tdp 12-7Z (12) PATENTSKRIFT

Transkript

1 (19) DANMARK DK B1 tdp 12-7Z (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: C 07 K A 61 K 39/09 C 12 N 15/31 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (86) International ansøgning nr: PCT/AU89/00539 (86) International indleveringsdag: (85) Videreførelsesdag: (30) Prioritet: AU 1989/88 (73) Patenthaver: De Staat der Nederlanden Vertegenwoordigd Door de Minister van Welzijn, Volksgesondheid en Cultuur, P.O. Box 5406, 2280 HK Rijswijk, Holland (72) Opfinder: James Cleland Paton, 49 Foster Street, Parkside, S.A. 5063, Australien David John Hansman, 66 Alexandra Avenue, Rose Park, S.A. 5067, Australien Graham John Boulnois, 26, Prospect Road, Kibworth Beauchamp, Leicestershire LE1 9[1, N, Storbritannien Peter William Andrew, 7 Chapel Lane, Leister, Leicestershire, LE1 9 HN, Storbritannien Timothy John Mitchell, 25 Mawbys Lane, Appleby Magna, Burton-on-Trent, Staffordshir, e DE12 7AA, Storbritannien John Arthur Walker, Traymore Apts., No. 11, 51 S.McLean, Memphis, TN 38104, USA (74) Fuldmægtig: Budde, Schou & Ostenfeld NS, Vester Søgade 10, 1601 København V, Danmark (54) Benævnelse: Ændret pneumolysin, vaccine indeholdende det ændrede pneumolysin, rekombinant plasmid, sorn koder for det ændrede pneumolysin, hybrid værtscelle indeholdende det rekombinante plasmid, metoder til fremstilling af det ændrede pneumolysin og metode til fremstilling af en vaccine indeholdende det ændrede pneumolysin (56) Fremdragne publikationer: ingen (57) Sammendrag: Der er konstrueret derivater af pneumolysin, som er ikketoksiske, på grundlag af aminosyresubstitutioner. Disse derivater fremkalder en immunreaktion hos dyr, som reagerer over for vild-type-pneumolysin. Opfindelsen omfatter også vacciner til mennesker baseret på disse derivater, herunder vacciner omfattende konjugater på pneumokok-kapsel-polysacchari der.

2 Den foreliggende opfindelse angår et ændret pneumolysin, en vaccine indeholdende det ændrede pneumolysin, et rekombinant plasmid, som koder for det ændrede pneumolysin, en hybrid værtscelle indeholdende det rekombinante plasmid, 5 metoder til fremstilling af det ændrede pneumolysin og en metode til fremstilling af en vaccine indeholdende det ændrede pneumolysin. Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) er en vigtig patogen organisme, som forårsager invasive sygdomme, såsom 10 pneumonia, meningitis og bacteraemia. Selv i områder, hvor effektiv antibiotisk terapi er frit tilgængelig, kan dødeligheden af pneumococcus pneumonia være så høj som 19% hos patienter indlagt på hospital, og denne stiger til 30-40% hos patienter med bacteraemia. Disse høje dødeligheder har 15 været rapporteret i USA, hvor pneumonia, hvoraf S. pneumoniae er den almindeligste årsag, rangerer som den femtehyppigste dødsårsag. Pneumonia er endda den eneste smitsomme sygdom blandt de ti hyppigste dødsårsager i dette land. I USA er dødelighederne for pneumococcus-meningitis fra 13-45%. I 20 udviklingslande dør mere end 3 millioner børn under 5 års alderen hvert år af pneumonia, og igen er S. pneumoniae den almindeligste årsag. S. pneumoniae forårsager også mindre alvorlige, men særdeles almindeligt udbredte infektioner, såsom otitis media og sinusitis, som har en væsentlig ind- 25 virkning på sundhedsudgifterne i I-lande. Otitis media har særlig betydning for små børn, sinusitis angriber både børn og voksne. Sidst i 1970'erne blev der givet licens på en vaccine med henblik på at forhindre alvorlige infektioner, især 30 bakteriel pneumonia, og til beskyttelse af visse grupper, såsom individer, der operativt har fået fjernet milten, og små børn, som er særligt udsatte for fulminant pneumokoksygdom. Vaccinen er sammensat af rensede kapsel-polysaccharider, som er de fremherskende pneumokok-overfladeanti- 35 gener. Imidlertid har hver serotype af S. pneumoniae (hvoraf der er 83) et strukturelt forskelligt kapsel-polysaccharid, i

3 og immunisering med &I serotype giver ingen som helst beskyttelse mod langt de fleste af de andre. Vaccinen, på hvilken der for tiden gives licens i Australien, indeholder polysaccharider renset op fra de 23 mest almindelige sero- 5 typer, som er ansvarlige for ca. 90% af pneumokok-infektioner i dette land. Beskyttelse selv mod de serotyper, som er indeholdt i vaccinen, er på ingen måde fuldstændig, og der har været flere rapporter om alvorlige, endda dødelige infektioner hos vaccinerede individer i høj-risiko-gruppen. 10 Effektiviteten af vaccinen er dårligst hos små børn, og flere undersøgelser, herunder en undersøgelse foretaget i Adelaide, har vist, at den eksisterende formulering har ringe eller ingen påviselig klinisk nytte i denne gruppe. Denne tydelige fiasko af vaccinen synes at være forbundet 15 med den ringe immunogenitet af visse pneumokok-polysaccharider hos børn under 5 år. Det er i forbindelse med den foreliggende opfindelse blevet vist, at antistof-reaktionen er særligt ringe over for de fem serotyper, som er den mest almindelige sygdomsårsag hos børn (type 6, 14, 18, 19 og 23). 20 Antistof-reaktionen over for disse pneumokok-polysaccharider nærmer sig således kun voksne niveauer hos børn over 8 år på vaccinationstidspunktet. I betragtning heraf synes en vaccine, som omfatter andre antigener end kapsel-polysacchariderne, at være nødven- 25 dig til beskyttelse af små børn mod pneumokok-infektion. Et sådant antigen kunne være pneumolysin, et proteintoksin produceret af alle virulente S. pneumoniae-isolater. Immunisering af mus med dette protein har vist sig at give en vis grad af beskyttelse mod pneumokok-infektion. 30 Imidlertid er der en vanskelighed derved, at pneumolysin er toksisk for mennesker. Pneumolysin, som medtages i en vaccine, skal derfor i det væsentlige være ikke-toksisk. Imidlertid vil den behandling, som gør pneumolysin ikke-toksisk, ved de fleste nuværende anvendte metoder sandsynligvis 35 ændre den grundlæggende konfiguration af proteinet til at være immunogent forskelligt fra nativt eller vild-type-pneu- 2

4 molysin. En immunreaktion fremkaldt af et ændret protein, som er immunogent forskelligt fra det native pneumolysin, vil have en formindsket beskyttelseskapacitet eller ingen beskyttelseskapacitet. Vanskeligheden består således i at producere 5 et ændret pneumolysin, som er ikke-toksisk og på samme tid tilstrækkeligt immunogent ligesom den toksiske form til fremkaldelse af en beskyttende immunreaktion. 3 Et ændret pneumolysin med de ovennævnte karakteristika kan så anvendes på flere måder i en vaccine. Det ændrede 10 pneumolysin kan således selv anvendes til immunisering, eller alternativt kan det ændrede pneumolysin konjugeres til pneumokok-polysaccharid eller kan alternativt medtages i en vaccine, i hvilken pneumokok-polysaccharider kan konjugeres til et andet protein, og det ændrede pneumolysin 15 kun er til stede i en ikke-konjugeret form, Den foreliggende opfindelse angår et ændret pneumolysin, som i det væsentlige er ikke-toksisk, og kan fremkalde en immunreaktion hos et dyr, der reagerer over for vildtype-pneumolysin, hvor det ændrede pneumolysin har amino- 20 syresekvensen illustreret i fig. 3, hvilken sekvens er ændret ved mindst en aminosyre-substitution, -deletion eller -blokering i en eller flere af regionerne , og Fortrinsvis har det ændrede pneumolysin formindsket 25 komplementbindings-aktivitet sammenlignet med vild-typepneumolysin. Formindskelse af komplementbindings-aktiviteten resulterer i mindre inflammation på vaccine-indgivelsesstedet. Fortrinsvis har det ændrede pneumolysin formindsket 30 Fc-bindingsaktivitet sammenlignet med vild-type-pneumolysin. Formindelse af Fc-bindingsaktiviteten resulterer i mindre inflammation på vaccine-indgivelsesstedet. Fortrinsvis er det ændrede pneumolysin ændret på grundlag af en eller flere aminosyresubstitutioner i forhold 35 til vild-type-pneumolysin. Pneumolysinet kan ændres ved, at aminosyren, som er

5 til stede på ethvert eller flere af reststederne 367, 384, 385, 428, 433 eller 435 af vild-type-pneumolysin, erstattes, fjernes eller blokeres. Opfindelsen angår også en vaccine indeholdende et 5 ændret pneumolysin, ifølge opfindelsen. Fortrinsvis omfatter vaccinen kapsel-polysaccharidmateriale, der er konjugeret med det ændrede pneumolysin. Kapsel-materialet kan afledes af enhver eller flere af Streptococcus pneumoniae-serotyperne 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 10 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F og 33F. Herved kan serotyper, som almindeligvis er knyttet til sygdom hos børn, og som børn generelt har en ringe immunreaktion overfor, specifikt gøres til mål (dvs. dansk sero- 15 type 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F og 23F). Andre almindelige serotyper indeholdt i den nuværende 23-valente Merck Sharp og Dohme-vaccine (Penumovax 23) kan imidlertid også anvendes til at syntetisere konjugater (dvs. type 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F og 33F) eller 20 endog enhver anden serotype. Konjugering af alle pneumokokpolysaccharider til proteinbærestoffet sikrer god T-celleafhængig immunogenitet hos børn, således at der produceres beskyttende niveauer af anti-polysaccharid-antistof. Kombinationen af det ændrede pneumolysin sammen med 25 kapsel-materialet vil sikre en ekstra grad af beskyttelse, især mod serotyper af S. pneumoniae, hvis polysaccharider ikke er inkorporeret i de eksisterende vaccine-formuleringer. Vaccinen indgives fortrinsvis ved subcutan injektion, med eller uden et godkendt hjælpestof, såsom aluminiumoxid- 30 gel. Opfindelsen angår desuden et rekombinant plasmid, som er ejendommeligt ved, at det indeholder en DNA-sekvens, som koder et ændret pneumolysin ifølge opfindelsen. Opfindelsen angår endvidere en hybrid værtscelle, 35 som er ejendommelig ved, at den indeholder et rekombinant plasmid ifølge opfindelsen, hvor det rekombinante plasmid 4

6 indeholder en inducerbar ekspressionskontrol, som kan anvendes til ekspression af det for det ændrede pneumolysin kodende DNA i en værtscelle. Opfindelsen angår yderligere 5 en metode til fremstilling af et ændret pneumolysin ifølge opfindelsen, hvilken metode er ejendommelig ved, at det ændrede pneumolysin renses fra et ekspressionssystem indeholdende et rekombinant plasmid ifølge opfindelsen, en metode til fremstilling af et ændret pneumolysin 10 ifølge opfindelsen, hvilken metode er ejendommelig ved, at det ændrede pneumolysin renses fra en kultur af en værtscelle ifølge opfindelsen, og en metode til fremstilling af en vaccine, hvilken metode er ejendommelig ved, at en rekombinant klon, som 15 koder et ændret pneumolysin ifølge opfindelsen, amplificeres, der fremkaldes transkription og translation af det klonede materiale, det ændrede pneumolysin renses, og det ændrede pneumolysin konjugeres med et kapsel-polysaccharid. Til en bedre forståelse af opfindelsen vil der i det 20 følgende blive beskrevet specifikke udførelsesformer af opfindelsen med henvisning til tegningen, hvorpå Fig. 1 er DNA-sekvensen af genet, som koder vild-typepneumolysin, Fig. 2 er DNA-sekvensen af et ændret gen, som koder 25 vild-type-pneumolysin anvendt til kloning af pneumolysingenet i en ekspressionsvektor, Fig. 3 er aminosyresekvensen af vild-type-pneumolysinet som afledt af DNA-sekvensen af genet, som koder vild-type-pneumolysin, og 30 Fig. 4 viser aminosyresekvensen af pneumolysin, som viser aminosyresubstitutioner indført ved stedrettet mutagenese. Rekombinante DNA-teknikker er blevet anvendt for at konstruere ikke-toksiske pneumolysin-derivater, som egner 35 sig til indgivelse til mennesker. Til opnåelse af dette klones S. pneumoniae-genet, som koder pneumolysin, i Es- 5

7 cherichia coli, og dets komplette DNA-sekvens bestemmes. DNA-sekvensen er vist i figur 1, og den afledte aminosyresekvens er vist i figur 3. Tre regioner af pneumolysin-genet underkastes oligo- 5 nucleotid-rettet mutagenese. Den første region koder aminosyrerne i proteinsekvensen og er vist ved en understregning i figur 3. Denne 11-aminosyrers sekvens viser absolut homologi med lignende regioner i andre beslægtede thiol-aktiverede toxiner og menes derfor at være ansvarlig 10 for den hæmolytiske aktivitet og derfor toxinets toksiske aktivitet. De andre to regioner koder aminosyrerne og aminosyrerne og er også vist ved en understregning i figur 3. Disse to regioner af toxinet har væsentlig aminosyresekvens-homologi med humant C-reaktivt protein (CRP) og 15 menes følgelig at være ansvarlige for pneumolysins evne til at binde Fc-regionen af immunoglobuliner og til at aktivere komplement. Der konstrueres femten særskilte mutationer i pneumolysin-genet, som resulterer i enkeltvise aminosyresubstitutioner, som vist i figur 4. I en bestræbelse på at 20 bevare strukturen af det ændrede pneumolysin udføres der konservative substitutioner, således at aminosyrer substitueres med aminosyrer af en lignende natur. For regionen involveret i hæmolytisk aktivitet reducerer Cys428-4Gly, Cys428-'Ser, Trp433-*Phe, Glu434-Asp og 25 Trp ,Phe hver hæmolytisk aktivitet med henholdsvis 97%, 90%, 99%, 75% og 90%. De andre mutationer i denne region (CYs428 G1u434-4Gln og Trp )Phe) påvirker ikke hæmolytisk aktivitet. Mutering af en separat region af toxinet, som menes at være ansvarlig for binding til målcellemem- 30 byaner, påvirker også proteinets hæmolytiske aktivtet. Denne substitution, His367-+Arg, inhiberer fuldstændig hæmolytisk aktivitet. Dette er et ganske uventet resultat, derved at His367Arg derfor viser en større inhibering af denne egenskab end substitutionerne udført i 11-aminosyrers regionen, 35 som menes at være ansvarlig for hæmolytisk aktivitet. 6 Mutationer i de CRP-lignende domæner testes for evne

8 til at aktivere komplement. For Trp Phe, Tyr 3 84-qphe, Asp385-,Asn og Trp397-4Phe formindskes komplementaktivering med henholdsvis 20%, 70%, 100% og 15%. De andre mutationer i de CRP-lignende domæner vist i figur 4 formindsker ikke 5 komplementaktivering. Det er betydningsfuldt, at de ovennævnte mutationer, som påvirker enten hæmolytisk aktivitet eller komplementaktivering, ikke forringer immunogeniteten af proteinerne sammenlignet med nativt eller vild-type-pneumolysin. 10 Selv om His367-)Arg således er den foretrukne mutation til formindskelse af hæmolytisk aktivitet, kan en kombination af to eller flere mutationer, som bevirker formindsket hæmolytisk aktivitet, også opnå en meget høj grad af formindskelse af hæmolytisk aktivitet. På lignende måde er 15 Asp385-+Asn den foretrukne mutation til opnåelse af formindsket komplementaktivering, men der kan også anvendes en kombination af to eller flere mutationer, som formindsker aktiviteten til en mindre grad. 7 Ved en foretrukken udførelsesform vil pneumolysin- 20 derivatet, som skal anvendes i vaccinen, indeholde en kombination af visse af de ovennævnte mutationer, sådan at proteinet er ude af stand til at aktivere komplement og heller ikke har nogen hæmolytisk aktivitet. Eksempler på en sådan kombination er: 25 1) His36 7 Arg + Asp Asn 2) His367-4Arg + Asp385->Asn + enten Cys 428-4Gly eller Trp Phe 3) Asp38 5-4Asn + Cys 428-4Gly + Trp433-4Phe. Disse er nogle foretrukne kombinationer, men det er 30 klart, at der kan anvendes andre kombinationer af mutationer til sammensætning af det ændrede pneumolysin, som skal anvendes i en vaccine. Desuden kan det ændrede pneumolysin omfatte enhver af de individuelle mutationer med tilstrækkeligt formindsket aktivitet. 35 Et højt niveau af ekspression af det ændrede pneumo- lysin fra DNA, som koder det ændrede pneumolysin, kan opnås

9 ved anvendelse af en hvilken som helst af en række gængse metoder, herunder ekspression i en prokaryotisk vært med DNA'et passende klonet i en hvilken som helst af de mange ekspressionsvektorer, som er tilgængelige for tiden, eller passende 5 klonet i værtschromosomet, ekspression i en eukaryotisk vært med DNA'et passende klonet enten i en ekspressionsvektor eller klonet i værtschromosomet, eller i et in vitro-ekspressionssystem, som f.eks. kan omfatte rensede komponenter, der er nødvendige til ekspression af ændret pneumolysin. 10 Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af det muterede pneumolysin-gen er det klonet i vektoren pkk233-2 til ekspression i Escherichia coli eller en anden lignende prokaryot. Denne vektor omfatter ampicillin- og tetracyclinresistensgener, trc-promotoren (som kan reguleres med IPTG 15 (isopropy1-13-d-thiogalactopyranosid)) og et lac Z-ribosombindingssted, som støder op til et ATG-startkodon, der inkorporerer et NcoI-restriktionssted. Umiddelbart efter startkodonet er der restriktionssteder for PstI og HindIII efterfulgt af en kraftig T1T2-transkriptionsterminator. Før ind- 20 føjning i pkk233-2 konstrueres et NcoI-restriktionssted ved 5'-enden af den pneumolysin-kodende sekvens (ved startkodonet) ved oligonucleotid-rettet mutagenese, som vist i figur 2. Dette gør det muligt at klone den proximale ende af det ændrede pneumolysin-gen i NcoI-stedet af pkk Et HindIII-sted ca. 80 baser efter pneumolysin-termineringskodonet anvendes til at splejse den distale ende af det ændrede gen i det forenelige sted i pkk Det ændrede pneumolysin-derivat kan imidlertid klones i en hvilken som helst af en række høj ekspressions-vektorsystemer. 30 Det ændrede pneumolysin fremstilles som følger: E. coli-celler indeholdende det ovennævnte rekombinante plasmid dyrkes først i 9 liters kulturer i Lurla Bertani-medium (eller ethvert andet passende medium), suppleret med det passende antibiotikum, ved 37 C med beluftning. Når kulturen 35 når den sene logaritmiske vækstfase, tilsættes IPTG til en slutkoncentration på 20 gm (for at fremkalde ekspression af 8

10 det ændrede pneumolysin-gen), og inkubationen fortsættes i yderligere 2-3 timer. Cellerne isoleres derpå ved centrifugering eller ultrafiltrering og lyseres derpå ved behandling med EDTA og 5 lysozym, efterfulgt af lydbehandling, eller ved sprængning i en French-trykcelle. Nedbrudt cellemateriale fjernes ved centrifugering, og ekstrakten dialyseres derpå omhyggeligt mod 10 mm natriumphosphat (ph = 7,0). Materialet anbringes derpå i en søjle af DEAE-cellulose og elueres med en lineær 10 gradient af mm natriumphosphat (ph = 7,0). Fraktioner indeholdende topniveauer af pneumolysin-derivatet forenes, koncentreres ved ultrafiltrering og anbringes i en søjle af "Sephacryl S-200". Denne søjle udvikles i 50 mm natriumphosphat (ph = 7,0), og igen forenes fraktioner med højt 15 indhold af pneumolysin-derivat, som koncentreres ved ultrafiltrering og opbevares i 50% glycerol ved -15 C. Slutproduktet er mere end 95% rent, som vurderet ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese. Hydrofob vekselvirkningschromatografi på phenyl-"sepharose" er en alternativ rensning, som også 20 kan anvendes. Det er imidlertid klart, at dette kun er &I metode til rensning af det ændrede pneumolysin, og at der kan anvendes andre, alternative metoder (herunder højtryksvæskechromatografi). Det rensede ændrede pneumolysin kan derpå indgives 25 som en vaccine i passende mængder, enten som sådan eller i kombination med andre antigener. I &I form kan pneumolysinet være konjugeret med polysaccharid afledt af en hvilken som helst eller flere af de mange pneumokok-stammer, der er beskrevet ovenfor. 30 Det ændrede pneumolysin kan konjugeres til de for- skellige serotyper af polysaccharid ved en række metoder. Den første indebærer fremstilling af et aktiveret polysac- charid ved behandling af rent polysaccharid (kommercielt tilgængeligt) med cyanogen-bromid og adipinsyredihydrazid 35 (ADH). ADH-polysaccharidet kombineres derpå med det ændrede pneumolysin i nærværelse af 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopro- 9

11 py1)-carbodiimid-hydrochlorid. Konjugeret materiale fraskilles fra reaktanterne ved chromatografi gennem "Sepharose CL-4B". Alternativt kan polysaccharid/ændret pneumolysin- 5 konjugaterne fremstilles under anvendelse af bifunktionelle reagenser, såsom N-succinimidy1-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat (SANPAH). Rent polysaccharid opløst i phosphat-pufret saltopløsning omsættes med SANPAH i nærværelse af en kraftig hvid lyskilde. Uomsat SANPAH isoleres derpå 10 fra aktiveret polysaccharid ved chromatografi på "Sephadex G-50". Aktiveret polysaccharid konjugeres derpå til det ændrede pneumolysin i 0,2M boratpuffer (ph = 8,5). Eventuelle overskydende reaktive grupper blokeres derefter med lysin, og polysaccharid-protein-konjugatet isoleres fra de andre 15 reaktanter ved chromatografi på "Sepharose CL-4B". Konjugater kan også fremstilles ved reduktiv aminering med cyanoborhydrid. 10 Alternativt kan et andet protein, såsom inaktiveret tetanus-toxin, konjugeres med de ønskede polysaccharider, 20 og ændret pneumolysin kan sættes til vaccinen i en ukonjugeret form. 25 Dette beskriver så den bedste metode til gennemførelse af opfindelsen, men det er klart, at opfindelsen ikke er begrænset dertil.

12 Patentkrav 1. Ændret pneumolysin, som i det væsentlige er ikketoksisk og kan fremkalde en immunreaktion hos et dyr, der reagerer over for vild-type-pneumolysin, hvor det ændrede 5 pneumolysin har aminosyresekvensen illustreret i fig. 3, hvilken sekvens er ændret ved mindst &I aminosyre-substitution, -deletion eller -blokering i en eller flere af regionerne , og Ændret pneumolysin ifølge krav 1, k e n d e t e g- 10 n e t ved, at det har formindsket komplementbindings-aktivitet sammenlignet med vild-type-pneumolysin. 3. Ændret pneumolysin ifølge ethvert af kravene i eller 2, kendetegnet ved, at det har formindsket Fc-bindingsaktivitet sammenlignet med vild-type-pneumolysin Ændret pneumolysin ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at det ændrede pneumolysin er ændret på grundlag af &I eller flere aminosyresubstitutioner i vild-type-pneumolysin. 5. Ændret pneumolysin, kendetegnet ved, 20 at det har den følgende aminosyresekvens:

13 Dk B Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gin Gly Glu " Ser Ile Glu Asn- Arg Phe lie Lys Glu Gly Asn Gln Leu 31 Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp lle Ser Val Thr Ala Thr 61 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Var Va - I Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gin Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu 121 Leu Ala Lys Trp His Gin Asp Tyr Gly Gin Val Asn Asn Val Pro Ala Arg Met Gin Tyr Glu Lys Ile Thr -Ala His 151 Ser Met Glu Gin Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu Asp ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gin Ile Gin Ile Val Asn Phe

14 Lys Gin Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys 201 Asn Pro Gfy Asp Val Phe Gin Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile Ser Aha Gik) Arg Pro Leu 231 Val Tyr lie Ser' Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr 241 Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser Asp Glu Val Glu 251 Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val Aia Pro Gin Thr Glu Trp Lys Gin Ile Leu Asp Asn Thr Glu 281 Val Lys Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser GIy 291 Ala Arg Val Val Thr Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gin Glu Gly Ser Arg Phe Thr Ala Asp His Pro 321 Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp 331 Atn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Giy Asp Leu Leu 361 Leu Asp R1 Ser Gly Ala Tyr Val Ala Gin Tyr Tyr Ile 371 Thr R2 Asp Glu Leu Ser R3 R4 His Gin Gi)/ Lys Glu 381 Val Leu Thr Pro Lys Ala R5 Asp Arg Asn Gly Gin _ Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gy 411 Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu R6 Thr 421 Gly Leu Ala R7 R8 Rg Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser lie 451 Trp Giy Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val Glu Asp Lys Val 461 Glu Asn Asp

15 hvori R 1 er His eller Arg, R 2 er Trp eller Phe, R 3 er Tyr eller Phe, R 4 er Asp eller Asn, R 5 er Trp eller Phe, R G er Cys, Gly eller Ser, R7 er Trp eller Phe, R8 er Glu eller Asp, R 9 er Trp eller Phe, og hvori mindst en af resterne 5 R1, R6, R 7, R 8 eller R 9 er forskellige fra vild-type. n e t Ændret pneumolysin ifølge krav 5, k e n d e t e g- ved, at R 1 er Arg, R2 er Trp, R 3 er Tyr, R4 er Asn, R5 er Trp, RG er Cys, R7 er Trp, R8 er. Glu, og R9 er Trp. 7. Vaccine indeholdende et ændret pneumolysin ifølge 10 ethvert af kravene Vaccine ifølge krav 7, omfattende kapsel-polysaccharidmateriale, der er konjugeret med en proteinbærer, og ikke-konjugeret proteinmateriale, hvor kapsel-polysaccharidet er afledt af en hvilken som helst eller mere end en 15 af Streptococcus pneumoniae-serotyperne, og det ikke-konjugerede proteinmateriale er det ændrede pneumolysin. 9. Vaccine ifølge krav 8, kendetegnet ved, at kapsel-materialet er afledt af en hvilken som helst eller mere end én af Streptococcus pneumoniae-serotyperne 20 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F og 33F. 10. Vaccine ifølge krav 7, omfattende kapsel-polysaccharidmateriale, der er konjugeret med en proteinbærer, hvor kapsel-polysaccharidrnaterialet er afledt af en hvilken 25 som helst eller mere end en af Streptococcus pneumoniaeserotyperne, og proteinbæreren er det ændrede pneumolysin. 11. Vaccine ifølge krav 10, kendetegnet ved, at kapselmaterialet er afledt af en hvilken som helst eller mere end 'e'n af Streptococcus pneumoniae-serotyperne 30 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F og 33F. 12. Rekombinant plasmid, kendetegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens, som koder et ændret pneumolysin ifølge ethvert af kravene Hybrid værtscelle, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant plasmid ifølge krav 12,

16 hvor det rekombinante plasmid indeholder en inducerbar ekspressionskontrol, som kan anvendes til ekspression af det for det ændrede pneumolysin kodende DNA i et værtscelle. 14. Metode til fremstilling af et ændret pneumolysin 5 ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det ændrede pneumolysin renses fra et ekspressionssystem indeholdende et rekombinant plasmid ifølge krav Metode til fremstilling af et ændret pneumolysin ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, 10 at det ændrede pneumolysin renses fra en kultur af et værtscelle ifølge krav Metode til fremstilling af en vaccine, k e n- detegnet ved, at en rekombinant klon, som koder et ændret pneumolysin ifølge ethvert af kravene 1-6, amplifi- 15 ceres, der fremkaldes transkription og translation af det klonede materiale, det ændrede pneumolysin renses, og det ændrede pneumolysin konjugeres med et kapsel-polysaccharid. 15

17 DK Bi AGATGGCAAA TAAAGCAGTA AATGACTTTA TACTAGCTAT GAATTACGAT AAAAAGAAAC TCTTGACCCA TCAGGGAGAA AGTATTGAAA ATCGTTTCAT CAAAGAGGGT AATCAGCTAC CCGATGAGTT TGTTGTTATC GAAAGAAAGA AGCGGAGCTT GTCGACAAAT ACAAGTGATA TTTCTGTAAC AGCTACCAAC GACAGTCGCC TCTATCCTGG AGCACTTCTC GTAGTGGATG AGACCTTGTT AGAGAATAAT CCCACTCTTC TTGCGGTTGA TCGTGCTCCG ATGACTTATA GTATTGATTT GCCTGGTTTG GCAAGTAGCG ATAGCTTTCT CCAAGTGGAA GACCCCAGCA ATTCAAGTGT TCGCGGAGCG GTAAACGATT TGTTGGCTAA GTGGCATCAA GATTATGGTC AGGTCAATAA TGTCCCAGCT AGAATGCAGT ATGAAAAAAT AACGGCTCAC AGCATGGAAC AACTCAAGGT CAAGTTTGGT TCTGACTTTG AAAAGACAGG GAATTCTCTT GATATTGATT TTAACTCTGT CCATTCAGGT GAAkAGCAGA TTCAGATTGT TAATTTTAAG CAGATTTATT ATACAGTCAG CGTAGACGCT GTTAAAAATC CAGGAGATGT GTTTCAAGAT ACTGTAACGG TAGAGGATTT AAAACAGAGA GGAATTTCTG CAGAGCGTCC TTTGGTCTAT ATTTCGAGTG TTGCTTATGG GCGCCAAGTC TATCTCAAGT TGGAAACCAC GAGTAAGAGT GATGAAGTAG AGGCTGCTTT TGAAGCTTTG ATAAAAGGAG TCAAGGTAGC TCCTCAGACA GAGTGGAAGC AGATTTTGGA CAATACAGAA GTGAAGGCGG TTATTTTAGG GGGCGACCCA AGTTCGGGTG CCCGAGTTGT AAC?GGCAAG GTGGATATGG TAGAGGACTT GATTCAAGAA GGCAGTCGCT TTACAGCAGA TCATCCAGGC TTGCCGATTT CCTATACAAC TTCTTTTTTA CGTGACAATG TAGTTGCGAC CTTTCAAAAC AGTACAGACT ATGTTGAGAC TAAGGTTACA GCTTACAGAA ACGGAGATTT ACTGCTGGAT CATAGTGGTG CCTATGTTGC CCAATATTAT ATTACTTGGG ATGAATTATC CTATGATCAT CAAGGTAAGG AAGTCTTGAC TCCTAAGGCT TGGGACAGAA ATGGGCAGGA TTTGACGGCT CACTTTACCA CTAGTATTCC TTTAAAAGGG AATGTTCGTA ATCTCTCTGT CAAAATTAGA GAGTGTACCG GGCTTGCCTG GGAATGGTGG CGTACGGTTT ATGAAAAAAC CGATTTGCCA CTAGTGCGTA AGCGGACGAT TTCTATTTGG GG?ACAACTC TCTATCCTCA GGTAGAGGAT AAGGTAGAAA ATGAC FIG. 1 DNA-sekvens af pneumolysin-gen. ATG-start- =don understreget.

18 CCATGGCAAA TAAAGCAGTA AATGACTTTA TACTAGCTAT GAATTACGAT AAAAAGAAAC TCTTGACCCA TCAGGGAGAA AGTATTGAAA ATCGTTTCAT CAAAGAGGGT AATCAGCTAC CCGATGAGTT TGTTGTTATC GAAAGAAAGA AGCGGAGCTT GTCGACAAAT ACAAGTGATA TTTCTGTAAC AGCTACCAAC GACAGTCGCC TCTATCCTGG AGCACTTCTC GTAGTGGATG AGACCTTGTT AGAGAATAAT CCCACTCTTC TTGCGGTTGA TCGTGCTCCG ATGACTTATA GTATTGATTT GCCTGGTTTG GCAAGTAGCG ATAGCTTTCT CCAAGTGGAA GACCCCAGCA ATTCAAGTGT TCGCGGAGCG GTAAACGATT TGTTGGCTAA GTGGCATCAA GATTATGGTC AGGTCAATAA TGTCCCAGCT AGAATGCAGT ATGAAAAAAT AACGGCTCAC AGCATGGAAC AACTCAAGGT CAAGTTTGGT TCTGACTTTG AAkAGACAGG GAATTCTCTT GATATTGATT TTAACTCTGT CCATTCAGGT GAAAAGCAGA TTCAGATTGT TTATTTTAGG CAGATTTATT ATACAGTCAG CGTAGACGCT GTTAAAAATC CAGGAGATGT GTTTCAAGAT ACTGTAAC:GG TAGAGGATTT AA.AACAGAGA GGAATTTCTG CAGAGCGTCC TTTGG7CTAT ATTTCGAG7G TTGCTTATGG GCGCCAAGTC TATCTCAAGT TGGA?_ACCAC GAGTAAGAGT GATGAAGTAG AGGCTGCTTT TGAAGCTTTG ATAAkAGGAG TCAAGGTAGC TCCTCAGACA GAGTGGAAGC AGATTTTGGA CAATACAGAA GTGAAGGCGG TTATTTTAGG GGGCGACCCA AGTTCGGGTG CCCGAGTTGT AACAGGCAAG GTGGATATGG TAGAGGACTT GATTCAAGAA GGCAGTCGCT TTACAGCAGA TCATCCAGGC TTGCCGATTT CCTATACAAC TTCTTT7TTA CGTGACAATG TAGTTGCGAC CTTTCAAAAC AGTACAGACT ATG7TGAGAC TAAGGTTACA GCTTACAGAA ACGGAGATTT ACTGCTGGAT CATAGTGGTG CCTATGTTGC CCAATATTAT ATTACTTGGG ATGAATTATC CTATGATCAT CAAGGTAAGG AAGTCTTGAC TCCTAAGGCT TGGGACAGAA ATGGGCAGGA TTTGACGGCT CACTTTACCA CTAGTATTCC TTTAAAAGGG AATGT7CGTA ATCTCTCTGT CAAAATTAGA GAGTGTACCG GGCTTGCCTG GGAATGGTGG CGTACGGTTT ATGAAAAAAC CGATTTGCCA CTAGTGCGTA AGCGGACGAT TTCTATTTGG GGAACAACTC TCTATCCTCA GGTAGAGGAT AAGGTAGAAA ATGAC FIG. 2 DNA-sekvens af modificeret pneumolysin-gen. Et Ncol-restriktionssted (understreget) er indført ved startcodonet.

19 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gin Gly Glu 21 Ser Ile Glu Asn Arg Phe Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu 31 Pro Asp Glu 'Phe Val Val Ile Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala 61 Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val 71 Val Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg A!a. Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gin Val Glu Asp 111 Pro Ser Asn Ser Ser Vat Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu 121 Leu Als Lys Trp His Gin Asp Tyr Gly Gin Val Asn Asn Val Pro Ala Arg Met Gin Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His 151 Ser Met Glu Gin Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe 161 Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gry Glu Lys Gin Ile Gin Ile Val Asn Phe 191 Lys Gin Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys 201 Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu

20 Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu 231 Val Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gin Val Tyr 241 Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser Asp Glu Val Glu 251 Ada Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val Ala Pro Gin Thr. Glu Trp Lys Gln Ile Lau ASE 281 Asn Thr Glu Y2-1--L4LÆ2h.Ialile---1,5 Ser Giy 291 Ala Arg Val Val Thr Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gin Glu Gly Ser Arc Phe Thr Ala Asp His Pro 321 Giy Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp 331 Asn Val Val A:a. Thr Phe G:n Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu 36 1 Leu Asp His 371 Thr T er Tvr Asp Hi 381 Val Leu Thr Pro Lys Al2 Tr.; Asp Arg Asn Gly Gin Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly 411 Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cvs Thr 421 Giv Leu Ala Tro Glu Tro Tm., Arq Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile 451

21 DK Bi Trp Gry Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 471 FIG. 3

22 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gin Gly Glu 21 Ser Ile Glu Asn Arg Phe Ile Lys Glu Gly Asn Gin Leu 31 Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr 'Ash Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala Thr 61 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val 71 Asp Giu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Vat Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ada Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gin Val Glu Asp 111 Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu 121 Leu Aia Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gin Val Asn Asn Val Pro Ale Arg Met Gin Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His 151 Ser Met Glu Gin Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe 161 Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Giu Lys Gln Ile Gin Ile Val Asn Phe 191 Lys Gin Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys 201 Asn Pro Gly Asp Val Phe Gin Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu 231

23 Val Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr 241 Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser Asp Giu Val Giu 251 Trp Ara Ala Phe Glu Ala Leu ile Lys Gly Val Lys Val Ala 261 Phe I 271 Pro Gin Thr Trp Lys Gin Ile Leu Asp Asn Thr Glu 281 Val Lys Ala Val 11e Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly 291 Ala Arg Val Val Thr Gly Lys Vat Asp Met Val Giu Asp Leu lie Gin Giu Gly Ser Arg Phe Thr Ala Asp His Pro 321 Gry Leu Pro lie Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp 331 Asn Val Val A:a Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu 361 Arg Leu Asp His Ser Gly Aia Tyr Val Ala Gin Tyr Tyr Ile 371 Phe Phe Asn I I Thr Trp Asp Glu Leu Ser Tyr Asp His Gin Gry Lys Glu 381 Phe Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Giy 411

24 Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys 421 Ile Arg Ala I Giy --Ser I Glu Cys Thr Asp I Phe Gin Phe Phe 1 I I I?iy Leu Ala. Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys : Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr lie 451 Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val 461 Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 471 FIG. 4