(12) PATENTSKRIFT (11) B1

Transkript

1 (19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT (11) B1 Patentdirektoratet TAASTRUP (21) Patentansøgning nr.: 0623/86 (22) Indleveringsdag: 07 feb 1986 (51) Int.CI.5 C 07 K 15/04 C 12 N 15/33 (41) Alm. tilgængelig: 08 aug 1986 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 20 dec 1993 (86) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 07 feb 1985 US (73) Patenthaver: SMITHKLINE BECKMAN CORPORATION; One Franklin Plaza; Phdadelphia, Pennsylvania 19103, US, THE *UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE ARMY; Washington, D.C., US (72) Opfinder: W. Ripley 'Ballou; US, Mitchell Stuart Gross; US, 'Wayne T. Hockmeyer; US, James Francis Young; US (83) Deponering af mikroorganismer (74) Fuldmægtig: Firmaet Chart. Hude (54) Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk præparat mod malaria (56) Fremdragne publikationer WO off.g.skrift nr. 84/02917 Andre publikationer: Science bind 225 (1984) side Science bind 225 (1984) side (57) Sammendrag: Vaccine til beskyttelse af pattedyr mod malaria FIG.lb DNA Bam HI Barar Bang a tet'' omp r p BR32 2

2 1 Den foreliggende opfindelse angår et fusionspolypeptid og en vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et præparat mod malaria. Malariå er en alvorlig, meget udbredt sygdom, som der trods 5 mange års store anstrengelser endnu ikke er udviklet nogen vaccine imod. Se f.eks. Science, bind 226, side 679 (9. november 1984). Pattedyr, herunder mennesker, er forsøgsvis blevet beskyttet mod infektion med maleriafremkalderen, Plasmodium, ved vaccination med bestrålede sporozoiter. Clyde et al., 10 Am. J. Trop. Med. Hyg., bind 24, side 397 (1975) og Rieckman et al., Bull. WHO, bind 57 (tillæg 1), side 261 (1979). Yoshida et al., Science, bind 207, side 71 (1980) angiver, at en sådan beskyttelse i det mindste delvis formidles af antistof rettet mod et protein på sporozoitoverfladen, circumsporozoit(cs)- 15 proteinet. Monoklone antistoffet dannet mod CS-proteiner neutraliserer infektionsvirkningen in vitro og beskytter dyr in vivo. CS-proteinet synes at være kraftigt evolutionært bevaret inden for arter, men varierer en.- del fra art til art. Man kender. fire Plasmodiumarter, der inficerer mennesker. 20 Disse er - P. falciparum, P. vivax, P. ovale og P. malariae. De to sidstnævnte optræder meget sjældnere. Andre arter af videnskabelig interesse er P. berghei og P. knowlesi. Værterne for disse arter er henholdsvis gnavere og aber. CS-proteinet fra P. knowlesi omfatter tolv tandemgentagelser 25 af en sekvens på tolv aminosyrer. Zavala et al., J. Exp. Med., bind 157, side 1947 (1983) anfører, at gentagelsesenheden er det vigtigste immunogen på P. knowlesi-cs-proteinet, hvilket baseres på forsøg, der viser, at monoklone antistoffer mod gentagelsesenheden blokerede anti-sporozoitantiseras adgang 30 til opløseliggjort sporozoitprotein. Gysin et al., J. Exp. Med., bind 160, side 935 (1984), anfører, at et syntetisk peptid med 24 led, og som repræsenterer tandemgentagelsesenheder fra P. knowlesi-cs-proteinet, neutraliserede virulente sporozoiters infektionsvirkning i aber.

3 2 Colman et al., WO A, publiceret 2. august 1984, beskriver kloning af en del af den region, der koder for P. knowlesi-cs-protein-gentagelsesenheden og ekspression af 8-lactamase- og 8-galactosidasefusioner deraf i E. coli. Nussenzweig 5 et al., US beskriver et sporozoitprotein, der benævnes som P44-proteinet, og dets kloning og ekspression i E. coli. Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 81, side 7520 (1984) beskriver en analog gentagelsesenhedsstruktur i CS-pro- 10 teinet fra P. cynomologi. Kemp et al., WO A, beskriver kloning og ekspression af P. falciparum cdna i E. coli. I fig. 2a-b beskrives syntetiske peptider med sekvensen Glu-Glu-Asn-Val 19 gange. Dame et al., Science, bind 225, side (1984), beskriver kloning 15 og ekspression af CS-proteinet fra P. falciparum i E. coli. Proteinet beskrives som omfattende ca. 412 aminosyrer med en omtrentlig molekylvægt på Det indeholder 41 tandemgentagelser af et tetrapeptid, hvoraf de 37 er Asn-Ala-Asn-Pro, og de sidste 4 er Asn-Val-Asp-Pro. Syntetiske peptider med 2, 3 og 4 gentagelser af Asn-Val-Asp-Pro er 20 også beskrevet. Syntetiske peptider med 7, 11 og 15 led, og som er afledt af gentagelsesregionen, bandt til monoklone antistoffer, der er dannet mod CS-proteinet. Endelig beskrives i Science, bind 225 (1984), side , en aminosyresekvens med Pro-Asn-Asn-Asn gentaget 23 gange, og det omhandlede 25 polypeptid anvendes i en malariavaccine. Den foreliggende opfindelse angår specifikke fusionspolypeptider, hvis fremstilling er illustreret i de efterfølgende eksempler, og som ikke kendes fra den ovenfor omtalte kendte teknik. De omhandlede specifikke fusionspolypeptider udmærker sig ved deres høje ekspressionshastighed, 30 der ikke kunne forudses på baggrund af kendskab til den hidtil kendte

4 3 teknik. FusionsPolypeptidet ifølge opfindelsen omfatter tandemgentagelsesen- heder af et P. falciparum-circumsporozoitprotein (-CS-protein) og en ikke-cs-protein-gentagelsessekvens og er kendetegnet ved, at ikke-cs- 5 protein-gentagelsessekvenserne er valgt blandt: Gly; Leu-Arg; influenzavirus-ustruktureret protein i (NS1); 81 N-terminale aminosyrer af NS1; Asn-Thr-Val-Ser-Ser; 86 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet 86 ); og 32 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet 32 ), samt yderligere 10 kendetegnet ved, at tandemgentagelsesenhederne omfatter: [(Asn-Ala-Asn-Pro) is (Asn-Val-Asp-Pro) i ] n, hvori n a 1. Polypeptidet ifølge opfindelsen kan bibringe pattedyr immunitet mod infektion forårsaget af Plasmodium falciparum. Opfindelsen angår endvidere en vaccine til beskyttelse af mennesker mod 15 infektioii med Plasmodium falciparum-sporozoit, hvilken vaccine er ejendommelig ved, at den omfatter en immunbeskyttende mængde polypeptid ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer. Endelige angår opfindelsen det omhandlede polypeptids anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat mod malaria, herunder en 20 vaccine mod malaria. På tegningen viser fig. la en del af et restriktionsendonukleasekløvningskort for en region i det genome DNA fra P. falciparum, som indeholder den sekvens, der koder for CS-proteinet, og

5 4 fig. 1b en del af restriktionsendonukleasekløvningskortet for pas1. Polypeptidet ifølge opfindelsen omfatter fire eller flere tandem-cs-proteingentagelsesenheder dannet i E. coli. Det er ikke CS-proteinet, selvom det kan omfatte andre dele af 5 CS-proteinet end gentagelsesenheden. P. falciparumgentagelsesenheden er et tetrapeptid med følgende sekvens: asparagin(asn)-alanin(ala)-asn-prolin(pro)-. I polypeptidet ifølge opfindelsen kan der forekomme variation af tetrapeptidet, forudsat at dette ikke på uhensigts- 10 mæssig måde signifikant påvirker reaktiviteten af antistoffer derimod med P. falciparum-cs-proteinet. Som beskrevet af Dame et al., Science, bind 225, side 593 (1984), som skal anses for inkorporeret i den foreliggende tekst ved henvisningen hertil, er f.eks. 37 af de 41 tetrapeptidgentagelser i det 15 naturligt forekommende P. falciparum-:cs-protein asn-ala-asn-pro, og 4 af dem er asn-valin (val)-asparaginsyre(asp.)-pro. Det foretrækkes, at mere end halvdelen af tetrapeptidgentagelsesenhederne i polypeptidet ifølge opfindelsen er den såkaldte consensussekvens, asn-ala-asn-pro. 20 Polypeptidet ifølge opfindelsen omfatter fortrinsvis ca. 8 gentagelser, dvs. 32 aminosyrer, op til ca. 148 gentagelser. Polypeptidet indeholder særligt fordelagtigt fra ca. 16 til ca. 112 gentagelser. Polypptidet ifølge opfindelsen kan være et hybrid, dvs. et 25 fusionspolypeptid med ikke-cs-proteingentagelsesenhedssekvenser. En sådan ikke-cs-proteingentagelsessekvens kan tjene som bæremolekyle til forøgelse af immunogeniciteten eller til lettelse af kloning og ekspression i rekombinante mikroorganismer. En sådan yderligere sekvens kan alternativt bære en 30 eller flere epitoper for andre sporozoitimmunogener, andre

6 5 5 Plasmodium-immunogener og/eller andre ikke-plasmodium-immunogener. Opfindelsen omfatter specielt ikke-cs-proteinet, som har vist sig ikke at blive stabilt udtrykt i anvendelige mængder i E. coli og ikke at være nødvendig til immunisering mod P. falciparum. Specifikke udførelsesformer for typer af polypeptider ifølge opfindelsen, der er eksemplificeret heri, er; 10 Rtet 32 -polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med ca. 32 N-terminale aminosyrer fra tetracyklinresistens(tetr)- genet i pbr322, sammensluttet til gentagelsernes C-ende, Rtet 86 -polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med 15 et tetr-genprodukt, sammensluttet til gentagelsernes C-ende, RNS1-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med de 227 aminosyrer fra NS1, sammensluttet til gentagelsernes C-ende, 20 NS1R-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med 81 --" N-terminale aminosyrer fra NS1, sammensluttet til gentagelsernes N-ende, RG-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser'efterfulgt 25 af en -glycinrest ved gentagelsernes C-ende, RLA-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser efterfulgt af -leucin-argininrester ved gentagelsernes C-ende, og 30 RN-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser efterfulgt af -asn-thr-val-ser-ser ved gentagelsernes C-ende. En genetisk kodningssekvens for CS-proteingentagelsesenhederne kan opnås ved hjælp af kendte teknikker. Disse omfatter 35 syntese og fortrinsvis opnåelse ud fra P. falciparum ved omvendt transskription af mrna, som beskrevet f.eks. af Ellis et al.,

7 Nature, bind 302, side 536 (1983), eller ved direkte kloning af det intakte gen fra genomt P. falciparum-dna, som beskrevet f.eks. af Dame et al., der tidligere er omtalt. Figurerne illustrerer CS-proteinkodningsregionen. P. falciparum og sporozoiter deraf kan opnås fra inficerede mennesker og myg. Efter at have klonet kodningssekvensen for hele eller en del af CS-proteinet, kan et underfragment deraf, der koder for hele eller en del af gentagelsesenheden, fremstilles ved hjælp af kendte teknikker. Fig. la viser valgte tilgængelige restriktionsteder i CS-proteingenet. Foretrukne steder er XhoII-stederne. Skæring med XhoII frigør en kodningssekvens for 16 gentagelser som følger: 15 N-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)15(asn-val-asp-pro)1]nC, 20 hvori n er 1. Anvendelsen af flere tandem-xhoii-fragmenter, orienteret rigtigt, resulterer i længere gentagelser, dvs. n er større end en. Synteseteknikker er velkendte og kan gennemføres ved anvendelse af kommercielt tilgængelige DNA-syntetiseringsmidler. Et syntetisk oligonukleotid med codoner for i alt væsentligt de samme aminosyrer og med de samme XhoII-ender erlr forskel- 25 lige kløvningssteder ved enderne kan syntetiseres. Sådanne syntetiske oligonukleotider kan afvige fra de naturlige 64 codoner og kan kode for de samme aminosyrer eller for et polypeptid med et ringere antal, fortrinsvis færre end ca. 8 forskellige aminosyrer, forudsat at disse ikke-på uhensigtsmæssig 30 måde signifikant påvirker polypeptidets immunobeskyttelsesevne. Et eksempel på en syntetisk kodende sekvens koder fuldstændigt for consensussekvensen (asn-ala-asn-pro) n, hvori n er mindst 4. Kodningssekvensen for polypeptidet kan indføres i en hvilken 35 som helst E. coli-ekspressionsvektor, hvoraf mange kendes

8 og er tilgængelige. Det høje ekspressionsniveau af polypeptiderne ifølge opfindelsen i E. coli er overraskende, når henses til den usædvanlige aminosyresammensætning i produktet - ca. 50% asparagin (asn), 25% alanin (ala) og 25% prolin (pro). Som beskrevet nærmere nedenfor har det vist sig, at kodnings- sekvensen udtrykkes godt under anvendelse af et regulerende element, som omfatter PL-promotoren fra lambda og cii-ribosombindingsstedet fra lambda, som omfattet af plasmid pasl beskrevet af Rosenberg et al., Meth. Enzym., bind.101, side 123 (1983) og Shatzman et al., i Experimental Manipulation of Gene Expression, udgivet af M. Inouye, Academic Press, New York, pas1 bærer pbr322-replikationsoriginet, en ampicillinresistensmarkør og en række fragmenter fra lambda, inklusive PL, N-antitermineringsfunktionsgenkendelsessteder 15 (NutL og NutR), det rho-afhængige transskriptionstermineringssignal (trl) og cii-ribosombindingsstedet, inklusive cii-translationsinitieringsstedet, hvis G-rest efterfølges umiddelbart af et BamHI-kløvningssted. pasl kan afledes af pkc3ocii ved at fjerne nukleotider mellem BamHI-stedet ved cii-pbr322-sam- 20 menfø - jningsstedet af pkc3ocii og cii-atg og-genligering af molekylet til gendannelse af BamHI-stedet umiddelbart nedstrøms for ATG. pkc3ocii opbygges ved at indføje et 1,3 kb Haellifragment fra lambda, som bærer cii-genet i pkc30's HpaI-sted. Se Shatzman et al., der er nævnt ovenfor, og Rosenberg et 25 al., der er nævnt ovenfor. pkc30 er beskrevet af Shimitake et al., Nature, bind 292, side 128 (1981). Det er et pbr322- derivat med et 2,4 kb HindIII-BamHI-fragment af lambda indsat mellem HindIII- og BamHI-stedet i pbr322's tetr-gen. En konstruktion svarende til pas1 er beskrevet af Courtney et al., 30 Nature, bind 313, side 149 (1985). pas1 blev deponeret i Ameri 2- can Type Culture Collection, Rockville, Maryland under assessionsnummer ATCC i overensstemmelse med Budapest-trak- tatens bestemmelser. Den kodende sekvens bindes operativt, dvs. i korrekt orientering og i korrekt læseramme, til et 35 regulerende element af en E. coli-ekspressionsvektor ved hjælp af standardteknikker for at opbygge en ekspressionsvektor ifølge opfindelsen.

9 8 Det således udtrykte polypeptid isoleres og oprenses fra den producerende kultur ved hjælp af standardproteinisoleringsteknikker, hvoraf mange er velkendte i teknikken. Eksempelvis omfatter et anvendeligt oprensningsskema 1) sprængning af 5 celler, 2) klaring af cellerester, 3) adskillelse af polypeptiderne ifølge opfindelsen fra andre polypeptider, som findes i den klarede celleekstrakt og 4) endelig rensning til fjernelse af resterende forureninger, herunder rester af polypeptider, carbohydrater, nukleinsyrer og/eller lipo- 10 polysaccharider. Det første trin kan udføres f.eks. ved tilsætning af lysozym eller et andet lyserende eller permeabiliserende middel eller ved mekanisk eller ultralydssprængning. Før centrifugering 15 eller filtrering for at klare ekstrakten tilsættes et overfladeaktivt middel for at holde polypeptidet ifølge opfindelsen opløst. I forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist 20 sig, at nogle af polypeptiderne ifølge opfindelsen meget effek- - tivt kan skilles fra andre polypeptider ved opvarmning af den klarede ekstrakt til ca. 80 C efter tilsætning af et overfladeaktivt middel til bevarelse af proteinets opløselighed. Opvarmning til 80 C i mindst ca. 4 minutter viste sigat be- 25 virke udfældning af næsten alle bakterielle polypeptider uden denaturering af polypeptider, som overvejende omfattede gentagelserne, eller gentagelserne knyttet sammen med andre ikke- varmedenaturerbare sekvenser. De denaturerede bakterielle polypeptider kan btindfældes ved centrifugering og fjernes. 30 Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at rense Rtet 32 -, RG-, RLA- og Rtet 86 -polypeptider. Denne fremgangsmåde blev især anvendt til med held at rense R16tet 32, R32tet 32, R48tet 32, R64tet 32, R48G, R32LA og R16tet 86, som beskrevet i de efterfølgende eksempler, men opvarmning af R16NS1 og R32NS1 resul- 35 terede i udfældning af disse polypeptider.

10 9 5 Polypeptidet ifølge opfindelsen kan renses yderligere, f.eks. ved tilsætning af et selektivt fældningsmiddel efterfulgt af et afsluttende kromatografitrin, såsom ionbytningskromato-. grafi eller højtryksvæskekromatografi med omvendt fase. I vaccinen ifølge opfindelsen kan en vandig opløsning af polypeptidet ifølge opfindelsen, fortrinsvis pufret til fysiologisk ph-værdi, anvendes direkte. Alternativt kan polypeptidet med eller uden forudgående frysetørring iblandes eller adsorberes 10 med et hvilket som helst af de forskellige kendte hjælpestoffer. Sådanne hjælpestoffer omfatter blandt andet aluminiumhydroxid, muramyldipeptid og saponiner, såsom Quil A. Som endnu et alternativt eksempel kan polypeptidet indkapsles - til mikropartikler, såsom liposomer. Som endnu et alternativt eksempel kan poly- 15 peptidet konjugeres til et immunostimulerende makromolekyle, såsom dræbt Bordetella eller tetanus toxoid. Vaccinefremstilling er beskrevet generelt i New Trends and Developments i Vaccines, udgivet af Voller et al., University 20 Park Press, Baltimore, Maryland, USA, Indkapsling i liposomer er beskrevet f.eks. af Fullerton, US-patent Konjugering af proteiner til makromolekyler er f.eks. beskrevet af Likhite, US-patent og af Armor et al., US-patent Anvendelse af Quil A er beskrevet af Dalågaard 25 et al., Acta. Vet. Scand., bind 18, side 349 (1977). Den i hver vaccinedosis indgående polypeptidmængde vælges som en mængde, der fremkalder en immunobeskttende reaktion uden signifikante uhensigtsmæssige bivirkninger i typiske 30 vaccinerede individer. En sådan mængde vil variere i afhængighed af det specielt anvendte polypeptid, og af hvorvidt vaccinen er tilsat hjælpestof eller ej. Almindeligvis forventes det, at hver dosis vil omfatte ug polypeptid, fortrinsvis ug. En optimal mængde til en bestemt vaccine kan be- 35 stemmes ved hjælp af standardundersøgelser, der omfatter observation af antistoftitre og andre reaktioner i patienter.

11 10 Efter en indledende vaccination vil patienter fortrinsvis få en ny vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået immunitet efter ca. 4 ugers forløb efterfulgt af en ny vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået 5 immunitet hver sjette måned, så længe der eksisterer risiko for infektion. De følgende eksempler tjener til belysning af opfindelsen. Den CS-proteinkodende sekvens blev leveret af James Weber, Walter 10 Reed Array Institute for Research som et 2337 bp EcoRI-fragment (se fig. la) af XmPF1 (Dame et al., som nævnt ovenfor) på EcoRIstedet i puc8, en standard E. coli-kloningsvektor (der kan fås f.eks. fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Det resulterende puc8-derivat kaldes puc8-klon EKSEMPLER Eksempel 1 20 CS-proteinderivat Renset plasmid-dna fra puc8-klon 1 plasmid-dna (40 mg) blev fordøjet med restriktionsendonukleaser Stul og Rsår (100 enheder 25 af hvert enzym) i 400 pl mediumpuffer (50 mm Tris, ph 7,5, 50 mm NaC1, 1 mm dithiothreitol (DTT), 10 mm MgC1 2 ) i 1 1/2 time ved 37 C. Det resulterende fragment på 1216 basepar, der koder for hele CS-proteinet, bortset fra de første 18 aminosyrer, blev isoleret ved elektroforene på en 5% poly- 30 acrylamidgel (PAGE). Ekspressionsvektor pas1 (10 ug) blev fordøjet med restriktionsendonuklease BamHI (25 enheder) i 200 ul mediumpuffer i 1 1/2 time ved 37 C. Det kløvede plasmid blev derpå behandlet med et stort DNA-polymerasefragment (Klenow, 5 enheder; 20 mm Tris-HC1, ph 7,5, 7 mm MgC1 2, 60 mm 35 NaC1, 6 mm 2-mercaptoethanol og 0,25 mm af hvert af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 25 C, 15 minutter) for at endeopfylde BamHI-stedet. CSgenfragmentet (1 ug) blev derpå ligeret

12 i denne vektor (100 ng) i 30 pl ligasepuffer (50 mm Tris, ph 7,5, 1 mm DTT, 10 mm MgC1 2, 100 pm ratp) med en enhed T4-DNA- ligase i 16 timer ved 4 C. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. colistamme MM294CI+, og der blev opnået ampicillin-resistente kolonier, der blev undersøgt for indfø- jelse af CS-genfragmentet i pas1. Et plasmid med den korrekte opbygning (pcsp) blev identificeret og blev transformeret ind i E. coli-stamme N5151 (cits857) og undersøgt for ekspression af CS-protein i fuld længde. (Udeladelsen af de 18 aminosyrer ved proteinets aminoende ville svare til et kløvet signalpeptid af det autentiske CS-protein). Celler blev dyrket i Luria-Bertani-suppe (LB) ved 32 C til en absorbans ved 650 nm (A650) på 0,6, og temperaturinduceret ved 42 C i 2 timer for at starte transskription af ekspressionsplasmidets PL-pro- 15 motor og efterfølgende translation af CS-proteinderivatet. Cellerne blev udtaget i 1 ml prøver, bundfældet ved centrifugering,. suspenderet igen i lyseringspuffer (10 mm Tris-HC1, ph 7,8, 25% (volumen/volumen) glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% bromphenylblåt) og inkuberet 20 i en 105 C varmeblok i 5 minutter. Proteiner blev adskilt ved hjælp af SDS-PAGE (13% acrylamid, 30:0,8 acrylamid:bis-acrylamid). Proteiner blev overført til nitrocellulose, og det i E. coli dannede CS-protein blev påvist ved hjælp af westernaftryks-analyse under anvendelse af en blanding af tem monoklone 25 antistoffer, som reagerer med P. falciparum CS-proteinets tetrapeptidgentagelsesområde. (Dame et al., der tidligere er nævnt). 30 Eksempel 2 R16tet 86. Renset plasmid-dna fra puc8-klon 1 (100 ug) blev fordøjet med restriktionsendonuklease XhoII (40 enheder) i 400 pl medium- 35 puffer ved 37 C i 16 timer. Et fragment på 192 basepar, der koder for 16 tetrapeptidgentagelser af CS-proteinet, blev derpå isoleret ved hjælp af PAGE. Ekspressionsvektor pas1

13 12 blev kløvet med restriktionsendonuklease BamHI, som beskrevet i eksempel 1. XhoII-fragmentet på 192 basepar (1 ug) blev ligeret på BamHI-stedet af pas1 (100 ng), som beskrevet i eksempel 1. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. 5 colistamme MM294CI+. Der blev identificeret en klon, som indeholdt et enkelt XhoII-fragment med 192 basepar med korrekt orientering i pasl's BamHI-sted ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforeseanalyse af et BamHI-HindII-fragment af plas- midet, idet HindII-stedet er nedstrøms for tetr-genet, og 10 idet BamHIstedet er ved sammenføjningen af cii-atg og det indsatte stykke i korrekt orienterede plasmider. Dette plasmid prl6tet86 kan belyses på følgende måde: 15 pbr322 PL gentagelse tetr S pbr322 BH B B hvori BH angiver et BamHI-sted, B angiver et BanII-sted og S en termineringscodon. prl6tet 86 blev anvendt til at trans- formere E. coli-stamme N5151 (cits857) og undersøgt for dannelsen af CS -proteintetrapeptidgentagelsen ved hjælp af western-aftrykningsanalyse. Det således dannede protein havde følgende sekvens: N-met-asp-pro(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro) 1 T86-C hvori T86 var 86 aminosyrer afledt af tetracyklinresistensgenet, der findes på pas1. Den N-terminale methionin(met)rest stammede også fra vektoren, nærmere betegnet fra cii-proteininitieringscodonen. Eksempel 2a R32tet 86 og R48tet Renset prl6tet 86 -plasmid-dna (10 pg) blev fordøjet med 25 enheder BamHI i 200 ul mediumpuffer i 2 timer ved 37 C. 100 ng

14 13 af dette DNA blev derpå ligeret med 1 ug af det ovenfor beskrevne XhoII-fragment med 192 basepar. Plasmidekspressionsvektorer, pr32tet 86 og pr48tet 86, der koder for de følgende polypeptider, blev fremstillet og udtrykt i E. coli. 5 N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 -(asn-val-asp-pro) 1 ] n-t86-c hvori n er 2 (R32tet 86 ) eller n er 3 (R48tet 86 ). pasl-kloner, hvori n var 2 eller 3, blev valgt blandt kloner, hvori n var 10 forskellig fra henholdvis 2 eller 3, som beskrevet ovenfor. Alle de undersøgte kloner havde det indsatte stykke i korrekt 15 orientering. Både R32tet 86 og R48tet 86 blev udtrykt til omtrent den samme grad som R16tet 86, hvilket blev bestemt ved hjælp af immunoaftryk. Immunoaftryksanalyse af adskillige af Rtet 86 -proteinerne af- slørede et heterogent sæt af produkter, som ikke kunne ses med Coomassie Brilliant Blue R-250-farvning. Disse proteiner viste sig at have akkumuleret til ca. halvdelen af de nedenfor 20 beskrevne mængder af Rtet 32 -polypeptiderne.-det viste sig, 25 at størrelserne af de mindste nedbrydningsprodukter var propor- tionale med antallet af tetrapeptidgentagelser i klonerne. Disse proteiners manglende stabilitet kan skyldes nedbrydning af den heterologe COOH-endehale. Eksempel 3 R16tet Renset prl6tet 86 -DNA (10 ug) blev skåret med 25 enheder restrik- tionsendonuklease BanII i mediumpuffer i 2 timer ved 37 C. 100 ng af det skårne DNA blev derpå sammenføjet ved ligering. Denne manipulation resulterede i fjernelse af et BanII-fragment med 14 basepar og dannede en afslutningscodon 35 umiddelbart nedstrøms for det tilbageblevnebanii-kløvnings- punkt. Det resulterende plasmid, prl6tet 32, blev anvendt til

15 14 at udtrykke R16tet 32 i E. coli-stamme N5151, og R16tet 32 blev renset derfra. 30 g (våd vægt) E. coli, der indeholder R16tet 32, blev suspenderet igen i 200 ml puffer A (50 mm Tris-HC1, ph 8,0, 2 mm ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,1 mm dithio- 5 threitol, 5% (vol/vol) glycerol). Lysozym blev tilsat til en slutkoncentration på 0,2 mg/ml, og blandingen inkuberet på is i 30 minutter til lysering af celler. Blandingen blev derpå behandlet i en Waring-blender i 30 minutter ved den høje hastighed efterfulgt af lydbehandling i 1 minut med et 10 Branson 350 lydbehandlingsapparat til skæring af bakterielt DNA. Natriumdeoxycholat blev tilsat til en slutkoncentration på 0,1% (vægt/volumen), og denne blanding blev omrørt i 30 minutter ved 4 C. Suspensionen blev derpå centrifugeret ved x g i 30 minutter til fjernelse af celleaffald. Super- 15 natanten blev opsamlet i en kolbe, inkuberet i et kogende vandbad i 10 minutter og centrifugeret ved x g i 30 minutter. Det viste sig, at næsten alle E. coli-proteinerne udfældedes under opvarmningstrinnet og bundfældedes under centrifugeringen, hvorimod R16tet 32 -proteinet var opløseligt 20 og var indeholdt i supernatanten. Supernatanten blev opsamlet og ammoniumsulfat derpå langsomt tilsat til en slutkoncentration på 20% mætning. Dette resulterede i selektiv udfældning af R16tet 32 -proteinet, som derpå blev opsamlet ved centrifugering ( x g i 30 minutter). På dette tid4iinkt var 25 R16tet 32 -proteinet mere end ca. 95% rent med hensyn til andre forurenende bakterielle proteiner. Et sidste kromatografisk trin (f.eks. ionbytning, højtryksvæskekromatografi med omvendt fase, phenylsepharosekromatografi, 30 størrelsesseparering etc.) kan derpå gennemføres til fjernelse af resterende forurening med andre stoffer, såsom proteiner, carbohydrater, nukleinsyrer eller lipopolysaccharider. R16tet 32 blev udtrykt og renset ved koncentrationer omtrent svarende til 5% af det samlede E. coli-protein, dvs. ca mg/l, 35 påvist ved hjælp af Coomassie Blue-farvning.

16 15 R16tet 32 havde følgende sekvens: N7met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro) 1 ] nt32-c 5 hvori n er en, og T32 er 32 aminosyrer, afledt af tetracyklinresistentsgenet. T32 har nærmere bestemt følgende sekvens: -leu-arg-arg-thr-his-arg-gly-arg-his-his-arg-arg-his-arg-cys -gly-cys-trp-arg-leu-tyr-arg-arg-his-his-arg-trp-gly-arg-ser 1 0 -gly-ser-c idet det resterende BanII-kløvningspunkt er mellem resterne 30 og Eksempel 3AS R32tet 32, R48tet 32. I alt væsentligt som beskrevet ovenfor i eksempel 3 blev 20 R32tet 32 og R48tet 32 (R16tet 32, hvori n er henholdsvis 2 og 3) udtrykt i E. coli og isoleret til samme niveau og renhedsgrad som R16tet 32. Udgangsvektorerne var henholdsvis pr32tet og pr48tet 25 Eksempel 3B R64tet 32, R80tet 32. Renset pr48tet 32 -plasmid-dna (10 lig) blev fordøjet med enheder BamHI i mediumpuff er i 2 timer ved 37 C. 100 ng af dette DNA blev derpå ligeret med 1 lig af XhoII-fragmentet med 192 basepar, som beskrevet ovenfor. Plasmidekspressionsvektorer, der koder for de følgende polypeptider, blev fremstillet og udtrykt i E. coli. 35

17 16 N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro) 1 ] n-t32-c hvori n er 4 (R64tet ), eller n er 5 (R80tet ). pasl-kloner, hvori n var 4 eller 5, blev valgt blandt kloner, hvori n er forskellig fra henholdsvis 4 eller 5, som beskrevet ovenfor. Både R64tet 32 og R80tet 32 udtryktes ved omtrent de samme niveauer som R48tet 32. R64tet 32 blev renset i alt væsentligt på samme måde som R16tet 32, R32tet 32 og R48tet 32, som beskrevet ovenfor. Eksempel 3C R96tet 32 og R112tet I alt væsentligt som beskrevet i eksempel 3B ovenfor blev R96tet 32 og R112tet 32 (hvori n er henholdsvis 6 og 7) udtrykt i E. coli ved omtrent de samme niveauer som R48tet 32. Udgangsvektoren var pr8otet Selvom der sås nogen heterogenitet i rensede Rtet 32 -polypep- _ tider ved immunoaftryksanalyse, korrelerede de reaktive hovedformer med båndet, som sås ved proteinfarvning. De ved SDS-PAGE observerede molekylvægte var omtrent dobbelt så store som forventet, selvom hvert af proteinernes vandring V- a.r propor- 25 tional med antallet af tetrapeptidgentagelsesenheder i hver af konstruktionerne. Bestemmelser af aminosyresammensætning foretaget på adskillige Rtet 32 -polypeptider stemte overens med de forventede værdier. 30 Eksempel 4 R16G. pterm blev fremstillet ved at indføje en syntetisk kobler 35 med følgende sekvens:

18 17 5'-GATCCCGGGTGACTGACTGA -3' 3'- GGCCCACTGACTGACTCTAG -5' 5 10 i pas1's BamHI-sted. pas1 (10 ug) blev fordøjet med 25 enheder BamHI. 100 ng af det BamHI-skårne pas1 blev ligeret med 20 ng af den syntetiske kobler, og plasmid pterm blev identificeret med en kobler indføjet i pas1's BamHI-sted. Denne vektor bibeholder BamHI-stedet og resulterer i indføjelse af TGA-termineringscodoner nedstrøms for ATG-initieringscodonen i cii-proteinet i alle tre læserammer. pr16g blev fremstillet ved at indføje det 192 basepar XhoIIfragment fra puc8-klon 1 i pterm's BamHI-punkt, og en klon med et enkelt indsat XhoII-fragment indføjet i den korrekte 15 orientering blev valgt i alt væsentligt som beskrevet tidligere. pr16g blev klonet og udtrykt i E. coli-stamme N5151 i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. 20 R16G har følgende sekvens: N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 - (asn -val -asp-pro) 1 ] n -gly-c 25 hvori n er en. Da dette protein ikke indeholder nogen aromatiske rester, kan det ikke gøres synligt ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue R-250-farvning for at bestemme ekspressionsniveauer kvantitativt. Ved immunoaftrykanalyser med 5 monoklone antistoffer, 30 der er specifikke for CS-proteinet (Dame et al., tidligere 35 citeret) blev niveauerne bestemt til at være ca. 1% af samlet celleprotein i sammenligning med R16tet 32 med hvilket synliggørelse ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue R-250-farvning er mulig.

19 18 Eksempel 4A R32G, R48G, R64G, R8OG og R112G. 5 R32G, R48G, R64G, R8OG og R112G (R16G, hvori n er henholdsvis 2, 3, 4, 5 eller 7) blev udtrykt i E. coli-stamme N5151, som beskrevet i eksempel 4 ovenfor. Disse polypeptider blev udtrykt ved omtrent det samme niveau som R16G. R48G blev renset i alt væsentligt som beskrevet i eksempel Eksempel 5 R16LA og R32LA. 15 pterm2 blev fremstillet ved at indføje en syntetisk kobler med følgende sekvens: 5'-GATCCGCTGCGTT -3' 3'- GCGACGCAACTAG-5' 20 i pasl's BamHI-sted i alt væsentligt som beskrevet i eksempel 4. pterm2 bibeholder BamHI-stedet. Det 192 store basepar XhoIIfragment fra puc8-klon 1 blev indføjet som beskrevet ovenfor. pr16la og pr32la, kloner med henholdsvis et eller td indføjede 25 XhoII-stykker i rigtig orientering, blev valgt i alt væsentligt som beskrevet tidligere. R32LA blev renset i alt væsentligt som beskrevet i eksempel 3. pr16la og pr32la blev klonet og udtrykt i E. coli-stamme N i alt væsentligt som beskrevet tidligere. R16LA og R32LA har følgende sekvens: 35 N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro) 1 ] n-leu-arg-c hvori n er henholdsvis 1 og 2. Det C-terminale leucin og arginin stammer fra den syntetiske kobler i pterm2. R16LA'et blev

20 19 udtrykt med ca. 1% af totalt E. coli-protein, hvorimod R32LA blev udtrykt med ca. 5% af totalt celleprotein. Eksempel 6 5 R16NS1. pas1aeh blev fremstillet ved at fjerne en ikke-essentiel EcoRI- HindIII-region fra pas1's pbr322-origin. 10 mikrogram pas1 blev skåret med EcoRI og HindIII (20 enheder hver) i 200 pl 10 mediumpuffer, behandlet med DNA-polymerase (Klenow), lukket ved ligering og transformeret ind i E. coli i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Der blev identificeret en klon uden det 29 basepar EcoRi-Hindlil-fragment. Et 1236 basepar BamHI- fragment af papr801 (Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 15 USA, bind 80, side 6105 (1983)), som indeholder den influen- zavirus (A/PR/8/34)-NS1-kodende region inde i 881 basepar af virusoprindelse, og 375 basepar af pbr322-oprindelse blev indføjet i BamHI-stedet af pas1aeh. Det resulterende plasmid, pas1aeh/801, udtrykker autentisk NS1 (230 aminosyrer). Dette 20 plasmid bevarer BamHI-stedet mellem cii-translationsstartstedet og den NS1-kodende sekvens pas1aeh/801 (10 ug) blev skåret med EcoRI (20 enheder) og Sall (20 enheder) i 200 pl høj puffer (50 mm Tris-HC1, ph 7,5, 1mM DDT, 10 mm MgC1 2, lo mm NaCl) i 2 timer ved 37 C, behandlet med stort DNA-polymerasefragment (Klenow) og lukket ved ligering i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Der blev isoleret en klon, hvori EcoRI-SalI-regionen på 650 basepar var fjernet. Dette plasmid, pns1aes, udtrykker autentisk NS1. pr1gns1 blev fremstillet ved indføjelse af et 192 basepar XhoII-fragment fra puc8-klon 1 i BamHI-stedet i pns1aes, og kloner med et enkelt XhoII-fragment indsat i passende orientering blev valgt i alt væsentligt som tidligere beskrevet.

21 20 pr16ns1 blev klonet og udtrykt i E. coli, og R16NS1 blev renset i alt væsentligt som beskrevet ovenfor, idet kogningstrinnet blev udeladt. 5 R16NS1 har følgende sekvens: N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro) 1 ] nn227 hvor n er en, og N227 er 227 aminosyrer af NS1-oprindelse R16NS1 i R16NS1-præparatet blev bestemt til at indeholde mere end 80% protein udenkognings- eller ionbytningstrinnet. R16NS1 repræsenterede en særligt overraskende høj andel af totalt cellulært protein, nemlig ca. 25%. Eksempel 6A R32NS1, R48NS1 og R64NS1. 20 R32NS1 (R16NS1, hvori n er 2) blev udtrykt i og renset fra E. coli i alt væsentligt som beskrevet i det ovennævnte eksempel 3, idet kogningstrinnet udelades. R32NS1 blev udtrykt ved omtrent det samme niveau som R16NS1 og renset til omtrent den samme grad R48NS1 (R16NS1, hvori n er 3) og R64NS1 (R16NS1, hvori n er 4) blev udtrykt i E. coli i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. R48NS1 og R64NS1 udtryktes ved henholdvis ca. 10% og 5% af totalt E. coli-protein. Eksempel 7 NS1R48 35 pr48tet 86 blev kløvet med BamHI og suppleret i enden med DNApolymerase (Klenow) i alt væsentligt som beskrevet ovenfor.

22 21 Plasmidet blev derpå kløvet med BanII, som beskrevet ovenfor til frigørelse af et 672 basepar stort fragment, som har 3 XhoII-fragmenter og 96 basepar fra tetracyklinresistensgenet mikrogram pas1eh/801 blev skåret med NcoI (20 enheder) i 200 p1 puffer med høj saltkoncentration i 2 timer ved 37 C og suppleret i enden med et stort DNA-polymerasefragment (Kle- now) i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. NcoI-stedet findes i codonen for rest 81 i NS1. Plasmidet blev dernæst skåret 10 med BanII som beskrevet ovenfor for at fjerne de restende NS1-codoner og en del af tetracyklinresistensgenet til dannelse af pas1aeh/ Det 672 basepar store BamHI (ende-suppleret)-banii-fragment 15 blev indføjet i pas10eh/801-1 til fremstilling af pns1r48. Dette plasmid blev udtrykt i E. coli i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. NS1R48 har følgende sekvens: 20 N-81N-asp-pro[(asn-ala-asn-pro) 15 (asn-val-asp-pro l ] nt32-c hvori 81 N er 81N-terminale aminosyrer fra NS1, n er 3, og T32 har den ovenfor beskrevne betydning. NS1R48 blev udtrykt 25 som ca. 5% af totalt cellulært protein. Eksempel 8 30 R32N 10 mikrogram pr32ns1 blev skåret med HindIII (25 enheder) i 200 pl mediumpuffer i 2 timer ved 37 C og suppleret i enden med DNA-polymerase i alt væsentligt som beskrevet ovenfor til fremstilling af pr32ns1-1. HindIII-stedet findes i codonen 35 for rest 5 i den NS1-kodende region. pr32ns1-1 (100 ng) blev derpå lukket ved ligering i alt væsentligt som beskrevet oven- for. Det resulterende plasmid, pr32n, indeholdt nu en TAA-

23 22 termineringscodon efter den femte codon i den NS1-kodende sekvens. pr32n blev anvendt til at udtrykke R32N i E. coli ialt væsentligt som tidligere beskrevet. 5 R32N har følgende sekvens: N-met -asp -pro[(asn-ala-asn-pro) 15 -(asn-val-asp-pro) 1 ] n-n5-c hvori n er 2, og N5 er 5 aminosyrer, der er afledt af NS1-genet. 10 N5 har nærmere bestemt følgende sekvens: -asn-thr-val-ser-ser-c. R32N blev udtrykt som ca. 5% af totalt E. coli-protein. 15 Eksempel 9 Antistofreaktion - ELISA 20 Rekombinante proteiner R16tet 32, R32tet 32 og R48tet 32 blev renset i alt væsentligt som beskrevet ovenfor, dialyseret mod 0,01 M phosphatpufret saltvand, ph 7,0 (PBS), udtaget i afmålte mængder og lagret ved -80 C. Konstruktioner blev blandet med enten PBS, aluminiumhydroxid (alun) eller Complete 25 Freund's Adjuvant (CFA) til dannelse af en 0,5 ml dosis, der indeholder 50 ug protein. CFA (GIBCO, Grand Island, New York) plus antigen i PBS blev emulgeret i 1:1-forhold ved hvirvling i 30 minutter ved hjælp af et mekanisk vortex-apparat. Alun blev fremstillet af aluminiumhydroxidgel, USP, fortyndet i 30 PBS. Antigen blev absorberet til alun ved 4 C i 12 timer på et roterende blandingsapparat. Suspensionen blev henstillet til bundfældning i yderligere 12 timer, og der blev fjernet tilstrækkeligt supernatant til opnåelse af 0,80 mg Al og 50 ug rekombinant protein per dosis. 6-8 uger gamle C57B1/6-mus 35 blev subkutant og intraperitonealt immuniseret med ialt 50 ug protein (5 dyr per gruppe). Dyrene fik en forstærkerdosis 4 uger efter den primære immunisering under anvendelse af

24 23 5 den samme fremgangsmåde som ved de første injektioner, bortset fra at gruppen, som havde fået immunogenerne i CFA, fik forstærkerdosen med proteiner, der var emulgeret i Incomplete Freund's adjuvant (IFA). En uge senere blev komplet blod, opnået ved blødning fra halerne sammenblandet, størknet natten over ved 4 C og centrifugeret til adskillelse af serumet. Disse sera blev lagret ved -80 C, indtil der var brug for dem. 10 En enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) blev anvendt til afprøvning af alle serumernes evne til at reagere med et syntetisk peptid med 16 aminosyrer og bestående af 4 gentagelser fra P. falciparum CS-proteinet (asn-ala-asn-pro) 4 Dame et al., (Science, bind 225, side 593 (1984)). Syntetisk peptid- 15 antigen blev koblet til bovint serumalbumin. (BSA) og anvendt til at beklæde mikrotiterpladernes brønde. 50 ul (0,1 ug) af screeningsantigenet, fortyndet med 0,01 M phosphatpufret saltvand, ph 7,4 (PBS), blev pipetteret i brønde i polystyrenmikrotitreringsplader (Immunlon 2 Dynatech Laboratories, Alex- 20 andria, VA) og holdt natten over ved stuetemperatur (ca. 22 C) (RT). Indholdet i brøndene blev dernæst luftet, fyldt med blokeringspuffer (BB=1,0% BSA, 0,5% casein, 0,005% thimersol og 0,0005% phenolrødt i PBS) og holdt i en time ved RT. Musesera blev fortyndet i serier i BB, og 50 pi_ blev sat til'hver brønd. 25 Efter 2 timers inkubation ved RT blev brøndene luftet, vasket 3 gange med PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW20), og 50 ug peberrodsperoxidase konjugeret til gedeanti-muse-igg (H+L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) fortyndet 1/500 med 10% varmeinaktiveret humant serum i PBS blev sat til hver brønd. Efter 30 1 times forløb blev brøndenes indhold luftet, vasket 3 gange med PBS-TW20, og substrat (1 mg 2,2'-azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsyre - 6) per ml 0,1 M citrat-phosphatpuffer, ph 4,0 med 0,005% hydrogenperoxid tilsat umiddelbart før brug) blev derpå sat til hver brønd. Absorbansen ved 414 nm blev 35 bestemt 1 time senere med en ELISA-pladelæser (Titertek Multi- skan, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). R16tet 32 -, R32tet32-

25 24 og R48tet 32 -konstruktionerne resulterede alle i dannelse af antistof, som reagerede i ELISA. R16tet 32 var, givet alene, dårligt immunogent i sammenligning med R32tet 32 og R48tet 32. Både alun og CFA forøgede immunogeniteten af alle tre proteiner, 5 og antistof blev bestemt ved titere op til i mindst et system. Eksempel Antistofreaktion - IFA Antiserumerne fra eksempel 9 viste sig at reagere kraftigt med autentisk P. falciparum CS-protein, hvilket blev afprøvet i en indirekte immunofluorescent antistofanalyse (IFA). Reak- 15 tivitet mod P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva og P. galli- naceum blev ikke påvist. Der sås en ringe reaktivitet af antiserumerne over for R32tet 32 med P. berghei. Denne observation stemmer overens med tidligere data fra Hockmeyer et al. i Proc. 3d Int'l. Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, udgivet 20 af Atassi, M.Z., Plenum New York (in press); som viste, at nogle Mabs over for P. falciparum reagerer med P. berghei-sporozoiter ved IFA. Sporozoiter blev dissekeret fra inficerede mygs spytkirtler 25 i alt væsentligt som beskrevet af Bosworth, J. Parasitol., bind 61, side 769 (1975), fortyndet i saltvand eller medium 199 (GIBCO) indeholdende 0,5% BSA, talt under anvendelse af et hæmacytometer og fortyndet til sporozoiter per 10 p1. Prøver på 10 ul blev fordelt på hver brønd i multi- 30 brøndtrykte IFA-slæder, lufttørret ved stuetemperatur og lagret ved -80 C. IFA'erne blev igangsat ved fordeling af 20 pl volumener serumer, fortyndet 1/100 med BB, på en IFA-slædes brønd indeholdende 35 tørrede sporozoiter. Efter 20 minutters inkubation i et fugtigt kammer ved RT blev serumopløsningerne luftet, og pletterne blev vasket med 2 dråber PBS. 20 pl prøver indeholdende gede-

26 25 5 anti-museantistof konjugeret med fluoresceinisothiocyanat (Kirkegard og Perry, Gaithersburg, MD), fortyndet 1:40 med 1313_, blev derpå sat til hver plet. Efter endnu 20 minutters inkubation ved RT blev pletterne vasket igen med 2 dråber PBS, monteret i glycerol og undersøgt for fluorescens under ultraviolet lys under ved en forstørrelse på 500 gange. Eksempel CSP-reaktion Sera fra mus, der var immuniseret med R16tet 32, R32tet 32 og R48tet 32, gav kraftige CSP-positive reaktioner (tabel 1). Det var kun R16tet 32, som, når det anvendtes uden hjælpestof, 15 ikke dannede antistof, som gav positive CPS-reaktioner, hvorimod alle tre konstruktioner, når de blev anvendt sammen med CFA eller alun, fremkaldte antistoffer, som bevirkede kraftige CSP-reaktioner. 20 TABEL 1 CSP-reaktivitet af antisera over for R16tet 32, R48tet 32. R32tet 32 og 25 HJÆLPESTOF Antisera R16tet 32 R32tet 32 R48tet 32 INTET 0/25(-) 17/25(2+) 21/25(4+) 30 CFA 23/25(4+) 21/25(4+) 21/25(4+) ALUN 25/25(4+) 25/25(4+) 16/27(2+-4+) 35 CSP-reaktioner blev gennemført i alt væsentligt som beskrevet af Vanderberg et al. mil. Med. bind 134 (Supp. 1), side 1183

27 26 (1969). 5 mikroliter, der indeholder P. falciparummyggespytkirtelsporozoiter, resuspenderet i medium 199, blev blandet med 5 Til serum på et mikroskopobjektglas, forseglet under et dækglas, indrammet med vaseline og inkuberet ved 5 37 C i 1 time. Reaktionerne blev vurderet ved hjælp af fasekontrastmikroskopi ved en forstørrelse på 400 gange. 25 tilfældige sporozoiter blev undersøgt for hver serumprøve, og antallet af CSP-positive organismer er angivet. CSP-reaktivitetsgraden, som beskrevet af Vanderberg et al., som er nævnt 10 ovenfor, er vist i parenteser. (-) viser, at der ikke kunne påvises nogen CSP-reaktivitet. (2+) viser forekomsten af et granulært bundfald på sporozoiternes overflade. (4+) viser forekomsten af et langt trådlignende filament i sporozoiternes ene ende. Normalt museserum og serum fra mus, der er immuni- 15 seret med CFA alene, gav ikke nogen påviselig CSP-reaktivitet i parallelle forsøg. Eksempel Hepatocytblokering Serumerne fra det ovennævnte eksempel 9 blev undersøgt ved en in vitro-hæmning af invasionsprøve (tabel 2). Disse data viser, at R32tet 32 - og R48tet 32 -proteinerne fremkalder anti- 25 stoffer med kraftig blokeringsvirkning selv uden nærværelse af hjælpestof. R16tet 32 var mindre effektivt med hensyn til at udvikle kraftigt blokerende antistoffer, bortset fra når de blev givet adsorberet til alun. Dette resultat stemmer overens med den ringe CSP-reaktivitet og de lave ELISA-titere, 30 som blev konstateret med de antistoffer, som blev dannet imod R16tet 32 -proteinet. 35

28 27 TABEL 2 Hæmning af P. falciparum-sporozoit-invasion HepG2-A16 Hepatomaceller in vitro. 5 Antisera HJÆLPESTOF R16 R32 R48 10 INGEN CFA ALUN Inhibering af sporozoit-invasion af dyrkede celler blev udført 15 i alt væsentligt som tidligere beskrevet af Hollingdale et al. J. Immunol. bind 32, side 909 (1984). De sera, som blev opnået fra mus, der er immuniseret med R16tet 32 -, R32tet 32 og R48tet 32 -konstruktionerne, blev undersøgt for deres evne til at hæmme invasion P. falciparum-sporozoiter i dyrkede celler. Serumerne blev fortyndet i dyrkningmedium og sat til HepG2-A16-cellekulturer til dannelse af en slutfortynding på 1:20 (volumen/volumen). Kulturer fik derpå myggespytkirtel-p. falciparum-sporozoiter og blev. inkuberet ved 37 C i en 5% CO 2 -atmosfære i 3 timer, skyllet med Dulbecco's phosphat-puf ret saltvand (PBS), fikseret i methanol og skyllet 2 gange med PBS Sporozoiterne, som var trængt ind i cellerne, blev gjort synlige ved hjælp af en immunoperoxidase-antistof-analyse (IPA) (Hollingdale et al., beskrevet ovenfor). Immunoperoxidaseantistofreaktionen blev gennemført ved først at behandle de fikserede kulturer med en Mab til P. falciparum (2F1.1, se Dame et al., nævnt ovenfor) efterfulgt af inkubation med kaninantimuseimmunoglobulin konjugeret med peberrodperoxidase og farvning med 3,3-diaminobenzidin. Antallet af sporozoiter, som invaderede dyrkede celler blev bestemt ved at tælle de

29 28 5 intracellulære parasitter, som findes i hele præparatet, på et Leitz-mikroskop ved en forstørrelse på 250 gange med et mørkeblåt filter. Forsøgene blev gennemført enten in duplo eller triplo, og hver cellekultur i et forsøg fik det samme antal sporozoiter. Hæmning var den procentiske' reduktion af sporozoitinvasion med anti-konstruktionsimmunsera i sammenligning med normale museserumkontroller, hvor CS-reaktivt Mab 2F1.1 gav 100% hæmning af sporozoitinvasion ved fortyndinger på 1/ Rekombinante proteiner RLA, R16NS1 og R32NS1, i alt væsentligt fremstillet som beskrevet ovenfor, blev på lignende måde undersøgt ved hjælp af ELISA- og IFA-analyserne og viste sig lige- ledes at fremkalde antistof, som reagerede med det 16-led 15 store syntetiske peptid og at give positive CSP-reaktioner. R32tet 32 og R32LA foretrækkes på grund af deres relative homogenitet, ekspressionsniveauer og lette fremstilling. For en hvilken som helst syntetisk fremstillet vaccine er 20 det af største interesse, hvorvidt antistof_ dannet mod det.- syntetiske immunogen vil genkende det autentiske molekyle, og hvorvidt antistoffet vil besidde de nødvendige biologiske egenskaber til kunne fremkalde beskyttelse. Eksemplerne, som viser både en immunofluorescensanalyse og CPS-reaktionen, 25 viser, at antistof dannet mod E. coli-konstruktionerne reagerer med sporozoitoverfladen og-således genkender autentisk CS-protein. Det er blevet påvist, at tilstedeværelsen af CSP-anti- stof i dyr og mennesker har nøje sammenhæng med immunitetsbeskyttelse. Den kendsgerning, at antikonstruktionsantistoffer 30 hæmmer sporozoitinvasion af humane hepatomaceller in vitro, er signifikant. Hollingdale et al., nævnt ovenfor, viste, at både Mohs mod P. falciparum og P. vivax såvel som polyklont serum fra mennesker, der er immune over for disse malariaformer, blokerede sporozoitinvasion. Blokering af sporozoitinvasion 35 in vitro antages således at være en analyse for beskyttende antistof. Dataene viser således sammen, at invasionsvaccinen

30 29 kan anvendes til at beskytte mennesker mod invasion af P. falciparum-sporozoiter. Immunreaktionen over for disse rekombinante proteiner, som 5 er analyseret ved hjælp af ELISA-titer, overfladereaktivitet (som vist ved hjælp af IFA og CPS) og blokering af sporozoitinvasion forøges ved anvendelse af enten Complete Freunds Adjuvant eller Alum. Complete Freunds Adjuvant kan ikke anvendes hos mennesker, da det forårsager feber, fremkalder 10 granulomer og resulterer i tuberkulinhypersensitivitet. Alun anvendes for tiden som et hjælpestof i etablerede vacciner, 15 sker. såsom mod difteritis og tetanustoksoid såvel som i en af de nyeste vacciner, vaccinen mod Hepatitis B. Lang tids brug har vist, at det er effektivt og sikkert til brug hos menne- Eksempel Vaccinefremstilling Et vaccineeksempel fremstilles på følgende måde. Til en pufret vandig opløsning af 3% aluminiumhydroxid (10 mm natriumphosphat, 150 mm NaC1, ph 6,8; steriliseret ved filtrering) sættes polypeptidet ifølge opfindelsen i en lig- 25 nende puffer under omrøring til en slutkoncentration på ug/ml polypeptid og 1,0 mg/ml aluminium (Al 3+ ). ph-værdien holdes på 6,6. Blandingen henstår natten over ved ca. 0 C. Der tilsættes thimersol til en slutkoncentration på 0,005%. ph-værdien kontrolleres og justeres om nødvendigt til 6,8. Selvom ovenstående fuldstændigt beskriver opfindelsen og alle foretrukne udførelsesformer deraf må det forstås, at opfindelsen ikke er begrænset til de heri specielt anførte udførelsesformer, men derimod omfatter alle modifikationer deraf, 35 som falder inden for de efterfølgende patentkravs definition.

31 30 P a t e n t k r a v. 1. Fusionspolypeptid omfattende tandemgentagelsesenheder af et P. faiciparum-circumsporozoitprotein (-CS-protein) og en ikke- 5 CS-protein-gentagelsessekvens, k e n d e t e g n e t ve d, at ikke-cs-protein-gentagelsessekvenserne er valgt blandt: Gly; Leu-Arg; influenzavirus-ustruktureret protein i (NS1); 81 N-terminale aminosyrer af NS1; Asn-Thr-Val-Ser"-Ser; 86 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet 8 _ 10 6 ); og 32 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet 32 ), samt yderligere kendetegnet ved, at tandemgentagelsesenhederne omfatter: [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro) 1 ] n, hvori n z Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro( (Asn-Ala-Asn-Pro) is (Asn- Val-Asp-Pro) 1 i n-tet 86 -C, hvori n a Fusionspolypeptid ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro[Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn- Val-Asp-Pro) i ] n-tet32 -C, hvori n a Polypeptid ifølge krav 3, kendetegnet ved, at tet 32 består af aminosyresekvensen: L eu -Arg -Arg- Thr-Hi s -Arg- Gly -Arg -Hi s -His -Arg-Arg-His -Arg- Cys - Gly- Cys - Trp -Arg- Leu - Tyr-Arg-Arg- Hi s -His -Arg - Trp -Gly -Arg- S er - Gly- Ser- C Fusionspolypeptid ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro) 15 - (Asn-Val-Asp-Pro) 1 1 n-gly-c, hvori n z 1.