Enzymkemi H. C. Ørsted Ungdomslaboratorium Kemisk Institut Københavns Universitet august 2001

Transkript

1 Enzymkemi H.. Ørsted Ungdomslaboratorium Kemisk Institut Københavns Universitet august 2001

2 2 Indholdsfortegnelse Enzymkinetik Indledning...2 Teori:...2 Mekanismen...2 Reaktionshastigheden:...5 Fremgangsmåde:...7 Databehandling...8 Øvelse med Molekyle-viewer...10 Apendiks A. De almindeligt forekommende amminosyrer...12 Indledning Vi skal undersøge to ting. Først udføres en laboratorieøvelse hvor vi undersøger reaktionshastigheden som funktion af substratkoncentrationen for en enzymkatalyseret reaktion. Dernæst ser vi på opbygningen af enzymet og vigtige grupper i det. Dette undersøges ved at arbejde med et computerprogram, hvor man kan se en 3D model af proteiner (på skærmen er det 2D, men når man drejer molekylet får man en 3D fornemmelse). Teori: Mekanismen Enzymer er proteiner, der katalyserer en lang række kemiske processer. De fleste enzymer er meget specifikke i deres virkning. Enzymet trypsin, som vi skal undersøge tilhører gruppen af proteaser, enzymer der kan spalte proteiner. Proteiner er opbygget af polypeptider, lange kæder af aminosyrer typisk aminosyrer, der er bundet sammen med peptidbindinger (det samme som et amid), se Fig. 1. Et protein kan bestå af en kæde eller flere ens eller forskellige kæder sammlet i en kompleks struktur. H 3 H H H 2 H 2 H H 2 H 2 H 2 H H H 2 H Fig. 1. En tegning af tetrapepidet, H 2 N-Alanin-phenylalaninlysin-serin-H. Peptidbindingerne er fremhævet.

3 3 For at kunne sige noget om mekanismen for et proteinspaltende enzym er vi nødt til at se lidt på hvad der sker når peptidbindingen bliver spaltet. Når et amid hydrolyseres bliver der dannet syre + amin, se Fig. 2. Enzymet trypsin kan katalysere denne spaltning. På grund af aminogruppens og syregruppens syre/baseegenskaber vil der ske en proton overførsel fra aminogruppen til syregruppen efter hydrolysen, hvorfor reaktionen er praktisk talt irreversibel. R 3 H H R 1 H H H + H 2 R 2 R 4 R 3 H 2 N + H H H 2 N H H H H R 1 Fig. 2. Spaltning af et tetrapeptid med dannelse af en syre og en amin. R 2 R 4 En lang række studier har givet et bud på mekanismen for spaltningen. Det har vist sig, at det kun er få af proteinets aminosyrer, der er essentielle for selve katalysen. Resten af enzymet tjener som en slags stillads for disse få katalytiske aminosyrer og sørger for, at substratet kan binde til enzymet så den binding, der skal spaltes, er tæt på de essentielle aminosyrer. Det første trin af spaltningen er altså binding af substratet tæt ved det sted hvor enzymet faktisk katalyserer spaltningen. Dette sted kaldes enzymets active site. Selve katalysen sker i to hovedtrin. Første trin er dannelsen af et intermediat (mellemprodukt) bestående af en ester dannet af syregruppen fra substratets amidbinding og en alkoholgruppe fra en aminosyre, serin nr.195 i enzymet, se Fig.3. Den ene del af subtratet bliver altså frigivet, mens den anden del bliver bundet til enzymets serin nr Enzym + H 2 H R 2 R 1 Enzym H 2 R1 + H 2 N Enzym substrat Intermediat Produkt 1 Fig. 3. Fra enzymet er det kun sidekæden fra serin nr. 195 der er vist. Fra substratet er det kun atomerne lige omkring peptidbindingen der er vist. R 1 og R 2 refererer altså ikke til de samme kæder som i Fig. 2. R 2

4 4 Det andet trin af katalysen er en esterhydrolyse. Dette er vist på Fig. 4. Enzym H 2 Enzym + H 2 H 2 H + H R 2 Intermediat Enzym Produkt 2 Fig. 4. Spaltningen af intermediatet. Det ses, at enzymet er blevet gendannet og er klar til at spalte et nyt substrat. R 2 For at gøre katalysen mere effektiv har enzymet to aminosyrer i active site (histidin nr. 57 og asparaginsyre nr. 102), som gør den reaktive serin gruppe mere sur og dermed letter spaltningen af amidbindingen og dannelsen af ester. Histidin og asparaginsyre kan så at sige trække i protonen i alkoholgruppen på serin og dermed hjælpe til at få dannet esteren. På fig. 5 er histidins baseegenskaber vist. Enzym H 2 H N H H N + H + Enzym H 2 H N H H + Fig. 5. En histidin sidekæde reagerer som base, pk a for imidazol gruppen er 6,0-6,5 afhængigt af omgivelserne i proteinet. Hvis histidin gruppen er protoniseret har enzymet en meget mindre katalytisk effekt. Dette vil vi prøve at vise ved at måle aktiviteten som funktion af ph.

5 5 Reaktionshastigheden: Hvordan kan vi sige noget om et enzyms aktivitet? Hvis reaktionen følger et skema som herunder, Fig. 6, kan det udledes, at reaktionshastigheden følger ligningen Fig.7. E + S ES E + P Fig. 6. Det simplest mulige reaktionsskema for en enzymkatalyseret reaktion. e0 kcat v = K m 1+ [] S Fig. 7. Micaelis-Menten ligningen. v er reaktionshastigheden, e 0 er den totale koncentration af enzym, k cat er hastighedskonstanten for omdannelsen af ES E + P, K m er en slags dissociations konstant (den reciprokke af ligevægtskonstanten) for dannelsen af ES komplekset og [S] er koncentrationen af substrat. Betingelserne for, at Michaelis-Menten ligningen gælder er, at der skal være meget højere [S] end e 0 (dette er meget ofte tilfældet) og, at der ikke må være dannet for meget produkt (dette er ikke altid tilfældet). Et mere komplekst system som det her beskrevne for trypsin med et ES-intermediat og to forskellige produkter, vil ofte følge Michaelis-Menten hastighedsudtrykket, der altså ikke kun gælder for skemaet i Fig. 6. K m er stadig et udtryk for hvor godt, substratet bindes til enzymet, jo lavere K m værdi jo bedre binder substratet, og k cat vil være hastighedskonstanten for den hastighedsbestemmende reaktion, altså den langsomste delreaktion, i vores tilfældet er det dannelsen af intermediatet (reaktionen på Fig.3).

6 6 Hvad kan vi så bruge Michaelis-Menten ligningen til? Hvis vi kender størelsen af de to parametre K m og k cat, er vi i stand til at lave en graf over v som funktion af [S], se Fig. 8. Vi kan se af grafen, at hastigheden går mod en maksimalhastighed, V max. Man kan vise, at V max = e 0 k cat. Når reaktionen forløber ved høj [S] forløber den ved V max svarende til at alt enzymet hele tiden er mættet med substrat. Det ses også af figuren, at ved [S]= K m er v = ½ V max. Vmax Hastighed/(nM/sek) /2 Vmax 0 0 Km Fig. 8. [Substrat]/mM Reaktionshastigheden, v som funktion af substratkoncentrationen, [S]. Værdien af V max er 50 nm/sek. og K m er 5 mm. I det forsøg vi skal lave, skal vi bestemme K m og k cat for spaltningen af modelsubstratet BANA (2-N-benzoyl L-arginin 4 -nitroanilid se Fig. 9) katalyseret med enzymet trypsin. Vi bestemmer parametrene ved to forskellige ph værdier. H H 2 HN + H 2 N H 2 H 2 N 2 + H 2 Fig N-benzoyl L-arginin 4 -nitroanilid. Amid bindingerne er markeret med en kraftigere streg. Vi måler på reaktionen ved at følge absorbansen ved 410 nm, idet det dannede 4-nitroanilin absorbere meget mere end substratet ved denne bølgelængde. HN H H H 2 H 2 H 2 + H 2 N + H 2 N N 2

7 7 Fremgangsmåde: Der udføres spektrofotometriske målinger på hydrolyse af BANA katalyseret af trypsin. Der måles på en række forskellige koncentrationer af BANA ved ph = 7.5 og ph = 5.0. Blandingerne af forskellig koncentration laves udfra 2 mm BANA og 0,1 M phosphatbuffer med den aktuelle ph: pløsninger: pløsningerne laves i reagensglas. Sørg for, at der ikke er nogen krystaller i BANA stamopløsningen man kan evt. varme i et glas varmt vand og/eller ryste opløsningen for at fjerne disse. Til at afmåle mængderne bruges finnpipetter: Det er vigtigt, at man ikke bruger dem til andre voluminer end de, der er angivet på siden af dem og pipetterne må ikke vendes på hovedet. Man må ikke bruge den samme pipettespids til forskellige stamopløsninger. Der fremstilles 2 serier af blandinger, en med buffer ph = 7.5 og en med buffer ph = 5.0. På den måde har vi to ens serier med hvert sit ph. Hver serie laves med dobbeltbestemmelse, så der laves 2x6 reagensglas i hver serie. Dertil laves der en ekstra opløsning af [BANA] = 1.93 med ph = 5: [BANA] = 0.17: [BANA] = 0.33: [BANA] = 0.67: [BANA] = 1.00: [BANA] = 1.33: [BANA] = 1.93: 250 µl BANA og 2650 µl buffer. 500 µl BANA og 2400 µl buffer µl BANA og 1900 µl buffer µl BANA og 1400 µl buffer µl BANA og 900 µl buffer µl BANA. Der laves en opstilling, hvor et spektrofotometer af mærket ecil er tilsluttet en computer. Der laves et basislinie skan som beskrevet i vejledningen til apparatet. Målinger ved ph = 7.5: Under ecil 10xx vælges Måling ved en bølgelængde. Bølgelængden sættes til 410 nm, tid pr. måling til 1 sek. og antal af målinger sættes til 90. Til den fremstillede opløsning tilsættes 100 µl ca. 3 µm trypsin (det er vigtigt, at man tilsætter trypsin umiddelbart inden målingen foretages tænk over hvorfor). Derefter rystes der 2 sek. på reagensglasryster og indholdet af reagensglasset overføres til en plast kuvette (rør kun ved den øverste del) som hurtigst muligt placeres i spektrofotometeret og målingen påbegyndes (tryk Mål ). Når målingen er afsluttet vælges Reg og hældningen noteres. Dette gentages med de resterende opløsninger med ph = 7.5.

8 8 Målinger ved ph = 5.0: Under ecil 10xx vælges Måling ved en bølgelængde. Bølgelængden sættes til 410 nm, tid pr måling til 1 sek. og antal af målinger sættes til 120. Ved denne ph er fremgangsmåden den samme, dog laves der først en måling med en trypsin koncentration på 3 µm og [BANA] = Derefter laves samme målings række som ved før bare med en trypsin koncentration på 15.6 µm. Databehandling De noterede hældninger har enheden 1/1000 absorption pr. minut (ma/min). Dette omregnes til mm pr. minut ved at dividere med ekstentionskoefficienten, ε 410 nm = 8500 cm -1 M -1 for p- nitroanilin ved 410 nm, dette følger af Lambert-Beers lov: A = ε l c hvor l er kuvettens længde (1,0 cm) og c er koncentrationen. Programmet Grafit åbnes og under filer vælges åbn og dernæst Enzymkinetik. I det fremkomne skema indtastes de beregnede værdier og de dertil hørende koncentrationer. Når alle værdier er plottet ind ses en fittet kurve til punkterne og de dertil hørende konstanter K m og V max. k cat kan nu beregnes og værdierne ved de to ph kan sammenlignes. Synes du udfra dit kendskab til pk a for histidin, at det er to rimelige værdier?

9 9 Note til læreren: Ud fra litteraturen er det rimeligt at antage, at substratbindingen og dermed K m er upåvirket af histidins protonisering, mens den del af enzymmolekylerne, som får protoniseret His- 57 ikke kan bidrage til katalysen af substratet. Derfor kan hastighedsmålingerne anvendes til at estimere denne histidinrests pk a -værdi. Hele enzymmængden, E 0 er fordelt på His-protoniseret, EH + og His-uprotoniseret, E, [E 0 ] = [EH + ] + [E], så [E] / [E 0 ] = 1 / {1 + ([EH + ] / [E])} Syredissociationskonstant for histidinen, K a er: K a = [E] [H + ] / [EH + ] og altså har vi [E] / [E 0 ] = 1 / { 1 + ([H + ] / K a )} = K a / ([H + ] + K a ) Da maximalhastigheden er et mål for koncentrationen af enzym med uprotoniseret histidin og da målinger mellem ph 7,5 og 8, med samme E 0, giver samme V max (det viser vi ikke), må praktisk taget hele enzymmængden være uprotoniseret i dette ph-område. Vi antager altså ph = 7.5: V max, ph=7,.5 = k cat E 0, ph=7,5 = 1/5 k cat E 0,pH=5,0 (Der ganges med 1/5 da der bruges 5 gange højere [E 0 ] ved ph=5,0) ph = 5: V max, ph=5,0 = k cat E ph=5,0 = k cat E 0, ph=5,0 / {1 + ([H + ] / K a ) }, hvor [H + ] er 10-5 M Division af V max bestemt ved ph 7,5 med V max ved ph 5,0 giver forholdtallet, F: F = V max,ph=7,5 / V max,ph=5,0 = 1/5 ( / K a ) eller K a = 10-5 / (5F-1). pk a = - logk a bør ligge på

10 10 Øvelse med Molekyle-viewer. I skal kigge på trypsin i programmet Raswin (RasMol). Hvis I går frem efter denne plan så får I set nogle detaljer ved enzymet som er væsentlige (nogle af dem er helt generelle for alle proteiner). Det er en god ide at have en blok ved siden af til at tage notater undervejs. Det er også en god ide at have appendiks a ved siden af. Her kan I se alle de almindeligt forekommende aminosyrer og de tre bogstavs forkortelser,der bruges til dem. 1. Først åbnes programmet og under File og open findes trypsin. Maksimer vinduet. 2. Start med at vende og dreje enzymet med musen (hold venstre musetast nede mens du flytter musen). Hvergang I har udført en kommando kan I prøve at dreje enzymet, og se hvad der er sket. 3. Find RasMol ommand Line nede i menubjælken og klik på den. Skriv i command line : background white 4. Skriv i command line : zoom I edit vælges select all. 6. I display vælges de forskellige muligheder der er. Prøv jer frem og giv et bud på, hvad der er fordele ved de forskellige muligheder. I spacefill og ball and stick, er der en masse røde kugler. Hvad tror I de symboliserer? 7. Find ud af hvilke farvekoder de forskellige atomer har. 8. Find en peptid binding (vælg en display måde, hvor de er til at se). 9. Prøv at se på den tredimensionelle struktur, kan I finde et stykke α-helix? Vælg en måde hvor det er til at se. Hvilke aminosyrerester danner dette stykke?(i kan finde deres nummer ved at klikke på dem og se i command line). Prøv tilsvarende at finde et stykke β-sheet. 10. Hvordan vil I beskrive hele enzymets form? 11. Skriv i command line : select asp, glu, lys, arg Er sidekæderne af disse aminosyrer polære eller nonpolære? 12. Skriv i command line : colour green 13. Skriv i command line : select trp, phe Er der her tale om polære eller nonpolære aminosyrer? 14. Skriv i command line : colour magenta 15. Vend og drej enzymet. Kan I se en sammenhæng mellem, hvordan de enkelte aminosyrer er placeret tredimensionelt i enzymet, og hvilke egenskaber de har med hensyn til, om de er polære eller non-polære?

11 I kan komme tilbage til de oprindelige farver ved at vælge select all i edit og derefter vælge PK i colours. 17. Nu går vi lidt mere i detaljer med samenhængen mellem enzymets struktur og dets egenskaber. Skriv i command line : select ser195, his57, asp102 Disse tre aminosyrer kaldes den aktive triade. 18. Skriv i command line : colour black 19. I edit vælges select all. 20. Vend og drej enzymet således, at I tydeligt (så tydeligt som muligt) kan se en kløft med den aktive triade på siderne. Det er nok nemmest at se, hvis I ser enzymet som sticks eller ball and stick. Prøv at forestille jer, at der kan komme et protein (eller en streng fra et protein) ned i kløften og, at en peptidbinding kan køres i stilling til at blive hydrolyseret ved den aktive triade. 21. Skriv i command line : select trp215, gly216, tyr Skriv i command line : colour green 23. Skriv i command line : select asp Skriv i command line : colour magenta 25. I edit vælges select all 26. Se på modellen som stick. Drej nu enzymet så I kigger ned på enden af asp189 (den magenta). I skal dreje enzymet sådan, at der bliver et hul ned til lysinen, med triaden liggende oven over (de sorte), det kan godt tage lidt tid at få det på plads. Forestil jer, at den positive ladede ende af en arginin-rest fra substratet kan binde ned til den negativt ladede asparaginsyrerest. Samtidigt kan backbone (selve kæden) af substratet lave et β-sheet (foldeblad) med de tre grønne aminosyrer. Hvilke bindinger holder et β-sheet sammen? I skal prøve at forestille jer, at det kun er de tre aminosyrer fra den aktive triade, der udfører selve katalysen. Få af enzymets aminosyrer er direkte involveret i bindingen af substratet og alle resten af aminosyrerne er nødvendige for at få det hele til at hænge sammen tre dimensionelt på den rigtige måde.

12 12 Apendiks A. De almindeligt forekommende amminosyrer. Neutrale aminosyrer H 2 N H 2 H H 3 H H H 3 H 3 H H H Glycin (Gly) Alanin (Ala) Valin (Val) H 3 H 2 H H H 3 H H 3 H 2 H 3 H H H H H H H H H 2 H H Leucin (Leu) Isoleucin (Ile) Phenylalanin (Phe) H H H H H H 2 H Tryptophan (Trp) H H 2 H N H H 2 H 2 Prolin (Pro) H H 3 S H 2 H 2 H Methionin (Met) H H 3 H H 2 H H H H H H HS H 2 H H Serin (Ser) Threonin (Thr) ystein (ys) H H 2 H H H H H Tyrosin (Tyr) H H 2 N H 2 H H Asparagin (Asn) H 2 H 2 H Glutamin (Gln) H

13 13 Basiske aminosyrer H H N N H H 2 H H H 2 N H 2 H 2 H 2 H2 H H Histidin (His) Lysin (Lys) HN H 2 H 2 H 2 H H Arginin (Arg) Sure aminosyrer H H 2 H H H H 2 H 2 H H Asparagin syre (Asp) Glutamin syre (Glu)