Indhold. Indhold 5. Cellecyklus, mitose og meiose 55

Transkript

1 Indhold Indhold 5 Forord 10 stamtræssymboler 12 Menneskets genom 15 Indledning 15 Det personlige genom og artens genom 15 Generelt om arvemateriale 17 DNA-replikation 18 Arvematerialets funktion 20 Proteinkodende gener 21 Transkription og posttranskriptionel modificering 28 Den genetiske kode 33 Translation og posttranslationelle modifikationer 33 Ikkekodende RNA 36 DNA ets organisering i cellekernen kromatin og kromosomer 43 Mitokondrie-DNA (mtdna) 47 Betydning og perspektiver 51 ellecyklus, mitose og meiose 55 Indledning 55 ellecyklus 55 Mitosen 57 Meiosen 58 Meiosens faser i relation til gametogenesen 60 Mitokondriernes forhold ved celledelinger 61 Genetisk variation 65 Indledning 65 Mutationers opståen 65 Mutationstyper 66 Genetiske markører og markøranalyser 77 Normal variant eller patogen mutation? 78 Beskrivelse af sekvensvariation på DNAog proteinniveau 79 ytogenetik og kromosomsygdomme 83 Indledning: Den cytogenetiske analyse 83 Den normale kromosomsammensætning 83 Kromosomafvigelser book.indb 5 09/12/

2 INDHOLD Mikrodeletionssyndromer og molekylær cytogenetik 100 Referencer 103 Arvegange, monogene sygdomme og mitokondriesygdomme 105 Dominans og recessivitet 108 Afvigelser fra klassiske nedarvningsmønstre 116 X-bundet recessiv sygdom 119 Mitokondriesygdomme 121 Patogen mutation eller normal variant? 124 Genetisk epidemiologi 127 Hvad er genetisk epidemiologi? 127 Genetisk-epidemiologiske metoder 127 Populationsgenetik 141 Multifaktoriel arv 147 Kvantitativ arv 147 Tærskelmodellen 148 Folkesygdomme 150 Psykiatriske sygdomme 152 Bipolær affektiv sindslidelse 154 Atopiske sygdomme 156 Inflammatoriske tarmsygdomme 157 Genetisk rådgivning 163 Hvad er genetisk rådgivning? 163 Genetisk rådgivning i specielle situationer 167 Specielle aspekter ved genetisk rådgivning 168 Prænatal genetisk diagnostik 173 Formålet 174 Organisationen af den prænatale genetiske diagnostik 174 Metoder til udtagning af føtalt væv 175 Diagnostisk ultralydscanning af fosteret 177 Sygdomme og misdannelser der kan påvises ved prænatal genetisk diagnostik 178 Prænatal screening for Downs syndrom (risikovurdering) 182 Indikationer for prænatal genetisk diagnostik 186 Rådgivning ved prænatal genetisk diagnostik 189 Resultater af prænatal genetisk diagnostik 190 Præimplantationsdiagnostik 191 Prænatal genetisk diagnostik i fremtiden 192 Supplerende litteratur 193 Postnatal genetisk screening 195 Indledning 195 Teoretiske overvejelser 195 Overordnede etiske overvejelser 196 Typer af postnatal screening 197 Afslutning book.indb 6 09/12/

3 INDHOLD Arvelige stofskiftesygdomme 201 Genetisk og biokemisk patologi 202 Abnorm kompartmentalisering pga. defekt membrantransport 207 Øget enzymaktivitet 208 Debutalder 210 Sygdomsmønstre 210 Sygdomsforløb 210 Dysmorfe træk 211 Screening 211 Specifikke biokemiske/ molekylærgenetiske analyser 214 Prænatal diagnostik 214 Neonatalscreening 214 Diæt 215 Enzymhæmning 215 Medikamentel reduktion af substrat 216 Medikamentel eliminering af biprodukter 216 Vitaminer 216 Substitution 216 Medikamentel bedring af enzymfunktion 217 Transplantation 217 Forebyggende foranstaltninger 218 Dysmorfologi 219 Isolerede misdannelser 223 Malformationssyndromer 224 Opslagsværker 230 ancergenetik arvelig disposition for cancer 231 Indledning 231 Arvelig cancerrisiko 232 ancer opstår ved en flertrinsproces 233 Onkogener 233 Tumorsuppressorgener (gatekeepers) 235 aretakers 236 ancer kan betragtes som en stamcelledefekt 237 Arvelighed ved de hyppigste former for cancer 237 Monogen/syndromal arvelig disposition for cancer 241 Risikoklassifikation: 242 Onkogenetisk udredning og rådgivning 248 Den onkogenetiske konsultation 251 Litteratur 253 ancercytogenetik 255 Indledning 255 De kromosomale sygdomsmekanismer ved cancer 258 Hvordan opstår gentagne specifikke kromosomforandringer? 259 ancerstamcellen og dens betydning for tumorudvikling 263 På hvilket tidspunkt i livet opstår kromosomforandringer? 263 Er de erhvervede kromosomforandringer tilstrækkelige til neoplastisk udvikling? book.indb 7 09/12/

4 INDHOLD Hvilke cytogenetiske metoder er bedst til at påvise neoplasi-relaterede forandringer? 264 De maligne hæmatologiske sygdomme 265 Normal hæmopoiese 265 Er abnorm hæmopoiese tilstrækkeligt til at medføre leukæmi/lymfom? 267 Korrelation mellem morfologi, fænotype og kromosomale rearrangementer. 269 Myeloproliferative neoplasier 270 Kronisk myeloid leukæmi (ML) 270 Myeloide og lymfoide neoplasier med eosinofili og aberrationer i PDGFRA, PDGFRB eller FGFR1 272 Myelodysplastiske syndromer/ Myeloproliferative sygdomme (MDS/ MPD) 272 Myelodysplastiske syndromer (MDS) 273 Akut myeloid leukæmi (AML) og relaterede precursor-neoplasier 273 Akut lymfatisk leukæmi (precursor lymfoide neoplasier) 275 B-celle-lymfoblastleukæmi (B-ALL)/ lymfom (B-LBL), uspecificeret 275 B-celle-lymfoblastleukæmi (B-ALL)/ lymfom (B-LBL) med gentagne genetiske forandringer 275 T-celle-lymfoblastær leukæmi (T-ALL)/ lymfoblastisk lymfom (T-LBL) 276 Modne B-celle-neoplasier 276 Kronisk lymfatisk leukæmi (LL)/Small lymphocytic lymphoma 276 Plasmacelle-neoplasier (myelomatose) 277 Follikulært lymfom, diffust storcellet B-lymfom, mantle-celle lymfom, Burkitts lymfom og MALTlymfom 278 Modne T-celle- og NK-celleneoplasier 278 Aggressiv NK-celle-leukæmi 278 Anaplastisk storcellet lymfom (ALL), ALK-positiv vs. ALK-negativ 278 Hodgkin-lymfom 278 Solide tumorer 279 Fremtidige perspektiver for cancercytogenetikken 280 Neurologiske og neuro muskulære sygdomme 285 Indledning 285 Misdannelser 286 Kromosomsygdomme 286 Mitokondriesygdomme 286 Sygdomme med monogen arvegang 286 Repeatsygdomme 287 Parkinsonisme 302 Mental retardering 307 Indledning 307 Intelligenskvotient 308 Genetiske årsager til mental retardering 309 Generelt om udredning og gentagelsesrisiko ved mental retardering 314 Litteratur book.indb 8 09/12/

5 INDHOLD Genterapi 317 Introduktion 317 Generelle principper 317 Risici 323 Fremtidige udviklinger og perspektiver 323 Litteratur 325 Molekylærgenetisk diagnostik metoder og teknikker 327 Indledning 327 Fragmentanalyse 332 Heteroduplex 333 SNP-analyse 334 Dynamiske mutationer 337 MLPA 340 MLPA methyleringsstatus 342 Array-teknologier 344 Array-GH 345 SNP-array 346 Ekspressions-array 347 Nye sekventeringsteknologier 349 Øjebliksbillede af NGS (Next Generation Sequencing) 349 Forfatteroversigt 359 Ordliste 363 Stikordsregister book.indb 9 09/12/

6 Forord Når man taler om menneskets arvelighedsforhold i et lægeligt perspektiv, skelner man gerne mellem tre genetiske discipliner: humangenetik, medicinsk genetik og klinisk genetik. Humangenetik er læren om menneskets arvemasse og variationen heri. Medicinsk genetik er læren om arvelige faktorers betydning for opståelsen af sygdomme hos mennesket, og endelig kan man definere klinisk genetik som den disciplin der omhandler den praktiske udmøntning af den medicinsk genetiske viden i diagnostik og genetisk rådgivning. Denne lægelige udfordring kræver dels kendskab til de kliniske manifestationer af genetiske sygdomme, dels udvikling og anvendelse af laboratoriediagnostiske analyser. Det er formålet med nærværende lærebog er at give en indføring på dansk i nogle af de vigtigste anvendelsesområder inden for medicinsk og klinisk genetik, og ved udarbejdelsen af bogen har fokus været på klinisk relevans, samtidig med at det biologiske og teoretiske fundament forklares. Den primære målgruppe for denne bog er medicinstuderende på 1. og 2. del, men det er vores håb at bogen også vil finde anvendelse i det postgraduate forløb, herunder i speciallægeuddannelserne. Humangenetikken er en forholdsvis ung videnskabelig disciplin der, ligesom anden genetik, har sit grundlag i de arvelighedslove den østrig-ungarnske munk og naturforsker Gregor Mendel opstillede i midten af 1860 erne. Uden at kende til det fysiske grundlag for arvematerialet beskrev han nedarvningsmønstrene for dominante og recessive egenskaber hos ærteplanter, og sluttede at de skyldes distinkte arvelige enheder, Elemente; det vi kalder arveanlæg eller gener. Mendels arbejder forblev dog i mange år stort set upåagtede, men omkring år 1900 blev de genopdaget, samtidig med at man nu fik fastere grund under fødderne med hensyn til arveanlæggenes lokalisation i cellen. Siden opdagelsen i 1953 af arvemassens molekylære struktur (DNA-molekylets dobbeltspiral, den såkaldte Watson-rick model) har udviklingen i vor viden om menneskets arvemasse været i en konstant ekspansiv fase. Denne udvikling nåede et foreløbigt klimaks i oktober 2004 med offentliggørelsen af den fuldstændige kemiske opbygning af menneskets arvemasse, i form af basesekvensen i menneskets DNA. Den medicinske genetik anses i dag for en kernedisciplin inden for biologi og lægevidenskab. Den har muliggjort en fundamental ny indsigt i årsag og patogenese ved arveligt betingede sygdomsprocesser, og fagets potentiale giver grundlag for meget store forventninger til den nære fremtid. Hvis patienterne og deres familier til fulde skal høste fordelene af vores voldsomt forøgede genetiske viden er det helt nødvendigt, at læger tilegner sig en forståelse af genetikkens grundbegreber og den rolle som genetiske faktorer spiller for individets udvikling samt for opståelsen af sygdom. Genetik som videnskab er baseret på en kraftfuld teori med stor forklaringsstyrke. Nøglebegrebet er enheden et gen, navngivet af den danske plantefysiolog og genetiker Wilhelm Johannsen i Genet er enheden for oplagring, videreførelse samt omsætning af den information, der er lagret i arvemassen, omend gen-be book.indb 10 09/12/

7 FORORD grebet har undergået en nødvendig udvikling i takt med kortlægningen af arvemassens struktur og funktion. Andre genetisk vigtige grundbegreber, ligeledes indført i den internationale terminologi af Wilhelm Johannsen, er genotype (anlægspræg) og fænotype (fremtoningspræg). I mange år udgjordes kerneområdet for den medicinske genetik af et raritetskabinet af monogene sygdomme som fx dværgvækst, blødersygdom og seglcelleanæmi; tilsammen nok et stort antal sygdomme, men hver for sig ganske sjældne. Det er siden blevet klart, dels at flertallet af de almindeligt forekommende sygdomme som åreforkalkning, sukkersyge, cancer og skizofreni har meget væsentlige genetiske årsagskomponenter, dels at de genetiske sammenhænge i disse tilfælde kun sjældent er så simple som for de klassiske arvelige sygdomme. I mange tilfælde spiller genetiske faktorer en afgørende rolle for tilbøjeligheden til at udvikle en given sygdom; i andre tilfælde er genetiske faktorer væsentlige elementer i organismens forsvar mod at udvikle sygdom. Den medicinske genetik har traditionelt været tættest associeret med pædiatri, men som en følge af fagets udvikling er den i dag relevant for alle lægevidenskabelige specialer, herunder ikke mindst neurologi, hæmatologi, kardiologi, psykiatri og onkologi; hertil kommer obstetrikken som den kliniske genetik har et nært samarbejde med om fosterdiagnostikken. Den videnskabelige udvikling inden for humangenetik og medicinsk genetik har på en bemærkelsesværdig hurtig måde givet afkast til den kliniske genetik. Således førte opdagelsen af enzymdefekten ved Føllings sygdom (fenylketonuri) i 1950 erne umiddelbart til den første succesrige behandling af en arvelig sygdom. Opdagelsen af menneskets kromosomtal i 1956 førte til diagnosen af den første kromosomsygdom i 1959 (trisomi 21 ved Downs syndrom). Et nyt gennembrud kom da prænatal diagnostik af kromosomsygdomme og visse arvelige stofskiftesygdomme blev mulig i slutningen af 1960 erne. Med udviklingen af rekombinant DNA-teknologi og DNA-diagnostik i 1970 erne og 1980 erne kunne genetisk rådgivning nu i mange tilfælde baseres på sikre diagnoser og ikke blot på udsagn om sandsynligheder og risiko. De seneste år har vi været vidne til den spæde begyndelse af genterapi og måske af større praktisk betydning udviklingen af nye lægemidler baseret på viden om sygdomsgener. De nye muligheder for anvendelsen af forskningsresultaterne fra genetikken kan i befolkningen udløse såvel skrækscenarier som urealistiske forventninger. Derfor er det vigtigt at der til stadighed føres en bred debat om den nye genetiks muligheder og de etiske aspekter heraf. Misbrug er altid en mulighed, men et demokrati med åben dialog er den bedste garant herimod. Der er et stort behov for information og uddannelse, både af lægmand og professionelle. Vi håber at denne bog vil kunne bidrage hertil. De senere års nærmest eksplosive udvikling inden for den humane og medicinske genetik nødvendiggør en hyppig opdatering af lærebøger i faget. Den foreliggende 2. udgave af Medicinsk Genetik er både ajourført og udvidet i forhold til første udgave. Bl.a. er der i 2. udgave tilføjet et egentligt metodekapitel samt en omfattende ordliste, og samtlige kapitler er revideret og opdateret i overensstemmelse med den udvikling faget har gennemløbet siden første udgave kom i Bogen er tilstræbt at være pensumdækkende for undervisningen i genetik på det medicinske studium i Danmark. Oktober 2011 Søren Nørby og Peter K.A. Jensen book.indb 11 09/12/

8 Stamtræssymboler book.indb 12 09/12/

9 STAMTRÆSSYMBOLER book.indb 13 09/12/

10 25139-book.indb 14 09/12/

11 Kapitel 1 Menneskets genom Indledning Levende organismer består af celler. Som en helt central del af deres biologi har organismerne på Jorden gennem årmillioners evolution udviklet et molekylært lager af information der styrer de overordnede processer i cellerne. Den enkelte organismes liv afhænger af at cellerne kan opbevare og afkode denne information samt videreføre den når cellerne deler sig. For artens eksistens er det endvidere nødvendigt at informationen videreføres fra generation til generation. Det er det biologisk arv drejer sig om, og denne information betegnes genetisk information. De molekyler der bærer den genetiske information, betegnes det genetiske materiale eller arvematerialet, og det samlede molekylære lager af genetisk information betegnes cellens/organismens arvemasse eller genom. Efter en generel introduktion om genomet vil dette kapitel gennemgå dels dets molekylære struktur og funktion, dels dets organisering i cellerne. Det personlige genom og artens genom Når man ser bort fra énæggede tvillinger (og andre flerlinger udviklet fra samme befrugtede æg), har vi hver vores eget personlige genom. Det er sammensat af det arvemateriale vi har fået fra vores biologiske forældre gennem de to kønsceller hvis fusionsprodukt vi er udviklet fra (Kap. 2). Arvematerialet består af nukleinsyren DNA (Boks 1.1. og 1.2). I cellerne er arvemassens DNA fordelt på dels cellekernen (det nukleære genom, kernegenomet), dels mitokondrierne (det mitokondrielle genom, mitokondriegenomet, s. 47ff.), Fig En persons nukleære genom udgøres af kromosomernes DNA-molekyler og er derfor diploidt (s. 55). Dertil kommer mitokondriegenomet (mitokondrie-dna, mtdna) som i en celle foreligger i et meget varierende antal kopier, idet både antallet af mitokondrier, og antallet af mitokondrie-dna-molekyler per mitokondrie, varierer fra celle til celle. Boks 1.1 Opdagelsen af DNA I slutningen af 1860 erne lagde schweizeren Johann Friedrich Miescher ( ) grunden til udforskningen af nukleinsyrer med sin opdagelse af det der skulle vise sig at være DNA. Han studerede hvide blodlegemer under et studieophold i den tyske universitetsby Tübingen. Udgangsmaterialet var pusfyldte bandager fra universitetshospitalets kirurgiske afdeling. Herfra isolerede han cellekerner og ekstraherede en hidtil ubeskrevet højmolekylær og fosforrig sur komponent som han navngav Nuklein (lat. nucleus, kerne). Senere foretog han, i hjembyen Basel, yderligere ekstraktioner af det samme stof, denne gang fra laksesæd. Mieschers elev Richard Altmann ( ) forbedrede ekstraktionsmetoden og indførte betegnelsen Nukleinsäure (nukleinsyre) for den oprensede komponent. Omkring år 1900 havde man afklaret at nukleinsyre består af tre forskellige stofgrupper: fosfat, kulhydrat og nitrogenholdige baser. Se mere om opdagelsen af DNA på book.indb 15 09/12/

12 KAPITEL 1 MENNESKETS GENOM Menneskecelle ellekernen (det nukleære genom) Mitokondrie (mitokondriegenomet) Figur 1.1. Elementær skitse af et tværsnit af en celle til illustration af lokaliseringen af dens arvemasse (genom). Genomet består af to distinkte dele: 1) det nukleære genom, lokaliseret i cellekernens kromosomer, og 2) mitokondriegenomet, lokaliseret i mitokondrierne. Når man taler om menneskets genom, mener man nutidsmenneskets, arten Homo sapiens genom. I modsætning til et individ har en art ikke noget entydigt genom, men menneskets genom kan defineres som det minimumssæt af DNA-molekyler der repræsenterer en normal arvemasse hos mennesket. Det vil for det nukleære genoms vedkommende sige 24 DNAmolekyler som repræsenterer dem der er indeholdt i menneskets 24 forskellige kromosomer: kønskromosomerne X og Y samt de 22 autosomer (kromosomerne 1-22 inkl.) (Fig. 1.2 og Kap. 4, s. 83). Dette betegnes det haploide genom (haploid = med ét kromosomsæt, s. 55). En detaljeret kortlægning af det haploide humane genom, i form af fastlæggelsen af basesekvenserne for de 24 kromosomale DNA-molekyler, blev iværksat i 1990 med det store internationale Human Genome Project (HGP) og formelt erklæret for afsluttet i april 2003, præcis 50 år efter gennembruddet med afklaringen af DNA s dobbelthelix-struktur (Boks 1.4). Der resterer endnu (2011) 6-7 % af det i alt ca. 3,1 mia. basepar lange genom, som det ikke er lykkedes at sekventere færdigt. Dette skyldes tekniske vanskeligheder, idet de pågældende DNAsegmenter hovedsageligt består af højt repeteret DNA, dvs. mange kopier af gentagne sekvenser. Figur 1.2. Kromosombesætningen hos en kvinde med normal karyotype (46,XX); se også Figur 4.1 og Boks 4.2. Præparatet er båndfarvet (Giemsa-farvning), med kromosomspecifikke lyse og mørke bånd langs de enkelte kromosomer, hvilket muliggør den parvise anordning af kromosomerne. Tallene angiver de enkelte autosomale kromosompar 1-22, bogstaverne X og Y angiver pladserne for kønskromosomerne book.indb 16 09/12/

13 GENERELT OM ARVEMATERIALE Det drejer sig for størstedelens vedkommende om DNA i såkaldt konstitutivt heterokromatin (Boks 1.8) der ikke indeholder aktive gener. I den del af genomet der indeholder sekvenser af aktive gener, dvs. DNA i de eukromatinholdige dele af kromosomerne, har man kortlagt over 99 % af DNA-sekvensen, i alt 2,85 mia. bp (2,85 Gb), se Tabel 1.1 (for længdeangivelse af nukleinsyremolekyler, se Boks 1.5). For mitokondriegenomet har man siden 1981 haft en referencesekvens. Den først offentliggjorte sekvens viste sig dog at have en del fejl som blev endegyldigt rettet i 1999 (Boks 1.10). Denne mtdna-sekvens stammer fra ét enkelt individ. Man har ved denne detaljerede kortlægning fået indsigt i menneskets helt grundlæggende biologi. Samtidig har man fået en meget værdifuld referencesekvens for menneskets DNA til brug for det daglige DNA-diagnostiske arbejde i de klinisk genetiske afdelingers molekylærgenetiske laboratorier. Generelt om arvemateriale Arvemateriale består af molekyler tilhørende stofgruppen kernesyrer (nukleinsyrer). Det er kædemolekyler (polymerer) opbygget af enheder betegnet nukleotider. Der skelnes mellem to slags nukleinsyre: deoxyribonukleinsyre, også kaldet DNA (eng. tidligere Deoxyribose Nucleic Acid, nu deoxyribonucleic acid), og ribonukleinsyre, også kaldet RNA (eng. tidligere Ribose Nucleic Acid, nu ribonucleic acid). Alle cellulære organismer fra de simpleste bakterier til de mest komplekse planter og dyr, herunder mennesket har nukleinsyren DNA som arvemateriale. Blandt virus, som er biologiske strukturer med arvemateriale, men ikke selvstændigt levende organismer, har mange arter ligeledes DNA som arvemateriale (DNA-virus), andre har RNA (RNA-virus). Boks 1.2 Det første bevis for DNA som arvemateriale I 1944 offentliggjorde den amerikanske mikrobiolog Oswald T. Avery ( ) og medarbejdere forsøgsresultater som viste at en stamme af harmløse bakterier kunne ændres blivende til sygdomsfremkaldende ved at optage DNA fra en sygdomsfremkaldende stamme. Denne skelsættende påvisning af DNA som bærer af genetisk information var dog ikke tilstrækkelig til i sig selv at overbevise det videnskabelige samfund om at arvemateriale generelt består af DNA (se Boks 1.4). Den grundlæggende kemiske forskel mellem DNA og RNA ligger i molekylernes kulhydrat som i DNA er deoxyribose, i RNA ribose (Fig. 1.3, Boks 1.3), heraf nukleinsyrernes navne. I begge nukleinsyrer indgår der fire forskellige nukleotider, hver med deres nitrogenholdige base. Purinbaserne adenin og guanin samt pyrimidinbasen cytosin er fælles for DNA og RNA. I RNA indgår desuden nukleotider med pyrimidinbasen uracil, mens DNA som fjerde base har pyrimidinen thymin (5-methyluracil). Boks 1.3 DNA og RNA I begyndelsen af det 20. århundrede var kalvebrisler (thymus) og gær hovedkilderne til udvinding af nukleinsyre mhp. nærmere kemisk karakterisering. Kulhydratet i den gærnukleinsyre man havde isoleret, blev hurtigt identificeret som ribose, mens det tog årtier at få fastlagt at det i nukleinsyren fra thymus var deoxyribose. Konklusionen blev at de to nukleinsyrer var forskellige, hhv. hvad vi i dag betegner RNA og DNA, og på den baggrund troede man i lang tid at DNA var dyrerigets og RNA planterigets nukleinsyre. Det var først i 1930 erne at det blev endeligt klarlagt at både plante- og dyreceller indeholder såvel DNA som RNA book.indb 17 09/12/

14 KAPITEL 1 MENNESKETS GENOM A B HOH 2 O OH H H H H OH OH Ribose H H O N NH H Uracil O HOH 2 O OH H H H H OH H Deoxyribose H 3 H O N NH H Thymin O 5' 3' Figur 1.3. Strukturelle forskelle mellem DNA og RNA. A. RNA indeholder kulhydratet ribose, mens DNA indeholder 2 -deoxyribose. B. RNA indeholder basen uracil, DNA basen thymin (5-methyluracil).. RNA-molekyler er polynukleotider ligesom DNA-molekyler, med nukleotiderne koblet sammen af 3,5 -fosfodiesterbindinger. I modsætning til DNA et er cellernes RNA-molekyler i udgangspunktet enkeltstrengede, men det er essentielt for deres funktion at de kan baseparre dels med sig selv, dvs. intramolekylært som på skitsen her, dels med andre RNA-molekyler. G U A U A U A G DNA-molekyler er polymerer af deoxyribonukleotider der danner lineære kædemolekyler (polynukleotider) med kovalent binding mellem 3 -OH-gruppen i et nukleotids deoxyribose og nabonukleotidets 5 -fosfatgruppe (Fig. 1.4A). Arvemassens DNA er endvidere dobbeltstrenget, idet molekylerne består af to DNA-polynukleotider som er snoet omkring en fælles akse i en højredrejet dobbelthelix (dobbeltspiral). De to ender af en DNA-streng defineres som hhv. 5 - og 3 -enden, hvor 5 -enden er karakteriseret ved en fri fosfatgruppe på den endestillede deoxyriboses 5 -carbonatom, mens 3 -enden har en fri OH-gruppe på sin endestillede deoxyriboses 3 -carbonatom. Strengene er modsat orienterede (antiparallelle), idet 5 -enden af den ene streng ligger over for 3 -enden af den anden. De to strenge holdes sammen af hydrogenbindinger mellem strengenes baser der på denne måde danner molekylets basepar (Fig. 1.4B): adenin (A) danner par med thymin (T), guanin (G) med cytosin (). De pågældende basepar, AT og G, er karakteriseret ved hhv. to og tre hydrogenbindinger mellem baserne. Som følge af baseparringerne er rækkefølgen af baserne (basesekvensen) i et DNA-molekyles to strenge komplementære: Sekvensen i den ene streng afspejler entydigt sekvensen i den anden. Dette er helt grundlæggende for cellernes opformering og reparation af DNA samt for det laboratoriemæssige arbejde med DNA. DNA-replikation Forud for en celledeling sker der en opformering af cellens DNA (Kap. 2, Fig. 2.1). Denne proces, DNA-replikation, initieres ved bestemte replikationsstartsekvenser (origins of replication) og består af følgende trin: 1. Adskillelse af molekylets to strenge ved brydning af baseparrenes hydrogenbindinger. Dette trin katalyseres af to typer af protein: helikaser og enkeltstrengsbindende proteiner der hhv. åbner dobbelthelixen og holder den åben. 2. Syntese af korte RNA-strenge med DNAenkeltstrengene som skabeloner. For RNA-syntese med DNA som skabelon gælder følgende baseparringsregler: guanin parrer med cytosin, thymin i DNA parrer book.indb 18 09/12/

15 DNA-REPLIKATION A 5 3 G A T G T A G A T A T A G G A T A T G G G T 3 5 Hydrogenbindinger 5 3 O O P O OH H 2 5 O H H 4 1 H H 3 O H 2 O P OH O H 2 5 O G H H 4 1 H H 3 O H 2 O P O O H 2 T 5 O H H 4 1 H H 3 2 O H H O H 2 3 H 1 4 H H O 5 G H 2 O HO HO P P O H O 2 H 3 H 1 4 H H O 5 H 2 O O H O 2 H 3 H 1 4 H H O 5 A H 2 O HO P O O 3 5 B H 2 O H N H N H N H O N N N O Thymin H N Adenin N N N O ytosin H H N N N H Guanin N Figur 1.4. Et DNA-molekyles struktur. A. Til venstre er vist en modeltegning af et dobbeltstrenget DNA-molekyle (en DNA-dobbelthelix). Det består af to DNA-strenge (polynukleotider) snoet omkring en fælles akse så de danner en højredrejet spiral. Strengene holdes sammen af hydrogenbindinger mellem baserne. Til højre er vist den detaljerede opbygning af de to polynukleotider, hvor nukleotiderne i hver DNA-streng er koblet sammen med 3,5 -fosfodiesterbindinger, og baserne (A, G, og T) er kovalent bundet til deoxyriboses carbonatom 1 og derudover via hydrogenbindinger til basepartneren i den anden streng. Pilene angiver strengenes orientering 5 3 og viser at de to strenge er modsat orienterede (antiparallelle). B. DNA s to slags basepar: Adenin (A) danner par med Thymin (T), ytosin () med Guanin (G) vha. hydrogenbindinger. Der er to hydrogenbindinger mellem A og T, og tre hydrogenbindinger mellem G og. med adenin i RNA, og adenin i DNA parrer med uracil i RNA. Den korte RNAstrengs rolle er at fungere som startmolekyle, primer, for den efterfølgende DNAsyntese. RNA-syntesen katalyseres af enzymet DNA-primase, en RNA-polymerase. I modsætning til DNA-polymeraser kræver RNA-polymeraser ikke nogen primer book.indb 19 09/12/

16 KAPITEL 1 MENNESKETS GENOM Boks 1.4 Opklaringen af DNA s dobbelthelix-struktur. I første halvdel af 1900-tallet mente man at nukleinsyrer er opbygget af tetranukleotider, dvs. af gentagne enheder bestående af et af hver af de fire nukleotider som nukleinsyrebaserne repræsenterer. Tetranukleotid-modellen understøttede den opfattelse at de centrale stoffer i arvematerialet var proteiner, da kun de ville kunne rumme den tilstrækkelige variation; måske var DNA en slags støtteskelet for proteinerne. Det blev der sat et stort spørgsmålstegn ved i 1944, da det påvistes at DNA fungerer som arvemateriale i bakterier (Boks 1.2). Dette blev fulgt op af fornyede kemiske studier af DNA, og i slutningen af 1940 erne offentliggjorde den østrigskfødte biokemiker Erwin hargaff ( ) nye målinger af de fire baser i DNA fra forskellige kilder. Resultaterne var uforenelige med tetranukleotidhypotesen, men viste samtidig at DNA indeholder lige meget guanin og cytosin og lige meget adenin og thymin (G/ = A/T = ca. 1); dette blev kendt som hargaffs regel. Derimod varierede forholdet (G+)/ (A+T). Få år senere, i 1953, kom afklaringen af DNA s molekylstruktur gennem et historisk berømt samarbejde mellem den amerikanske biolog James Watson (f. 1928) og den britiske fysiker Francis rick ( ) da det lykkedes dem at bygge en korrekt model af et dobbeltstrenget DNA-molekyle, til dels baseret på røntgenkrystallografiske data opnået af biofysikeren Rosalind Franklin ( ). Først da de løste spørgsmålet om baseparringer mellem adenin og thymin, hhv. guanin og cytosin, blev det klart at hargaffs regel bunder i denne komplementaritet mellem de to strenges basesekvenser. Molekylets dobbeltstrengede struktur med komplementære basesekvenser angav samtidig en umiddelbar mulighed for den opformering af molekylet til to præcise kopier som arvematerialet skal kunne gennemgå. Efter dette gennembrud blev det efterhånden alment accepteret at arvematerialet er DNA. 3. Syntese af nye DNA-strenge sker med udgangspunkt i RNA-primerne og med DNAenkeltstrengene som skabeloner. Her gælder DNA-baseparringsreglerne, og trinnet katalyseres af enzymet DNA-polymerase. Syntesen af en nukleinsyrestreng sker i retningen Afslutningsvis nedbrydes RNA-primerne, og de derved opståede huller i DNA-strengene udfyldes med deoxyribonukleotider. Processen katalyseres af DNA-polymerase. Resultatet af DNA-replikationen er to dobbeltstrengede DNA-molekyler med samme struktur som modermolekylet. I dattermolekylerne stammer den ene streng således fra modermolekylet, mens den anden er nysyntetiseret. DNA-replikationen karakteriseres derfor som semi-konservativ. ellerne har flere forskellige DNA-polymeraser. I cellekernen foretages DNA-replikationen af dels DNA-polymerase α (der indgår i et multimert kompleks med DNA-primasen, se pkt. 2 ovenfor, og overtager syntesen efter denne), dels DNA-polymerase δ der hurtigt afløser DNApolymerase α. Mitokondrierne har deres egen polymerase: DNA-polymerase γ (se s. 122). Boks 1.5. Længdeangivelse af DNA- og RNA-molekyler Længden af dobbeltstrenget DNA angives i basepar (bp): bp betegnes 1 kb (kilobase), 1 mio. bp betegnes 1 Mb (megabase) og 1 mia. bp betegnes 1 Gb (gigabase). Længden af enkeltstrenget nukleinsyre angives i antal nukleotider (nt). Arvematerialets funktion Traditionelt beskrives arvemassen som bestående af diskrete strukturelle og funktionelle enheder kaldet arveanlæg eller gener (Boks 5.1). Vi vil derfor tage udgangspunkt i denne beskrivel book.indb 20 09/12/

17 PROTEINKODENDE GENER Genom Transkriptom Proteom DNA Transkription RNA Translation Protein Replikation Ikkeproteinkodende funktionelt RNA Figur 1.5. Skitse der viser flowet af den genetiske information i en celle. Genomet er cellens samlede genetiske information, transkriptomet er cellens samlede transkripter, og proteomet er den samlede gruppe af proteiner cellen syntetiserer. Angående ikkeproteinkodende funktionelt RNA se Tabel 1.4. se, om end det hurtigt vil vise sig vanskeligt at afgrænse et gen. Den information der rummes i generne, udnyttes forskellige steder i og uden for cellen, samtidig med at genomet forbliver hvor det er. Det problem løses ved at cellerne laver RNA-kopier af genernes DNA og kanaliserer disse kopier derhen hvor deres information udnyttes. Denne RNA-syntese betegnes transkription 1 (eng. transcription, overskrivning; underforstået fra én type nukleinsyre til en anden). Genet bliver transkriberet, og det syntetiserede RNA-molekyle betegnes et transkript. På den baggrund har man defineret et gen som bestående af det DNA-segment der transkriberes, samt de sekvenser af basepar der regulerer transkriptionen. Det er en helt central funktion for genomet at kode for organismens proteiner der i form af enzymer og andre vigtige funktionsmolekyler er ansvarlige for bl.a. de stofskifteprocesser der udgør livsfunktionerne. Det er da også kendskabet til de proteinkodende gener der har størst betydning i den medicinske genetik idet, som det vil fremgå af senere kapitler i bogen, det er ændringer i disse gener og deres funktion der ligger til grund for de mange forskellige kortlagte arvelige sygdomme og for kræftsygdomme. Gennemgan- 1 Bemærk at termen transkription i molekylærbiologi og genetik skrives med kun ét s. Dette i modsætning til retskrivningen inden for humaniora hvor man bruger termen transskription om fx overskrivning af en tekst fra ét alfabet til et andet, eller af et partitur fra en tonart til en anden. gen af genomets opbygning og funktion vil derfor tage udgangspunkt i de proteinkodende gener og deres ekspression, dvs. hvordan de kommer til udtryk. Nyere forskning har vist at den øvrige del af genomet indeholder mange ikkeproteinkodende gener hvis genprodukter (ikkekodende RNA, s. 36) er stærkt involveret i bl.a. reguleringen af de proteinkodende geners ekspression. Denne gruppe af ikkekodende RNA forventes at få stor betydning i den fremtidige medicinske verden. I analogi med termen genom der betegner en celles/organismes arvemasse, har man indført termerne transkriptom og proteom til at betegne en celles/organismes samlede sæt af hhv. transkripter og proteiner. Mens alle kroppens somatiske celler grundlæggende har samme genom, har de ca. 200 forskellige celletyper, som udgør kroppens forskellige væv og organer, i løbet af deres differentiering udviklet hver deres transkriptom og proteom som basis for deres karakteristiske struktur og funktion. Proteinkodende gener Den information der ligger i et proteinkodende gen, er information om det pågældende proteins aminosyresekvens. Der er tale om en fuldstændig grundlæggende information idet et proteins aminosyresekvens afgør proteinmolekylets rumlige struktur og derigennem dets funktion. At denne sekvensinformation kan rummes i genets DNA (og i det tilsvarende RNA-transkript), skyldes at der er en simpel, lineær relation mel book.indb 21 09/12/

18 KAPITEL 1 MENNESKETS GENOM lem basesekvens (i et nukleinsyremolekyle) og aminosyresekvens (i et protein), se Tabel 1.2. Pga. den sproglige forskel mellem nukleinsyrer og proteiner, jf. udtrykket den genetiske kode, betragtes proteinsyntesen informationsmæssigt som en oversættelse fra basesekvens til aminosyresekvens og betegnes i fagsproget en translation (dansk udtale; eng. translation, oversættelse). Genets/transkriptets proteinkodende sekvens translateres til proteinets aminosyresekvens. Det pågældende informationsflow er resumeret i Fig. 1.5; translationsprocessen beskrives nærmere senere (s. 33). Det transkript der bringer en kopi af genets proteinkodende sekvens hen til det sted hvor translationen sker, betegnes messenger-rna eller blot mrna (eng. messenger, bud, kurér). Genstruktur exons og introns Analyserne af det haploide genoms basesekvens har vist at der er et sted mellem og proteinkodende gener i menneskets genom. De varierer meget i størrelse og detailstruktur men har nogle grundlæggende fællestræk (Fig. 1.11). Som model-gen for beskrivelsen af et proteinkodende gens struktur er her valgt et af de små proteinkodende gener: genet for β-globin, hæmoglobinets β-kæde (Fig. 1.6, se også s. 113). De først kortlagte gener i menneskets genom, også hvad DNA-sekvensen angår, var netop de gener der koder for de forskellige hæmoglobiners kæder (Fig. 1.9). Indtil 1977 var det den almindelige antagelse at basesekvensen i et mrna-molekyle er en tro kopi af sekvensen i det pågældende gens ene DNA-streng, blot med den forskel at mrna et har basen uracil i stedet for DNA ets thymin. Men da man efter genteknologiens gennembrud begyndte at kunne kortlægge genernes faktiske størrelse, opdagede man at de allerfleste proteinkodende gener indeholder mange flere basepar end svarende til mrna ets basesekvens. Dette skyldes at den sekvens der er repræsenteret i mrna-sekvensen, på gen-niveau er delt op i et antal delsekvenser (kaldet exons) der er adskilt fra hinanden af kortere eller længere sekvenser (kaldet introns) som ikke er repræsenteret i mrna et, jf. Fig Grænseovergangene mellem exons og introns er karakteriseret ved bestemte sekvenser som er meget ens i næsten alle proteinkodende gener. Man taler således om konsensussekvenser for hhv. 5 - og 3 -afgrænsningerne af introns. I den DNA-streng hvis exonsekvenser er kopieret i mrna-sekvensen, begynder praktisk taget samtlige proteinkodende geners introns med sekvensen GT i 5 -enden, og de ender med AG i 3 -enden. Som navnet konsensussekvens antyder, er der imidlertid tale om stor overensstemmelse i også andre af grænsesekvensernes positioner, se detaljer i Fig Dertil kommer en tredje karakteristisk intronsekvens, den såkaldte forgreningssekvens (eng. branch site, ikke afbildet i Fig. 1.6), som er en kort sekvens med et obligatorisk A lokaliseret ca. 30 baser fra intronens 3 -ende. De nævnte sekvenser er af central betydning for dannelsen af et korrekt mrna for det pågældende gen, se afsnittet Transkription og posttranskriptionel modificering nedenfor. De første og sidste exons i et proteinkodende gen indeholder en kortere eller længere sekvens af basepar som ikke translateres og derfor betegnes UTR (eng. untranslated region, utranslateret region), hhv. 5 UTR og 3 UTR (Fig. 1.6). En UTR kan strække sig over flere exons. Gennemsnitslængden for 5 UTR er ca. 170 bp, mens den for 3 UTR er ca. fire gange større. På mrna-niveau har UTR-sekvenserne forskellige funktioner: 5 UTR indeholder bl.a. en sekvens der er afgørende for initieringen af mrna ets translation; dels for hvilket nukleotid translationen starter ved dvs. hvor den proteinkodende sekvens begynder dels for om translationen initieres hyppigt eller sjældnere (se book.indb 22 09/12/

19 PROTEINKODENDE GENER Promotorsekvenser Transkriptionsstart Transkriptionsstop 3' 5' -75 AAT box -30 TATA box +1 ap ATG site startcodon A Exon 1 A G } AGGT AGT intron 1 intron 2 } Exon 2 (Y) n NYAGG } } Exon 3 TAA stopcodon 5' 3' AATAAA signal for trimning og polyadenylering Konsensus-sekvenser for 5'- (donor) og 3'- (acceptor) splejsningssignaler Transkription og capping ap Exon 1 Exon 2 Exon 3 5' intron 1 intron 2 3' UTR Det primære transkript (præ-mrna) UTR Figur 1.6. Et proteinkodende gens struktur. Som eksempel er her vist en skitse af β-globin-genets struktur, med regulatoriske promotorsekvenser lokaliseret opstrøms for de proteinkodende sekvenser der begynder ved ATG. afsnittet Translation og posttranslationelle modifikationer, s. 33). Derudover kan 5 UTR indeholde sekvenser der fungerer som bindingssteder for proteiner af betydning for mrna ets stabilitet. 3 UTR indeholder dels en såkaldt polyadenyleringssekvens, dels målsekvenser for mikro-rna-betinget regulering af mrna ets translation og evt. nedbrydning (se afsnittene Transkription og posttranskriptionel modificering s. 28 og Mikro-RNA, s. 36). De proteinkodende gener optager ca. 45 % af genomet, men det er bemærkelsesværdigt at det er introns det meste, idet genernes samlede exons, det man betegner organismens exom (jf. genom, transkriptom og proteom), kun udgør ca. 2 % af genomet. Den direkte proteinkodende del af genomet udgør således mindre end 2 %. I de resterende 98 % af genomet forekommer der imidlertid tusindvis af DNA-segmenter som sekvensmæssigt er nært beslægtede med proteinkodende gener, men som pga. forskellige mangler ikke er i stand til at kode for proteiner. De betegnes pseudogener (se det følgende afsnit), og som navnet kan antyde, anså man dem tidligere generelt for at være uden funktion og dermed noget overflødigt DNA (eng. junk DNA) efterladt på evolutionens losseplads. De senere års funktionelle studier af genomet har imidlertid vist at mindst en femtedel af pseudogenerne transkriberes. Boks 1.6 Guinness-rekorder for gener Det største proteinkodende gen i menneskets genom er dystrofin-genet, DMD (Duchenne muscular dystrophy, Duchennes muskeldystrofi, s. 293) som er beliggende på den korte arm af X-kromosomet. Det er på ca. 2,4 Mb (2,4 mio. basepar) og har sit maksimale udtryk i muskelceller hvor det med sine 79 exons koder for muskelproteinet dystrofin på aminosyrerester (Fig. 14.3). Mutationer i DMD er årsag til de X- bundne muskelsvindssygdommene Duchennes mu book.indb 23 09/12/

20 KAPITEL 1 MENNESKETS GENOM skeldystrofi og Beckers muskeldystrofi. Et andet muskelprotein, titin, har med sine ca aminosyrerester rekorden som det største protein der kodes for i genomet. Genet, TTN, er på knap 300 kb og har det største antal exons (363), hvoraf en er den størst kendte (lidt over 17 kb). Pseudogener Pseudogener er generelt ikkefunktionelle DNAsegmenter som ligner funktionelle gener. Man skelner mellem processerede (eng. processed, forarbejdede) og ikkeprocesserede pseudogener. De to typer pseudogener adskiller sig fra hinanden i både struktur og tilblivelse. Forskellen er den at et ikkeprocesseret pseudogen minder meget om det tilsvarende funktionelle gen idet det har en tilsvarende exon/intron-struktur samt regulatoriske sekvenser som fx promotoren. Det antages da også at være opstået ved duplikation af det funktionelle gen og efterfølgende inaktiveret af mutationer i DNA-sekvensen, jf. pseudogenerne i globin-genklyngerne (Fig. 1.9). Hvis der kun er tale om kopi af en mindre del af det funktionelle gen, fx en enkelt exon, taler man om et genfragment. Et processeret pseudogen indeholder hverken intron- eller promotor-sekvenser. Det antages derfor at være dannet såkaldt revers transkription, dvs. ved transkription af mrna til DNA, og efterfølgende integrering af DNA-kopien i genomet. Det kan i nogle tilfælde ske at et processeret pseudogen transkriberes fordi det tilfældigvis er blevet sat ind tæt på en promotor. I så tilfælde betegnes pseudogenet et retrogen. Det autosomale gen for enzymet fosfoglyceratkinase (PGK2) på kromosom 6p er formentlig et sådant retrogen. Det er interessant at ekspressionsmønstret for dette gen er meget forskelligt fra det oprindelige X-bundne gens (PGK1). PGK2 udtrykkes kun i testes, mens PGK1 udtrykkes i alle øvrige væv. Den testisspecifikke ekspression af PGK2 er formentlig en kompensatorisk reaktion på inaktivering af det X-bundne PGK1 i det spermatogenetiske væv inden meiosen. Genernes fordeling i genomet Hvis de proteinkodende gener var jævnt fordelt i genomet, ville der være ét gen pr kb genomsekvens. Imidlertid er gentætheden meget varierende inden for et kromosom og fra kromosom til kromosom (Tabel 1.1). Subtelomer-regionerne, dvs. regionerne kb centromert for telomererne (se Fig. 1.7B), er de områder i genomet der har den største gentæthed. De fleste geners transkriberede segmenter ligger i en vis A B Kromatid Telomer entromer Subtelomer region kb 12 kb Telomerassocierede Telomer repeats AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG... TAATAATAATAAT 3 5 Figur 1.7. A. Skitse af et metafasekromosom. Kromosomet består af to kromatider der holdes sammen i den region der betegnes centromeret. Regionerne i enderne af kromatiderne betegnes kromosomets telomerer. B. Skitse af et kromatids telomerregion. De terminale afsnit med ca. 12 kb DNA udgør telomeren. entromert herfor ligger en region med kb DNA bestående af telomer-associerede repeats (Tabel 1.6), og yderligere centromert herfor ligger den såkaldte subtelomerregion, en region der er forholdsvis rig på gener.. Skitse af et kromatid med angivelse af den ene telomerregion og et udsnit af det telomere DNA s basesekvens. DNA et består af et par tusind tandemrepeterede enheder à seks basepar (indrammet) book.indb 24 09/12/