3-vejs differentiering af equine multipotente mesenchymale stromale celler fra fedtvæv og perifert blod

Transkript

1 3-vejs differentiering af equine multipotente mesenchymale stromale celler fra fedtvæv og perifert blod Veterinærmedicin, kandidatspeciale Marie Hallager Askholm, pdt560 August januar 2015 Københavns Universitet Institut for Produktionsdyr og Heste Hovedvejleder: Lise C. Berg Medvejleder: Line N. Thomsen

2 Disclaimer The work presented in this report is that of the student alone. Students were encouraged to take ownership of their projects and to develop and execute their experiments with limited guidance and assistance. The content of the research does not necessarily represent the views of the supervisor or any staff member of the University of Copenhagen, Faculty of Health and Medical Sciences. The supervisor did not read or edit the final report and is not responsible for any technical inaccuracies, statements or errors. The conclusions and recommendations given in the report are also not necessarily that of the supervisor, sponsors or companies involved in the research.

3

4 "Af natur er mennesker næsten ens. Gennem deres udvikling bliver de vidt forskellige." Kungfutse

5 Forord Denne afhandling er, som mit kandidatspeciale, den afsluttende del af min uddannelse på veterinærmedicinstudiet. Opgaven er en del af et større 3-årigt forskningsprojekt omkring stamcellebehandling af ledskader hos heste, under udførelse af Lise C. Berg, Line N. Thomsen og Preben D. Thomsen. Denne opgave omhandler 3-vejs differentiering af formodede equine multipotente stromale celler fra fedtvæv og perifert blod, og er udført på Københavns Universitet, Grønnegårdsvej 7, på afdelingen for biokemi. Opgaven henvender sig til dyrlæger, dyrlægestuderende og andre personer, der måtte have interesse for dyrkning af stamceller. Opgaven er skrevet i et videnskabeligt sprog og er tiltænkt læsere, der har en forudgående viden om basal cellebiologi og histologi, samt en grundviden omkring celledyrkning. Alle tabeller og figurer er lavet af undertegnede, med mindre andet er specifikt angivet. Flere af billederne, taget af de dyrkede celler, mangler fejlagtigt en målestok for angivelse af størrelse. Disse billeder er taget med en Nokia N8 mobiltelefon, igennem et 10x okular på et mikroskop med objektiver på 10 eller 20 gange forstørrelse. Jeg vil gerne takke Lise C. Berg (vejleder) og Line N. Thomsen (medvejleder) for vejledning til både det praktiske arbejde med celledyrkning og hjælp til forståelse af nye faglige begreber, jeg er stødt på undervejs i dette projekt. Mange tak til laborant Helle Vestergaard Ruby for den store hjælp med indstøbning, snitning og farvning af cellepellets. Tak til min specialemakker Natacha Muderspach for støtte og opbakning hele vejen gennem specialet og for et godt og uundværligt samarbejde. En stor tak skal lyde til både min mor, Bente Askholm, for mange timers korrekturlæsning og grammatiske rettelser, til min kæreste Lars W. Jensen og min bror Bjørn Askholm for hjælp til layout af opgaven og til Ellen Mønsted Johansen for faglig gennemlæsning af opgaven. Til sidst vil jeg gerne takke venner og familie mange gange, for den store støtte og opbakning jeg har modtaget hele vejen gennem dyrlægestudiet. Dato og underskrift 12/ Marie Hallager Askholm I

6 II

7 Resumé Formål: Multipotente mesenchymale stromale celler (MSC er) fra fedtvæv og perifert blod er begge lovende for det kliniske arbejde med stamceller, og er derfor af stor forskningsmæssig interesse. Målet med dette studie var at sammenligne potentialet af equine MSC er fra fedtvæv (AT-MSC) og perifert blod (PB-MSC) til at differentiere i en adipogen, osteogen og chondrogen retning, og efterfølgende via histologi og måling af enzym-aktivitet at validere cellernes differentieringspotentiale. Metode: MSC er fra fedtvæv og perifert blod fra 3 heste blev undersøgt for plastikadhærence, cellemorfologi og potentiale til 3-vejs differentiering. Adipogen differentiering blev udført ved 6 dages dyrkning i et medie tilsat kaninserum, dexamethason, insulin, indomethacin og 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, og efterfølgende valideret ved Oil Red O farvning af lipiddråber. Osteogen differentiering blev udført ved 20 dages dyrkning i et medie tilsat føtal bovin serum, dexamethason, β-glycerofosfat og ascorbinsyre og efterfølgende valideret ved Alizarin Rød S farving af calciumdepot samt ved måling af ALP-aktivitet. Chondrogen differentiering blev udført ved 30 dages dyrkning af cellepellets i et medie tilsat føtal bovin serum, dexamethason, ascorbinsyre og TGF β3, og efterfølgende valideret for vækst af pelletstørrelse, morfologi af ekstracellulært matrix og lacunaedannelse samt Toluidin Blå og Safranin O farvning af proteoglycaner. Resultater: Både AT-MSC er og PB-MSC er havde dannet lipiddråber ved validering af Oil Red O farvning. AT-MSC er havde dannet en større mængde lipiddråber og havde, i modsætning til PB-MSC er, opnået en adipocyt-lignende morfologi. Både AT-MSC er og PB-MSC er havde dannet ekstracellulært calcium ved validering af Alizarin Rød S farvning. Mængden var tydeligt størst for PB-MSC er. Der var signifikant større ALP-aktivitet for PB-MSC er end for AT-MSC er. ALP-aktiviteten for PB-MSC er var desuden signifikant større for celler dyrket i et osteogent medie, end for kontrolcellerne. Dette var ikke tilfældet for AT-MSC erne. Der var i mindre grad positiv farvning af både lipiddråber og calciumdepot for kontrolceller af MSC er fra både fedtvæv og perifert blod. For både AT-MSC er og PB-MSC er dyrket i et chondrogent medie var der ingen vækst af pellet, ingen lacunaedannelse og negativ farvning for proteoglycaner med Toluidin Blå og Safranin O. For 2 ud af 3 heste havde MSC er fra perifert blod dog dannet et homogent ekstracellulært matrix. Konklusion: MSC er fra både fedtvæv og perifert blod kan differentieres i en adipogen og osteogen retning. MSC er fra fedtvæv er bedre til at differentiere i en adipogen retning, og MSC er fra perifert blod er bedre til at differentiere i en osteogen retning. Ingen af cellerne i dette forsøg var i stand til at differentiere i chondrogen retning, men grundet suboptimale forhold i dyrkningsperioden kan det ikke konkluderes entydigt, at MSC er fra fedtvæv og perifert blod ikke er i stand til chondrogen differentiering. Nøgleord: Stamceller; MSC; 3-vejs differentiering; Hest; Fedtvæv; Perifert blod; Adipogenese; Osteogense; Chondrogenese III

8 Abstract Objective: Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs), derived from adipose tissue and peripheral blood, are both very promising for clinical work with stem cells, and is of a great interest for research. The purpose for this study was to compare the potential for differentiation of equine MSCs derived from adipose tissue (AT-MSC) and peripheral blood (PB-MSC), towards adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis, and to validate the potential by histology and measurement of enzyme activity. Method: Plastic adherence, morphology of cells, and the potential for 3-lineage differentiation were evaluated in MSCs derived from adipose tissue and peripheral blood. For adipogenic differentiation cells were cultured for 6 days in a medium supplemented with rabbit serum, dexamethasone, insulin, indomethacin and 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, and were validated by Oil Red O staining of lipid droplets. For osteogenic differentiation cells were cultured for 20 days in a medium supplemented with fetal bovine serum, dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbic acid, and were validated by Alizarin Red S staining of calcium deposits, and measurement of ALP-activity. For chondrogenic differentiation cells were cultured as pellets for 30 days, in a medium supplemented with fetal bovine serum, dexamethasone, ascorbic acid and TGF β3, and were validated for growth of pellet-size, for morphology of ekstracellular matrix and development of lacuna, and by staining of proteoglycans with Toluidine Blue and Safranin O. Results: Both AT-MSCs and PB-MSCs had formed lipid droplets, when validated by Oil Red O staining. AT-MSCs had developed a larger amount of lipid droplets, and had, unlike the PB-MSC s, acquired a morphology, that resembles adipocytes. Both AT-MSCs and PB-MSCs had composed ekstracellular calcium, when validated by Alizarin Red S staining. The amount was distinctly larger for PB-MSCs. The ALP-activity was significantly larger for PB-MSCs, compared with AT-MSCs, and the ALP-activity for PB-MSC s was significantly larger for cells cultured in an osteogenic medium, compared with control cells. This was not the case for AT-MSCs. To a smaller distinct, the control cells for MSCs derived from both adipose tissue and peripheral blood, stained positive for lipid droplets and calcium deposits. Neither AT-MSCs nor PB-MSCs cultured in a chondrogenic medium had an increase in pellet-size or appearance of lacuna, and both stained negative for proteoglycans with Toluidine Blue and Safranin O. However, for 2 out of 3 horses, MSCs from peripheral blood had composed a homogeneously ekstracellular matrix. Conclusion: MSCs from both adipose tissue and peripheral blood can be differentiated towards adipogenesis and osteogenesis. MSCs from adipose tissue have a greater potential for adipogenic differentiation and MSCs from peripheral blood have a greater potential for osteogenic differentiation. In this study none of the cells were able to differentiate towards chondrogenesis, but due to suboptimal conditions in the culture period, it cannot unequivocally be concluded, that MSCs from adipose tissue or peripheral blood lack the potential for chondrogenic differentiation. Key words: Stem cells; MSC; 3-lineage differentiation; Horse; Adipose tissue; Peripheral blood; Adipogenesis; Osteogenesis; Chondrogenesis IV

9 Forkortelser ALP alkalisk fosfatase AT fedtvæv (adipose tissue) AT-MSC MSC er fra fedtvæv BMP bone morphogenetic protein dh 2O destilleret vand DMEM Dulbecco s Modificerede Eagle s Medium DMEM-hg DMEM med højt glucose indhold (4,5 g/l) DMEM-lg DMEM med lavt glucose indhold (1,5 g/l) DMSO dimethyl sulfoxid FBS føtal bovin serum (fetal bovine serum) HE Hæmatoxylin-Eosin IBMX 3-isobutyl-1-methyl-xanthine ISCT The International Society for Cellular Therapy MSC mesenchymale stamceller /mesenchymale stromale celler PB perifer blod PB-MSC MSC er fra perifert blod PBS fosfat buffret saltvand Pen/strep pencillin/streptomycin PFA paraformaldehyd pnpp para-nitrofenyl-fosfat rh insulin rekombinant human insulin RS kaninserum (rabbit serum) SO Safranin O TB Toluidin Blå TGF transforming growth factor V

10 VI

11 Indholdsfortegnelse Forord... I Resumé... III Abstract... IV Forkortelser... V 1 Indledning Formål og problemformulering Projektafgrænsning Teori Stamceller Multipotente mesenchymale stromale celler (MSC) Dyrkning af MSC er vejs differentiering Materialer og metode Resultater Adipogen differentiering Osteogen differentiering Chondrogen differentiering Diskussion Konklusion Perspektivering Referencer Bilag 1: Sammenligning af differentieringsprotokoller fra nyere studier Bilag 2: Adipogen differentieringsprotokol Bilag 3: Chondrogen differentieringsprotokol Bilag 4: Osteogen differentieringsprotokol Bilag 5: Resultater fra målinger af ALP-aktivitet VII

12 VIII

13 1 Indledning Hesten er et atletisk dyr, der benyttes til et væld af ride- og sportsdiscipliner verden over. Ortopædiske lidelser er en af de hyppigste årsager til sygedage hos heste (1-3), ofte resulterende i, at heste, til stor følelsesmæssig og økonomisk frustration for ejere, ikke kan anvendes til det påtænkte formål i en kortere eller længere periode. Et 2-årigt studie over dødsårsager hos væddeløbsheste i Californien viste, at 80-85% skyldtes muskuloskeletale lidelser (4), et studie over lidelser hos irske fuldblodsføl op til 12 måneders alderen viste, at muskuloskeletale lidelser var den næsthyppigste årsag til sygdom, udgørende 25% af 711 separate sygdomstilfælde (5), og et nyligt studie har vist, at ortopædiske lidelser er den hyppigst forekommende årsag til sygedage hos danske rideskoleheste (6). Hesten er et alsidigt dyr, idet den både udgør en hobby i form af et selskabsdyr, en atlet i form af en sportsudøver i væddeløb, spring og dressur og en økonomisk forretning for mange seriøse avlere. Trods den brede anvendelse af hesten er den i alle discipliner nødt til at kunne bevæge sig frit og uproblematisk for at opfylde ejerens behov. Af disse årsager er der også stort fokus og mange specialiserede dyrlæger inden for ortopædi hos heste, hvilket blandt andet ses ved det stigende antal medlemmer af ISELP 1. Det er et emne, der i den veterinære verden er højt prioriteret og hele tiden udvikler sig i form af ny viden og nyudviklede teknologier og behandlingsmetoder. Stamcellebehandling af muskuloskeletale lidelser hos heste har vundet stort indpas over den seneste årrække (7, 8). Behandling af seneskader bliver alment praktiseret (9, 10), og stamcellebehandling af ledskader hos heste er i stort fokus og under rivende udvikling (7, 11, 12). Skader i ledbrusken udgør imidlertid en stor andel af de ortopædiske lidelser hos heste (13-15), og da ledbrusk samtidig, grundet den manglende vaskularitet, har en dårligt regenererende evne (7, 16, 17), giver det ofte langvarige restitutionsperioder og reserverede prognoser. Netop derfor er interessen for stamcellebehandling af ledbrusk i stort fokus (7). Stamceller har evnen til selvfornyelse og ekstensiv proliferation samt evnen til at differentiere til flere forskellige celletyper på baggrund af dens potens (18). Det varierer fra totipotente morulaceller i det helt tidlige stadie af embryonets udvikling, der kan udvikles til alle kroppens celler og en faldende evne til differentiering i grad med individets udvikling og den dermed faldende potens i takt med cellernes specialisering i de forskellige dele af kroppen (19). Kan disse evner for stamceller udnyttes til for eksempel at transplantere stamceller til et patologisk dårligt regenererende væv som ledbrusk og inducere differentiering til ny ledbrusk, og derved øge helingsprocessen, nedsætte restitutionsperioden og forbedre prognosen? Denne hypotese ligger bag den stadigt stigende interesse for forskning i stamceller. Dette kan i teorien lyde simpelt, men det er til stadighed usikkert hvordan disse stamceller helt nøjagtigt fungerer in vivo, hvorvidt de kan udvindes fra postnatalt væv, samt hvordan cellerne opfører sig når der manupuleres med dem in vitro og hvad langtidseffekten af stemcellebehandling er. Derudover vides det ikke med sikkerhed, om det er stamcellerne og ikke den samtidige konservative og farmakologiske behandling der gør hestene raske. Der er således mange spørgsmål, der mangler at blive besvaret og mange egenskaber ved disse potentielle celler, der løbende søges forståelse for. 1 The International Society of Equine Locomoter Pathology 1

14 1.1 Formål og problemformulering Det er et problem i den veterinære sektor, at man ofte har en suboptimal prognose efter ledbehandlinger hos heste (20, 21). For at styrke lægevidenskaben er det vigtigt hele tiden at undersøge og udvikle alternativer til de traditionelle behandlingsmetoder. I både veterinær og human lægevidenskab har behandling med stamceller haft en rivende udvikling de senere år (22), men der er stadig mange ubesvarede spørgsmål i relation hertil. Det er et problem, at det ikke med sikkerhed vides, hvordan disse celler arbejder in vivo ved regeneration og opbygning af nyt væv, da denne viden er uundværlig for at kunne udnytte disse celler mest succesfuldt med behandling i øjemed. Forskning i stamceller er ikke blot med til at styrke den veterinærmedicinske viden, men i stor grad også til gavnligt udbytte for mennesker med ledskader, da hesten er en velegnet dyremodel til den humane forskning af skader i ledbrusk (22, 23). Behandling med stamceller fra knoglemarv er hyppigt anvendt (22, 24), men det er uvist om det altid er det mest optimale væv at udvinde de ønskede stamceller fra (25, 26). Der forskes derfor i forskelle på stamceller fra andre alternative væv, og i hvordan cellespecifikke egenskaber kan udnyttes bedst muligt til at fremme arbejdet med stamcellebehandling af lidelser. Formålet med dette projekt er at undersøge, om der er en forskel i cellernes potentiale til at udvikles i en hhv. adipogen, osteogen og chondrogen retning (3-vejs differentiering) afhængigt af deres ophav in vivo. I dette projekt indgår formodede multipotente mesenchymale stromale celler (MSC er), der dyrkes i de tre retninger og efterfølgende valideres for deres for deres differentieringspotentiale via histologisk undersøgelse og måling af enzym-aktivitet. Gennem dette arbejde er det målet at søge beviser for, at cellerne besidder nogle af de stamcelleegenskaber, der er angivet af Mesenchymal and Tissue Stem Cell udvalget for ISCT (The International Society for Cellular Therapy) som minimalkriterier for definering af MSC er (27). Følgende hypoteser undersøges i projektet: Hypoteser: 1. Celler fra fedtvæv og perifert blod, der indgår i dette projekt, kan dyrkes og valideres til MSC er ud fra 3-vejs differentiering og plastikadhærence. 2. MSC er fra perifert blod er bedre til at differentiere i en osteogen og en chondrogen retning end MSC er fra fedtvæv. 3. MSC er fra fedtvæv er bedre til at differentiere i en adipogen retning end MSC er fra perifert blod. 1.2 Projektafgrænsning Denne opgave er et delprojekt af et stort 3-årigt forskningsprojekt omkring stamcellebehandling af ledskader hos heste (28). Forskningsprojektet omhandler og sammenligner stromale celler fra flere typer væv, der valideres for stamcelleegenskaber samt undersøges for respons på et inflammatorisk mikromiljø og antiinflammatoriske lægemidler. Denne opgave har et omfang på 30 ECTS point, og er derfor afgrænset til kun at omhandle validering af MSC er fra fedtvæv og perifert blod i form af 3-vejs differentiering. Dette speciale kigger kun på prøver fra 3 ud af de i alt 8 heste, der vil indgå i forskningsprojektet. 2

15 Vævsprøver til isolering af stamcellerne til dette projekt er udtaget aseptisk umiddelbart efter aflivning ved boltpistol og afblødning af hestene. Vævsudtagning samt oprensning, isolering, opformering og kryopræservering af cellerne er udført af Lise C. Berg og Line N. Thomsen, forud for opstarten på dette speciale, og er derfor ud over indholdet af denne opgave. Optøning af cellerne er ved projektets start udført i samarbejde med Lise C. Berg og Line N. Thomsen. Snitning på mikrotom af paraffinindstøbte cellepellets er udført at laborant Helle Vestergaard Ruby. De efterfølgende histologiske farvninger er udført i samarbejde med Helle Vestergaard Ruby. 3

16 4

17 2 Teori 2.1 Stamceller Stamceller defineres ved at have in vivo kapaciteten til 1) selvfornyelse, 2) ekstensiv proliferation og 3) udvikling til en eller flere celletyper (18). Stamceller er grundstenene til udviklingen fra zygote til embryo (embryonale stamceller), og senere i det postnatale dyr (adulte stamceller) til en kontinuerlig fornyelse af væv samt reparation af vævstab (19). Stamcellers evne til at differentiere sig, deres potens opdeler dem i undergrupper. Totipotente stamceller er de mest potente, der kan udvikles til celletyper af alle kroppens væv samt ekstraembryonalt væv som placenta. De findes kun i de helt tidlige stadier af udviklingen, før dannelsen af blastocysten (29). Pluripotente stamceller findes i den indre cellemasse af blastocysten inden fosterdannelsen og kan blive til celler af alle kroppens væv. Multipotente stamceller er adulte stamceller, der kan differentieres til celler med samme oprindelse som stamcellens kimlag (endo-, ekto- eller mesoderm). Det er påvist in vitro, at nogle multipotente stamceller kan trans-differentieres til celler af et andet kimlag end stamcellens egen oprindelse (30). Dette begreb betegnes plasticitet og er omdiskuteret i forskningen af stamceller. Unipotente stamceller er stamceller i et specifikt organ, der kan blive til celletyper af det pågældende organ og står for den kontinuerlige vævsfornyelse (18, 19). Figur 1: Klassifikation af stamceller, opstillet i et skematisk overblik. En stamcelle defineres ved at opfylde følgende tre kriterier in vivo; evnen til 1) selvfornyelse 2) ekstensiv proliferation og 3) differentiering til minimum én anden celletype. Stamceller opdeles prænatalt i embryonale stamceller (ESC), der kan være toti- eller pluripotente med en meget stor differentieringsevne, og i postnatale adulte stamceller, der kan være multi- eller unipotente og har en lavere differentieringevne. Multipotente stamceller kan differentieres til celler med samme oprindelse som stamcellens kimlag. De grønne stiplede pile illustrerer begrebet plasticitet, der er evnen til at differentiere til en celletype af et andet kimlag end stammcellens egen oprindelse. GI; gastro-intestinal. (Egen figur, modificeret fra De Schauwer et al. 2011). 5

18 I takt med den stigende forskning opdages hele tiden nye egenskaber af stamcellerne. Der er derfor også til dels modstridende forklaringer på definitionen og nomenklaturen af de forskellige stamcelleinddelinger. Cellernes oprindelse, proliferative kapacitet, specifikke overflademarkører, specifikke genekspressioner og evne til differentiering er markører, der adskiller cellerne fra hinanden og giver dem forskellige karakteristika (19). 2.2 Multipotente mesenchymale stromale celler (MSC) Nomenklaturen stamcelle i videnskabelige fora er vidt udbredt til en lang række forskning i og arbejde med celler, uden at disse altid imødekommer specifikke stamcelle-kriterier. Mesenchymal and Tissue Stem Cell udvalget for ISCT (The International Society for Cellular Therapy) har foreslået den mere dækkende nomenklatur multipotente mesenchymale stromale celler til beskrivelse af fibroblastlignende plastikadhærente celler uanset ophav, samt MSC som anvendt forkortelse for disse celler (31). Dette er gjort for at skabe en videnskabelig korrekt standardiseret terminologi, til at fremme udveksling af viden mellem biomedicinske forskere og formidle viden til offentligheden, uden at skabe urealistiske forventninger. De har ligeledes opstillet en række minimalkriterier for definering af humane MSC er, for at mindske uoverensstemmelser og bedre kunne sammenligne videnskabelige studier inden for dette felt (tabel 1) (27). Tabel 1: ISCT s minimalkriterier til identifikation af humane MSC er. 1. Plastikadhærence i standard cellekultur-forhold 2. In vitro differentiering i adipogen, osteogen og chondrogen retning (3-vejs differentiering) 3. Specifik overfladeantigen ekspression og fravær af hæmatopoetiske overflademarkører Positive ( 95% ekspression): CD 73 CD 90 CD 105 Negative ( 2% ekspression): CD 34 CD 45 CD 14 eller CD 11b CD79α eller CD 19 MHC-II Forskning i MSC er startede tilbage i 60 erne og 70 erne med celler fra knoglemarv fra mus (32-34). I dag forskes der i MSC er fra mange species og en lang række andre væv (26, 35-38), og trods lignende karakteristika viser data, at der er forskelle på MSC er ikke blot fra forskellige species (39-41), men også fra forskellige oprindelsesvæv (25, 37, 40, 42). I den veterinære equine forskning af MSC er er det alment brugt at benytte kriterierne for plastikadhærence og 3-vejs differentiering til validering af MSC er, tillige med en karakteristisk cellemorfologi (24, 41). Men ekspression af overfladeantigener er ikke standardiseret som et minimumskriterie, da der ikke er opstillet en liste i lighed med den definerede for humane MSC er, grundet at der kun er omkring 4% krydsreaktivitet af antistoffer mod CD molekyler mellem MSC er fra mennesker og heste (43). Morfologien af udifferentierede equine MSC er er delvist varierende fra lange smalle ten-formede celler til mere kubiske med korte cytoplasmatiske udstikkere, og beskrives ofte som fibroblastlignende celler (29, 44). Morfologien kan variere afhængigt af cellernes oprindelsesvæv, hvor MSC er fra knoglemarv og fedtvæv har mere spindelformet morfologi, og MSC er fra navlestrengsblod og -væv er mere runde i formen (24). 6

19 Tabel 2: Metoder til karakterisering af equine MSC er. 1. Morfologi 2. Evne til plastikadhærence 3. 3-vejs differentiering 3.1. Histologi: specifikke farvninger samt morfologi af differentierede celler 3.2. Gen-ekspression på mrna niveau: specifikke gener og transskriptionsfaktorer 3.3. Immunofænotypisk karakterisering: cellulære proteinmarkører 2.3 Dyrkning af MSC er Ved dyrkning af celler in vitro forsøges at skabe et dyrkningsmiljø, der simulerer forholdene for cellens miljø in vivo. Der er derfor afgørende krav til temperatur, ph, osmolaritet og næringsstoffer til cellerne (45). Den optimale temperatur for de fleste pattedyrceller ligger omkring 37,5 C (46). Cellerne dyrkes i et medie der indeholder næring til cellerne og fjerner metaboliske affaldsprodukter. Pattedyrceller er sensitive og vil ofte reagere på suboptimale dyrkningsforhold som ændringer i ph værdi, hvorfor mediet indeholder en buffer der opretholder et optimalt ph omkring 7,2-7,4 (46). Natriumbicarbonat (NaHCO 3) er en standardbuffer, der benyttes i et system med atmosfærisk kuldioxid (CO 2). NaHCO 3 ækvilibreres af CO 2 og H 2O ud fra følgende kemiske ligning: CO 2 (g) HCO 3 + H + H 2 CO 3 CO 2 (d) + H 2 O Mediet er ofte tilsat serum, der medvirker til at skabe de essentielle forhold for cellen (45). Serum indeholder uorganiske ioner, kulhydrater, lipider, proteiner, aminosyrer, nukleotider, hormoner, vitaminer og vækstfaktorer (46). Det mest anvendte er føtal bovin serum (FBS), men der findes eksempler på succesfuld differentiering af MSC er dyrket i serumfri medier (47, 48). Mikroorganismer vil ligesom pattedyrceller trives godt i disse dyrkningsmedier. Derfor er tilsætning af antibiotika og antimykotika samt et sterilt miljø en nødvendig standardprocedure ved celledyrkning (49). Brug af antibiotika og antimykotika i dyrkningsmedie bør dog holdes op imod den ulempe, at det samtidig kan være hæmmende for de MSC er vi ønsker at dyrke (50, 51). MSC er fra forskellige species har forskellige krav til et optimalt dyrkningsmedie (52), og evnen til differentiering i en ønsket retning er begrænset af mediesammensætningen (53, 54) vejs differentiering Ved 3-vejs differentiering dyrkes celler in vitro i en adipogen, osteogen og chondrogen differentieret retning. Målet er, via signalering til cellerne med udvalgte stoffer, at påvirke dem til at differentiere sig i en grad, så de udviser målbare egenskaber tilsvarende in vivo egenskaber for cellerne i det væv der differentieres imod. For eksempel at celler dyrket i 7

20 en adipogen retning er i stand til at danne lipid (55), celler dyrket i en osteogen retning kan danne ekstracellulært calcium (56), og celler dyrket i en chondrogen retning kan danne ekstracellulært matrix rigt på proteoglykaner og type II kollagene fibre (57). Det er endnu ikke fuldt forstået i detaljer, hvad alle de anvendte stoffer til signalering af cellerne gør, og i hvor stor grad de virker synergistisk, eller hvad den optimale varighed af inducerede dyrkninger er. Der er heller ikke er fuld enighed om de korrekt anvendte koncentrationer. Dette resulterer i en manglende standardisering af differentieringsprotokoller. Dexamethason er et tydeligt eksempel på dette. Dexamethason anvendes almindeligvis både til at signalere differentiering i en osteogen (58), chondrogen (41) og adipogen (59) retning. Dexamethason er både tids- og dosisafhængigt. En lav koncentration vil inducere MSC er i en osteogen retning, og en høj koncentration vil påvirke glucocorticoidreceptorer til at starte en signaleringskaskade i en adipogen differentiering (60). Man kan på trods af dette se en 100 x forskel i anvendt koncentration ved sammenligning af adipogene protokoller for MSC er fra samme species og væv. I en sammenligning af adipogene protokoller for MSC er fra humant knoglemarv er der anvendte doser for dexamethason på 0, 10, 100 og 1000 nm (61). I 1985 fandt Tenenbaum et al. frem til, at 100 nm var den optimale koncentration af dexamethason til osteogen differentiering af celler fra periost fra høns (62). Det har herefter været almindeligt at bruge 100 nm dexamethason til osteogene differentieringsmedier til celler fra både andre væv og species. I 2001 viste Walsh et al. at 10nM dexamethason er en mere optimal koncentration, da den er nærmere et naturlig fysiologisk niveau, samt at en for høj koncentration af dexamethason kan være hæmmende for cellernes proliferative evne (63). Song et al. fandt igen i 2012, at en initiel tilsætning af dexamethason i en høj koncentration (100 nm) den første uge, efterfulgt af lav koncentration (10 nm) i resten af dyrkningsperioden var det mest optimale for osteogen differentiering (64). I bilag 1 findes tabeller til sammenligning af anvendte adipogene, osteogene og chondrogene differentieringsprotokoller fra nyere videnskabelige studier, til illustration af de meget varierende metoder, der anvendes. Varigheden af differentieringsperioden, supplerende tilsætningsstoffer og koncentration af de forskellige stoffer sammenlignes. Adipogenese Protokoller for adipogen differentiering indeholder oftest et medie tilsat kaninserum, insulin, dexamethason, 3-isobutyl- 1-methyl-xanthin (IBMX) og et insulin-sensitivt stof af gruppen thiazolidinedion (indomethacin (65), rosiglitazone (65) eller troglitazone (66)). Kaninserum har en høj koncentration af frie fede syrer, hvilket flere studier har vist er nødvendigt for induktion af adipogenese (40, 67-69). Andre studier har dog vist succesfulde resultater for adipogenese med medier uden kaninserum, og et studie med ovine MSC er har vist succesfuld adipogen differentiering af MSC er fra knoglemarv, fedtvæv og synovialmembran, i et medie uden hverken kaninserum eller insulin (60, 70), hvilket igen tydeliggør den mangelfulde forståelse for mekanismerne, der ligger bag cellernes evne til at differentiere (59). De supplerende stoffer virker ved et komplekst samspil af mekanismer, hvor blandt andet insulin aktiverer preadipocyt receptorer (59), dexamethason aktiverer glucocorticoidreceptor (60), og IBMX opregulerer cyklisk AMP (65) der alle fører til mekanismer, der medfører aktivering af vigtige transskriptionsfaktorer for adipogenese, som for eksampel PPAR-ƴ (29). Cellerne dyrkes i monolagskultur, enten med samme induceringsmiddel gennem hele dyrkningperioden eller som cyklisk dyrkning (71), hvor der veksles mellem et induceringsmiddel indholdende alle induceringsfaktorer efterfulgt af et vedligeholdelsesmedie, hvoraf nogle faktorer, typisk IBMX og et thiazolidinedion, mangler. En begyndende adipogen konvertering, kan typisk erkendes efter blot 24 timer i et adipogent induktionsmedie (65). 8

21 Oil Red O farvning af dannede intracellulære lipiddråber er den mest anvendte metode til validering af adipogent differentieringspotentiale. Oil Red O er selektiv for farvning af lipid, og det er vist, at der er en direkte proportional sammenhæng mellem graden af adipogen konvertering, og graden af Oil Red O farve, der optages (55). Af andre metoder kan nævnes måling af ekspression af proteinet adiponectin (72) eller transskriptionsfaktoren PPAR-ƴ (29), der begge er meget specifikke for adipocytter. Osteogenese Standardproceduren til induktion af osteogen differentiering er dyrkning som monolagskulturer i et medie tilsat en kombination af dexamethason, ascorbinsyre og β-glycerofosfat (58). Dexamethason anvendes ofte til differentiering af celler i en osteogen retning ved opregulering af forskellige gener, der inducerer expression af Runx2, en afgørende transskriptionsfaktor for den tidlige fase af osteogenesen. Ascorbinsyre faciliterer osteogen differentiering ved at øge produktion af kollagen type I, som sekundært giver en signaleringskaskade, der aktiverer Runx2. β-glycerofosfat er både en fosfatkilde til hydroxyapatit, et vigtigt krystallisk mineral i knoglevæv, og fosforylerer intracellulære signalmolekyler, medvirkende til aktivering af Runx2 (29, 58). Hyppigt anvendte metoder til påvisning af osteogen differentiering er måling af alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet, et enzym, der findes i særlig høj koncentration i blandt andet knoglevæv (24, 44). På et senere stadie af osteogenesen kan farvning med Alizarin Rød S og Von Kossa for ekstracellulær aflejring af calcium og fosfatsalte anvendes (29). Andre muligheder for validering af differentiering i en osteogen retning er påvisning af Runx2 transskriptionsfaktor og genekspression af osteonectin, et calcium-bindende glycoprotein, der interagerer med hydroxyapatit og initierer osteogenese (73). Ligeledes kan påvisning af de osteogent relaterede proteiner som kollagen type I og osteocalcin påvises (74). Chondrogenese Chondrogen differentiering induceres hyppigst med et medie suppleret med dexamethason, ascorbinsyre, TGF β (transforming growth factor beta) og eventuelt BMP (bone morphogenetic protein). Chondrogenese kan induceres både som monolagskultur (66, 75) eller i 3D struktur som pellets, der tillader celle-celle interaktioner analogt til dem, der ses ved præcartilaginøs dannelse under den embryonale udvikling (76). Effekten af de supplerende stoffer er omdiskuteret. Dexamethason er anerkendt til at stimulere chondrogen differentiering af MSC er fra både mennesker, heste, rotter og kaniner (76-79). Flere studier har vist, at TGF β er nødvendig for chondrogenesen, og at dexamethason ikke er tilstrækkeligt alene (80). Andre studier peger på, at både TGF β og BMP er afgørende vækstfaktorer (39, 57, 68). Et højt glucoseindhold menes også at have en afgørende betydning (81). Chondrogene pellets øges både i størrelse og vægt ved succesfuld chondrogenese, som udtryk for kontinuerlig dannelse af ekstracellulært matrix under differentieringen (48). De histologiske farvninger Alcian Blue, Safranin O og Toluidin Blå, til påvisning af proteoglycaner i dannet matrix, er hyppigt anvendte metoder til påvisning af chondrogen differentiering (29). Morfologisk undersøgelse for ekstracellulær matrix og lacunaedannelse hører også til den histologiske undersøgelse for chondrogenese (39). Andre muligheder er påvisning af transskriptionsfaktoren Sox-9, der positivt regulerer ekspressionen af kollagen og ekstracellulær matrix i chondrocytter, påvisning af kollagen type II, der danner netværket af matrix og påvisning af aggreccan, den mest udtrykte proteoglykan i ledbrusk (73). 9

22 10

23 3 Materialer og metode Afsnittet dækker materialer og metoder, der er brugt til udførelse af dette projekt. Det er beskrevet, hvordan der er udført en 3-vejs differentiering af equine MSC er fra fedtvæv og perifert blod, og hvordan de færdigdyrkede celler efterfølgende er valideret i form af histologiske farvninger og målinger for alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet. I slutningen af dette afsnit er firma og produktnummer for anvendte produkter oplistet alfabetisk. Oplysninger om de anvendte farvestoffer er angivet i differentieringsprotokollerne i bilag. Der gives en kort gennemgang af de anvendte protokoller, og henvises til bilag 2, 3 og 4 for en detaljeret og fuldstændig gennemgang. Alt arbejde med dyrkning af cellerne er foregået sterilt i en LAF-bænk i et cellelaboratorium. Alle cellerne er dyrket i en inkubator ved 37 C, 5% CO 2 og høj luftfugtighed. Dyrkningsflasker og falconrør har haft løstsiddende låg. Figur 2: Flowdiagram, til overblik over cellernes gang, fra optøning til validering efter 3-vejs differentiering. 11

24 De anvendte celler til dette projekt stammer fra 3 middelstore heste, af almindeligt forekommende racer i Danmark, i alderen 7-10 år. Cellerne har ophav fra subkutant fedtvæv fra regio glutealis caudalis, (AT-MSC) og perifert blod fra v. jugularis (PB-MSC). Cellerne er forud for projektets opstart kryopræserveret som hhv. passage 1 (celler fra perifert blod) og passage 2 (celler fra fedtvæv). Tabel 3: Oplysninger om de 3 heste, cellerne i dette projekt stammer fra. Hest Alder (år) Race/køn Estimeret stangmål (cm) Estimeret vægt (kg) Aflivningsårsag varmblod/vallak pladsmangel islænder/vallak benproblem islænder/hoppe smider ejer af Optøning og dyrkning af celler De kryopræserverede celler optøs, udsås som passage 2 (PB-MSC) og 3 (AT-MSC) og dyrkes til fuld konfluens. Optøningsproceduren blev udført i samarbejde med Line N. Thomsen og Lise C. Berg. - Hætteglas fra flydende nitrogen med cellerne optøs langsomt i lunkent rindende vand. Herefter pooles cellerne og overføres til 15 ml falconrør, hvor de tilsættes opvarmet dyrkningsmedie (tabel 4). Mediet tilsættes initialt med 1 dråbe ad gangen, indtil ca. 1 ml, hvorefter det tilsættes gradvist hurtigere indtil et totalvolumen på 5 ml. Cellerne renses herefter 1-2 gange ved centrifugering i steril PBS, for at fjerne overskydende DMSO. Cellerne fordeles til T75 dyrkningsflasker med 12 ml dyrkningsmedie (tabel 4) pr flaske. Der skiftes medie hver dag indtil fuld konfluens. Trypsinering og celletælling Ved fuld konfluens trypsineres cellerne fra fedtvæv og perifert blod (AT-MSC og PB-MCS) og tælles på et hæmocytometer. - Dyrkningsmediet fjernes, og PBS tilsættes. Efter et par min. fjernes PBS, trypsin tilsættes (10-12 ml/t75 flaske) og flaskerne stilles i inkubatoren. Efter 5-10 min. kontrolleres cellerne ved mikroskopering for plastikadhærence. Har cellerne sluppet plastikunderlaget tilfredsstillende, overføres trypsin/celler til 15 ml falconrør. Trypsin inaktiveres ved tilsætning af et par ml FBS. Rørene centrifugeres (5 min./500 g), og supernatanten fjernes, dog efterlades en lille smule, så cellerne ikke fejlagtigt suges op. Cellerne pooles i et fælles 15 ml falconrør og centrifugeres (5 min./500 g). Supernatanten fjernes og cellerne skylles evt. en ekstra gang ved centrifugering i PBS. Der tilsættes 2-3 ml FBS, og cellesuspensionen opslæmmes. - Den nyligt opslæmmede cellesuspension fortyndes i methylviolet farveopløsning. Afhængig af hvor stor celletætheden er, laves enten en 1:100 opløsning (1 µl cellesuspension til 99 µl methylviolet) eller en 1:10 opløsning (10 µl cellesuspension til 90 µl methylviolet). Cellerne tælles på et hæmocytometer. Opløsningen skal være godt 12

25 opslæmmet, inden den overføres til tællerkamrene, og der tælles i minimum 4 kvadranter. Antal celler i cellesuspensionen beregnes herefter ud fra følgende formel: N F ( 1 ) = antal celler/ml cellesuspension V Hvor N = gennemsnitligt antal celler pr. talt kvadrant F = fortyndingsfaktor (her enten 10 eller 100) V = volumen af 1 kvadrant (V= 0,1 mm 3 for det anvendte Bürker-Türk tællekammer (= 1*10-4 ml)). 3-vejs differentiering (se bilag 2, 3 og 4 for mere detaljerede beskrivelser) Efter celletælling dyrkes cellerne videre i en adipogen, osteogen og chondrogen retning (3-vejs differentiering). AT-MSC dyrkes nu i passage 4, og PB-MSC i passage 3. Ikke differentierede celler dyrkes i et basalt celledyrkningsmedie (tabel 4) baseret på Dulbecco s Modificerede Eagle s Medium med lav glucose indhold (DMEM-lg), tilsat føtal bovin serum (FBS), 10% for celler fra fedtvæv og 30% for celler fra perifert blod, antibiotika (1% pencillin/streptomycin og 50 µg/ml gentamycin) og antimykotika (0,25 µg/ml fungizone). Ved differentieringsopstart dyrkes kontrolceller videre i samme medie, men uden fungizone. - De adipogent og osteogent differentierede cellelinjer dyrkes som monolagskulturer i 6-brønds bakker med 2 ml medie pr. brønd. Der udsås 3000 udifferentierede, formodede MSC er pr. cm 2 vækstareal og dyrkes indtil fuld konfluens, hvorefter differentiering induceres. For de adipogent differentierede linjer, skiftes mediet hver tredje dag i 6 dage. For de osteogent differentierede linjer foretages medieskift hver fjerde dag i 20 dage. Det adipogene medie (tabel 5) er DMEM-lg suppleret med 15% kaninserum (RS), 1 µm dexamethason, 0,5 mm 3-isobutyl-1- methyl-xanthine (IBMX), 10 µg/ml rekombinant humant insulin, 0,2 mm indomethacin og antibiotika. Det osteogene medie (tabel 5) er et DMEM-lg suppleret med 10% FBS, 0,1 µm dexamethason, 10 mm β-glycerofosfat, 50 µm L-ascorbinsyre-2 fosfat og antibiotika. - De chondrogent differentierede cellelinjer dyrkes i 3D struktur som pellets i 15 ml falconrør, med 2,5 x 10 5 MCS er pr. rør. Der dyrkes i 0,5 ml medie pr. falconrør, og der skiftes medie hver tredje dag i 30 dage. Det chondrogene medie er et DMEM medie med højt glucoseindhold (DMEM-hg) suppleret med 10% FBS, 0,1 µm dexamethason, 1 µm L-ascorbinsyre-2 fosfat, 10 ng/ml TGF β3 og antibiotika. Tabel 4: Dyrkningsforhold for MSC er fra fedtvæv og perifert blod, forud for inducering, samt til kontroldyrkning. Oprindelsesvæv Medie Serum Supplement Fedtvæv (AT-MSC) DMEM-lg 10% FBS 1% pen/strep 50 µg/ml gentamycin 0,25 µg/ml fungizone * Perifert blod (PB-MSC) DMEM-lg 30% FBS 1% pen/strep 0,25 µg/ml fungizone* *kun indtil induceringstidspunktet 13

26 Tabel 5: Dyrkningsforhold for 3-vejs differentiering af MSC er - differentieringsmedier. Differentieringslinje Medie Serum Supplement Dyrkningsmetode Adipogenese DMEM-lg 15% RS* 1% pen/strep 50 µg/ml gentamycin** 1 µm dexametason 0,5 mm IBMX* 10 µg/ml rh insulin* 0,2 mm indomethacin* Osteogenese DMEM-lg 10% FBS 1% pen/strep 50 µg/ml gentamycin** 0,1 µm dexametason 50 µm L-ascorbinsyre-2-fosfat 10 mm β-glycerofosfat* Chondrogenese DMEM-hg 10% FBS 1% pen/strep 50 µg/ml gentamycin** 0,1 µm dexametason 1 µm L-ascorbinsyre-2-fosfat 10 ng/ml TGFβ3* * tilsættes umiddelbart før medieskift **tilsættes kun medier til dyrkning af celler fra fedtvæv Monolag Monolag Pellet Validering af differentieringspotentiale (se bilag 2, 3 og 4 for mere detaljerede beskrivelser) Ved afsluttet dyrkning valideres cellerne på forskellig vis for kontrol af deres differentieringspotentiale. - For validering af adipogen differentiering fikseres cellerne i 4% paraformaldehyd i 10 min. ved stuetemperatur og farves med Oil Red O i 15. min. ved stuetemperatur. Herefter vurderes visuelt ved mikroskopering for farvede cytoplasmatiske lipiddråber. - For validering af chondrogen differentiering indstøbes pellets i paraffin, snittes og farves med Hæmatoxylin- Eosin (HE), Toluidin Blå (TB) og Safranin O (SO). De HE-farvede præparater vurderes visuelt for celleformologi, ekstracellulær matrix og laconaedannelse, og størrelsen af pellet måles til sammenligning af pelletstørrelse ved dag 0. TB- og SO-farvede præparater vurderes for positiv farvning af proteoglycaner. - For validering af osteogen differentiering fikseres cellerne i iskold 70% ethanol i 5 min. ved stuetemperatur og farves med Alizarin Rød S i 3 min. ved stuetemperatur. Herefter vurderes visuelt for farvet ekstracellulært calcium depot. For yderligere validering af osteogen differentiering laves en kvantitativ måling af cellernes ALP-aktivitet. Cellerne overføres til eppendorfrør, skylles i PBS, centrifugeres, isoleres for supernatant og nedfryses forud for ALP måling. Det anvendte kit 2 til målingen benytter para-nitrofenyl-fosfat (pnpp) som en fosfatkilde. ALP enzymet defosforylerer pnpp til pnp. Kolorimetrisk måling af pnp for hver replikat anvendes, som et respons på ALPaktiviteten i prøverne. En række standardmålinger, med kendte pnpp koncentrationer anvendes som reference for absorbansmålinger til at få oplyst pnp koncentrationer for celleprøverne. Der blev lavet dublikatmålinger af både standard- og celleprøver. Se bilag 4 og 5 for præcis udførelse og resultater af målingerne. 2 Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric) - Abcam ab

27 I resten af opgaven er celleprøver fra hver hest forkortet fx AT4. Tabel 6 viser hest, oprindelsesvæv og passagetrin for de brugte forkortelser. Tabel 6: Donorhest, oprindelsesvæv og passagetrin for de omtalte cellelinjer i resten af opgaven. Kolonnen til venstre angiver forkortelsen for cellelinjen, der vil blive brugt i resten af opgaven. Hest Væv Passagetrin (p) Cellelinje AT Fedtvæv (AT) p4 AT0414 msc p4 AT Fedtvæv (AT) p4 AT0514 msc p4 AT Fedtvæv (AT) p4 AT0614 msc p4 PB Perifert blod (PB) p3 PB0414 msc p3 PB Perifert blod (PB) p3 PB0514 msc p3 PB Perifert blod (PB) p3 PB0614 msc p3 Produktinformation (produktnavn, firma og produktnummer) Ascorbinsyre (L-ascorbic acid 2-phospahte sesquimagnesium salt hydrate. Sigma-Aldrich A8960-5G) β-glycerofosfat (β-glycerophosphate disodium salt hydrate. Sigma-Aldrich G G) Dexamethason (Dexamethasone-Water Soluble. Sigma-Aldrich D MG) DMEM-hg (DMEM high glucose, GlutaMAX TM Supplement, pyruvate. Gibco ) DMEM-lg (DMEM low glucose, GlutaMAX TM Supplement, pyruvate. Gibco ) DMSO (Dimethyl sulfoxide. Sigma-Aldrich D ml) FBS (FBS. Gibco ) Fungizone (Fungizone Amphotericin B 250 µg/ml. Gibco ) Gentamycin (Gentamicin sulfate salt. Sigma-Aldrich G1264-1G) IBMX (3-isobutyl-1-methylxantine. Sigma-Aldrich MG) Indomethacin (Indomethacin. Sigma-Aldrich G) Insulin (Insulin, human. Recombinant (yeast). Roche ) Kaninserum (Rabbit serum. Gibco ) Methylviolet (Methylviolet-eddikesyreopløsning (K.ø.o.l.R45). Veterinærapoteket Københavns universitet ) PBS (Phosphate Buffered Saline Tablets. Calbiochem ) Pen/strep (Penicillin Streptomycin Solution. HyClone SV30010) TGF β3 (Recombinant Human TGF-beta 3. R&D Systems 243-B3-101) Trypsin (0,05% Trypsin-EDTA (1X). Gibco ) 15

28 16

29 4 Resultater Alle dyrkede celler i projektet udviste plastikadhærence og havde inden opstart af 3-vejs differentiering en fibroblastlignende aflang, spindelformet cellemorfologi karakteristisk for MSC er, samt en tydelig tendens til at ligge parallelt i strømlinede mønstre (figur 4). Der var ingen visuel forskel på cellerne fra fedtvæv og perifert blod, og cellerne fra begge væv havde en høj proliferativ vækst og opnåede fuld konfluens efter 4-8 dage fra udsåning i 6-brøndsbakker med 3000 celler pr cm 2. Dog var cellerne fra fedtvæv fra hest 0414 (AT4) lidt længere tid om at opnå fuld konfluens (7-10 dage). Kontrol og differentierede celler fra perifert blod fra alle tre heste (PB4, PB5 og PB6) mistede på forskellige tidspunkter af dyrkningen deres plastikadhærence, løsnede sig fra bunden af brønden som et sammenhængende lag af celler og rullede sig op i en makroskopisk klump i mediet. Herefter udbredtes, i de fleste tilfælde, en ny population af plastikadhærente celler, dog med en markant nedsat proliferativ vækst sammenlignet med det første hold celler. Der var ikke noget klart mønster at spore i forhold til det miljø, cellerne blev udsat for, når de mistede plastikadhærencen, men der var en tendens til, at cellerne var fuldt konfluente. Dette tab på plastikadhærence blev ikke observeret for celler fra fedtvæv. Figur 3: Monolagskultur af celler, der mister plastikadhærencen og ruller sig op i en makroskopisk klump i mediet. Ved den adipogene og osteogene differentiering var der tydelig forskel på cellerne fra de to forskellige væv, både i form af den ændrede cellemorfologi undervejs i differentieringen, samt i cellernes indbyrdes beliggenhed. Der er derfor lavet en beskrivelse af cellernes vækst undervejs i dyrkningsperioden, såvel som en beskrivelse af det endelige resultat. Slutresultaterne er efter disse beskrivelser kort opsummeret i en oversigtstabel. Oil Red O og Alizarin Rød S farvningerne blev visuelt tolket (en semi-kvantitativ vurdering) og inddelt i en af fire kategoriske inddelinger ( ), (+), (++) og (+++) repræsenterende graden af farvet materiale (tabel 7): Tabel 7: Inddeling for visuel vurdering af farveresultater (Oil Red O og Alizarin Rød S). Intet farvet + Minimalt farvet ++ Moderat farvet +++ Meget farvet 17

30 Figur 4: Udifferentierede celler med en fibroblastlignende aflang, spindelformet cellemorfologi karakteristisk for MSC er. Cellerne ligger parallelt i et strømlinet mønster. 4.1 Adipogen differentiering AT-MSC; udvikling, morfologi og Oil Red O farvning Alle tre cellelinjer udviklede sig ens, og bliver derfor beskrevet samlet i det følgende. På dag 0 var baseline Oil Red O farvningen negativ ( ). Cellerne i kontrolbrøndene forblev morfologisk uforandrede gennem hele dyrkningsperioden. På dag 3 havde de adipogent differentierede celler samlet sig til centrum af brøndene. Cellemorfologien var tydeligt ændret fra de aflange fibroblastlignende celler, til store celler med en tydelig centralt beliggende rund cellekerne omgivet af et stort cytoplasma. Cellekernerne var 3-5 gange større end på dag 0 (visuelt vurderet). Cellernes form varierede mellem kantede, afrundede, ovale og trekantede. Der var tydelige multiple, runde granula i cytoplasmaet. På dag 5 og 6 var cellerne uændrede. Oil Red O farvningen på dag 6 var stærkt positiv (+++). Store tydelige, velafgrænsede lipiddråber udfyldte hele cytoplasmaet på alle differentierede celler. Kontrolcellerne havde uændrede morfologi, men viste ved Oil Red O farvning enkelte små lipiddråber i cytoplasmaet (+). Dette var mest tydeligt i områder med høj celletæthed, og der var en anelse mere positivt farvet materiale i cellerne fra AT4 end for AT5 og AT6. Se figur 5 for billeder af cellerne. PB-MSC; udvikling, morfologi og Oil Red O farvning På dag 0 var baseline Oil Red O farvningen for PB4 tydeligt positiv (++) med multiple tydelige små lipiddråber jævnt fordelt i cellernes cytoplasma. Cellerne var kun omkring 40% konfluente, og enkelte celler havde en ændret morfologi med cytoplasma mere centreret omkring cellekernen. PB4 blev ikke dyrket færdig, grundet kontaminering. For PB5 og PB6 var baseline Oil Red O farvningen på dag 0 svagt positiv (+) med enkelte små lipiddråber i cytoplasmaet. På dag 2 ændrede cellerne i differentieringsmediet tydeligt morfologi. Cellerne var stadig aflange og spindelformede, men kun ca. en fjerdedel af deres oprindelige længde, og den indbyrdes strømlinede placering var erstattet med kaotisk arrangerede tætliggende, celler. I enkelte brønde havde cellerne for PB6 løsnet sig fra plastikunderlaget, som beskrevet tidligere. I disse brønde med ca. 5% konfluens var cellemorfologien ændret til samme morfologi som de adipogent differentierede 18