Problemformulering: Hvilken effekt har resveratrol på cancercellers vækst, og kan det skyldes en hæmning af elektrontransportkæden eller cellecyklus?

Transkript

1

2 1. Abstract Dansk Den seneste tids store interesse for phytokemikaliers medicinske egenskaber, har blandt andet ført til stor opmærksomhed omkring polyphenolet resveratrol (3, 4,5-trihydroxystilben). Resveratrol findes blandt andet i brombær, jordnødder og broccoli, men de største koncentrationer findes i druer. Forskning viser blandt andet, at resveratrol har antiproliferative egenskaber, hvilket gør resveratrol interessant at forske i med henblik på udvikling af nye metoder til cancerbehandling. Afdækning af resveratrols egenskaber vil ydermere være med til give indsigt i cancers biologiske egenskaber. I dette studie har vi søgt at klarlægge resveratrols eventuelle effekter på cancercellers elektrontransportkæde og cellecyklus. For at belyse dette har vi udført forsøg på to typer Helacancerceller; HeLa-WT og HeLa-Rho 0. I modsætning til HeLa-WT er HeLa-Rho 0 depleteret for mtdna, hvilket sætter dens elektrontransportkæde ud af funktion. Denne forskel udnyttes til at se, om resveratrol hæmmer elektontransportkæden; dette vil være sandsynliggjort, hvis HeLa-WT hæmmes mere end HeLa-Rho 0. De to celletyper udsættes for resveratrol med koncentrationerne 0, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 µm i en periode på 48 timer. Efterfølgende foretages en optælling af cellerne, samt en FACs-analyse for at klarlægge i hvilken fase af cellecyklus, cellerne befandt sig. Resultaterne fra celleoptællingen blev modelleret matematisk for at anslå de to celletypers respektive tolerance overfor resveratrol. En resveratrolinduceret hæmning af celledelingen blev konstateret hos både HeLa-WT og HeLa-Rho 0 celler. Som forventet udviste HeLa-WT en lavere tolerance overfor resveratrol end HeLa-Rho 0. FACs analysen viste en standsning af HeLa-WT celler i S-fasen ved en koncentration på µm resveratrol og en akkumulering af HeLa-WT celler i G 1 -fasen ved µm resveratrol. Dette viser, at resveratrol påvirker cellecyklus. English Title: Resveratrol and cancer An increasing amount of interest in phytochemicals and their medical potentials has led to a great attention towards the polyphenole resveratrol (3, 4,5-trihydoxystilbene). Resveratrol is present in many of todays vegetable food groups, e.g. mulberrys, peanuts, broccoli and grapes, the latter holding the highest concentrations. Research shows that resveratrol has antiproliferative abilities, which makes it interesting as an object of investigation in order to develop new methods of cancer treatment. Uncovering the prospects of resveratrol will furthermore tribute to the understanding of carcinogenesis. The present study seeks to reveal the possible effects resveratrol might have on the electronic transport chain and the cell cycle. To answer this we conducted experiments on two types of HeLacancercells; HeLa-Wildtype and HeLa-Rho 0. HeLa-Rho 0 is a HeLa cell in which mtdna has been depleted. This depletion results in a dysfunctional electronic transport chain. The difference between HeLa-WT and Rho 0 cells enables us to decide if resveratrol inhibits the electronic transport chain; this will be confirmed if HeLa-WT is inhibited to a higher extent than HeLa-Rho 0 cells. Both celltypes were exposed to resveratrol with concentrations ranging from µm for a period of 48 hours. Following this procedure the cells were counted and a FACs analysis was conducted to decide in which phase of the cell cycle the cells were accumulating. The results from the cell counts were mathematically modelled in order to evaluate tolerance of the two cell types towards resveratrol. We observed a resveratrol induced inhibition of the cell proliferation in both HeLa-WT and -Rho 0. As expected HeLa-WT turned out to be less tolerant towards resveratrol than did HeLa-Rho 0. The FACs analysis showed that when exposed to µm of resveratrol there was an arrest of HeLa-WT in the S-phase and when exposed to µm the HeLa-WT cells accumulated in the G 1 -phase. This shows that resveratrol affects the cell cycle.

3 2. Forord Der har i medierne været fokus på fænomenet The French Paradox, idet franskmænd, trods deres store forbrug af rødvin og fed mad har forholdsvis få tilfælde af hjerte-kar-sygdomme. Efterfølgende er der blevet forsket i eventuelle gavnlige stoffer, som findes i deres kost [Sun et al., 2002]. Dette har blandt andet resulteret i fundet af polyfenolet resveratrol, som blandt andet findes i vindruer, og dermed i rødvin. Efterfølgende forskning har kortlagt en række gavnlige effekter af resveratrol og flere af de fundne resultater peger på, at resveratrol hæmmer udvikling og vækst af cancerceller [Ignatowicz, 2005; Jang 1996; Schneider 2000]. Den præcise sammenhæng mellem cancer og resveratrol er endnu ikke afklaret, men der er mange teorier, som forsøges eftervist ved hjælp af forskning på området. Tidligere forsøg har vist, at resveratrol hæmmer forskellige komplekser i elektrontransportkæden (ETC), hvilket bl.a. fører til mindre dannelse af energi (ATP) [Kipp og Ramirez, 2001; Zini et al., 2002; Zheng og Ramirez 2000; Gledhill og Walker, 2004]. Resveratrol har også vist sig at hæmme DNA-syntesen ved at hæmme enzymet ribonukleotid reduktase, der er afgørende for syntetisering af nukleotider [Fontecave et al., 1998]. Andre forsøg har vist, at resveratrol standser cancercellers cellecyklus ved at nedregulere ekspressionen af essentielle cykliner. Cykliner er proteiner, der regulerer cellecyklus, og nedregulering af cyklinerne vil føre til hæmning af cellernes vækst og spredning [Joe et al., 2002]. Vi vil gerne bidrage til denne forskning, og har derfor valgt at undersøge en række processer nærmere i forbindelse med resveratrol og cancer. Til forsøgene anvendte vi cancercellelinjen HeLa, med og uden mitochondrielt DNA (mtdna), hhv. betegnet som HeLa-WildType (WT) og HeLa- Rho 0 celler. I cancerceller uden mtdna (HeLa-Rho 0 ) vil ETC være ude af funktion. Ved at tilsætte resveratrol til HeLa-cellerne, og sammenligne væksthæmningen af HeLa-WT og HeLa-Rho 0, undersøges det nærmere, hvilken effekt resveratrol har på væksten i cancerceller, og om dette evt. skyldes en hæmning af elektrontransportkæden (ETC). Udover resveratrols indvirkning på ETC, er vi også interesserede i at undersøge, hvor i cellecyklus resveratrol påvirker cellen, og hvilken sammenhæng, der er mellem hæmningen af cellevæksten og cellecyklus. Dette gøres ved at lave en FACs analyse (Flourescence Activated Cell sorter), som fastlægger, hvor mange procent af cellerne, der befinder sig i de forskellige faser af cellecyklus. 3 3

4 Problemformulering: Hvilken effekt har resveratrol på cancercellers vækst, og kan det skyldes en hæmning af elektrontransportkæden eller cellecyklus? Semesterbinding: Ved opstilling af disse forsøg, har vi søgt at afdække vores problemformulering ved eksperimentelt arbejde. Således bliver kravene til semesterbindingen om teori, eksperiment og fordybelse i et lille hjørne af naturvidenskaben tilgodeset. Målgruppe: Som nævnt er projektet bygget på eksperimentielt arbejde, der skal søge at belyse en afgrænset hypotese omkring resveratrols indvirkning på cancerceller. Det faktum, at vi anskuer problemstillingen så specifikt, håber vi vil resultere i en interesseværdi for andre, der laver grundforskning inden for området. Læsevejledning: Ord skrevet i kursiv forklares i ordforklaringen s undtaget er latinske ord, der konsekvent er skrevet i kursiv. 3. Tak til En kæmpe tak til Dvora Berenstein og Claus Desler for alle de timer, I har brugt på os. Tak for jeres overskud og tålmodighed til at sætte os ind i et vanskeligt emne. Der skal også gå en stor tak til Birgitte Munck Petersen for motiverende kritik og vejledning. Tak til Mikkel Rohde fra Kræftens Bekæmpelse for at sætte os ind i den aktuelle cancerforskning. Tak til alle dem, der arbejder i laboratorierne i bygning Forsidebilledet viser en af vores HeLa-Rho 0 prøver, der ikke er udsat for resveratrol. 4 4

5 Indholdsfortegnelse 1. Abstract Forord Tak til Resveratrol Carcinoginese: Omdannelse af raske celler til cancerceller Cellecyklus Cdk og cykliners regulering af cellecyklus Resveratrols påvirkning af cellecyklus Mitochondrier Elektrontransportkæden Dannelse af frie radikaler i elektrontransportkæden Apoptose Mitochondrier uden mtdna Resveratrols påvirkning af mitchondrier ROS: resveratrols pro- og antioxidative egenskaber Resveratrols hæmmende effekt på ATPasen Resveratrols apoptoseinducerende egenskaber Syntetisering af dntp til DNA-syntese - De novo pathway Dihydroorotat dehydrogenase DHODH Ribonukleotid Reduktase - RNR Materialer og metode HeLa celler Materialeliste Behandling af cellekultur Forsøgsgennemgang Coulter Counter FACs analyse Statistik Resultater og resultatbehandling Coulter Counter resultater Statistisk behandling af Coulter Counter resultater t test Udregning af IC 50 værdier FACs resultater Diskussion Metode overvejelser Konklusion Ordforklaring Litteraturliste Artikler Bøger Bilag FACs histogrammer

6 4. Resveratrol Resveratrol er en phytoalexin af typen stilben, som syntetiseres i forskellige planter, heriblandt vinplanten Vitis vinifera. Dens kemiske navn er 3,5,4'-Trihydroxystilben, og der findes både en trans- og en cisisomer. Trans-isomeren er langt den hyppigst forekommende i druer, mens omkring 40 % af resveratrolmolekylerne i vin er af cis-typen [Jeandet et al., 1995]. Figur 4.1 Trans- og cis-formen af resveratrolmolekylet. Trans- formen er den hyppigst forekommende. [ Det har ikke været muligt at finde ud af hvilken af de to isomerer der er mest aktiv. En kilde, Stivala et al., (2001), angiver dog at trans-formen er den biologisk mest aktive hvad angår antioxidative egenskaber. Resveratrol forekommer i alle druesorter som en af de polyfenoler, der befinder sig i skallen. Når planten udsættes for svampeangreb eller UV-bestråling, øger den produktionen af resveratrol som forsvarsmekanisme. Voldsomme svampeangreb fører imidlertid til nedbrydning af resveratrol [Jeandet et al., 1995; Breuil et al., 1999]. Resveratrol er tilsyneladende den mest aktive polyfenol, der er fundet i forbindelse med forskning i cancerpræventive midler [Gescher og Steward, 2003] og findes i 72 plantearter, heriblandt jordnødder, brombær og vindruer [Dong, 2002]. Vinplanten Vitis vinifera er en af de planter, der indeholder de højeste koncentrationer af resveratrol, da den kan indeholde op til 100 µg pr. gram drueskal. I rødvin findes gennemsnitligt ca. 5 mg/l. En person, der vejer 70 kg, opnår således en resveratrolkoncentration på 18 µg/kg ved at drikke ca. 250 ml rødvin [Gescher og Steward, 2003]. Hvad angår biotilgængeligheden, betvivles det dog, hvorvidt det er muligt at indtage tilstrækkelige mængder in vivo, til at opnå gavnlige effekter af resveratrol. Dette skyldes, at der kræves en forholdsvis høj koncentration på over 10µM, for at opnå en gavnlig effekt [Gescher og Steward, 2003]. Forskning viser, at resveratrol er i stand til at modvirke inflammation og vævsskader [Frémont, 1999]. 6 6

7 Resveratrols positive effekt på hjerte og kredsløb har længe været kendt. Der er tale om en antioxidant, som nedsætter kolesterolaflejringen i blodkredsløbet. Den antioxidative effekt gør resveratrol antimutagent, og det kan derfor virke cancerpræventivt. Resveratrol er i stand til at hæmme cancercellers vækst og synes at påvirke cancerceller på forskellige måder afhængigt af celletype og koncentration af resveratrol. [Frémont, 1999; Gusman et al., 2001; Schneider et al., 2000]. 7 7

8 5. Carcinoginese: Omdannelse af raske celler til cancerceller Overordnet forklaret er en cancercelle en celle, hvis cellecyklus er ude af normal kontrol og som reagerer unormalt på kroppens reguleringsmekanismer. Hvis en cancertumor er malign, i modsætning til benign, vokser den uhæmmet og ofte ind i omkringliggende væv. Dette skyldes, at de maligne cancerceller ikke udviser tæthedsafhængig inhibering, der får normale celler til at stoppe formering. Hvis cancerceller endelig stopper delingen, sker det tilfældige steder i cellecyklus, og ikke ved checkpoints, som i raske celler. En celles vækst og celledeling kontrolleres af en række komplekse mekanismer. Under normale forhold styrer de såkaldte proto-oncogener vækststimulering i cellen, mens tumorsupressorsgener styrer væksthæmning. Protooncogener koder for normale proteiner, der indgår i cellens signalveje, hele vejen fra receptorer i cellemembranen til genregulerende proteiner i nucleus. Hvis der sker mutationer i protooncogenerne eller reguleringen af dem ændres, vil de kunne udvikle sig til oncogener. Oncogener er en betegnelse for gener, der virker cancerfremkaldende. Transformation af protooncogener til oncogener kan ske på tre måder: Ved en translokation flyttes protooncogener til et nyt sted på kromosomet og kan ved den nye lokalisering blive underlagt en ny og mere aktiv promotor, der overstimulerer ekspressionen af genet. Et andet fænomen er amplifikation, hvor en genmutation medfører øget ekspression af et bestemt protooncogen, der således kommer til at virke som et oncogen, da det protein, det koder for produceres i forøgede mængder. Tredje mulighed kaldes punktmutation, hvor protooncogenet muterer og producerer proteiner, som er enten mere aktive eller blot mindre sensitive over for nedbrydning [Campbell og Reece, 2002]. Figur 5.2 omdannelsen af protooncogener til oncogener kan ske på tre måder: translokation, amplifikation eller punktmutation. I alle tre tilfælde fører mutationen til øget cellevækst [Campbell og Reece, 2002]. 8 8

9 Et eksempel på et oncogen er signalproteinet Ras. Ras-protein medvirker i overførsel af signaler fra cellens overflade til nucleus, som respons på en aktiv receptor på cellens overflade. Et muteret Rasprotein vil blive ved med at sende signaler til kernen om at aktivere vækstfaktorer uden at Ras er blevet aktiveret fra cellens overflade. Figur 5.2 Figuren viser eksempler på mutationer i henholdsvis protooncogener (a) og tumorsupressorgener (b). Begge tilfælde fører til ukontrolleret cellevækst (c) [Campbell og Reece, 2002]. Tumorsupressorgener er gener, der virker hæmmende på celledeling og cellevækst, og som er til stede i raske celler. Sker der mutationer i disse gener, kan det føre til øget cellevækst. Tumorsupressorgener virker på forskellige måder. Visse tumorsupressorgener koder for proteiner, der under normale omstændigheder reparerer DNA-skader. Et eksempel på et tumorsupressorgen er genet p53, som koder for proteinet p53 [Eklund et al., 2001]. Det har en meget vigtig rolle i cellecyklus, da det registrerer og videreformidler, hvis der er fejl i DNA et og forhindrer, at denne fejl videregives til næste generation af celler. Det har p53 mulighed for at gøre på tre måder: Den første mulighed er, at p53 midlertidigt stopper celledelingen via. aktivering af proteinet p21, der inhiberer cdk2, og derved standser cellecyklus. Dette stop i cellecyklus sker for, at DNA kan blive repareret. Hvis fejlen kan repareres vil p53 efterfølgende sætte cellecyklus i gang igen. En anden mulighed er, at p53 direkte aktiverer enzymer, der reparerer DNA. Den sidste mulighed er, at p53 inducererer apoptose (programmeret celledød), der forhindrer videreførsel af cellens muterede 9 9

10 gener (se afsnit om apoptose). En mutation af p53 genet kan hurtigt føre til akkumulering af mutationer og derved skabe grobund for udvikling af cancer [Krude, 1999; Jensen og Prentø, 2000]. Andre tumorsupressorgener kontrollerer sammenhæftning af celler til hinanden eller til andet væv. Denne hæftning mangler tit i cancerceller, så de kan vokse videre selvom de ikke har kontakt til andre celler. Endnu andre tumorsupressorgener koder for proteiner, der virker hæmmende på cellecyklus [Campbell og Reece, 2002; Prentø og Jensen, 2000]. Mutationer i p53 ses i op til 80 % af cancertilfældene. Ca. 2 % af alle kræfttilfælde skyldes et såkaldt cancervirus i form af f.eks. adenovirus eller human papillomavirus [Prentø og Jensen, 2000; Pedersen, 2000]. Det opstår ved at virus bygger sit DNA ind i en rask celle og ad den vej fremprovokerer mutationer enten ved ovennævnte omdannelse af proto-oncogener til oncogener, eller blot ved kraftigt at øge ekspressionen af bestemte protooncogener [Campbell og Reece, 2002; Prentø og Jensen, 2000; Pedersen, 2000]. Udviklingen af cancer er en balance mellem de carcinogener (cancerfremkaldende stoffer), kroppen udsættes for, og de forsvarsmekanismer kroppen besidder. For at der skal dannes cancer i en organisme, skal der ske en større akkumulering af mutationer [Campbell og Reece, 2002]. Således vil ovennævnte mutationer tit finde sted i mindre omfang, og altså først blive sygdomsfremkaldende, når mutationerne når et vist omfang

11 6. Cellecyklus Cellecyklus er intervallet mellem en celledeling og den næste forekommende celledeling, og det anslås, at hver cellecyklus varer mellem 18 og 24 timer for raske humane celler [Prentø og Jensen, 2000]. Der er fire faser i cellecyklus (Figur 6.1): G 1, S-fasen, G 2 og M-fasen. I den første fase, G 1 -fasen, vokser cellen. Her syntitiseres, trna, ribosomer, mrna og adskillige vigtige enzymer. Denne syntetisering gør cellen i stand til at duplikere sit DNA. Figur 6.1 Cellecyklus består af fire faserg 1, S, G 2 og M-fasen. I G 1 vokser cellen og der syntetiseres trna, mrna og ribosomer. Cellen forbereder duplikation af DNA. I S-fasen syntetiseres og duplikeres cellens DNA, hvilket resulterer i at der bliver skabt en identisk DNA dobbelt helix. Cellecyklus fortsætter ind i G 2, hvor cellen har dobbelt kromosomantal, endvidere syntetiseres cykliner, som gør cellen i stand til at foretage mitose. I M-fasen sker mitosen som fordeler kromoserne ud i dattercellerne. Herved er der igen 46 kromosomer i cellen. [ Det er altså i G 1 -fasen, cellen vokser og gør sig klar til S-fasen. I S-fasen sker syntetisering og replikation af cellens DNA, hvor strengene i den originale DNA dobbelt-helix bliver adskilt, og hver af strengene bliver duplikeret, således at der bliver skabt et identisk DNA dobbelt-helix. DNA polymerase syntetiserer de nye DNA-strenge ved at kopiere basesekvenserne fra de originale strenge. S-fasen varer ca. 6 timer [Zubay, 1998]. I den næste fase, G 2, har cellen duplikeret sit DNA og har derfor det dobbelte antal kromosomer, og det er i denne fase, cellen gør sig klar til at adskille kromosomerne ved mitosen i M-fasen. Dette gøres ved syntetisering af flere proteiner herunder cykliner, som vil blive forklaret nærmere i afsnit 6.1. I den afsluttende fase, M-fasen, foregår mitosen, og her adskilles og fordeles kromosomerne i dattercellerne, så der igen er 46 kromosomer i hver celle

12 Når kromosomerne er blevet fordelt i dattercellerne er cellecyklus fuldendt og cellerne er tilbage i G 1 -fasen [ 16/4 2005]. Cellerne kan også befinde sig i en hvilefase, G 0 -fasen, hvor cellerne midlertidigt er ude af cellecyklus. 6.1 Cdk og cykliners regulering af cellecyklus Cyclin dependent kinases (cdk) er proteiner, der regulerer cellecyklus ved at fosforylere andre udvalgte proteiner. Nogle enzymer aktiveres, når de bliver fosforyleret og inaktiveret når fosfatgruppen fjernes. Andre enzymer bliver inaktiveret når de fosforyleres. Af denne grund fosforylerer cdk specifikke proteiner for at aktivere dem, så cellen derved kan fortsætte ind i næste fase af cellecyklus [Zubay, 1998]. Cdk kan dog ikke fungere alene, og er ikke i stand til at fosforylere før et specifikt cyklin har bundet sig til det og derved aktiveret det. Der findes hos mennesker 5 forskellige cykliner (A-E) og 6 forskellige cdk er (1-6), hvor kun cdk1 og cdk2's rolle i cellecyklus er afklaret. De virker alle forskellige steder i cellecyklus, og der vil nedenfor blive gennemgået, hvor de induceres. Figur Denne figur viser fordelingen af de forskellige cdk og cyklin komplekser involveret i cellecyklus. I G 1 -fasen sker en opregulering af cyklin D1-3 og cdk 4/6, efterfølgende induceres cyklin E, som danner et kompleks med cdk 2. I S-fasen nedreguleres cyklin E, hvorefter cyklin A induceres. Cyklin A binder sig til cdk2 og dette kompleks findes i S, G 2 -fasen og i starten af M-fasen. I G 2 -fasen induceres cyklin B, som resulterer i at cellen kan fortsætte fra G 2 - til M- fasen. Cyklin B danner kompleks med cdk1. Efter M-fasen vender cellen tilbage til G 1 -fasen [Berenstein, 2005]. I G 1 -fasen induceres cyklin D (D1, D2, D3), cdk2, cdk4 og cdk5. Cyklin E binder sig senere i G 1 - fasen til cdk2. I S-fasen induceres cyklin A og cdk2. I G 2 og M-fasen induceres cyklin B og cdk1 [Prentø og jensen, 2000]. I G 1 sker der en opregulering af cyklin D, som binder sig til cdk2, cdk4 og cdk6. Herefter opreguleres ekspressionen af cyklin E. Idet cellen går ind i S-fasen, sker der en nedregulering af cyklin D og cyklin E, og cdk2 danner kompleks med cyklin A, hvilket resulterer i, at ekspressionen af cyklin A opreguleres. Både cyklin E og A har cdk2 som partner, men cyklin A/cdk2 komplekset menes at være den mest aktive af cyklin/cdk komplekserne i G 2 -fasen [Berenstein, 2005]. For at cellen kan fortsætte fra G 2 til M-fasen, er det nødvendigt, at der sker en opregulering af cyklin B, 12 12

13 som binder sig til cdk1. Defosforylering af cyklin B/cdk1 komplekset, og derved dens aktivitet, hæmmes, hvis DNA er beskadiget eller ikke er replikeret hvilket vil resultere i, at mitosen ikke kan forløbe. Retinoblastomaproteinet, Rb, medvirker til at kontrollere overgangen fra G 1 til S-fasen, og er derfor en tumorsupressor. Rb-proteinet findes både i fosforyleret form og i ikke-fosforyleret form. Det er den ikke-fosforylerede form af Rb, der er aktiv og virker hæmmende. Fosforyleringen af Rb øges i slutningen af G 1, og holdes på et højt niveau gennem S og G 2, men falder derefter ved overgangen fra G 2 til M. Rb-proteinet fosforyleres af cyklin E/cdk2, der er et SPF-kompleks (Start Promoting Factor). Dette kompleks regulerer aktiviteten af adskillige vækst-regulerende proteiner ved at blokere dem eller binde sig til dem, og aktiviteten af disse proteiner er derfor lav i den første del af G 1 og M, mens den i resten af cellecyklus er forholdsvis høj [Prentø og jensen, 2000]. Mængden af Cdk er konstant i celle cyklus, i modsætning til cykliner, der er ustabile, og som nedbrydes hele tiden. Cykliner er derfor lette at påvirke og dette sker eksempelvis hvis cellen har mangel på næring, hvilket vil hæmme transkriptionen af cyklingenerne. Hvis transkriptionen hæmmes, kan cyklinerne derfor ikke nå den koncentration, der skal til for at danne det aktive SPFkompleks. SPF-komplekset er nødvendig for at cellen kan starte DNA-replikationen i S-fasen, idet SPF indleder fosforyleringen af S-fase proteinerne [Prentø og Jensen, 2000]. Der findes også en anden gruppe af proteiner, der kontrollerer cellecyklus. Disse proteiner kaldes Cyclin-dependent kinases inhibitors (CKI) og de nedregulerer cdk's aktivitet. CKI kan deles op i forskellige grupper ud fra deres struktur, og ud fra hvilke typer cdk er, de påvirker. Den ene gruppe er Cip/Kip, som består af proteinerne p21, p27, p57. Denne gruppe kan binde sig til både cyklin D, cyklin E og cyklin A, og de dertilhørende cdk er [Berenstein, 2005]. En anden gruppe af CKI er INK4 proteiner, som kun påvirker kinaser fra G 1 -fasen; cdk4 og cdk6. De påvirker altså ikke cyklin D, cyklin A og cyklin E, som Cip/Kip gruppen gør. Der er opstillet en hypotese, som går ud på, at forøgelse af INK4 proteiner vil føre til en forøgelse af Cip/Kip, og herigennem føre til, at cyklin E/cdk2 hæmmes og stopper cellecyklus [Berenstein, 2005]. 6.2 Resveratrols påvirkning af cellecyklus Der er mange iagttagelser, der peger på, at resveratrol påvirker forskellige cdk og cykliner i forskellige cancercellelinier. Joe et al. (2002) har udført tre forsøg med tre forskellige humane cancercellelinier: A431 lungecancer, HCL60 leukemi og SW480 colorectal cancerceller. Formålet med forsøgene var at 13 13

14 undersøge resveratrols effekt på cykliner. I hvert forsøg blev der tilsat en resveratrolkoncentration på 300 µm, og cellerne blev høstet efter 24 timer. Ved tilsætning af resveratrol til A431 lungecancerceller, blev der observeret et fald i ekspressionen af cyklin D1, cyklin D2, cyklin E, cdk2 og cdk4/6. Faldet af cyklin D1 vil hæmme cellens fortsættelse ind i S-fasen, da cyklin D1 er en katalysator mellem G 1 og S-fasen, og forsøget resulterede også i akkumulering af celler i G 1 -fasen. Ulrich et al., (2005) har også vist, at hæmning af cdk2 og cdk4 forhindrer cellen i at fortsætte ind i S-fasen, men i stedet forbliver i G 1 -fasen. I det andet forsøg, udført af Joe et al., (2002), hvor der blev der brugt HCL60-leukæmi celler, skete akkumuleringen af celler i S-fasen. I forsøget blev det observeret, at resveratrol forøgede niveauet af cyklin A, cyklin E, men ikke påvirkede G1-fase proteinerne, cyklin D1, cyklin D2, cyklin E, cdk2, cdk4 og cdk6. Som tidligere beskrevet er cyklin E ansvarlig for faseovergangen mellem G 1 og S-fasen, og denne nedreguleres kun i løbet af S-fasen. En forklaring på, at cellerne i forsøget udført af Joe et al., (2002) blev akkumuleret i S-fasen, kan være at der var en høj koncentration af cyklin E tilstede i cellerne. Herved vil cellerne sandsynligvis ikke være i stand til at fortsætte over i M-fasen, men vil i stedet forblive i S-fasen [Rigolio et al., 2004] I et tredje forsøg udført af Joe et al., (2002), blev der brugt SW480 colorectal cancerceller, og der blev her observeret en akkumulering i S-fasen og et fald i ekspressionen af cyklin B, cyklin A og cyklin D1. Cyklin D1 niveauet faldt allerede efter 2 timer. På grund af faldet i ekspressionen af cyklin D1, ville det forventede udfald være, at cellecyklus ville stoppe i G 1 -fasen, og ikke i S-fasen, som var tilfældet i forsøget med SW480 colorectal celler. Akkumuleringen af celler i S-fasen, på trods af nedreguleringen af cyklin D1, skyldes sandsynligvis opreguleringen af cyklin E, da en høj koncentration af denne vil få cellerne til at fortsætte ind i S-fasen. Hvis den høje koncentration af cyklin E herefter ikke nedreglueres i S-fasen, vil det betyde at cellerne ikke kan forstsætte ind i G 2 - fasen. Derudover forårsager resveratrol en tids- og dosisafhængig inducering af p53 og p21. En opregulering af p53 i cellen vil betyde en større forekomst af apoptose. Endvidere vil opreguleringen af cdk hæmmeren p21 betyde en nedregulering af aktiviteten af de påvirkede cdk, og forårsage et stop i cellecyklus [Ahmad et al., 2001]

15 7. Mitochondrier Mitochondrier er organeller, der findes i cellens cytosol. Jo højere metabolisme en celle har, des flere mitochondrier indeholder den, og der kan være op imod flere tusinde mitochondrier i en celle. Det er et interessant organel, idet teorien omkring deres tilstedeværelse i den eukaryote celle er, at det som endosymbiont for omkring 1 milliard år siden blev inkorporeret i eukaryote celler. Ved at indgå symbiose med mitochondrier, der er i stand til at udnytte oxygen, opnåede den eukaryote celle en langt mere effektiv energiproduktion, idet den gik fra at være anaerob til at være aerob [Prentø og Jensen, 2000]. Dette blev muliggjort ved at jordens atmosfære gik fra at være iltfri til at blive rig på molekylært oxygen. Den dengang nydannede iltrige atmosfære var et resultat af cyanobakteriernes fotosyntese. Herved opstod oxidativ fosforylering, der står for den egentlige dannelse af energi (ATP) ved hjælp af ilt. Mitochondrier indeholder deres eget DNA (mtdna), der replikeres uafhængigt af det nucleare DNA (ndna) [Dykens et al., 1999], og de er opbygget af to membraner, der er adskilt af det intermembranale rum. Mitochondriernes inderste rum kaldes for matrix. Den inderste membran er foldet, hvilket giver en stor overflade, der giver mulighed for stor transport fra matrix til det intermembranale rum og eventuelt ud i cytosolen. Mitochondriernes vigtigste funktion er energiproduktion (dannelse af ATP), hvilket primært sker via den oxidative fosforylering. Figur 7.1 Her ses opbygningen af et mitochondrie med dets 2 membraner, hvoraf den inderste er foldet og den yderste glat [Campbell og Reece, 2002]. Dannelsen af energi starter ved, at lipider, pyruvat og acetat omdannes af acethylcoenzym A og overføres til TCA-cyklus, hvor de efterfølgende bliver nedbrudt til CO 2 og H. NAD+ og FAD bliver i TCA-cyklus reduceret, og optager således hydrogen.. TCA-cyklus er således ansvarlig for produktionen af NADH og FADH 2, der både fungerer som elektrondonorer til 15 15

16 elektrontransportkæden og oxidationsmiddel i TCA-cyklus. NADH afleveres til elektrontransportkædens kompleks I, mens FADH 2 afleveres til kompleks II i ETC (se figur 7.1.1). Figur 7.2 Denne figur illustrerer sammenhængen mellem ETCs kompleks I-II og TCA-cyklus. NAD+ og FAD reduceres i takt med at elementerne i TCA-cyklus oxideres. NADH og FADH 2 bliver efterfølgende oxideret i ETC og indgår således skiftevis imellem ETC og TCAcyklus [ Under den mitochondrielle metabolisme dannes en række biprodukter i form af frie iltradikaler, som under ét kaldes ROS (Reactive Oxygen Species). ROS kan have en skadelig effekt på eksempelvis membraner og andet omkringliggende væv. Mitochondrierne har også en central rolle for apoptose, da forstyrrelser af mitochondriernes funktion kan iværksætte en række processer, der i sidste ende kan føre til apoptose. Dannelsen af ATP via oxidativ fosforylering, ROS, samt regulationen af apoptose, er de nogle af de vigtigste aspekter ved mitochondrierne, og de vil derfor blive uddybet i de følgende afsnit. Den oxidative fosforylering er den mest bidragende proces med henblik på produktion af ATP. Når kroppen nedbryder monosaccharider, dannes der ved den oxidative fosforylering 34 ATP molekyler per glukosemolekyle, i kontrast til 2 ATP molekyler fra hver af henholdsvis TCA-cyklus og glykolysen. Både glykolysen og TCA-cyklus er dog nødvendige for at elektrontransportkæden forbliver funktionel, idet de er ansvarlige for produktionen af NADH og FADH Elektrontransportkæden Elektrontransportkæden er betegnelsen for en række proteinkomplekser (I-V), der har til opgave at tilpasse dannelsen af ATP, således dette når et niveau, der er hensigtsmæssigt for kroppens øjeblikkelige behov. ETCs proteinkomplekser er lokaliseret i mitochondriernes indre membran og er drevet af redoxreaktioner. ETC består hovedsageligt af proteiner, men indeholder også 16 16

17 prostetiske grupper. De prostetiske grupper er koblet til proteiner og er afgørende for deres respektive enzyms katalyserende effekt. De prostetiske grupper undergår redoxreaktioner og skifter således mellem deres reducerede og oxiderede tilstand [Campbell et al., 2002]. Andre af ETCs grundlæggende elementer er jern-svovlproteiner (Fe-S) og cytokromer (cyt). Et cytokrom er et protein indeholdende en prostetisk gruppe betegnet som en hæm-gruppe. Hæm-grupper er karakteriseret ved at have et jernatom omkranset af fire organiske ringe. Det er til jernatomet i cytokromernes hæm-grupper, at elektronerne binder sig, ligesom det også er jernatomet i Fe-S, der accepterer elektroner [Campbell et al., 2002; Matthews et al., 1990]. Ved overførslen af elektronerne udskilles de resterende protoner i det intermembranale rum, og der opbygges således en elektrokemisk gradient ( Ψ) over den indre membran. Denne protongradient danner grundlaget for den endelige syntese af ATP. ETCs første kompleks, kompleks I, består af 41 proteiner, hvoraf det mitochondrielle DNA (mtdna) koder for de 7 [Mandavilli et al., 2002]. Den første elektronacceptor i kompleks I er et flavoprotein med den prostetiske gruppe flavin mononukleotid (FMN). FMN modtager elektroner fra den reducerede elektronoverfører NADH, som kan være genereret i TCA-cyklus eller af DHODH (dihydroorotat dehydrogenase) (se afsnit 8.1) og sender, for hvert modtaget elektronpar, en til to elektroner over den indre membran til coenzymet ubiquinon (CoQ). CoQ er en lipid og befinder sig i den mest viskøse del af den indre cellemembran [Dykens et al., 1999]. CoQ er den eneste del af ETC, der ikke er et protein [Campbell et al., 2002]. Ved overførslen af elektroner til CoQ, bliver de resterende protoner sendt ud i det intermembranale rum. Overførslen af protoner til det intermembranale rum sker på baggrund af en energifrigivelse, der finder sted under redoxreaktionerne. Dette sker ved at kompleks I optager 3 hydrogenatomer fra matrix og efterfølgende afgiver 2 elektroner til det intermembranale rum. Kompleks II består af 4 proteiner, der alle er kodet af det nucleare DNA (ndna) [Mandavilli et al., 2002], og er som det eneste kompleks ikke integreret i mitochondriernes indre membran, men er i stedet lokaliseret i det mitochondrielle matrix. På samme måde som kompleks I, modtager kompleks II elektroner fra TCA-cyklus, dog fra den oxiderede elektronoverfører FADH 2. Elektronerne overført fra FADH 2 indtræder først i kompleks II hvilket resulterer i, at Ψ kun bliver forøget med 1/3, i forhold til forøgelsen af Ψ foråsaget af elektroner doneret til kompleks I [Campbell et al., 2002]. I kompleks I fungerer Fe-S som elektronacceptor, og de modtagne elektroner bliver herefter direkte overført til elektronbæreren CoQ. CoQ overfører elektronerne til cytb i kompleks III, som består af 10 proteiner, hvoraf det ene er kodet af mtdna [Mandavilli et al., 2002]. Det relativt store kompleks III (500 kd) overfører sine 17 17

18 elektroner til cytc, som er den anden elektronbærer i ETC. Denne overførsel sker via henholdsvis Fe-S og cytc 1. Som beskrevet i forbindelse med kompleks I, bliver de resterende protoner her ligeledes efterfølgende udsendt i det intermembranale rum, således at Ψ øges. Figur7.1.1 illustrerer hvorledes henholdsvis NADH og FADH 2 overfører elektroner til elektrontransportkæden (ETC). Efterhånden som de donerede elektroner, via redoxreaktioner, bliver ført gennem ETC, overføres protoner fra matrix til det intermembranale rum, og der dannes herved en elektrokemisk protongradient ( Ψ). Ψ danner grundlag for et flow af protoner gennem ATPasen (kompleks V), og derved syntsen af ADP og uorganisk fosfor til ATP [Dykens et. al 1999]. CytC fungerer som elektronbærer, men er også et centralt protein i apoptosen. Såfremt mitochondriet skulle blive særligt beskadiget vil cytc blive overført til cytosolet, hvor det aktiverer en række proteaser (caspaser), der medfører apoptose (se afsnit om apoptose) [Dykens et al., 1999]. CytC overfører elektronerne modtaget fra kompleks III til ETCs kompleks IV via det intermembranale rum. Kompleks IV består af 7 proteiner kodet af ndna og 3 proteiner kodet af mtdna [Mandavilli et al., 2002]. Kompleks IV er det sidste egentlige led i ETC og har til funktion at overføre elektroner til den sidste elektronacceptor O 2, hvorved der dannes H 2 O. Kompleks IV overfører 4 elektroner ad gangen for at minimere udskillelsen af frie radikaler. Denne overførsel forløber via cyta 1 og cyta 3. Ved denne overførsel frigives igen protoner til det intermembranale rum og Ψ øges

19 ATPasen, er ikke en del af det elektrontransporterende system, men danner sammen med den opnåede elektrokemiske gradient grundlag for syntetisering af ATP. ATPasen består af 14 proteiner, hvoraf mtdna koder for 2. ATPasen er det eneste protein, som går hele vejen igennem den indre membran [Mandavilli et al., 2002]. Under normale forhold er den indre membran impermeabel for protoner, og ATPasen er således den eneste vej protonerne kan komme igennem membranen og derved udligne protongradienten. På baggrund af den opbyggede Ψ vil de protoner, der befinder sig i det intermembranale rum søge at udligne denne forskel ved at diffundere til det mitochondrielle matrix. Således opnås elektrokemisk ligevægt mellem det intermembranale rum og det mitochondrielle matrix [Dykens et al., 1999]. ATPasen er opdelt i to moduler kaldet F0-ATPasen og F1-ATPasen. F1-ATPasen er et transmembranalt kompleks, hvor protein-enhederne udgør en cylinderformet rotor. Det er via denne cylindriske kanal, protonerne passerer igennem mitochondriernes indre membran, hvilket får F1- ATPasen til at rotere [Matthews og van Holde, 1990]. Protonerne passerer videre igennem F0- ATPasen, som bruger energien til at fosforylere ADP til ATP [Dykens et al., 1999] Dannelse af frie radikaler i elektrontransportkæden Under ETC vil der naturligt dannes biprodukter i form af O 2, H 2 O 2 og OH, der under et kaldes frie radikaler eller ROS (Reactive Oxygen Species). Der er således i ETC en balance mellem dannet ATP og frigivelsen af frie radikaler. Et frit radikal er et molekyle med en uparret elektron i den yderste skal. Dette resulterer i en særdeles reaktiv forbindelse, der ikke vil være selektiv med hvilke komplekser den udveksler elektroner med [Dykens et al., 1999]. Frie radikaler er mutagene, og OH kan sågar bryde en DNAstreng [Mathews og Van Holde, 1990]. Figur : Oversigt over udskillelsen af frie radikaler via ETC. Kompleks I og III udskiller radikaler i cellens matrix. Tillige udskiller kompleks III radikaler i det intermembranale rum, hvor der ikke er nogen antioxidanter til at neutralisere dem [Chen et al., 2003] 19 19

20 De frie radikaler kan herigennem føre til oxidative skader på DNA, membranener, proteiner og andet væv [Wallace, 1999]. Dannelsen af frie radikaler sker, når O 2, som er tilgængeligt i både matrix og det intermembranale rum, modtager en elektron (jf. figur ), hvorved der dannes superoxid O 2. Såfremt O 2 accepterer endnu en elektron dannes der H 2 O 2. Hvis H 2 O 2 reduceres dannes hydroxylradikalet OH, der er den mest reaktive oxygenmetabolit [Oxford dictionary, 2004; Wallace, 1999]. Dannelsen af frie radikaler sker primært i ETCs kompleks I og III. De frie radikaler fra kompleks I afleveres ud i det mitochondrielle matrix hvor de bliver neutraliseret af det antioxidative forsvar. Det oxidative forsvar består blandt andet af mangansuperoxiddismutase (MnSOD), som omdanner O 2 til H 2 O 2. Enzymet catalase spalter efterfølgende H 2 O 2 til O 2 og H 2 O. Kompleks III, der er ETCs største producent af frie radikaler, har to centre: Q 0 og Q i. Q 0 er vendt ud mod det intermembranale rum i modsætning til Q i, der vender ind mod det mitochondrielle matrix. ROS dannet i Q i bliver frigivet i det mitochondrielle matrix, hvor det bliver neutraliseret af de føromtalte antioxidanter [Chen et al., 2003]. ROS, som dannes i Q 0, bliver frigivet i det intermembranale rum, hvor der ikke er et antioxidativt forsvar og risikoen for skade på mitochondrierne således er forøget [Chen et al., 2003; Pelicano et al., 2004] Apoptose Apoptose er en kontrolleret form for celledød. Den adskiller sig fra nekrosen (ikke reguleret celledød) idet den fører til, at alle celledele og organeller i den berørte celle indkapsles og fagocyteres. I nekrosen vil der derimod ske inflammation og en udsivning af DNA fra den destruerede celle. Genet p53, i visse sammenhænge kaldet det apoptoseregulerende gen, medvirker via forskellige pathways til inducering af apoptose. Proteinet p53 er bla. i stand til at registrere, om der er sket en fejl i DNA-syntesen i den enkelte celle og derved, om cellen har potentiale til at udvikle sig til en cancercelle. Hvis der er opstået fejl i DNA, der ikke kan repareres, vil p53 inducere apoptose [Prentø og Jensen, 2000]. Dette sker via en forstyrrelse af det mitochondrielle membranpotentiale, der medfører udsivning af cytokrom C fra det intermembranale rum til cytosolet. Her aktiverer cytc caspase-9, der er første af en række proteinspaltende enzymer (proteaser), der er involveret i apoptosen. Caspase-9 aktiverer caspase-3, og afhængig af celletype, vil det være forskellige caspaser, der aktiveres, men forsøg af Hwang et al. (2005) viser aktivering af caspaserne -9, -8, -7, -6, -3, -2 i HeLa-celler ved apoptose. Caspaseaktivering afsluttes med DNA-fragmentering og efterfølgende celledød

21 7.2 Mitochondrier uden mtdna Det mitochondrielle DNA (mtdna) er et cirkulært molekyle, som kun består af ca. 16,5 kilo basepar, og som er uden introns. Det kopierer sig uafhængigt af cellecyklus og der findes mindst 7-10 forskellige genotyper i et menneske [Dykens et al., 1999]. Udover at kode for 22 trna og 2 rrna, koder mtdna også for 13 proteiner, der indgår som vigtige elementer i ETC (jf. afsn. 7.1). Hvis mtdna fjernes eller ødelægges, vil ETC blive hæmmet og i sidste ende ikke længere være funktionel [Dykens et al., 1999; Wallace, 1999]. Det manglende mtdna resulterer også i, at ATPasen vil blive defekt og ude af stand til at syntetisere ATP [Zheng og Ramirez, 2000]. Cellen kan reagere ved at opregulere glykolysen for at danne mere ATP, hvilket ofte er set hos cancerceller [Xu et al., 2005] Når ETC er ude af funktion, medfører det, at produktionen af ROS i kompleks III vil ophøre [Dykens et al., 1999]. Forsøg har vist, at mængden af O 2 er ti gange mindre i celler uden mtdna i forhold til celler med mtdna, mens mængden af H 2 O 2 var den samme [Delsite et al., 2003]. Hvis mtdna muteres kan det have skadelige effekter på ETC og øge produktionen af de frie radikaler, som er mutagene og medfører vævskader [Pelicano et al., 2004]. Det kan altså have alvorlige konsekvenser, hvis mitochondrierne bliver defekte. Ikke mindre end 100 forskellige sygdomme er sat i forbindelse med defekte mitochondrier, bl.a. Alzheimers og Parkinsons syge [Dykens et al., 1999]. I forsøg med cancerceller har man også vist, at defekte mitochondrier fører til større modstandskraft overfor cancerterapi [Xu et al., 2005]. 7.3 Resveratrols påvirkning af mitchondrier Zini et al. [2002] har undersøgt resveratrols beskyttende virkning på mitochondrier fra rottehjerner, som var blevet udsat for anoxia-reoxygenation, altså midlertidig anaerobe forhold. Resveratrol forhindrede visse af de resulterende skader, f.eks ved at forhindre cytc, som er apoptoseinducerende, i at trænge igennem den mitochondrielle membran. Ligeledes mindskede resveratrol produktionen af O 2 ved at konkurrere med ubiquinol og derved hæmme kompleks III. Samtidig beskyttede den også op til 70 % af den mitochondrielle membran, som var blevet skadet efter anoxia-reoxygenation [Zini et al. 2002] ROS: resveratrols pro- og antioxidative egenskaber Resveratrol udviser interessant nok både anti- og prooxidative egenskaber alt afhængig af koncentration og celletype [Pervaiz et al., 2004]. Resveratrol kan virke som antioxidant, da det er i stand til at neutralisere frie radikaler. Lorentz et al., [2003] har ved forsøg vist at stilben uden hydroxylgrupper ikke udviser antioxiderende effekt, 21 21

22 hvilket antyder, at det er hydroxylgrupperne der har den primære antioxidative virkning. Der er dog andre forhold, end blot tilstedeværelsen af hydroxylgrupper, der gør sig gældende: Stivala et al., [2001]. har undersøgt følgende tre forhold omkring resveratrolmolekylet for nærmere at afdække dets antioxidative egenskaber: I) stereoisomeri II) hydroxylgruppernes placering og III) stilben dobbeltbindingen [Stivala et al., 2001]. De tre forhold (I-III) undersøges eksperimentielt ved hjælp af modificeret trans- og cisresveratrol. 6 forskellige resveratrol derivater tilsættes skiftevis til rotteleverceller tilsat et radikal i form af 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Efterfølgende måles de respektive derivaters evne til at reducere DPPH, og derved begrænse oxidative membranskader forsaget af DPPH. Undersøgelsen konkluderer følgende: I) Trans-resveratrol viste signifikant større effekt end cis-resveratrol, med EC 50 -værdier på henholdsvis 0,77 µm og 1,10 µm (værdier gående fra 0,77-2,40 µm). II) Af de tre OH-grupper, viste 4' hydroxylgruppen at være afgørende for trans-resveratrols antioxiderende effekt, da substitution af netop denne OH-gruppe med en methoxygruppe gav det største fald i stoffets antioxidative effekt. III.) Ved fjernelse af stilben dobbeltbindingen observeres et fald i den antioxidative effekt ved en stigning i EC 50 fra 0,77 µm til 1,57 µm [Stivala et al., 2001]. Forsøg udført af Ahmad et al., [2003] påviser, at små doser resveratrol (4-8 µm) beskytter HL60 leukæmiceller mod apoptose. Det sker ved, at resveratrol opregulerer mængden af intracellulær superoxid (O - 2 ). Tilsyneladende virker tilstedeværelsen af en lille mængde superoxid beskyttende på en lang række cancerceller, idet det forhindrer aktivering af apoptose. Den prooxidative effekt af resveratrol ophører ved doser højere end 8 µm [Ahmad et al., 2003] Resveratrols hæmmende effekt på ATPasen Resveratrol hæmmer aktiviteten af F0F1-ATPase (IC 50 på 12-28µΜ) i mitochondrier udtaget fra rottehjerner. Dette resulterer i, at ATP syntesen hæmmes, med en IC 50 værdi på 27,7 µμ [Zheng og Ramirez, 2000]. Resveratrols hæmning af ATPasen sker sandsynligvis ved at hæmme subunits i F1- delen [Zheng og Ramirez, 2000; Zini et al., 2002; Zini et al., 1999]. Man har fundet ud af, at resveratrol binder sig til de samme sites som aurovertin B i binder sig til i celler fra køer. Aurovertin B binder sig til to identiske sites på β TP og β E subunits [Gledhill og Walker, 2004] Resveratrols apoptoseinducerende egenskaber Forsøg, der er lavet på en række forskellige cancerlinier, viser, at resveratrol inducerer apoptose [Fulda og Debatin, 2004]. Resveratrol kan tilsyneladende føre til apoptose via flere forskellige 22 22

23 pathways. En af de pathways, der er forsket meget i er, hvorledes resveratrol inducerer apoptose via p53 og caspaseaktivering [Laux et al., 2004; She et al., 2001 og 2002; Kim et al., 2004; Huang et al., 1999]: De eksakte mekanismer er svære at afklare, men She et al., (2001) har vist, at resveratrol kan aktivere ekstracellulære signalregulerede proteinkinaser (ERK) og p38 kinase, der fosforylerer p53 og derved starter apoptosen. Denne apoptose forløber tilsyneladende enten helt uden involvering af cytc eller ved ganske kortvarig opregulering af cytc og derpå følgende aktivering af caspaser. Resveratrol aktiverer ifølge Tinhofer et al., (2001) både caspase 9,2,3 og 6. Således vil resveratrol inducere apoptose ved koncentrationer over 10 µm i en lang række cancerceller. Den samme apoptoseinducerende effekt er ikke observeret i forsøg med humane lymfocytter eller raske celler fra rotter [hhv. Clément et al., 1998; Le Corre, 2005]

24 8. Syntetisering af dntp til DNA-syntese - De novo pathway Nukleotider er grundelementer i DNA og RNA, og indgår i en række cofaktorer som ATP, NAD +, NADP +, FAD og CoA [Zubay, 1998]. DNA opbygges af de fire deoxyribonukleotider datp, dgtp, dctp og dttp, som fælles betegnes dntp. dntp til DNA-syntese kan syntetiseres via to veje de novo eller salvage pathway. I biosyntesen af nukleotider via. salvage pathway genbruges dele af nukleotiderne til nukleotidsyntesen. I de novo pathway bliver nukleotiderne derimod syntetiseret ud fra små simple uorganiske molekyler som CO 2, H 2 O og NH 3 [Zubay,1998; Matthews og van Holde, 1996]. Der er to forskellige de novo pathways, som er ansvarlige for syntetisering af henholdsvis pyrimidin- og purinnukleotider. Ud fra purinnukleotidet IMP (Inosin Mono Phosphate) syntetiseres datp og dgtp, mens der ud fra pyrimidinnukleotidet UMP (Uridin Mono Phosphate) syntetiseres dttp og dctp [Zubay,1998; Matthews og van Holde, 1996]. 8.1 Dihydroorotat dehydrogenase DHODH DHODH er et enzym i de novo syntetiseringen af pyrimidinnukleotider. DHODH oxiderer dihydroorotat til orotat ved at reducere NAD + til NADH. Herved overføres en elektron via kompleks I i ETC til CoQ, som donerer elektronen videre til kompleks III i ETC [Löffler et al., 1997; Mathews og van Holde, 1990]. DHODH befinder sig i mitochondriets indermembran og er det eneste enzym i nukleotidmetabolismen, som afhænger af kompleks III og IV og derved ETC [Löffler et al., 1997]. Hvis ETC er ude af funktion, vil pyrimidinsyntesen derfor blive stærkt hæmmet, og der vil blive mangel på pyrimidinnukleotiderne dctp og dttp til DNA replikation og reparation [Löffler et al., 1997]. Figur CAD er et multifunktionelt protein med de tre første enzymaktiviteter i de novo pyrimidin pathway, som foregår i cytosolet. Herefter bliver dihydroorotat oxideret af DHODH til orotat, hvilket foregår i mitochondriernes indermembran. Orotat bliver syntetiseret videre til UMP i cytosolet af UMP syntase, som er et multifunktionelt protein ligesom CAD [Löffler et al., 1997]

25 Det er indtil videre ikke undersøgt, hvorvidt resveratrol direkte hæmmer aktiviteten af DHODH, men da tidligere resultater viser, at resveratrol hæmmer kompleks III [Zini et al., 2002], er det muligt at resveratrol derigennem også har en negativ effekt på aktiviteten af DHODH i cancerceller. 8.2 Ribonukleotid Reduktase - RNR RNR spiller en central rolle i biosyntesen af deoxyribonukleotider. Reaktionerne foregår i cellens cytoplasma, hvor RNR reducerer de fire forskellige ribonucletider til deoxyribonukleotider ved at reducere 2 - OH gruppen til H [Eklund et al. 2001; Zubay, 1998]. Figur RNR reducerer 2 - OH gruppen i ribonukleotidet til H. Herved dannes deoxyribonukleotid [Siegbahn et al., 1998]. RNR er opbygget af to dimere proteinenheder, R1 og R2. R1 er den regulerende, såvel som reducerende del, mens R2 har de tyrosylradikaler, som er nødvendige for aktiviteten af enzymet [Eklund et al., 2001]. Der er uvished omkring R2 proteinets pathways: Et iltmolekyle, O 2, oxiderer et Fe II dimer kompleks i R2 til Fe III. Dette jernkompleks omdanner aminosyren tyrosin til en fri tyrosylradikal, som fjerner et hydrogenatom fra 3 - kulstofatomet i ribonukleotidets ribosering. Radikalen binder sig herefter til ribonukleotidet og transporterer det op til substratsekvensen i R1, hvor ribonukleotidet reduceres. Herefter vender tyrosylradikalet tilbage til R2 delen [Siegbahn et al., 1998; Stubbe, 1990]. Figur RNR er opbygget af to proteinenheder, R1 og R2. R1 er den reducerende og aktivitets regulerende del (jf. fig ), mens R2 sørger for transporten af ribonukleotidet til reduktionssekvensen i R1 [mvl.chem.tu-berlin.de]