor de skal. Almindeligvis er det sekvensen af de første GENEKSPRESSION side 29

30 aminosyrer, der bestemmer proteinets destination. Denne sekvens kaldes ligesom hos prokaryoter signalsekvensen eller signalpeptidet. Proteiner, der bruges i cytoplasma, cellekerne, mitochondrier og chloroplaster, fremstilles på frie ribosomer i cytoplasmaet. Signalsekvensen hjælper dernæst proteinet frem til det organel, hvor det, skal bruges. En række proteiner fremstilles af ribosomer, der binder sig til overfladen af E.R. Det gælder proteiner, hvis endemål er eksport ud af cellerne, proteiner som skal indbygges i plasmamembranen og proteiner, som skal bruges i lysosomerne. Her er det også en signalsekvens, der bestemmer, hvad der skal ske. Ved starten af syntesen samles ribosomet omkring mrna-strengen som i fig. 1.26, og proteinsyntesen begynder. Når de første aminosyrer, der udgør signalsekvensen er sat sammen, holder ribosomet en pause i den videre syntese. I løbet af pausen bindes ribosomet til overfladen af E. R. Signalpeptidet føres dernæst igennem E. R.- membranen af særlige proteiner, der er indbygget i membranen og ribosomet genoptager syntesen af proteinet. I E. R. findes et enzym, der klipper signalpeptidet af proteinet, endnu før proteinet er færdigdannet. Proteiner, der bygges i E. R. er alle glycoproteiner, idet der i løbet af syntesen sættes oligosaccharider på proteinet. På fig ses, hvordan carbohydratenheder er knyttet til proteinerne. Fig Proteinsyntese i E.R. 1) og 2) Lille og store subunit samles på mrna i 5 enden i cytoplasmaet. 3) Proteinsyntesen begynder, og signalsekvensen dannes. 4) Proteinsyntesen er midlertidig stoppet og ribosomet med signalsekvens bindes til overfladen af det ru E.R. ved hjælp af et protein, der er indlejret i E.R.-membranen (ribosomreceptorer). 5) og 6) Signalsekvensen føres gennem membranen, og ribosomet fortsætter proteinsyntesen. Signalsekvensen klippes af af enzymet signalpeptidase. Efterhånden som proteinet dannes, sørger enzymer i E.R. for, at der sættes oligosaccharider på visse asparaginrester. Golgiapparat Proteiner, der er dannet i E. R. transporteres herefter til golgi apparatet, hvor der sker en yderligere bearbejdning af oligosaccharidkæderne. I golgi sættes der oligosaccharider på GENEKSPRESSION side 30

31 visse serin- og threoninrester og de oligosaccharider, der allerede er sat på asparaginresterne bearbejdes yderligere. Derefter transporteres proteinerne videre til bestemmelsesstedet. På figur 1.29 ses, hvordan transporten foregår. Proteinerne transporteres fra ribosomerne til golgiapparatet og imellem golgi-apparatets forskellige afdelinger med vesikler. Figur 1.29 Proteinerne dannes i E.R. Her sættes der oligosaccharider på bestemte aminosyrer, og umiddelbart derefter begynder andre enzymer at klippe bestemte stykker af oligosaccharidet. Nogle proteiner pakkes ind i vesikler, der afsnøres fra E.R.-membranen og transporteres gennem cytoplasmaet til golgiapparatet, hvor vesiklerne tømmes, idet de smelter sammen med golgiapparatets membran. Oligocacchariderne bearbejdes, dvs. der fjernes og påsættes hexoseenheder på oligosacchariderne. Derefter sendes proteinerne videre med andre vesikler, der er afsnøret fra golgimembranen til andre afdelinger af golgiapparatet, hvor der sker yderligere bearbejdning. Når proteinet er færdigt, sendes det igen med vesikler til bestemmelsesstedet. Proteiner, der er beregnet til indbygning i membranen, indbygges allerede i E.R.-membranen og sendes videre til bearbejdning i Golgi, indstøbt i transporsportvesiklens membran. Den del af proteinet, der vender ind i vesiklens hulrum, vil vende ud på overfladen af cellemembranen, når vesiklen indbygges i denne. GENEKSPRESSION side 31

32 Kapitel 2 DNA biblioteker For at kunne undersøge en organismes DNA, er det ofte nødvendigt, at det er isoleret og organiseret på en måde, så det kan håndteres i laboratoriet. Ved fremstilling af et genetisk bibliotek organiserer man en organismes DNA, ved at det fraktioneres og klones i bakterieceller. Viden om generel molekylær kloningsteknik i bakterier kan fx skaffes gennem AMU kurset Genteknologi Introduktion. I det følgende er molekylær kloningsteknik beskrevet i hovedtræk. Formålet er at skabe mange kopier af et givet DNA fragment, fx et gen, og det kan gøres ved at man indsætter DNA fragmentet i en anden organisme (værtsorganisme), så det indsatte (splejsede) fragment kopieres i værtsorganismen. For at gøre kopiering mulig i værtscellen, skal DNA fragmentet indsættes i en vektor, som indeholder et genetisk signal for replikation (ori-site). Det kan være et plasmid eller en virus. Vektoren optages i værtscellen, og vil i de fleste tilfælde kopieres selvstændigt i cellen. Kloningen skitses i følgende figur. Figur 2.1 Kloning af DNA En mere detaljeret beskrivelse kan læses på næste figur, hvor man kloner humant DNA i bakterieceller, og bruger lacz genet som selektiv markør.. GENEKSPRESSION side 32

33 Fig 2.2 Kloning af humant DNA i bakterieceller. DNA biblioteker er en samling af klonede DNA fragmenter fra en bestemt organisme. Biblioteket udgør således en fuldstændig kopi af organismens genetiske information. Biblioteket består oftest af et antal bakteriekolonier, som rummer organismens DNA, indsat i plasmid DNA. Ofte er genomstørrelsen en begrænsning, når man skal fremstille kloner til biblioteket, og specielt er vektortypen afgørende. Fig 2.3 giver et indtryk af, hvor store fragmenter, der kan klones i forskellige vektortyper. GENEKSPRESSION side 33

34 Vektor Type DNA fragment størrelse (kb) Plasmid 20 phage 25 Cosmid 45 P1 phage 100 BAC (bacterial artificial chromosome) 300 YAC (yeast artificial chromosome) 1000 Fig 2.3 Fragment størrelse, som kan klones i forskellige vektorer. Bibliotekets omfang vil afhænge af organismen; virusbiblioteker og prokaryote biblioteker er meget mindre end biblioteker fra eukaryote organismer, som har meget større genomer. Typiske genomstørrelser er angivet i fig 2.4. Art Genom størrelse (bp) E. coli 4,6 x 10 6 S. cerevisiae 1,8 x 10 7 Drosophila melanogaster 1,2 x 10 8 Ris 5,7 x 10 8 Menneske 3,2 x 10 9 Frø 2,3 x Fig 2.4 Genom størrelse hos forskellige organismer Man kan udfra ovenstående oplysninger beregne, hvor mange kloner, fx bakteriekolonier, der som minimum vil blive, hvis man anvender forskellige vektortyper til fremstilling af et bibliotek. Se fig 2.5 Art Plasmid phage Cosmid BAC YAC E. coli S. cerevisiae Menneske Fig 2.5 Antal kloner ved fremstilling af gen biblioteker Ved fremstilling af biblioteker fra højere eukaryoter anvendes vektorer, som stammer fra bakteriofager ( phage eller cosmider) eller BAC (Bacterial Atificial Chromosomes). Se fig 2.6 og 2.7. GENEKSPRESSION side 34

35 Fig 2.6 Kloning i cosmid vektor. GENEKSPRESSION side 35

36 Fig 2.7 Kloning i BAC vektor. I forbindelse med det humane genom projekt (HUGO) blev der fremstillet kloner til humant genomisk bibliotek i BAC vektorer, som kan rumme store fragmenter, og replikeres i E. coli. GENEKSPRESSION side 36

37 Der findes 2 typer genetiske biblioteker: 1. Genomiske DNA biblioteker, som indeholder DNA fragmenter, der repræsenterer organismens samlede genom. I eukaryote celler indeholder genomisk DNA både kodende ( exons) og ikke kodende regioner, såsom introns, repetitive sekvenser og regulatoriske områder, så et genomisk bibliotek vil afspejle organismens samlede DNA, og vil i princippet kunne isoleres fra alle vævstyper på alle udviklingstrin. 2. c DNA biblioteker, som kun indeholder komplementært DNA, syntetiseret fra mrna molekyler i cellen. c DNA biblioteker indeholder således kun de kodende regioner (exons), og afspejler den genetiske information, der bliver udtrykt som protein i en given vævstype på et givent udviklingstrin. I humane celler udgør den kodende del af cellens DNA godt 1 %. Figur 2.8 Genekspression er afhængig af celletypen ( efter Brown: Gene Cloning) Genomiske DNA biblioteker fremstilles ved at oprense genomisk DNA fra organismen, skære det med restriktionsenzym, og klone det i en vektor, som beskrevet i ovenstående. GENEKSPRESSION side 37

38 cdna biblioteker fremstilles ud fra mrna fra den pågældende celletype. 1. trin er således oprensning af RNA fra cellen, dernæst separation af mrna fra rrna og trna. Da eukaryot mrna indeholder en polya hale, er det muligt ved fx søjlekromatografi at foretage denne adskillelse. Enzymet revers transkriptase katalyserer syntesen af DNA udfra en RNA template og danner således cdna komplementært til mrna, dvs kun de aktive kodende regioner af genomet er kopieret. cdna kopieres efterfølgende af enzymet DNA polymerase for at få tilstrækkeligt DNA materiale til kloning i en vektor og indførsel i bakterier. Se fig 2.9. Fig 2.9 cdna syntese Der er adskillige væsentlige forskelle på genomiske kloner og cdna kloner. Genomiske kloner repræsenterer organismens totale DNA, og vil, med få undtagelser, ikke afhænge af, hvilken celletype, DNA et er oprenset fra, ej heller hvilket udviklingstrin. Genomiske kloner fra eukaryote organismer vil indeholde store mængder af repetitive sekvenser, samt introns, gen regulations regioner og proteinkodende sekvenser. GENEKSPRESSION side 38

39 cdna kloner vil derimod kun indeholde proteinkodende sekvenser, og kun DNA fra de gener, der blev udtrykt i det væv, mrna blev oprenset fra. Celler fra forskellige vævstyper udtrykker ikke helt de samme gener, nogle af generne udtrykkes i alle celler, de såkaldte husholdningsgener, mens andre gener er vævsspecikke (leverceller producerer andre proteiner end fx muskelceller). Derfor vil man få en række forskellige cdna biblioteker fra en bestemt organisme. Ligeledes afhænger genudtrykket af cellens udviklingstrin, som også vil afspejles i cdna biblioteker. Den mest oplagte fordel ved cdna kloner er, at de indeholder en uafbrudt kodende sekvens af et gen, hvilket gør det muligt at producere fx humant protein i gærceller (som ikke kan fjerne introns). cdna kloner anvendes også til at fremstille prober ved fx Microarray teknik. Fordelene ved genomiske biblioteker er at de indeholder regulatoriske sekvenser og i øvrigt indeholder oplysninger om en organismes totale DNA. Ved sekventering af en organismes genom anvendes det genomiske bibliotek, da man let kan sekventere DNA indsat i en vektor. Screening af genbiblioteker kan foretages med enten nukleinsyre prober eller med antistoffer, afhængig af om man søger efter kloner, der indeholder en DNA sekvens (fx et bestemt gen ) eller efter kloner, der producerer et bestemt protein. Hvis man gerne vil finde en bestemt klon, som indeholder gensekvensen for et bestemt protein, kan man vælge 2 strategier: Man kan fastlægge basesekvensen af genet ud fra proteinets aminosyresekvens, og fremstille en DNA probe til hybridisering. Man kan også anvende et antistof, rettet mod det pågældende protein. I så fald skal man sikre at genet kan udtrykkes i det pågældende vektor og værtsorganisme. Vektoren skal være en ekspressionsvektor (se kap 3) Fig 2.10 Screening af genbibliotek GENEKSPRESSION side 39

40 Links on.1611 GENEKSPRESSION side 40

41 Kapitel 3 Produktion af rekombinant protein Produktion af rekombinant protein forudsætter, at man kan klone genet (donor DNA) for det ønskede protein i en vektor, indsætte det i en værtsorganisme, som udtrykker genet, så proteinet bliver produceret. Denne proces er skitseret i nedenstående figur. Figur 3.1: Produktion af rekombinant protein GENEKSPRESSION side 41

42 I figur 3.1 er donor DNA vist som genomisk DNA, hvor det ønskede gen isoleres ved restriktionssenzym skæring. Denne metode er ikke altid velegnet, hvis genomisk DNA indeholder introns ikke kodende regioner, som findes i de fleste eukaryote cellers DNA. For at undgå introns kan man bruge cdna som donor DNA i kloningsprocessen. cdna dannes udfra mrna svarende til det ønskede protein. mrna kopieres ved revers transkription, fx ved RT-PCR (se afsnit 4.3). I mrna er intron sekvenser fjernet under transkriptionen i cellekernen. Figur 3.2 Syntese af donor DNA (cdna) ved RT-PCR For at få produceret protein fra et klonet gen er det nødvendigt at : genet er indsat efter en stærk, regulerbar promotor der findes signal for terminering af transskription der findes signal for ribosombinding der findes tilstrækkeligt antal af kopier af det klonede gen i cellen det klonede gen opretholdes stabilt i cellen det klonede protein er stabilt i cellen Disse forudsætninger afhænger i høj grad af den vektor, der anvendes til at overføre det ønskede gen til cellen. GENEKSPRESSION side 42

43 Vektorer til ekspression af protein Hvis man ligerer et gen fra en organisme i en standard vektor til kloning vil man højst sandsynligt ikke få produceret det ønskede protein i værtsorganismen. Det skyldes at ekspression af protein afhænger af tilstedeværelsen af flere nødvendige signal-sekvenser, så transskription og translation vil finde sted. De vigtigste signaler for ekspression: Promotor: Markerer startstedet for transkription. I E. coli genkendes promotoren af sigma subunit i RNA polymerase og i eukaryoter genkendes promotoren af transkriptionsfaktorer, knyttet til RNA polymerase. Terminator: Markerer det punkt på genet, hvor transkriptionen skal stoppe. En terminator er ofte en nuklotidsekvens, som kan baseparre med sig selv, så der opstår en loop struktur. Ribosombindingssted: En kort nukleotid sekvens, som genkendes af ribosomet som det sted, hvor mrna skal bindes til ribosomet ved translation. Start codon for genet findes altid få nukleotider downstream dette sted. Figur. 3.3 Ekspressionssignaler i E. coli Disse ekspressions signaler er lidt forskellige i pro- og eukaryote celler, f.eks er forskelligheder i promotorsekvenser vist i fig GENEKSPRESSION side 43

44 E. coli promoter:. TTGACA.. TATAAT..... strukturgen -35 box - 10 box eukaryot promotor: forskellige signaler. TATAAAT..strukturgen - 25 box Figur 3.4. Promoter sekvenser På figuren ses, at der er forskel i konsensussekvenser i pro- og eukaryote celler. På grund af sådanne forskelligheder vil E. coli RNA polymerase sandsynligvis ikke kunne forstå signalerne fra eukaryot DNA, og proteinet vil ikke blive udtrykt. Hvis eukaryote gener skal udtrykkes i E. coli er løsningen at indsætte det fremmede gen i en vektor, som indeholder E. coli ekspressionsignaler. (fig. 3.5) Hvis gener skal udtrykkes i eukaryote organismer skal genet indsættes i en ekspressionsvektor, der indeholder eukaryote ekspressions signaler. Figur3.5 Ekspression af gener i E. coli (Efter Brown: Gene Cloning) GENEKSPRESSION side 44

45 Mere udførlig beskrivelse af promotorer. Promotoren er den mest kritiske komponent af en ekspressionsvektor, da den styrer initiering af transskription og dermed hastigheden, hvormed mrna bliver syntetiseret. Promotoren er således afgørende for, for meget rekombinant protein, der bliver produceret. Man taler om stærke og svage promotorer, hvor en stærk promotor opretholder en høj produktion af mrna. I celler findes stærke promotorer i forbindelse med gener, der udtrykkes i større mængde ( mange kopier af det pågældende protein). Svage promotorer findes i forbindes med gener, som kun udtrykkes i mindre mængde protein. Figur 3.6 Stærke og svage promotorer (fra Brown: Gene Cloning) Forskelle i transskriptionseffektivitet kan skyldes små forskelle i konsensussekvenser i promotoren, f. eks. at TTGAAC er udskiftet med TTCAAC. I ekspressionsvektorer er det afgørende at have en stærk promotor, så det klonede gen udtrykkes mest muligt. Promotorer kan reguleres, (beskrevet i kap. 1), som regel ved induktion eller repression, og derved reguleres transkriptionen. Disse reguleringsmekanismer er forskellige hos pro- og eukaryote celler. Genekspression kan også reguleres på andre niveauer som ikke involverer promotoren, fx på translationsniveau GENEKSPRESSION side 45

46 Figur 3.7 Eksempler på regulation af promotorer i E. coli Translation i ekspressionsvektorer Translationseffektivitet og stabilitet af det producerede protein vil ligesom promotoren have indflydelse på mængden af dannet rekombinant protein. Ikke alle mrna bliver translateret med samme effektivitet, der kan være mange ganges forskel på hvor mange proteinkopier der dannes. Det molekylære grundlag for denne forskel skal findes i translation initiering, som er knyttet til ribosombindingsstedet. Ribosom binding stedet er en sekvens af 6-8 baser på mrna som er komplementær til et område på rrna i ribosomets lille subunit. I E. coli kaldes denne sekvens Shine Dalgarno sekvensens. Ribosombindings sted findes få basepar upstream initieringscodon AUG. Jo stærkere denne binding er desto større translations effektivitet Dannelse af sekundære strukturer ( hairpin loops) i mrna vil have indflydelse på translationen, især må der ikke forekomme sådanne strukturer ved ribosombindingssted. I eukaryote celler findes sjældent et egentligt ribosombindingssted. I stedet er initiering knyttet til CAP molekylet på 5`enden af mrna. CAP indgår i initieringskompleks sammen med den lille ribosomale subunit, og 1. AUG codon fungerer som startsted. I ekspressionsvektorer kan være indsat et egentligt ribosombindingssted, ofte kaldet en KOZAK sekvens. GENEKSPRESSION side 46

47 Placering af det klonede gen i den rigtige læseramme er naturligvis afgørende for om man får det ønskede protein translateret. På plasmidet ( kodende DNA streng) findes koden til ribosombindingsstedet (rbs)og ATG start-signal (svarer til startcodon på mrna AUG). Det ønskede gen indsættes i poly cloning site mellem rbs og termineringssignalet. Hvis genet ikke passer helt i læserammen, må det justeres ved at fjerne eller tilføje 1-2 baser. Prokaryote ekspressionssystemer De mest anvendte promotorer i E. coli er: (der henvises til fig 3.8) Figur 3.8 Promotorer i ekspressionsvektorer (Efter Brown : Gene Cloning) lac -promotor: Kontrollerer Lac-operonet (se kap. 1). Lac-promotoren er inducibel, idet den induceres af lactose og analoge forbindelser. Oftest anvendes IPTG (fig 1.7), som igangsætter transskription af genet indsat downstream promotoren. lacuv5-promotoren: Er variant af lac-promotoren, med en ændret nucleotidsekvens i 10 området. Den er en stærkere promotor end vildtypen, men den er stadig reguleret af lac-repressorprotein. trp-promotor: Kontrollerer transskription af tryptophan-operonnet, som består af 10 proteinkodende sekvenser. Trp-promotoren er reguleret af et kompleks, der består af trprepressorprotein, der er bundet til tryptophan. Det samlede kompleks er bundet til trp- GENEKSPRESSION side 47

48 promotoren og det forhindrer dermed at genet udtrykkes. Dette er en negativ regulering af en type, som vises i fig. 1.9 (d). trp-repressorprotein kodes af genet trpr, som er placeret et andet sted på bakteriekromosomet og som transskriberes separat.. Når koncentrationen af tryptophan formindskes går tryptophan-trp-repressorprotein fra hinanden og genet kan udtrykkes. Ligesom i lac-promotoren startes transskriptionen når -faktoren bindes til promotoren. trp-promotoren représseres (undertrykkes) altså af tryptophan, og induceres således af tryptophanmangel, men også tilsætning af 3-indol-acrylsyre inducerer genet. trp-genet har et yderligere reguleringstrin, som arbejder på mrna-niveau. Denne reguleringsform kaldes attenuation og vi kommer ikke yderligere ind på den her. tac promotor Konstrueret hybrid mellem lac- og trp-promotorerne, men er en stærkere promotor end lac og trp. tac induceres af IPTG. P L -promotor Styrer transkription af bakteriophagen i E. coli, er en meget stærk promotor, som genkendes af E. coli RNA polymerase. Undertrykkes af repressorproteinet ci, som også kodes af et gen fra. Der anvendes en temperatur-sensitiv mutant af E.coli, så ci proteinet kun er aktiv repressor ved temperaturer under 30 grader. T7 promotor Stammer fra bakteriofag T7 og genkendes af T7 RNApolymerase, som ikke kodes af vildtype E. coli. For at anvende denne promotor skal genet for T7 RNA polymerase være indsat i E.coli kromosomet. Transskription af RNA polymerase genet er kontrolleret af lac-promotoren og induceres af IPTG. Når T7 RNA polymerase er produceret, transskriberes det gen, som er indsat downstream T7 promotoren. Balance mellem repressorproteiner og promotorer. Inaktivering af en repressor og dermed aktivering af transskriptionen afhænger af forholdet mellem mængden af repressorproteinmolekyler og hvor mange kopier af promotor sekvensen, der findes i cellen. Hvis der er for mange repressormolekyler, bliver det vanskelig at inducere transskriptionen. Hvis der derimod er for få finder transskriptionen sted, selvom der ikke har fundet en induktion sted. I det sidste tilfælde siger man at transskriptionen er leaky (=lækkende). Man har taget forskellige teknikker i anvendelse for at få den fulde kontrol over transskriptionen. Man kan f. eks. placere genet for repressorproteinet i plasmider, som findes i cellerne i et lavt kopitel og promotor sekvensen med det indsplejsede protein i plasmider med et højt kopital, det kan ofte give et passende forhold mellem repressor og promotor. Alternativt kan man placere en kopi af repressorgenet i bakteriens kromosom. GENEKSPRESSION side 48

49 I systemer hvor man anvender lac bruger man ofte en mutant af laci (det gen, der koder for repressoren), der producere en større mængde lac-repressor, således at man formindsker muligheden for ikke-induceret udtryk af genet. Figur 3.9 Dobbelt plasmidsystem til kontrol af p L -promotoren, der reguleres af ci repressoren vha. tryptophan. Tryptophan-promotoren er placeret foran ci genet på et plamid og p L -promotoren er placeret foran det klonende gen på et andet plasmid. Pilene angiver transskriptionen. A) uden tryptophan i substratet udtrykkes ci genet, og p L -promotoren er inaktiv det klonede gen udtrykkes ikke B) Ved tilstedeværelse af tryptophan i substratet er ci inaktivt og det klonede gen udtrykkes. (efter Glick og Pasternak (1998):Molecular Biology. SAM press) Problemer ved opscalering Når man skal opskalerer produktionen af en rekombinant er sætter økonomien begrænsninger. Hvis man benytter sig af en lac-promoter, bruger man som regel IPTG til udtryk af genet. IPTG er imidlertid et dyrt stof, som hvis det skal bruges i større mængder, kan ødelægge økonomien i en produktion af rekombinant protein. På samme måde vil, den opvarmning, der skal til når man anvender en varmeinduceret P L promotor være for dyr. Man har derfor udviklet et to-plasmid-system, der taget højde for økonomien på basis, af trp- og p L -operonnerne: ci repressoren placeres underkontrol af trp-operonnet i et lav-kopi-plasmid. Det sikre en passende produktion af ci-repressorprotein. I et andet høj-kopiplasmid placeret det GENEKSPRESSION side 49

50 klonede gen under kontrol af p L -promotoren. Ved et lavt tryptophanniveau produceres der således ci-repressorprotein. Dette opnår man ved at sammensætte et billigt substrat, hvor N-kilden er kasein, som indeholder meget lidt frit tryptophan. Når man derefter ønsker at udtrykke det rekombinante gen tilsætter man trypton til mediet. Det indeholder en del frit tryptophan, hvorved produktionen af ci ophører og det rekombinante protein derefter udtrykkes under konkrol af p L -promotoren (fig. 3.9). Cassette vektorer: Udover en stærk promotor skal vektoren indeholde ribosombindings sekvens og terminerings signal for transkription. Genet, som ønskes udtrykt indsættes i et unikt retriktionssite, beliggende mellem ribosom bindingsted og termineringssignal. Figur 3.10 Cassette vektor (skematiseret) (efter Brown : Gene Cloning) En generaliseret vektor til E. coli kan se ud som på fig Figur 3.11 Generaliseret ekspressionsvektor til E. coli (efter Glick: Molecular Biotechnology) Amp R : Gen for ampicillin resistens (selektion for transformation) ptac: tac promotor rbs: ribosom bindings sted NcoI, PstI, HindIII: unikke restriktionssites til indsættelse af det ønskede gen. T1 og T2: termineringssignaler ved transkription GENEKSPRESSION side 50

51 Eksempel på en ekspressionsvektor til ekspression i E. coli palter -Ex1: Vector sequence reference points: Base pairs 5854 T7 RNA polymerase transcription initiation site 1 SP6 RNA polymerase transcription initiation site 177 tac transcription initiation site 113 T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) SP6 RNA polymerase promoter (-17 to +3) tac promoter T7 translation start codon 37 tac and SP6 translation start codons 66, 70 multiple cloning region 5-78 lacz start codon N\A lac operon sequences N\A lac operator N\A Beta-lactamase (AmpR) coding region TetR gene coding region Chloramphenicol acetyltransferase (CmR) coding region N/A phage f1 region Binding site of puc/m13 Forward Sequencing primer Binding site of puc/m13 Reverse Sequencing primer Binding site of Ampicillin Repair Oligonucleotide Binding site of Tetracycline Repair Oligonucleotide Binding site of Chloramphenicol Repair Oligonucleotide N/A Note: This vector is tetracyline resistant and ampicillin sensitive as supplied by Promega. After mutagenesis with the Ampicillin Repair Oligonucleotide it will become ampicillin resistant and after mutagenesis with the Tetracycline Repair Olignucleotide it will become tetracycline sensitive. Use the T7 or puc/m13 Forward primers to sequence ssdna produced by the palter -Ex1 Vector. N.B. palterex-1 cannot be grown in DH5-alpha cells. GENEKSPRESSION side 51

52 Plasmidet anvendes sammen med en bestemt E. coli stamme Som supplerende læsning kan anbefales Glick, B.R. og Pasternak, J.J.: Molecular Biotechnology 2 ed. kap 6. Eukaryote ekspressionssystemer Produktion af eukaryote proteiner i prokaryote celler kan give problemer af forskellig art: Bakterier udskiller ofte toksiske stoffer, som ikke kan skilles fra proteinet ved oprensningen. Det kan fx være endotoksiner stoffer som kan give anledning til temperaturforøgelse i mennesker. Der kan være forskel i oversættelse af codons ved transskription, fx ved aminosyren proline. Bakterier anvender oftest prolin codon CCG og humane celler CCA, CCT, CCC. Gramnegative bakterier har ofte svært ved at udskille det producerede protein til mediet, og vil i stedet indlejre det i inklusionlegemer, som består af uopløselige, ukorrekt foldede proteiner. Færdiggørelsen af proteiner efter translation (posttransskriptionel modifikation) foregår ikke på samme måde i pro- og eukaryoter, så ofte kan bakterier ikke danne funktionelle eukaryote proteiner. Proteinmodifikationer, som foregår efter translation: Foldning af peptidkæden ved hjælp af chaperoner (proteiner, der assisterer foldning) Dannelse af disulfidbroer. Hvis svovlbroerne ikke dannes de rigtige steder, er proteinet ustabilt og ikke biologisk funktionelt. Fraspaltning af dele af det translaterede protein, for at danne det funktionelle protein (fx ved insulin) Glycosylering, som er tilhæftning af specifikke kulhydrater til proteinet. En del posttranslationelle modifikationer foregår hos eukaryote celler overvejende i endoplasmatisk reticulum og Golgi kompleks, organeller, som ikke findes i bakterier. I prokaryoter udgør disse modifikationer overvejende foldning ved chaperoner. Derfor er det ofte hensigtsmæssigt at vælge et eukaryot ekspressionssystem til produktion af fx humane proteiner. Værtsorganismer Der findes ekspressionsystemer med gær og skimmelsvampe, mammale celler og insektceller som værtsorganismer. Der findes tillige eksempler på, at pattedyr og planter er anvendt som værtsorganismer. I det følgende gives eksempler på eukaryote ekspressionsystemer. GENEKSPRESSION side 52

53 Eukaryote ekspressionvektorer Ekspressionsvektoren skal tilpasses værtscellen, og i de fleste tilfælde er der tale om enten et plasmid eller en virus vektor. Hvis værtscellen er gær er vektoren oftest et plasmid, og overførslen kaldes transformation. Vektorer til mammale celler og insektceller er ofte virus, og overførslen kaldes transfektion. En generaliseret vektor skal have følgende egenskaber, idet der henvises til figur 3.12: Figur 3.12 Generaliseret eukaryot ekspressions vektor (efter Glick: Molecular Biotechnology) Vektoren er en såkaldt shuttlevektor, idet den kan kopieres i både E. coli og en eukaryot celle. På fig ses, at den indeholder både ori euk og ori E Vektoren indeholder markørgener til både pro- og eukaryote celler, så man kan selektere celler der har optaget vektoren. Markørerne kan være antibiotikaresistensgener, f. eks. ampicillinresistens i E. coli og neomycinresistens (G418) i eukaryoter. Det kan også være gener, der koder for fx aminosyrer, så celler der har optaget vektoren, får tilført et gen, der gør cellen uafhængig af et bestemt næringsstof i mediet. På figuren er ESM den eukaryote markør, der også har sin egen promotor og termineringssignal Selve det ønskede gen indsættes i kloningssite (cs), beliggende mellem promotor (p) og terminerings-og polyadenyleringssignal (t) Polyadenyleringssignal er nødvendig i eukaryote celler, idet eukaryot mrna har en poly-a-hale. Vektoren kan yderligere indeholde en såkaldt tag, som anvendes til epitope tagging. En epitop, også kaldet en antigen determinant er en struktur eller sekvens, som kan genkendes af et antistof. Hvis DNA sekvensen for en epitop (tag protein) indsættes sammen med DNA sekvensen for et protein, der ønskes klonet, kan man spore proteinet med et antistof mod tag proteinet. GENEKSPRESSION side 53

54 Fordelen er at man kan spore forskellige proteiner med samme tag med det samme antistof. Principper i anvendelse af epitop tagging er skitseret i de 2 næste figurer. Figur 3.13 Skematisk overblik af epitope tagging Forklaring til figur: Ap R : ampicillin resistens (markør i E. coli) neo: kanamycin resistens G418 (eukaryot markør) ATG: start signal translation TGA: stop signal for translation MCS: multible cloning site (indsættelse ag det ønskede gen) ori SV : ori for replikation (eukaryot) ori b : ori for replikation i bakterier Pe: eukaryot promotor tag: sekvens, der koder for tag protein poly A: polyadenyleringssignal GENEKSPRESSION side 54

55 Figur 3.14: Generaliseret epitope tagging vektor Links: Saccharomyces cerevisiae Ekspressionsystemer S. cerevisiae kan dyrkes i større målestok og bruges til produktion af eukaryote proteiner fx kan nævnes insulin. Gær har forskellige fordele i forhold til bakterier, fx udskilles de producerede proteiner let fra cellerne, og gærceller kan klare visse posttranslationelle modifikationer, såsom glykosylering og foldning. Der kan anvendes forskellige typer ekspressionsvektorer Plasmidvektorer, hvor plasmidet forekommer selvstændigt (episomalt) i cellen. Det indsatte gen forekommer i flere kopier afhængig af kopitallet af plasmidet. Systemet er ikke altid stabilt, især ikke ved dyrkning i større målestok. Integrative vektorer, hvor plasmidet integreres i kromosomet ved homolog rekombination. Systemet er stabilt, men kopitallet af det indsatte gen er lavt. Det kan der kompenseres for ved at indsætte flere kopier af genet. Artificial yeast chromosomes (YAC) vektorer anvendes til at klone store fragmenter (100 kb) YAC opretholdes som selvstændige kromosomer i cellen med eget replikation ori og telomerstruktur, så de opretholdes stabilt i cellen. Som promotor i vektorer til gær anvendes ofte GAL promotoren, som induceres af galaktose. Som supplerende materiale henvise til Glick, B.R. og Pasternak, J.J.: Molecular Biotechnology 2 ed, kap 7 side Mammale ekspressionssystemer Pattedyrceller anvendes fortrinsvis som værtsorganismer, når man ønsker at producere store proteiner med kompleks 3 dim struktur og mange svovlbroer. De er også i stand til at foretage glykosylering og andre modifikationer korrekt af humane proteiener. Til gengæld er de langt sværere at dyrke i større målestok, og produktionen stiller store krav til sterilitet. Man anvender metoden transfektion til indføring af DNA i eukaryote celler. Som værtsceller anvendes forskellige etablerede cellelinjer af mammale celler, og genet indføres i en expressionsvektor, hvor det eukaryote ori for replikation fra virus fx SV40 (Simian virus 40). Promotorsekvenser, terminerings- og polyadenyleringssignaler stammer sædvanligvis fra virus (Human Cytomegalovirus, SV40, Herpex simplex) eller fra mammale gener (fx -actin) GENEKSPRESSION side 55

56 I nogle tilfælde vil DNA et integreres i værtscellens kromosomer, i andre tilfælde integreres vektoren ikke (ekstrakromosomalt system), og man siger da, at ekspressionen er transient (kortvarig) Et eksempel ses i fig 3.15: pact Vector CMV immediate-early enhancer CMV immediate-early promoter chimeric intron T7 RNA polymerase promoter (-17 to +2) GAL amino acids VP16 fusion protein SV40 large T nuclear targeting sequence multiple cloning region T3 RNA polymerase promoter (-16 to +3) SV40 late polyadenylation signal phage f1 origin of replication SV40 early enhancer/promoter SV40 minimum origin of replication neomycin (neo) phosphotransferase coding region synthetic polyadenylation signal beta-lactamase (Ampr) coding region Figur 3.15 Eksempel på ekspressionsvektor Stabile ekspressionsystemer forsøges etableret, f. eks. transgene dyr, som er tilført gener, så de bliver i stand til at producere bestemte proteiner til udskillelse i fx mælk. Som supplerende litteratur henvises til Glick, B.R. og Pasternak, J.J.: Molecular Biotechnology 2 ed, kap 7 side GENEKSPRESSION side 56

57 Kapitel 4 Metoder til undersøgelse af genekspression I dette kapitel omtales udvalgte metoder til undersøgelse af genekspression. Der er beskrevet flere metoder i T.A. Brown: Gene Cloning and DNA analysis, kap 11: Studying Gene Expression and Function 4.1. Western blotting I bioteknologi bruges flere analysemetoder, hvor det stof man ønsker at undersøge overføres fra en gel til en membran. Processen kaldes en blotning. Når det er DNA, der overføres kaldes metoden Southern blot, navngivet efter teknikkens opfinder. P. Southern. Derefter kaldte man overførslen af RNA til en membran for Northern Blot, og overførslen af protein til en membran hedder så Western blot. Ved et Western blot adskille proteinerne i en blanding ved en SDS-PAGE. Derefter overføres proteinerne elektroforetisk til en membran. Membranmaterialet kan være PVDF (polyvinylflou-rid), nylon eller nitrocellulose. Ligesom det er tilfældet med ELISA, skal de ubenyttede pladser på membranen blokeres, og der bruges de samme stoffer, nemlig proteiner, der ikke har nogen immunologisk identitet med de stoffer der skal overføres eller detergenter. Efter vask behandles membranen med et antistof rejst mod det protein man søger, og endelig behandles membranen med et sekundært mærket antistof. Mærkningen kan foretages med et enzym, men der kan også bruges radioaktiv mærkning. Ved enzymmærkningen behandles membranen med et farveløst substrat, der af enzymet omdannes til en uopløselig farve. Et positivt resultat vil da være en eller flere farvede plettet eller striber på membranen (fig. 4.1). Ved en radioaktiv mærkning, lægges membranen på en røntgenfilm, som efter eksponering og fremkaldelse vil vise et mørkt bånd. Når man skal undersøge hvorvidt et givet protein er udtrykkes i en organisme, kan man bruge forskellige blotningsteknikker. Man kan bruge dot-blot, hvor et ekstrakt, hvor man håber at finde proteinet overføres og fikseres til en membran og detekteres, GENEKSPRESSION side 57

58 Figur 4. 1 Princippet i Western blotting. Efter en SDS-PAGE overføres proteinerne elektroforetisk til en membran. De fri pladser på membranen blokeres, så der ikke sker en uspecifik binding af antistoffer til membranen. Membranen behandles med primært antistof, som bindes til antigenet. Dernæst behandles membranen med sekundært enzymmærket antistof, som bindes til det primære antistof. Endelig behandles membranen med farveløst substrat, som af enzymet omdannes til farvet uopløseligt produkt, og der fremkommer en synlig plet på membranen. GENEKSPRESSION side 58

59 4.2. Northern blotting Northern blotting er en analysemetode til detektion, størrelsesbestemmelse og kvantificering af RNA fragmenter. Teknikken består af følgende trin: 1: oprensning af RNA 2: denaturering af RNA 3: størrelsesadskillelse af RNA ved agarose gel elektroforese under denaturerende betingelser. 4: overførsel af gelfraktioneret RNA til membran. 5: hybridisering af mærket probe til membranen. 6: detektion af dannede hybrider. Ad 1: Ad 2: Ad 3: Ad 4: Ad 5: Man kan anvende både total RNA eller mrna. Eukaryot mrna (polya RNA) kan adskilles kromatografisk fra total RNA i en kolonne med polyt. Kun ca 1 % af total RNA er mrna, så oprensning af polya RNA vil øge sensitiviteten betydeligt. RNA denatureres før påsætning på gel, idet vandringslængden i agarosegeler afhænger af både fragmentets størrelse og konformation. RNA er overvejende enkeltstrenget, men kan danne sekundære strukturer som hairpin loops, hvis der er komplementære sekvenser. For at kunne foretage en nøjagtig størrelsebestemmelse skal alle fragmenter være enkeltstrengede, så kun størrelsen påvirker vandringslængden. Der medtages en denatureret størrelsesmarkør som kontrol. Selve adskillelsen af fragmenterne foregår i agarosegel med denaturerende runningbuffer.. Som eksempler på denaturerende stoffer kan nævnes formaldehyd/formamid eller glyoxal og DMSO. Efter elektroforese fotograferes for at man kan bedømme størrelse og koncentration af RNA fragmenterne. Ofte køres en ny gel, hvor der påsættes nogenlunde samme RNA mængde i alle brønde. RNA overføres fra gelen til en membran ved kapillær overførsel. Som transferbuffer kan anvendes 20X SSC. Og suget etableres med sugende papir med vægt ovenpå. Overførslen varer ofte natten over, med mindre man anvender en vacuum blotter. Membranen fjernes fra stablen, og gelen undersøges under UV lys for at kontrollere overførslen. Proben består af enten DNA eller RNA og kan mærkes radioaktivt eller nonradioaktivt. Ofte anvendes en probe mod det RNA der eftersøges samt en probe mod rrna for at kunne normalisere signalet. Membran og prober hybridiserer natten over. GENEKSPRESSION side 59

60 Ad 6: Membranen stringensvaskes for at vaske overskydende og uspecifik bundet probe væk. Efterfølgende detekteres signalet fra proben enten ved et farvesubstrat eller en røntgenfilm.. Links: Fig 4.2 Northern blotting GENEKSPRESSION side 60

61 4.3. RT-PCR RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) er en sensitiv teknik til at detektere og kvantificere mrna RT-PCR kan også anvendes til fx kloning, konstruktion af cdna biblioteker og til undersøgelse af genekspression, fx med micro arrays. Teknikken består i grundtræk af 2 trin: 1. Syntese af cdna udfra RNA ved revers transkription (RT) 2. Amplifikation af cdna ved polymerase chain reaction (PCR) Revers transkription katalyseres af enzymer med revers transkriptase aktivitet, dvs de er i stand til at katalysere kopieringen af RNA til DNA. Enzymer med RT aktivitet findes hos visse virus og de mest anvendte til RT-PCR er fra Moloney murine leukemia virus (M-MuLV) eller fra avian myeblastosis virus (AMV). Nogle termostabile DNA polymeraser (e.g., Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase) udviser revers transkriptase activitet ved tilstedeværelse af mangan ioner, og det har ført til udvikling af protokoller med kun et enzym. Revers transkription startes udfra et dobbeltstrenget startsted, altså behøver man 1 eller flere primere. Som vist på figuren kan man anvende random primere - hexanukleotider, som bindes tilfældige steder på RNA strengen mrna indeholder en polya hale i den ene ende, så et poly T oligonuklotid kan anvendes som universel primer til mrna. Hvis man vælger random primere eller poly T får man kopieret alt mrna i prøven. Det ønsker man fx ved fremstilling af cdna biblioteker. Hvis man kender specifikke sekvenser på sit mrna, og man kun ønsker et bestemt mrna kopieret, kan man vælge at anvende en sekvens specifik primer. GENEKSPRESSION side 61

62 Figur 4.3 Skematisk oversigt RT-PCR RT-PCR kan udføres i 2 eller 1 trins reaktioner : 2 trins metoder: Først udføres revers transkription med en revers transkriptase, dernæst udføres PCR i et nyt rør med Taq polymerase. 1 trinsmetoder: Revers transkription og PCR foregår i samme rør og katalyseres af fx Tth DNA polymerase eller en blanding af en revers transkriptase og en DNA polymerase. Links: (animation) (animation) GENEKSPRESSION side 62

63 Realtime RT PCR og qrt PCR Kvantitativ (q) RT PCR gør det muligt at bestemme en prøves indhold af mrna ved PCR reaktionens start. Metoden er også en Realtime PCR metode, hvor amplifikationen følges løbende i processen. Realtime PCR apparater har indbygget fluorescensdetektion, så amplifikation kan ses på en skærm. Fig 4.4 Skærmbillede fra Realtime PCR Realtime PCR giver mulighed for at amplifikationen kan detekteres i den eksponentielle fase, hvorimod man ved traditionel PCR detekterer PCR produktet ved slutningen med gelelektroforese. GENEKSPRESSION side 63

64 Detektion Fluorescensdetektionen er baseret på, at der anvendes enten DNA bindende farvestoffer som SYBR Green I eller prober som fx Taqman og Molecular Beacons. SYBR Green I bindes uspecifikt til ds DNA (minor groove), så jo mere DNA der amplificeres, desto flere bindingsteder er der for SYBR Green I. Farvestoffet bindes ikke til enkeltstrenget DNA og i fri opløsning udsender SYBR Green I meget lidt fluorescens. Der vil således udsendes lys proportionalt med syntesen af ds DNA ved PCR. Fig 4.5 Binding af SYBR Green I til DNA En begrænsning ved anvendelse af SYBR Green er, at det bindes uspecifikt til DNA, så reaktionens specificitet er bestemt udelukkende af primerne. Som konsekvens deraf er det vigtigt, at primerne er konstrueret, så uspecifik binding og primer dimer dannelse undgås. For at kontrollere reaktionens specificitet, udføres en smeltekurve analyse af PCR produkterne efter endt kørsel. Den temperatur, hvor DNA smelter, er bestemt af molekylets længde, så hvis der er amplificeret flere længder af PCR produkter, vil det kunne ses på smeltekurven. Fig 4.6 viser et eksempel på en smeltekurve. Først opvarmes til 95 grader, så alle PCR produkter denatureres, dernæst sænkes temperaturen til 55 grader, så alle anneales. Ved efterfølgende gradvis opvarmning vil PCR produkterne smelte ved forskellig temperatur, afhængig af længden. I en optimeret reaktion bør de smelte ved samme temperatur. GENEKSPRESSION side 64

65 Fig 4.6 Smeltekurve. Hvis man ønsker højere specificitet ved detektion af PCR produktet, kan dette opnås ved anvendelse af en intern probe, udover primerne. Proben er komplementær til en del af PCR produktet og er mærket med et fluorochrom (fluorescerende stof) og en Quencher, (et dæmpende stof). Hvis proben er fri i opløsningen, altså hvis der ikke er PCR produkt tilstede, vil proben ikke udsende fluorescerende signal, da quencher molekylet dæmper lysudsendelsen fra det fluorescerende stof Er der derimod PCR produkt produceret, vil proben bindes dertil og afstanden til quencher molekylet ændres, så lysudsendelse er mulig, og der vil udsendes et signal. Der henvises til figur 4.7, Molecular Beacons systemet. GENEKSPRESSION side 65

66 Fig 4.7 Molecular Beacons systemet. Fig 4.8 viser de forskellige faser i PCR. I de første cykler, hvor der er overskud af reagenser og ingen inaktivering af Taq polymerasen, foregår amplifikationen ekponentielt, så antallet af DNA molekyler fordobles for hver cyklus. Efterhånden som reagenserne slipper op og Taq polymerasens aktivitet nedsættes, vil amplifikationen aftage, og det vil ses som et plateau på kurven. GENEKSPRESSION side 66

67 Fig 4.8 Faser i PCR program. I den eksponentielle fase vil man kunne korrelere det fluorescerende signal med DNA mængden ved reaktionens start, ved at der er sammenhæng mellem startkoncentrationen af template DNA og Ct, hvor Ct er den cyklus, hvor det fluorescerende signal er signifikant over baggrundssignalet. Ct er således omvendt proportional med logaritmen til mængden af DNA ved reaktionens start. Jo mere DNA der er ved reaktionens start, desto hurtigere nåes Ct. Se fig 4.9. Fig 4.9 Threshold cycle (Ct) GENEKSPRESSION side 67

68 Ved kvantificering af mrna ved reaktionens start kan anvendes 2 forskellige strategier: Absolut kvantitering Relativ kvantitering Ved absolut kvantitering anvendes en standard kurve, som er udarbejdet udfra en fortyndningsrække af en kontrol template DNA med kendt koncentration. Standardrækken skal med hver gang på den samme kørsel som prøverne. På fig 4.10 ses en amplifikation af forskellige standarder i 10 folds fortynding. Fig 4.10 Amplifikation af kendte standarder ved QPCR (y-akse viser fluorescens og x-akse viser cyklus nr.) Efterfølgende indtegnes en standardkurve, hvor y-aksen angiver Ct værdier og x-aksen log DNA koncentration ved start (måles ofte som antal DNA kopier) Se fig GENEKSPRESSION side 68

69 Fig 4.11 Standardkurve (y-akse: Ct, x-akse: log antal DNA kopier) Samtidig med standardrækken er der kørt prøver med ukendt DNA indhold og Ct værdierne for prøverne er målt. Ved hjælp af standardkurven kan antallet af DNA kopier i prøverne bestemmes. Se fig 4.12 Fig 4.12 Aflæsning af prøvers indhold af DNA. (Ct på 22 svarer her til et DNA indhold på 10 5 kopier.) GENEKSPRESSION side 69

70 Relativ kvantitering Standard kurve metoden er velegnet, når man vil bestemme den absolutte mængde af mrna i en prøve. I mange tilfælde er det tilstrækkeligt at kunne måle en relativ mængde af mrna i forhold til en kontrol.prøve. Ofte suppleres metoden med at man normaliserer resultatet med ekspression af et såkaldt husholdningsgen, som har et konstant mrna niveau i celler. GENEKSPRESSION side 70

71 4.4 Microarrays Et array er et systematisk arrangement. Gen arrays består af et fast fundament (membran eller glasplade), hvorpå der er påhæftet en samling af genspecifikke nukleinsyrer i et bestemt mønster. De påhæftede nukleinsyrer kan være oligonukleotider, PCR produkter eller cdna. Sekvenserne kan repræsentere et helt genom eller cdna fra forskellige væv. Array beskrives enten som makroarrays eller mikroarrays, afhængig af størrelsen af påsat prøvespot. Mikroarrays eller DNA chips er fabriksfremstillede og indeholder tusindvis af påhæftede nukleinsyre fragmenter. Der kan således undersøges et meget stort antal gener samtidig. Der findes prefabrikerede arrays i handlen eller man kan selv bestille fremstilling af specifikke arrays. Microarrays kan anvendes til at fastlægge den samlede genekspression i væv, afhængig af udviklingstrin, genotype, forskellige former for behandling osv. I disse tilfælde vil man anvende arrays med påhæftet cdna fra et bibliotek. (se fig 4.13) Microarrays kan også anvendes til at finde SNP (Single Nukleotid Polymorfi) i individer. SNP opstår, når der sker mutation i et enkelt nukletid (punktmutation). SNP er i høj grad årsag til at individer inden for en art er forskellige. Sygdomstilstande er ofte knyttet til bestemte varianter i SNP, så teknikken kan anvendes til at forudsige om en person er disponeret for bestemte sygdomme. Der findes tillige eksempler på at microarrays kan anvendes til at monitorere mange forskellige mikroorganismer i en prøve. Eksempel på eksperimentelt forløb til ekspressionanalyse med mikroarrays: Microarrays er baseret på hybridiseringsteknik og følger forløbet: Forberedelse af det kendte DNA Forberedelse af prøve DNA Hybridisering Stringens vask Detektion/Kvantificering GENEKSPRESSION side 71

72 I traditionel filter hybridiseringsteknik immobiliseres prøve DNA på en membran, men i microarrays er det det kendte DNA, der immobiliseres på array platformen (fx en glasplade) Forberedelse af det kendte DNA Hvis man vil undersøge den samlede genekspression i en prøve, skal man bruge et komplet cdna bibliotek for det pågældende væv. cdna biblioteket vil som regel findes som inserts i plasmider, klonet i E. coli. (se også kapitel 2) Typisk har man kolonierne af E. coli, der repræsenterer biblioteket, dyrket i samme system, som man vil påsætte det på arrayen. cdna isoleres lettest fra en koloni ved at udføre PCR med primere, der flankerer insertet. Dette kan udføres med kolonimateriale som template. Efter PCR oprenses produktet og påsættes arrayen i fastlagt system. Hvis man vil undersøge for SNP, skal det kendte DNA være mulige varianter af et gen, som så påhæftes arrayen. Forberedelse af prøve DNA Til ekspressionsanalyse er prøvematerialet RNA oprenset fra det pågældende væv. Så først oprenses RNA, og der revers transkriberes med revers transkriptase og oligo T primer, så der produceres cdna. Rester af RNA fjernes enzymatisk. Ved revers transkription foregår samtidig en mærkning, fx med nukleotider påhæftet et fluorochrom, fx Cy 3 eller Cy 5. Ofte anvendes dobbelt mærkning, hvor man sideløbende har oprenset RNA fra kontrol væv. cdna fra kontrolvævet mærkes med det ene fluorochrom og cdna fra prøven mærkes med det andet. På den måde kan man få oplysninger om ekspression i prøven i forhold til en kontrol (fx normal ekspression i rask væv). Til SNP analyse fremskaffes en DNA prøve fra det individ, der ønskes testet, og ved PCR amplificeres det gen, man vil undersøge for SNP. Samtidig foretages en mærkning, som beskrevet ovenfor. Hybridisering og vask foregår efter de samme principper, som fx Southern blotting. Ved dobbelt mærkning hybridiseres med både kontrol og prøve. Detektion foregår i fluorescens detektor, opkoblet til computer, som foretager databehandlingen GENEKSPRESSION side 72

73 Figur Overblik microarray teknik Target preparation: Kendte nukleinsyrer, der påhæftes chippen. Kan være et cdnabibliotek, hvor man amplificerer inserts ved PCR. PCR produkterne påhæftes chippen. Probe preparation: Omdannelse af RNA fra prøver til cdna ved revers transkription (evt RT PCR) og samtidig mærkning. (flourescens). Proberne hybridiseres til chip. Dataanalyse: Ved detektion udsendes et flourescerende signal fra proben, hvis den baseparrer til target molekylerne på chip. Signalet behandles i computer. Signal fra gener med forskellig ekspression Signal fra gener med svag ekspression Signal fra gener der udtrykkes på samme niveau Figur 4.14 Flourescerende signal fra chip. Man kan skelne mellem hvorvidt der er et signal eller ej og også vurdere signalets intensitet.. GENEKSPRESSION side 73