In vitro studie af fedtvævsderiverende mesenkymale stromale cellers parakrine aktivitet.

Transkript

1 In vitro studie af fedtvævsderiverende mesenkymale stromale cellers parakrine aktivitet. Bacheloropgave Udarbejdet af Tina Toppevad Skov Professionshøjskole Metropol Bioanalytikeruddannelsen Projektperiode: Efteråret 2012 Antal anslag i opgaven: Antal sider: 109 Vejleder Ulla Tüschow Mol, Lektor, Bioanalytikeruddannelsen, København Louise Hansen, Bioanalytiker, Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet Annette Ekblond, leder af Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet

2 Fra Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser BEK nr 714 af 27/06/ En studerende, der under en prøve skaffer sig eller giver en anden studerende uretmæssig hjælp til besvarelse af en opgave eller benytter ikke tilladte hjælpemidler, skal af uddannelsesinstitutionen bortvises fra prøven. Stk. 2. Opstår der under eller efter en prøve formodning om, at en eksaminand uretmæssigt har skaffet sig eller ydet hjælp, har udgivet en andens arbejde for sit eget eller anvendt eget tidligere bedømt arbejde uden henvisning, indberettes dette til uddannelsesinstitutionen. Bliver formodningen bekræftet, og handlingen har fået eller ville kunne få betydning for bedømmelsen, bortviser uddannelsesinstitutionen eksaminanden fra prøven. Stk. 3. Udviser en eksaminand forstyrrende adfærd, kan uddannelsesinstitutionen bortvise eksaminanden fra prøven. I mindre alvorlige tilfælde giver uddannelsesinstitutionen først en advarsel. Stk. 4. Uddannelsesinstitutionen kan i de i stk. 1-3 nævnte tilfælde under skærpende omstændigheder beslutte, at den studerende skal bortvises fra institutionen i en kortere eller længere periode. I sådanne tilfælde gives en skriftlig advarsel om, at gentagelse kan medføre varig bortvisning. Stk. 5. En bortvisning efter stk.1-3 medfører, at en eventuel karakter for den pågældende prøve bortfalder, og at den studerende har brugt en prøveindstilling, jf. 6, stk. 3. Stk. 6. En studerende skal ved aflevering af en skriftlig besvarelse bekræfte med sin underskrift, der kan være digital, at opgaven er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. stk. 1 og 2. Undertegnede bekræfter hermed, at denne projektrapport er udfærdiget af mig, uden at udgive andres arbejde for mit og uden uretmæssig hjælp jf. ovenstående uddrag af eksamensbekendtgørelsen. Dato: 2. januar 2013 Underskrift: b

3 Forord: Dette projekt er udført i forbindelse med 14. og afsluttede modul på Bioanalytikeruddannelsen, København. Den praktiske del af projektet er udført på Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet. I forbindelse med projektet, vil jeg gerne benytte lejligheden til at takke mine vejledere Louise Hansen og Ulla Tüschow Mol for god konstruktiv vejledning og ikke mindst støtte igennem projektet. Særlig tak til laboratorie leder Annette Ekblond, Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet, for at givet mig muligheden for at være en del af et spændende og til tider udfordrende forskningsprojekt. Det har været utroligt lærerigt. Tak for tiltro igennem projektet. Tak til Sander Pyndt, Lektor på Bioanalytikeruddannelsen, København, samt Bjarke Follin Larsen, Biomediciner, på Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet, for vejledning i forbindelse med resultatbehandling og statistik. Tina Toppevad Skov Figur fra forsiden: c

4 Abstract Formål: I et forsøg på at behandle patienter med iskæmisk hjertesygdom (IHS), anvendes fedtvævsderiverede mesenkymale stromale celler (ADSC) til at regenere det iskæmiske væv. Som understøttelse af studiet MyStromalCellTrial, undersøges om stimulering af ADSC med vascular endothelial growth factor A(VEGF-A) ændrer ved cellernes parakrine aktivitet. Det er sandsynligt at FBS i mediet påvirker eller kamuflerer ADSC parakrine aktivitet. På baggrund af dette, seponeres serum forsøgsvis fra mediet, hvorefter ADSC parakrine aktivitet måles. Anvendelse af xmap teknologi implementeres, med henblik på bestemmelse af ADSC parakrine aktivitet, ved inddragelse af pro-angiogene vækstfaktorer. Metoder: ADSC dyrkes i Dulbecco s Modified Eagle Medium, low glucose (DMEM-LG) tilsat 10 % Føtal Bovin Serum (FBS) og 1 % Penicillin Streptomycin (pen-strep). Når cellerne har opnået en konfluens på 80 %, inddeles cellerne i grupper og stimuleres/dyrkes på forskellig vis. 1/3 af cellerne dyrkes og stimuleres med 50 ng/ml VEGF-A i 2 % FBS medie, 1/3 dyrkes i 10 % FBS medie og 1/3 dyrkes i 2 % FBS medie. Cellerne dyrkes i hhv. 1, 2 og 3 uger, hvorefter mediet serum seponeres og supernatant høstes ved tid 0, 2, 6 og 24 timer. Supernatant analyseres på Luminex 200 TM, via xmap teknologi, som er baseret på flowcelleflourometri. Resultater: Statistisk signifikans blev påvist for Hepatocyte Growth Factor (HGF) i serumholdigt medie, mellem 2 % FBS og 10 % FBS, samt mellem 10% FBS og 2% FBS + VEGF-A. Ligeledes blev statistisk signifikant påvist i serumsponeret medie for VEGF-A, mellem 2% FBS og 10% FBS. For HGF og Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) i serumseponeret medie, blev statistisk signifikant påvist mellem uge 1 og 3, samt uge 2 og 3.Ved seponering af serum fra mediet, indikerede resultaterne at ADSC parakrine aktivitet øges over tid og at den parakrine aktivitet fortsætter efter tid 24. Ekstra forsøg inddrages, for at undersøge ADSC parakrine aktivitet hhv. 48 og 72 timer efter serum seponering. Konklusion: VEGF-A stimulering af ADSC, ændrer ikke på cellernes parakrine aktivitet. Ved at dyrke ADSC i længere tid, øges den parakrine aktivitet. Derudover påvises det, at ved at sænke koncentrationen af FBS i dyrkningsmediet, øges ADSC parakrine aktivitet. Ved serum seponering af mediet, øges ADSC parakrine aktivitet over tid. Ekstraforsøget viste at ADSC parakrine aktivitet fortsat kan påvises i serumseponeret medie efter hhv. 48 og 72 timer. d

5 Indholdsfortegnelse Liste over forkortelser Problembaggrund Formål Problemformulering Uddybning af problemformulering Hypoteser Teori Mesenkymale Stromale Celler (MSC) Fedtvævsderiverede mesenkymale stromale celler (ADSC) Vækstfaktorer Angiogenese Serum Luminex 200 TM Metodevalg Præstudie: Analysering af standardkurver MyStromalCellTrial studie Donorer Valg af vækstfaktorer Celledyrkning Forsøgsopsæt Effekt af medie: VEGF- A stimulering: FBS s indflydelse på ADSC parakrine aktivitet: Pro- angiogene vækstfaktorer i 10 % FBS Seponering af FBS, efterfulgt af høst af supernatant Nedfrysning af supernatant ADSC parakrine aktivitet over tid, ved serum seponeret medie Effekt af dyrkningstid: Celletælling Luminex 200 TM Kvalitetssikring Databehandling Statistik Præsentation af data Etiske overvejelser Materialer og metoder Prøvemateriale Isolation af ADSC fra fedtvæv Celledyrkning Optøning/passage Passage 1 til Passage Celletælling: Forsøgsopsæt; Stimulering med/uden VEGF- A Kontrol af pro- angiogene cytokiner i standarddyrkningsmedie Høst af supernatant Nedfrysning af supernatant Analysering af supernatant på Luminex 200 TM Fremstilling af reagenser til analyse e

6 5.9.2 Opsætning af 96 brønds mikrotiterplade Analysekørsel af 96 mikrotiterplade på Luminex Resultater Præstudie: Analysering af standardkurver: Statistisk signifikant: Effekt af dyrkningsmedier på ADSC parakrine aktivitet: HGF til tiden Effekt af FBS seponering i dyrkningsmediet: VEGF- A til tiden 2,6 og 24: Pro- angiogene cytokiner i 10 % FBS medie: ADSC parakrine aktivitet over tid, ved serum seponeret medie Effekt af dyrkningstid på ADSC parakrin aktivitet FGF- 2 til tiden 2,6 og HGF til tiden 2, 6 og Diskussion Opsummering af projektets formål: Udarbejdelse af protokoller til Luminex 200 TM Præstudie: Analysering af standardkurver Projektets resultater Behandling af data Effekt af dyrkningsmedie: VEGF- A stimulering af ADSC Effekt af FBS i dyrkningsmediet: Sænket serumkoncentration FBS indhold af pro- angiogene vækstfaktorer Effekt af FBS i dyrkningsmediet: Serumseponering ADSC parakrine aktivitet over tid, ved serum seponeret medie Effekt af dyrkningstid på ADSC parakrine aktivitet Projektets pålidelighed Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilagsliste f

7 Liste over forkortelser ADSC Adipose-Derived Stem Cells/Fedtvævderiverede mesenkymale stromale celler ANG-2 Angiopoietin-2 ANOVA Analysis of variance bfgf basic Fibroblast Growth Factor DMEM-LG Dulbecco s Modified Eagle Medium, low glucose FGF-1 Fibroblast Growth Factor 1 FGF-2 Fibroblast Growth Factor 2 FBS Føtal Bovin Serum G-CSF Granulocyte Colony Stimualating Factor HGF Hepatocyte Growth Factor IHS Iskæmisk hjertesygdom ISCT International Society of Cellular Terapi LSD Fischer Least Significant Difference LVEF Left Ventricular ejetion fraction MSC Mesenkymale Stromale celler VEGF-A Vascular Endothelial Growth Factor A VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Pen-Strep Pencillin-Streptavidin Streptavidin-RPE Streptavidin R-Phycoerythin 1

8 1.0 Problembaggrund Ifølge registerstudier har danskere iskæmisk hjertesygdom (IHS), hvilket årligt fører til indlæggelser og dødsfald (1). Iskæmisk hjertesygdom er et resultat af hel eller delvis blokering af hjertes koronararterier. Ved delvis blokering af koronararterierne, vil myokardiet danne nye blodkar (angiogenese) i et forsøg på at genoprette perfusionen til myokardiet. Kroppens forsøg på genoprettelse, er ofte ikke tilstrækkelig, og det vil resultere i myokardie hypoperfusion, tab af funktionelle kardiomyocytter og distale og systole dysfunktioner, hvilket fører til angina pectoris, dyspnø og i værste tilfælde døden (2;3). Patienter med IHS bliver i dag behandlet med medicin, ballonudvidelse eller by-pass operationer. En stor gruppe af patienterne responderer dog ikke tilfredsstillende på de tilgængelige behandlinger (1). I et forsøg på at hjælpe patienter i behandlingen af iskæmisk hjertesygdom, undersøges nye behandlingsformer. En ny behandlingsform er regenerativ medicin, hvor stamceller anvendes til at regenerere det syge væv (2). I de fleste kliniske studier, omhandlende behandling af IHS, er Mesenkymale Stromale Celler (MSC) isoleret fra knoglemarv anvendt. I knoglemarven er koncentrationen af MSC så lav, at det er nødvendigt at dyrke cellerne i adskillige uger, for at få nok til at foretage kliniske studier (1;4;5), hvilket både er tidskrævende og dyrt. Det viser sig derimod, at i fedtvæv er koncentrationen af fedtvævderiverede stromale celler (ADSC) gange større end koncentrationen af MSC i knoglemarven (2). Det betyder, ved anvendelse af fedtvæv frem for knoglemarv, nedsættes den tid cellerne skal opformeres før videre behandling. Derudover har brugen af ADSC til klinisk formål, den fordel, at ADSC er lette at høste fra patients abdomen ved et simpelt indgreb (fedtsugning) (2). ADSC har vist sig at være en god kilde til regenerationen af iskæmisk hjertevæv, da ADSC biologisk set ligner MSC fra knoglemarven (2;6;7). Prækliniske studier har indikeret at ADSC kan differentierer til celletyper, såsom endotelceller og kardiomyocytter. Endotelcellerne vil medvirke i at fremme angiogenesen og kardiomyocytter vil erstatte det tilskadekomne myokardie (8;9). Teorien om, at ADSC differentierer til adskillige celletyper og dermed erstatter det iskæmiske væv, er dog 2

9 gradvist blevet overhalet af teorien om, at det er ADSC parakrine aktivitet, som stimulerer omkringliggende celler til nydannelse af blodkar i det iskæmiske væv (2;8;10). Talrige kliniske studier har påvist ADSC evne til at udskille vækstfaktorer, heriblandt VEGF-A (11; 12; 13). Mekanismen bag ADSC parakrine aktivitet til genopretning af iskæmisk hjertevæv, er endnu ikke blevet klarlagt (2;10). På Kardiologisk Stamcelle Laboratorie på Rigshospitalet er det kliniske studie MyStromalCellTrial påbegyndt. Dette er et studie, som tester om behandling med in vitro opformerede og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF-A) stimulerede ADSCer, vil stimulere til nydannelse af blodkar i det iskæmiske hjertevæv. VEGF-A, er kendt som en af de vigtigste pro-angiogene faktorer (14). VEGF-A indgår i angiogenesen ved at binde sig til VEGF receptor 2 (VEGFR2) på overfladen af omkringliggende endotelceller. Aktivering af VEGFR2 vil starte en signaleringskaskade, som fremmer celledifferentiering, proliferering og udspiring af endotelceller i dannelsen af nye blodkar (14). MyStromalCellTrial er det første registrerede kliniske studie, hvor VEGF-A stimulerede ADSCer anvendes hos patienter med iskæmisk hjertesygdom. ADSC bliver i studiet stimuleret med VEGF-A, for at få cellerne til at differentiere i endotelcelle retning (1;2). Mekanismen bag den forventede behandlingseffekt er imidlertid ikke klarlagt (2), hvorfor dette bachelorprojekt er initieret. Som følge af studiet MyStromalCellTrial, undersøges i dette bachelorprojekt, hvilken indflydelse VEGF-A stimulering, har på ADSC parakrine aktivitet. På Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet, er et lignende in vitro studie, med VEGF-A stimulerede ADSCer, udført. I studiet blev den oprindelige teorie om, at ADSC differentierer til endotelceller, ved stimulering af VEGF-A, analyseret. Studiet viste dog ingen endelige beviser på, at dette var tilfældet (Upubliceret data). Det er derimod tænkeligt at ADSC ved stimulering med VEGF-A, udskiller vækstfaktorer, som stimulerer omkringliggende celler til at differentiere til endotelceller og på den måde fremme angiogenesen i det iskæmiske væv. ADSC parakrine aktivitet analyseres i dette bachelorprojekt, ved at måle på udvalgte proangiogene vækstfaktorer, involveret i angiogensesen. Disse faktorer er: Fibroblast growth factor 1 (FGF-1), Fibroblast growth factor 2 (FGF-2), Hepatocyte Growth Factor (HFG), 3

10 og Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A) og Angiopoietin-2 (ANG-2), samt Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF), som produceres af endotelceller og har påvist at stimulere angiogenese (15). Vækstfaktorerne anvendes som indikatorer til at påvise om VEGF-A stimulering af ADSC, påvirker cellernes parakrine aktivitet. Inden analysering af ADSC parakrine aktivitet, skal ADSC først isoleres fra fedtvævet og dernæst skal cellerne dyrkes i 2-3 uger. Ved celledyrkning opformeres cellerne i serumholdigt standarddyrkningsmedie. Serums indflydelse på ADSC parakrine aktivitet er ukendt, idet serum udgør en ukendt faktor på cellernes trivsel (16). Det formodes at serum i dyrkningsmediet påvirker og kamuflerer ADSC egenproduktion af pro-angiogene vækstfaktorer. Forinden analysering af ADSC parakrine aktivitet, kan det være nødvendigt at seponere føtal bovin serum (FBS) fra mediet, for at måle effekten heraf. Til at analysere ADSC parakrine aktivitet anvendes apparaturet Luminex 200 TM fra MILIPORE A/S. Luminex 200 TM anvender xmap teknologi, som er en teknologi baseret på flowcelleflourometri. Dette er en objektiv og kvantitativ analyse til bestemmelse af komponenter i patientprøven (17). Luminex 200 TM er endnu ikke implementeret på Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, Rigshospitalet. 1.1 Formål Formålet med studiet er at analysere VEGF-A s betydning for ADSC parakrine aktivitet. I samarbejde med bachelorstuderende Christie Cantada, undersøges om in vitro stimulering af ADSC med vækstfaktoren VEGF-A, ændrer cellernes parakrine aktivitet, målt på udskillelsen af FGF-1, FGF-2, G-CSF, HFG og ANG-2, ved Luminex xmap teknologi på Luminex 200 TM. Ved denne problemstilling måles ikke på VEGF-A, da måling af VEGF- A, vil give et falsk forhøjet analyseresultat. Derudover undersøges om FBS i dyrkningsmediet har en indflydelse på ADSC parakrine aktivitet, ved hhv. at sænke serumkoncentrationen og ved helt at seponere serum fra mediet, for dernæst at måle ADSC parakrine aktivitet, målt på udskillelsen af FGF-1, FGF- 2, G-CSF, HFG, ANG-2 og VEGF-A, ved Luminex xmap teknologi på Luminex 200 TM. 4

11 Ikke mindst er formålet med dette projekt, at implementere brugen af xmap teknologi til analyse af ADSC parakrine aktivitet. Det er et delmål, at udarbejde protokoller herfor, til videre brug af Luminex 200 TM på Kardiologisk Stamcelle laboratorie, Rigshospitalet. 1.2 Problemformulering Ændrer fedtvævsderiverede mesenkymale stromale celler s parakrine aktivitet sig ved in vitro stimulering med Vascular Endothelial Growth Factor A? -Og har føtal bovin serum i dyrkningsmediet en indflydelse på cellerne parakrine aktivitet? Den parakrine aktivitet måles på Luminex 200 TM og forsøgene udføres på Kardiologisk Stamcelle laboratorie, Rigshospitalet. 1.3 Uddybning af problemformulering Ved VEGF-A stimulering af fedtvævsderiverede stamceller s parakrine aktivitet, anvendes Fibroblast Growth Factor 1(FGF-1), Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), Granulocyte- Colony Stimulating Factor (G-CSF), Hepatocyte Growth Factor (HGF) og Angiopoietin 2 (ANG-2) som måleparametre ved analysering på Luminex 200 TM. Ved analysering af føtal bovin serum s indflydelse på fedtvævsderiverede stamceller s parakrine aktivitet, anvendes Fibroblast Growth Factor 1 (FGF-1), Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), Hepatocyte Growth Factor (HGF) og Angiopoietin 2 (ANG-2) og Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A), som måleparametre ved analysering på Luminex 200 TM. Ved implementering af Luminex 200 TM, udarbejdes protokoller, som indføres på Kardiologisk Stamcelle laboratorie, Rigshospitalet. 5

12 1.4 Hypoteser 1. VEGF-A stimulation af ADSC, fremmer ADSC pro-angiogene parakrine aktivitet. 2. FBS i dyrkningsmediet påvirker eller kamuflerer ADSC parakrin aktivitet. 3. Ved at stimulerer ADSC med VEGF-A, over længere tid end 1 uge, vil en yderligere pro-angiogenetisk parakrin aktivitet induceres. 2.0 Teori 2.1 Mesenkymale Stromale Celler (MSC) Stamceller er defineret som uspecialiserede celler med kapacitet til at forny sig selv og differentiere til en bred vifte af vævsspecifikke celler (18). Der findes to hovedtyper af stamceller: Embryonale stamceller, som isoleres fra blastocytens inder-cellemasse i det befrugtede æg, embryonet. Disse stamceller er pluripotente stamceller, hvilket vil sige at de er i stand til at udvikle sig til enhver celletype i kroppen. Voksne stamceller, som findes i det udviklede væv hos fostre, børn, unge og voksne, herindunder MSC (16). Til trods for embryonale stamcellers potentiale til at udvikle sig til enhver celletype i kroppen, er MSC anvendt i de fleste kliniske studier (1). Brugen af embryonale stamceller er begrænset, på grund af etiske og politiske årsager (19). MSC er tenformede, fibroblastlignende multipotente celler, i stand til at differentiere til specialiseret celletyper, såsom adipocytter, chondrocytter, osteoblaser, myoblaster, og endotel (Se figur 1) (19;20;21). 6

13 Figur 1: MSC fra fedtvæv. Billedet illustrerer tenformede og fibrolastligende celler. Kilde: Billedet er taget af Tina Toppevad Skov. MSC er defineret ud fra visse kriterier etableret af International Society of Cellular Therapy (ISCT). Disse kriterier omfatter blandt andet at cellerne skal være plastik adhærente under standarddyrkningsbetingelser, udvise multipotent differentiering in vitro og præsentere en vis profil af overflademarkører (22). I de tidlige 1970 blev MSC for første gang opdaget i et studie af Fridenstein et al, som isolerede disse fra knoglemarvsstromaet (20). Studiet viste at cellerne dannede fibroblastlignende kolonier, og havde kapacitet til at differentiere til mesenkymale vævstypeceller in vitro, idet cellerne var adhærente til plastik i kultur dyrkningsflaskerne (20;21). MSC er en sjælden cellepopulation i knoglemarven, idet MSC kun repræsenterer 0,001 % til 0,01 %. Derfor er det nødvendigt at dyrke cellerne, før der er tilstrækkeligt antal til at foretage kliniske studier (23). 7

14 2.2 Fedtvævsderiverede mesenkymale stromale celler (ADSC) I 2001 blev mesenkymale stromale celler udledt fra fedtvæv, også kaldt Adipose Derived Stromal Cells (ADSC), for første gang, identificeret af Zuk et al (4). Det viste sig at ADSC havde lignende proliferings og differentierings potentiale som MSC udledt fra knoglemarv (1;2;4,6). I fedtvæv er koncentrationen af ADSC gange større end MSC i knoglemarven (2). Det høje antal af ADSC eliminerer ikke mindst tidskrævende, men også dyre in vitro opformeringskulturer, som er tilfældet ved opdyrkning af MSC fra knoglemarv. Dette gør ADSC til en populær kilde i regenerative behandlinger (5). Derudover har ADSC den fordel, at de er lette at høste, idet det kun kræver et simpelt indgreb, i form af en fedtsugning. Fedtvæv består af adipocytter i varierende størrelser logeret i lobus 1 og omgivet af bindevæv. Imellem de modne adipocyttter, findes stromaet som er sammensat af en heterogen cellepopulation af blodlegemer, endotelceller, pericytter, fibroblaster, og ikke mindst multipotente stamceller. Inden for det sidste årti har opfattelsen af fedtvæv ændret sig radikalt. Fedtvæv er gået fra at blive betragtet som lager for kroppens energi i form af triglycerider, til yderligere at blive betragtet som et rigt lager af multipotente ADSC (4). 2.3 Vækstfaktorer Studier har belyst ADSC evne til at uddifferentiere til andre celletyper, såsom neuroner, glatte muskelceller, endotelceller og kardiomyocytter (8;9). I et dyreforsøg fortaget af Li. M. et. al. angives det, at ADSC kan uddifferentiere til endotelceller og fremme angiogenesen, og/eller til kardiomyocytter og erstatte det tabte myokardie væv (8). I forsøget blev ADSC injicerede i koronararterien og efter 28 dage blev ekkokardiografi foretaget. Ekkokardiografi viste øget LVEF (Left Ventricular Ejetion Fraction), samt reduceret størrelse af det iskæmiske område. Forsøget viste dog ingen beviser på at ADSC havde uddifferentieret til endotelceller eller kardiomyocytter, i stedet blev det påvist at de transplanterede ADSC producerede pro-angiogenese vækstfaktorer, heriblandt: VEGF-A og basis fibroblast growth factor (bfgf). Disse parakrine faktorer er kendt for at fremme angiogenese i iskæmisk væv (8). I et andet studie udført af Rehmann et al. blev ADSC 1 :Lap. Mange organer er lobulerende, dvs. helt eller delvist inddelt i underafsnit, oftest af kar eller bindevæv. 8

15 cytokine-profil analyseret (4;12). Studiet viste blandt andet udskillelse af vasular endothelial growth factors (VEGF), HGF, G-CSF og bfgf (12). Vækstfaktorer anvendt i dette bachelorprojekt og deres rolle i angiogenesen, illustreres i tabel 1. Tabel 1: Projekts anvendte vækstfaktorer og deres rolle i angiogenesen VEGF-A FGF-1 & FGF-2 HGF ANG-2 G-CSF VEGF-A virker specifikt på endotelceller. VEGF-A formidler blandt andet vækst af nye blodkar, ud fra allerede eksisterende kar, ved tilstande med hypoxia (24). FGF-1 og FGF-2 indgår i angiogenesen, ved at fremme proliferingen af endotelceller. Derudover organiserer de endotelceller i rørlignende strukturer (25). HGF er udskilles af MSC og regulerer cellevækst, cellemotilitet og morfogenese. HGF fungerer som et multifunktionelt cytokin, som primært agerer på epitel- og endotelceller. Dets evne til at regulere cellemotilitet og cellevækst, giver HGF en central rolle i bl.a. angiogenesen (26). ANG-2 er nødvendig for dannelsen af modne blodkar, i form af stabilisering af blodkarrene(27). G-CSF er en vækstfaktor, produceret af bl.a. endotelceller. G-CSF stimulerer angiogenese (15) Tabel 1: Pro-angiogene vækstfaktorer og deres rolle i angiogenesen 9

16 2.4 Angiogenese Angiogenese er en fysiologisk proces, som involverer vækst af nye blodkar fra allerede eksisterende kar. I dannelsen af nye blodkar, nedbrydes eksisterende kapillærers basalmembran ved enzymatisk nedbrydning, efterfulgt af fremspiring af endotelceller, bedre kendt som sprouting angiogenese. Endotelcellernes fremspiring resulterer i dannelse af nye kapillærer. Sprouting angiogenese indledes ved tilstande med nedsat oxygen niveau, også kaldet hypoxia. De fleste celler responderer på hypoxia ved at udskille VEGF-A, et pro-angiogen vækstfaktor. VEGF-A fungerer som angiogent stimulus ved tilstande med nedsat oxygen niveau, idet at endotelceller, vil migrere mod denne og lidt forenklet sagt, danne nye blodkar (9). 2.5 Serum Serum tilsættes dyrkningsmediet, for at efterligne kroppens kompakte miljø og imitere forholdene in vivo. Serum indeholder blandt andet vigtige komponenter, som er nødvendigt for cellernes vækst, heriblandt vækstfaktorer og næringsstoffer, som aminosyrer, vitaminer og salte. Serum tilfører desuden mediet, enzymer, som omdanner inaktive stoffer i mediet til nødvendige aktive stoffer og proteiner som har betydning for opløseligheden af næringsstoffer. Serumholdige medier indeholder oftest føtal kalveserum (=Føtal Bovin Serum), da serum regnes for at være mere vækststimulerede, jo yngre individ, det stammer fra (22). Serumholdige medier kan ikke anvendes i studier, hvor analysering af vækstfaktorer indgår, idet mediet selv indeholder en ukendt koncentration af vækstfaktorer (22). I kliniske sammenhænge er anvendelsen af serumholdige medier meget omtalt, i det sammensætningen i serum, ofte varierer. Dette kan have en negativ indflydelse på analyseresultater, da analysen tager præg af denne variation. Samtidig udgør serum en ukendt faktor på cellernes trivsel, som ikke kan defineres (16). Seponering af serum fra dyrkningsmedie er forsøgt, men for de fleste cellers vedkommende, viste det sig nødvendigt at bibeholde en mindre mængde serum, for at opnå en tilfredsstillende cellevækst (22). 10

17 2.6 Luminex 200 TM Apparaturet Luminex 200 TM anvender xmap teknologi. Dette er en teknologi som er baseret på flowcelleflourometri. Luminex 200 TM er designet til at anvende xmap teknologi, sammen med specieldesignet analysekits. xmap teknologi er en bead-baseret måling, hvorved en række teknologibaserede laboratoriske test kan udføres, ved måling af biomolekylære reaktioner på overfladen af xmap mikrokugler (beads). Teknologien er effektiv, da den kan måle op til 100 forskellige komponenter i en enkelt prøve, med en lille mængde prøvemateriale. Styrken ved Luminex xmap teknologien, er at de anvendte beads er nemme at coate med antistoffer, rettet specifikt mod den komponent, som ønskes målt (17). I denne teknologi anvendes såkaldte polystyrene beads (mikrokugler), der hver især er farvet med rød og infrarød fluorescerende farvestof i forskellige intensiteter (figur 2). Ved at anvende forskellige intensiteter af rød og infrarød fluorescerende farvestof, er det muligt at adskille hver enkelt bead fra hinanden (28). Figur 2: xmap mikrokugler (beads) farvet med rød og infrarød fluorescerende farvestof i forskellige intensiteter (30). Beads tilsættes en mikrotiterplade bestående af 96 brønde (96-well plate). Beads bliver konjugeret med protein-specifikke antistoffer og bundet til en solid fase i mikrotiterpladens brønde. Til brøndene tilsættes prøven, standardkontroller og kvalitetskontroller. Under en timers inkubation, vil proteinerne i prøven binde sig til de protein-specifikke antistoffer. Mikrotiterpladen vaskes, for at fjerne overskydende protein-specifikke antistoffer. Protein-specifikt biotinyleret antistof (Detector antibody) tilsættes og inkuberes i 1 time. Det biotinyleret antistof vil binde sig til det passende immobiliseret protein. 11

18 Dernæst tilsættes Streptavidin konjugeret til det fluorescerende protein R-Phycoerythrin (Streptavidin-RPE) og mikrotiterpladen inkuberes i 30 minutter. Streptavidin-RPE vil under inkubationen binde sig til de biotinyleret antistoffer og danne et 4-lags sandwich kompleks. Mikrotiterpladen vaskes, for at fjerne ubundne Streptavidin-RPE (figur 3) (28). A B C (29) Figur 3: A. Beads konjugeret med protein- specifikke antistoffer binder sig til proteiner i prøven, kontroller og standarder. B. Protein- specifikt biotinyleret antistof (Dector antibody) binder sig til passende immobiliseret protein. C. Streptavidin- RPE binder sig til protein- specifikt biotimyleret antistof (28). Mikrotiterpladen analyseres på Luminex 200TM. Ved at tilsætte xmap sheath fluid, vil komponenterne i prøven passere individuelt igennem Luminex detektionssystem. Ved individuel passage belyses komponenten af 2 laserer (figur 4). Den første laser exciterer det fluorescerende farvestof i beads ne. Den anden laser exciterer RPE bundet til de biotinyleret antistoffer. Fotodioder registrerer excitations emissions intensiteten af det fluorescerende stof i beads og et fotomultiplikatorrør måler excitations intensiteten af de associerede fluorescerende RPE (17). 12

19 Figur 4: To laser belyser komponenten i prøven. Denne ene laser exciterer det fluorescerende farvestof i beads. Den anden laser exciterer RPE bundet til det biotinyleret antistof (17). (29) Ved at måle mængden af beads og RPE, kan koncentrationen af en eller flere komponenter i prøven bestemmes ud fra standardkurven. Standardkurver fastlægges ved hjælp af standardkontroller. I Human Angiogenesis/Growth Factor Magnetic Bead Panel 1 kit indgår én standardkontrol, som bliver standardiseret i 7 forskellige koncentrationer (se bilag 1). Luminex 200 TM udregner koncentrationen af cytokiner i de respektive brønde, ud fra den kalkulerede standardkurven. 3.0 Metodevalg 3.1 Præstudie: Analysering af standardkurver Til analyse af ADSC parakrine aktivitet, benyttes kittet Human Angiogenese - Growth Factor Magnetic Bead Panel 1, sammen med Luminex 200 TM. I kittet indgår èn standardkontrol, som standardiseres/fortyndes i 7 koncentrationer (se bilag 1). Standardkurverne for hvert af de 6 pro-angiogenetisk vækstfaktorer, ved medierne DMEM-LG tilsat 2 % FBS og 1 % Pen/Strep, DMEM-LG tilsat 10 % FBS og 1 % Pen/Strep, samt DMEM-LG tilsat 1 % Pens-strep uden tilsætning af FBS (serumfrit mediet ved tid 2, 6 og 24) fastlægges og sammenlignes i et præstudie, for at påvise om disse varierer fra hinanden. Sammenligningen vil afgøre om det er nødvendigt at opsætte standardkurver for alle tre medier, eller én fælles standardkurve kan anvendes ved analysering af supernatant på Luminex 200 TM. 13

20 3.2 MyStromalCellTrial studie Dyrkningsmedie og metode er fastlagt efter MyStromalCellTrial (se bilag 2). 3.3 Donorer ADSC fra 6 donorer analyseres i dette studie. Da studie udføres over en begrænset tidsperiode med begrænset økonomi, er det ikke muligt at inkludere flere donorer i forsøgsopsætningen. 3.4 Valg af vækstfaktorer Vækstfaktorerne HGF, FGF-1, FGF-2, ANG-2 og VEGF-A er valgt som indikatorer for analysering af ADSC parakrine aktivitet, idet disse er pro-angiogene. G-CSF er valgt, da denne fremmer angiogenesen (se tabel 1). Vækstfaktorerne er valgt ud fra et panel af faktorer, som kan analyseres på samme tid, idet de alle kan indgå i Human Angiogenese - Growth Factor Magnetic Bead Panel 1 kit (et specialdesignet analyse kit), fra producenten MILLIPORE A/S. Med forbehold for begrænset økonomiske midler, er et maksimum på 6 cytokiner, valgt i forsøgsopsætningen. 3.5 Celledyrkning ADSC tøs op og udsås i T 75 kulturflasker (passage 1). ADSC dyrkes til de er 80 % konfluente, hvorefter ADSC passeres og udsås i 9 T 25 kulturflasker (passage 2). Som cellerne vokser og opformerer sig, opdeles de i flere kulturer, for at have plads og næring nok til videre opformering. Som cellekulturen vokser, kommer cellerne til at ligge tættere. Dette vil standse deres vækst, i det cellerne kontakt-inhiberes (16). Når cellerne er 80 % konfluent, er de i det stadie, hvor de er mest proliferende (Den eksponentielle vækst fase). Passage skal helts foregå i dette stadie. Foregår passeringen senere vil det tage længere tid for cellerne at adhærere og genfinde det proliferative stadie (22). Forinden passage 1 til 2, tælles cellerne på apparaturet Nucleocounter (Apparatur for celletælling) og antallet af levende celler beregnes. Antallet af levende celler bruges til at beregne, hvor man µl ADSC, som skal udsås, for at opnå en koncentration omkring 1,17 x 10 5 ADSC pr. T 25 kulturflaske ved passage 2. (I en T 25 kulturflaske, kan max udsås 1,17 x 10 5 ADSC). Dette gøres med henblik på at få samme koncentration af ADSC i alle T 25 14

21 kulturflasker ved forsøgsopsætningen. ADSC passeres til passage 2, for at have samme udgangspunkt som i MystromalCellTrial (Se bilag 2). De 9 T 25 kulturflasker repræsenterer forsøgsopsætningen. Se afsnit Forsøgsopsæt Foruden beskrivelse af forsøgsopsætningen, illustreres denne også, i et flowdiagram (se figur 5, afsnit 3.13) Effekt af medie: VEGF- A stimulering: ADSC stimuleres med VEGF-A, med henblik på at undersøge om ADSC parakrine aktivitet ændres. I MystromalCellTrial stimuleres ADSC i 1 uge, med 50 ng/ml VEGF-A i DMEM-LG medie tilsat 2 % FBS og 1 % Pen-strep (2). (se bilag 2) For at kunne adskille effekten af VEGF-A og den nedsatte serumkoncentration (2% FBS), i forhold til standarddyrkningsmedie (10% FBS), opsættes to kontroller hertil: - én kontrol med standarddykningsmedie (10% FBS) - én kontrol med kun 2% FBS. (Standarddyrkningsmedie for dyrkning af mesenkymale stromale celler består af DMEM- LG tilsat 10 % FBS og 1 % Pen-Strep (31).) FBS s indflydelse på ADSC parakrine aktivitet: For at undersøge FBS indflydelse på ADSC parakrine aktivitet, sammenlignes ADSC dyrket i standarddyrkningsmediet (10% FBS) med ADSC dyrket i medie, hvorved serum koncentrationen er sænket (2 % FBS). Som følge af MyStromalCellTrial, undersøges hvilken effekt FBS har på ADSC parakrine aktivitet, når koncentrationen af serum sænkes. Derudover seponeres serum fra medierne, for at måle effekten heraf. Dette omtales i afsnit

22 3.6.3 Pro- angiogene vækstfaktorer i 10 % FBS FBS indhold af vækstfaktorer, analyseres på Luminex 200 TM. En T 25 kulturdyrkningsflaske tilsættes 15 ml DMEM-LG, tilsat 10 % FBS og 1 % pen-strep og dyrkes i 48 timer, hvorefter en prøve udtages og analyseres. Flasken behandles på samme måde, som supernatant høstet til tiden 0. Mediet analyseres med henblik på at undersøge om det indeholder en eller flere af de pro-angiogene vækstfaktorer, involveret i dette projekt. Hvis det er tilfældet, tages forbehold for analyseresultaterne af ADSC parakrine aktivitet målt i serumholdigt medie (tid 0), idet det formodes at FBS indhold af vækstfaktorer, kan kamuflere ADSC parakrine aktivitet Seponering af FBS, efterfulgt af høst af supernatant Da FBS indflydelse på ADSC s parakrine aktivitet, er ukendt, seponeres FBS fra hvert af de 3 medier, efter hhv. uge 1, 2 og 3 (se afsnit for begrundelse af dyrkningstid): DMEM-LG tilsat 10 % FBS og 1 % Pen/Strep DMEM-LG tilsat 2 % FBS og 1 % Pen/Strep DMEM-LG tilsat 2 % FBS og 1 % Pen/Strep stimuleret med 50 ng/ml VEGF-A. Ved at fjerne FBS fra mediet, er det muligt at måle på ADSC parakrine aktivitet, uden FBS indflydelse. FBS fjernes ved at suge alt medie fra og erstatte med serum seponeret medie. For at eliminere FBS potentielle kamuflerende effekt af VEGF-A stimulationen, høstes mediet ved 4 tider. En nulprøve (supernatant) udtages forinden seponering af serum, til tiden 0. Nulprøven anvendes til at sammenligne de 3 respektive medier i forhold til VEGF- A s og FBS indflydelse på ADSC parakrine aktivitet, i medier indeholdende serum. Efter 2, 6 og 24 timer med serumseponeret medie, udtages ligeledes prøver (supernatant). Det formodes at ADSC parakrine aktivitet, indledes efter ca. 2 timer med serum seponeret medie. Da dette kun er en formodning, måles ADSC parakrine aktivitet over et større tidsinterval, ved også at inddrage tid 6 og 24. Tid 2, 6 og 24 er også valgt ud fra en praktisk tilgang, idet at supernatant ved tid 2 og 6 kan høstes på en arbejdsdag og tid 24 kan høstes den efterfølgende dag. Cellernes overlevelsesrate formodes at falde, ved serum seponering af mediet (22). Ifølge et studie fortaget af Haack-Sorensen et al. blev MSC fra 16

23 knoglemarven, dyrket i serum seponeret medie, hvorefter cellerne døde. Det fremgår dog ikke i hvor lang tid cellerne blev dyrket (31). På baggrund af studiet og forventningen om at FBS i dyrkningsmediet er nødvendig for cellernes trivsel, høstes supernatant til og med tid 24, da det ikke forventes at cellerne overlever i mere end 24 timer Nedfrysning af supernatant Supernatant centrifugeres ved maksimum centrifugering, og overføres herefter til et kryorør, for at fjerne eventuelle celler og cellerester. Supernatanten nedfryses straks og opbevares ved -80 grader. Nedfrysning af supernatant er jævnført bilag 6, hvori PhD studerende Nili Naftali, forslår nedfrysningsprocedurer af supernatant ADSC parakrine aktivitet over tid, ved serum seponeret medie Ved serumseponering af mediet, sammenholdes ADSC parakrine aktivitet ved tid 2, 6 og 24, men henblik på at påvise hvilken indflydelse FBS i mediet, har på cellernes parakrine aktivitet. Formodentlig vil disse analyseresultater vise, ved hvilken tid, høst af supernatant er mest fordelagtig, med henblik på størst udskillelse af pro-angiogene vækstfaktorer. Data anvendes til at indikerer ADSC parakrine aktivitet, ved serum seponering Effekt af dyrkningstid: I MyStromalCellTrial, dyrkes VEGF-A stimulerede ADSCer i én uge (se bilag 2). Det er muligt at VEGF-A stimulerede ADSCer, skal dyrkes over en længere periode, for at opnå større parakrin aktivitet. ADSC dyrkes i hhv. 1, 2 og 3 uger, for at be- eller afkræfte denne hypotese. Idet projektet udføres over en begrænset periode og med forbehold for begrænset økonomiske midler, er det ikke muligt at inkludere flere uger i forsøgsopsætningen. 17

24 3.7 Celletælling Ved sidste høst af supernatant (tid 24) tælles ADSC på Nucleocounter og antallet af levende celler i hver T 25 kulturflaske beregnes. Antallet af levende celler bruges til at beregne koncentrationen af cytokiner i pg/ ADSCer, i hvert af de respektive medier for hhv. tid 0, 2, 6 og 24. Koncentrationen af cytokiner i pg pr ADSCer beregnes, i det henseende at få målbare resultater,samt da antallet af celler i flaskerne forventes at variere. (Se afsnit 3.10 databehandling, for udregning) 3.8 Luminex 200 TM Ved hjælp af Luminex xmap teknologi bestemmes hvilke af cytokinerne EGF, FGF-1, FGF-2, G-CSF, ANG-2 og VEGF-A, der frigives under dyrkning af ADSC med/uden stimulering af VEGF-A, i medier med sænket serumkoncentration, samt i serum seponeret medier. For at finde frem til dette, benyttes kittet: Human Angiogenese - Growth Factor Magnetic Bead Panel 1: Et kit specieldesignet til at bestemme mængden af FGF-1, FGF-2, HGF, G-CSF, ANG-2 og VEGF-A i supernatant fra cellekulturer. 3.9 Kvalitetssikring Forinden analysering af supernatant, på Luminex 200 TM, initialiseres apparaturet. I initialiseringen indgår blandt andet kalibratorer til kalibrering af apparaturet. I hver pladeopsætning inddrages en lav og en høj kvalitetskontrol (Q1 og Q2). Koncentrationen af kvalitetskontrollerne er af kendte værdier. Det kontrolleres om analyseresultaterne ligger indenfor kvalitetskontrollernes acceptinterval, med henblik på at godkende analysen og analyseresultaterne (se bilag 10). Alle prøver/supernatant analyseres ved dobbeltbestemmelser. Til enhver måling knytter der sig en vis måleusikkerhed. Måleusikkerheden kan skyldes unøjagtigheder i måleinstrumentet, måden analysen udføres på eller personlige fejl. Ved at køre dobbeltbestemmelse på alle prøver, fås et indtryk af måleusikkerheden og risikoen for konkluderer på fejldelagtige analyseresultater mindskes. 18

25 3.10 Databehandling Luminex 200 TM anvender programmet xponent software, som beregner koncentrationen af cytokiner i pg/ml. For at bedst at kunne sammenligne hhv. medier, tider og uger med hinanden, i forhold til antallet af cytokiner, beregnes koncentrationen af cytokiner i pg/ ADSCer: ((Middelværdi * Volumen/Celleantal) * ) = Koncentration af cytokiner pr ADSCer Middelværdi: Middelværdien af dobbeltbestemmelser, fra hvert målt cytokine, beregnet ved data fra Luminex 200 TM (se bilag 11) Volumen: Totalvolumen i ml, af supernatant ved eks. Tid 0, 2 % FBS, uge 1. Celleantal: Antal levende celler ved eks. 2 % FBS, uge Statistik Statistik anvendes i form af variansanalysen; 2 vejs ANOVA med gentagelser. Dette er en parret parametrisk måling. Ved 2 vejs ANOVA med gentagelser, behøver data ikke at være normalfordelte. Derimod skal residualerne, dvs. differensen mellem de observerede data være normalfordelte (32). Denne variansanalyse vælges, da der tages højde for flere faktorer af gangen; eksempelvis Tid 0 ved 2 % FBS medie og uge 1 = 2- vejs ANOVA. Samtidig med at flere målinger udføres, indenfor hvert medie (tid og uger varierer) = med gentagelser. Ved hjælp af 2 vejs ANOVA med gentagelser, kan en eventuel statistisk signifikant mellem medie pr. tid eller uger påvises. For at finde frem til, hvori den signifikante forskel ligger, anvendes Fischers Least Signifikant Difference (LSD), som er en postanalyse til ANOVA (33). 19

26 Da 2-vejs ANOVA med gentagelser, kun kan inkludere to parametre, slås medierne DMEM-LG tilsat 2% FBS, DMEM-LG tilsat 10% FBS, DMEM-LG uden tilsætning af FBS, sammen under fællesbetegnelsen medie. Dette gøres ligeledes med uge 1, uge 2 og uge 3, til fællesbetegnelsen uger. Da supernatant høstet til tiden 0, indeholder serumholdigt medie (FBS), i modsætning til supernatant høstet til tiden 2,6 og 24, adskilles disse ved 2-vejs ANOVA med gentagelser, da en sammenligning ikke kan forsvares (se bilag 12). LSD er en postanalyse til 2-vejs ANOVA med gentagelser. Når statistisk signifikant er påvist ved 2-vejs ANOVA med gentagelser, anvendes LSD til at beregne hvorved den statistiske signifikant ligger. LSD beregner mellem hvilke medier (DMEM-LG tilsat 2% FBS, DMEM-LG tilsat 10% FBS og DMEM-LG tilsat 2% FBS + 50 ng/ml VEGF-A) eller mellem hvilke uger (uge 1, uge 2 og uge 3) statistisk signifikans er påvist. LSD beregnes ud fra formlen: LSD= t (α; f)* SD 2 * (1/n 1 + 1/n 2 ) t=acceptinterval (95 %) α =0,05 (α er den mindste sandsynlighed for accept af H 0 ) f=frihedsgrader SD 2 = Variansfejl n= Antal af målinger For at beregne LSD, bruges data fra 2-vejs ANOVA med gentagelser (se bilag 13). LSD beregner den mindste forskel, der skal være mellem middelværdier for at forskellen er statistisk signifikant. Udregningen af LSD foretages i excel, version Præsentation af data Data præsenteres i form af figurer (grafer) og tabeller, som repræsenterer opgavens problemstillinger. Error-bars repræsenteres i graferne, som udtryk for spredningen af data. 20

27 3.13 Flowdiagram Figur 5: Flowdiagram over projektets udførsel og forsøgsopsæt. Celledyrkning Optøning/Passage 1 Passage 2/Celletælling Forsøgsopsæt: med /uden stimulering VEGF-A Uge 1 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 2 % FBS 10 % FBS Uge 2 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 2 % FBS 10 % FBS Uge 3 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 2 % FBS 10 % FBS 2 Serum seponering 3 Efter hhv. uge 1, 2 og 3 erstattes mediet med serum seponeret medie. Høst og nedfrysning af supernatant til tiden 0, 2, 6 og 24 Celletælling ADSC tælles på Nucleocounter og antallet af levende celler beregnes. Analysering Supernatanter analyseres på Luminex 200 TM Figur 5: Flowdiagram over projekt 2 Alle medier består, foruden FBS og VEGF-A, af DMEM-LG tilsat 1 % Pen/Strep. 21

28 4.0 Etiske overvejelser De anvendte stamceller er fra raske frivillige donorer efter samtykkeerklæring. Anvendelsen af stamcellerne er godkendt af De Videnskabsetiske Komiteer i Region Hovedstaden (Protokol nr. H ). 5.0 Materialer og metoder 5.1 Prøvemateriale ADSC fra 6 frivillige donorer. 5.2 Isolation af ADSC fra fedtvæv Fedtvæv fra abdomen udtages af en plastikkirurg på Rigshospitalet og udføres efter Rigshospitalets procedurebeskrivelse. Isolation af ADSC fra fedtvævet, sker ved hjælp af gentagne vaskeprocedurer og enzymatisk behandling. Her henvises til protokol: MyStromalCellTrial (Bilag 2). Isolationen af ADSC fra fedtvæv, ved de 6 anvendte donorer, udføres af en rutinerede bioanalytiker på Kardiologisk Stamcelle Laboratorie, efter overstående protokol. ADSC bliver efter isolation fra fedtvæv nedfrosset efter protokol: Nedfrysning af mesenkymale stromale celler (bilag 3), og opbevaret i cryorør med ca. 1x10 6 celler i 1 ml frysemedie ved -196 grader (Flydende Kvælstof). 5.3 Celledyrkning Optøning/passage 1 Cryorør med ADSC fra 6 donorer tages op af kvælstofstank. 4 cryorør udtages fra hver donor, for at sikre nok celler til at kunne udså omkring 1,17 x 10 5 ADSC pr. T 25 kulturflaske ved passage 2. Cryorør ne transporteres i fryseboks indtil optøningsproceduren starter. Optøning og udsåning af ADSC udføres efter protokollen: Optøning og udsåning af mesenkymale stromale celler (bilag 4). ADSC optøs ved neddypning af cryorør i et 37 graders varmt vandbad, indtil en isklump, svarende til en ærts størrelse er tilbage. ADSC samt frysemedie fra hver enkelt donorer overføres til T 75 kulturflaske (Nunc, ca.no ), tilsat 15 ml standarddyrkningsmedie. Standarddyrkningsmedie består af Dulbecco s Modified Eagle Medium, low glucose (DMEM-LG) (PAA, cat. no. 22

29 E15-808) tilsat 10 % Føtal Bovin Serum (FBS) (PAA, cat. no. A15-512) og 1 % Penicillin Streptomycin (pen-strep) (GIBCO, cat. no ). Til fremstilling af mediet henvises til tabel 3, afsnit 5.5. T 75 kulturflaskerne med de optøede ADSC inkuberes ved 37 grader og 5 % CO 2 natten over. Dagen efter ADSC er tøet op, suges alt medie fra ved brug af serror sugesystem, med henblik på at fjerne Dimethyl Sulfoxid USP Grade (DMSO) fra frysemediet og 15 ml nyt standarddyrkningsmedie tilsættes. ADSC dyrkes i inkubator ved 37 grader og 5 % CO 2, indtil cellerne er 80 % konfluente. Dette tager ca. 1 uge. Under dyrkningen skiftes dyrkningsmediet hver 3-4 dag, ved at suge alt mediet fra på nær 1 ml og tilsætte ml nyt standarddyrkningsmedie. ADSC konfluente status vurderes undervejs ved hjælp af mikroskopi. Når cellerne er 80 % konfluente passeres cellerne til nye kulturflasker (passage 1 til passage 2) Passage 1 til Passage 2 Når ADSC er 80 % konfluente, høstes de fra T 75 kulturflasker og passeres til 9 T 25 (Nunc. ca.no f) kulturflasker (Passage 1 til Passage 2) pr. donor. Dette udføres efter protokol: MyStromalCellTrial (bilag 2). Grunden til ADSC passeres til 9 T 25 kulturflasker, er at de er lettere at håndtere rent praktisk, i det videre forsøgsopsæt (Se tabel 2). Alt dyrkningsmediet suges fra og ADSC vaskes med 10 ml phosphate-buffered saline -CaCl2 & MgCl 2 ph 7,4 (PBS) (Gibco, ), for at fjerne rester af dyrkningsmediet, da eventuelle rester af serum vil inaktivere Tryple Select. ADSC høstes ved inkubation i 5-10 min i inkubationsskab ved 37 grader, tilsat 3 ml Tryple Select (Gibco, ca. no ). Tryple Select er et animalsk fri enzym, som løsner cellerne i kulturflasken ved at klippe overfladen af proteinerne i cellemembranen i stykker (22). Ved hjælp af mikroskopi vurderes om cellerne har løsnet sig. Hvis dette er tilfældet tilsættes 7 ml standarddyrkningsmedie, for at neutralisere Tryple Select. Herefter overføres cellerne til et falkonrør og centrifugeres i 5 minutter ved 300g-kraft, stuetemperatur, acceleration 9, bremse 5. Centrifugeringen vil resultere i at ADSC vil ligge sig i bunden af centrifugerøret, adskilt fra supernatanten. Supernatanten hældes fra og ADSC fra hver donor resuspenderes i et kendt volumen standarddyrkningsmedie. 100 µl af cellesuspensionen tages fra til analysering på Nucleocounter NC

30 5.4 Celletælling: Ved hjælp af Nucleocounter NC-100 fra Chemometec (Chemometec, Allerød Denmark) foretages celletælling af ADSC fra hver donor. Celletællingen bruges til at beregne antallet af levende celler, med henblik på at beregne hvor mange µl ADSC der skal udså i hver af de 9 T 25 kulturflasker, for at opnå en koncentration på ca. 1,17 x 10 5 celler. Formålet med dette er at have samme udgangspunkt i hver T 25 kulturflasker ved forsøgsopsætningen (se tabel 2, afsnit 5.5). Nucleocounter-100 er et integreret fluorescensmikroskop, som detekterer farvesignaler fra farvestoffet propidium iodid (PI), som binder sig til DNA i cellekernen. Da farvestoffet ikke kan trænge igennem en levedygtig celle, er det nødvendigt at lysere cellemembranen for at farvestoffet kan binde sig til DNA et inde i kernen. Inden lyseringen af cellernes membran, måles antallet af ikke levedygtige celler (non-viable) ved at udtage en prøve ved hjælp af en NucleoCassette og analyserer denne på Nucleocounter NC-100 (Chemometec, Allerød Denmark). Dernæst lyseres cellerne i en 1:3 fortynding, ved at resuspendere 25 µl cellesuspension med 25 µl lyseringsbuffer (Reagens A, ca. no ) min 5. gange. 25 µl stabiliseringsbuffer (Reagens B, ca. no ) tilsættes og blandingen resuspenderes min. 5 gange for at stoppe lyseringen af cellemembranen. En prøve udtages ved hjælp af en NucleoCassette og analyseres på Nucleocounter, for at måle den totale cellekoncentration. Ud fra disse to målinger, kan antallet af levende celler i prøven beregnes. Her henvises til protokol: Anvendelse af NucleoCounter-100 fra Chemometec (bilag 5). I en T 25 kulturflasker kan 1,17 x 10 5 celler udsås. Ved at dividerer antallet af levende celler med antallet af celler som skal udså pr. T 25 kulturflaske, findes frem til hvor mange T 25 kulturflasker som kan udså i. Antallet af T 25 kulturflasker divideres med den samlede cellevolumen, for at finde frem til hvor mange µl ADSC, der skal udsås pr. T 25 kulturflaske. 24

31 Eksempel på regnestykke: Antal levende celler: 20, 904 x 10 5 celler = 17 T 25 kulturflasker Celler pr. T 25 kulturflaske: 1, 17 x 10 5 celler Cellevolumen: 3,9 ml = 0,229 ml 229 µl pr. Antal T 25 kulturflasker: 17 T 25 kulturflasker T 25 kulturflaske Hver enkelt donor udsås i 9 x T 25 kulturflasker indeholdende 7 ml standarddyrkningsmedie. Cellerne dyrkes i inkubator ved 37 grader og 5 % CO 2 i ca. 1 uge indtil cellerne vurderes til at være 80 % konfluente. Under opformeringen af cellerne, skiftes mediet hver 3-4 dag, ved at suge alt medie fra på nær 1 ml og tilsætte 7 ml nyt dyrkningsmedie. 5.5 Forsøgsopsæt; Stimulering med/uden VEGF- A Når cellerne i T 25 kulturflaskerne har opnået en konfluens på 80 %, inddeles de 9 x T 25 kulturflaskerne i grupper, alt efter hvorledes og i hvor lang tid (antal uger) cellerne skal dyrkes med/uden stimulering af VEGF-A. Flaskerne markeres med et nummer og stimuleres efter nedenstående plan (tabel 2): Tabel 2: Viser forsøgsopsætningen; Stimulering med/uden VEGF Flaske nr. Medie tidsperiode 1 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 1 uge 2 10 % FBS 1 uge 3 2 % FBS 1 uge 4 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 2 uger 5 10 % FBS 2 uger 6 2 % FBS 2 uger 7 2 % FBS tilsat 50 ng/ml VEGF-A 3 uger 8 10 % FBS 3 uger 9 2 % FBS 3 uger 25