HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT?

Transkript

1 HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT? Aalborg Universitet Medicin og MedIS 4. semester 29/ Vejleder: Simone Elkjær Riis Af: Arvin Nahavandipour Elin Danielsen Lunde Maj Roja Stougaard Andersen Malene Mølbak Andreassen Robert Winther Simone Lund Lauritsen

2 HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT? Normalsider: 39 Appendix antal: 4 Titel: Tema: Har adipøse stamceller en immunsupprimerende effekt? Eksperimentielt projekt kontrol af cellevækst Projektperiode: 24/ / Projektgruppe: 408 Medlemmer: Stud.med, Arvin Nahavandipour Stud.med. Elin Danielsen Lunde Stud.scient.med Maj Roja Stougaard Andersen Stud.scient.med Malene Mølbak Andreassen Stud.med Robert Winther Stud.med Simone Lund Lauritsen Vejleder: Ph.D- stipendiat Simone Elkjær Riis Arvin Nahavandipour Elin Danielsen Lunde Maj Roja Stougaard Andersen Malene Mølbak Andreassen Robert Winther Simone Lund Lauritsen 2/43

3 1. Abstract Previous studies have shown an inhibitory effect on dendritic cells (DC) mediated by adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). However, it is still unclear how this effect is mediated. This study investi- gates the interactions between ASC s and monocytes/dc s by focusing on both differentiation and mat- uration of DC s derived from CD14 + monocytes in vitro. Four setups are used to clarify how this immuno- regulatory effect might be mediated, and those are respectively conditioned medium added early or late (spontanious cytokine secretion), co- culture (cell- cell contact) and transwell- insert (cytokine secretion). To investigate the results from the four setups, flow cytometri (FCM) was used to clarify the expression of the markers HLA- DR, CD80, CD83 and CD86. Furthermore quantitative polymerase chain reaction (qpcr) was used to detect whether or not TGF- β- gene- expression was present in ASC. Through the use of FCM, it was demonstrated that the suppressive effect was more prominent in co- culture when cell- to- cell contact was possible, but the effect was still shown through a lesser extent by non- spontan cytokine secretion. The inhibitory effect was detected by downregulation of CD83, CD80, CD86 and HLA- DR using FCM. qpcr did not show an expression of TGF- β in ASC. In conclusion, the results revealed that conditioned medium from ASC had no significant effect, while ASC showed a possible inhibition of monocytes differentiation to DCs through soluble factors and an even stronger inhibitition when cell- to- cell contact was possible. These results indicate that ASC pro- vides a broad clinical potential as in organ transplantation. 3/43

4 2. Forord Dette projekt, omhandlende adipøse stamcellers effekt på immunsystemet, er udarbejdet af seks stude- rende på fjerde semester på medicin og medicin med industriel specialisering ved Aalborg Universitet i perioden april- maj Formålet bliver beskrevet som følgende i studieordningen: At udvikle færdig- heder inden for molekylært/cellulært laboratoriearbejde. At videre udvikle akademiske kompetencer indenfor læring, samarbejde og projektstyring. Projektet er foregået som et samarbejde mellem fire projektgrupper, hvorfor vi vil takke disse. Ligeledes takkes vejlederne Romana Maric og Trine Fink samt laborant Brita Holst Jensen. En særlig tak til vores primære vejleder, Simone Riis, som har bistået os i udarbejdningen af dette projekt. 4/43

5 3. Læsevejledning I dette projekt anvendes medicinske og immunologiske fagtermer, hvorfor det forventes, at læseren har et forudgående kendskab til denne terminologi eller forinden har sat sig ind i dette. I projektet benyttes endvidere forkortelser for hyppigt anvendte termer. Første gang en af disse benyttes, vil denne være skrevet fuldt ud, og forkortelsen vil være angivet i parentes herefter. Efterfølgende vil forkortelsen blive anvendt. Ligeledes vil der i projektet blive benyttet engelske ord, hvor det ikke har været muligt at finde tilsvarende danske synonymer. Når der refereres til mesenchymale stamceller (MSC), er dette ment i betydningen knoglemarvsderiverede MSC. Dette er grundet, at tidligere undersøgelser er baseret på disse. Adipøse stamceller er som bekendt en type MSC og antages at have en sammenlignelig effekt med knoglemarvsderiverede MSC. I teksten er referencerne angivet efter Harvard- modellen. De referencer, der indeholder * henviser til hjemmesider. Samtlige referencer vil kunne findes i litteraturlisten bagerst i rapporten. 5/43

6 Indholdsfortegnelse 1. Abstract Forord Læsevejledning Introduktion Problem Problemformulering Problemstillinger Baggrund Mesenchymale stamceller Adipøse stamceller Dendritiske celler Celleinteraktioner mellem ASC og DC Celle- celle kontakt Opløselige faktorer Mesenchymale stamcellers påvirkning af dendritiske celler MSCs påvirkning på differentieringen fra monocytter til umodne DC er Mesenchymale stamcellers påvirkning af modningen af DC Mesenchymale stamcellers påvirkning af modne dendritiske celler Mekanismerne bag MSCs påvirkning af DC MSC versus ASC Mesenchymale stamcellers kliniske relevans Flowcytometri Antistoffer samt isotyper qpcr: Trinene i qpcr Metode Cellekulturer Klargøring af ASC, HEK og konditioneret medie samt tilvænning til medie Dag Dag Høst af konditioneret medie Dag Høst af celler CO- kultur Transwell- insert Konditioneret medie Konditioneret medie Dag Dag 2 og Dag Dag Flowcytometri /43

7 9. Resultater Flowcytometri qpcr Diskussion Konklusion Perspektivering Litteraturliste Appendix /43

8 4. Introduktion Organtransplantationer kan være en livsforlængende eller livsreddende behandling i tilfælde, hvor anden behandling ikke er mulig. De sidste 50 år har der været foretaget et stigende antal transplantationer [WHO*], men proceduren er forbundet med flere komplikationer som eksempelvis afstødningsreaktion [Agger et al, 2011]. Dette forsøges forebygget ved hjælp at immunsuppresive farmaka, hvilket dog ofte er forbundet med uønskede bivirkninger [ProMedicin*]. Forskning [Zhang et al. 2004] har vist, at der er et sammenspil mellem mesenchymale stamceller (MSC) og immunforsvaret. Dette sammenspil er eksempelvis blevet kendt ved MSCs negative påvirkning af dendritiske celler (DC). Disse har en unik position i regulationen af celler i den adaptive del af immunforsvaret, da de blandt andet er de mest potente antigenpræsenterende celler [Agger et al. 2011] og er derfor en vigtig brik i immunforsvarets reaktionsevne. Det overvejes, om denne viden og egenskab kan udnyttes i relation til organtransplantationer i fremti- den for at undgå de immunresponser, der kan opstå ved disse procedurer. Dog er stamceller mest kendt for deres egenskaber, som bruges inden for forskning i regenerativ medicin [Sadler, 2010]. Der findes mange forskellige typer stamceller, hvor adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC), som navnet indikerer, er en type stamceller, der findes i adipøst væv, og som for den terapeutiske anvendelse, er lettere at skaffe i tilstrækkeligt antal. Denne lette tilgængelighed i form af isolering fra det cellulære affaldsprodukt fra fedtsugninger er medvirkende til at gøre ASC interessante sammenlignet med MSC, der kun findes i sparsommelige mængder samt er mindre tilgængelige. Det antages derfor, at ASC kan være en vigtig brik som immunregulatorer i fremtidens behandlingsmetoder, da de ydermere har vist sig at have en stærkere inhiberende effekt på immunsystemet sammenlignet med MSC [Ivano- va- Todorova et al, 2009]. ASC s unikke egenskaber, herunder plasticitet, differentieringskacitet og evne til selvfornyelse er vigtige indenfor regenerativ medicin, og de senere år har der ydermere været fokus på ASC ers immunsupprimerende karakteristika, hvilket giver disse et interessant aspekt i forhold til behandling ved organtransplantationer [Jiang et al, 2005]. Klinisk er dette en stor fordel inden for immunsuppresiv behandling, da stamceller kan være med til at modvirke afstødning af organet samt graft versus host- effekten (GvH) [Aggarwal, Pittenger, 2001]. I 2002 blev mesenchymale stamceller fra bavianer testet in vivo ved administration af autologe MSC forud for transplantation af en allogen donors hud. MSC hæmmede T- celleproliferationen og derved gik der længere tid før, at bavianen afstødte den allogene hud sammenlignet med en ikke- behandlet kon- 8/43

9 trol [Bartholomew, et al, 2002]. Mekanismerne bag den immunsupprimerende effekt på T- celler er ikke fuldt ud klarlagt, da mange aspekter er involveret. En del af effekten tænkes at være medieret via dendritiske celler [Ramasamy et al, 2006]. I forlængelse af den immunsupprimerende effekt på T- celle proliferation in vitro, blev DC s rolle i denne suppression videre undersøgt. Studier har vist, at MSC hæmmer alle stadier af DC s livscyklus herunder differentiering, modning [Jiang et al, 2005] samt aktivering [Zhang et al, 2004]. Den molekylære meka- nisme bag den hæmmende differentiering er vist at komme som følge af nedregulering af cyklin D2 og herved blokering af monocytter i G0/G1- fase [Ramasamy et al, 2006]. Både direkte celle- celle kontakt og cytokiner er involveret i den supprimerende effekt på dendritiske celler, men nogle studier har indikeret, at cytokiner påvirker MSC i størst omfang så længe ratio MSC:DC er større end 1:10 [Zhang et al, 2004]. I 2004 blev det demonstreret, at ASC viste samme hæmmende effekt på MLR (mixed lymfocyt reaction) som MSC, men det krævede dog celle- cellekontakt for at udøve fuld inhibitorisk effekt [Puissant et al, 2004]. I 2009 blev ASC s indvirkning på DC er ligeledes undersøgt, og resultatet viste, at ASC havde en større inhiberende effekt på differentiering og modning af DC er end MSC. Det skal dog pointeres, at mekanis- men bag den stærkere inhibitoriske effekt hos ASC ikke kendes. En hypotese er, at denne effekt ses som følge af en højere mængde eller af andre typer opløselige faktorer [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Formålet med projektet er at kortlægge de mekanismer, som spiller ind på ASC s påvirkning af CD14 + monocytters differentiering til DC er. Dette forsøges belyst via samarbejde med tre andre grupper, hvor der undersøges, hvorvidt det er intercellulær- kontakt (co- kultur), cytokinpåvirkning (transwell- insert) eller spontan cytokinpåvirkning (konditioneret medie), der skaber den immunsupprimerende effekt. For at kvantificere de forskellige resultater bruges flowcytometri (FCM), hvor de forskellige overflade- markører og cytokiner, der specifikt udtrykkes på monocytter, umodne DC er og modne DC er sammen- lignes. Ligeledes benyttes quantitative polymerase chain reaction (qpcr) for kvantitativ vurdering af udtrykket af transforming growth factor- beta (TGF- β). 9/43

10 5. Problem Problemformulering Hvilken indflydelse har adipøst deriverede mesenchymale stamceller på differentieringen af monocytter til dendritiske celler? Problemstillinger Er der en observerbar forskel på differentieringen af monocytter i co- kultur med ASC i forhold til de negative kontroller samt i hvilken grad? Optræder der en forskel i forhold til denne differentiering i forsøgene med co- kultur, transwell- insert og konditioneret medie? Stemmer vores resultater overens med tidligere viden? Kan den mulige immunsupprimerende effekt benyttes i et klinisk perspektiv? 10/43

11 6. Baggrund I dette afsnit gennemgås viden, som vurderes relevant for forståelsen af dette projekt. Mesenchymale stamceller Stamceller er celler, som har evne til at differentiere til et vidt spektrum af modne celler, herunder knogle-, brusk-, adipøse-, muskel- og endothelceller. Ligeledes besidder de evnen til at genskabe sig selv. Disse nævnte karakteristika er unikke for stamceller og er grundlaget for, at der i høj grad forskes i at kunne udnytte stamceller klinisk [Reya et al, 2001]. MSC er multipotente, nonhæmopoietiske progenitorceller, som er i stand til at videredifferentiere sig til en bred vifte af mesenchymale celler [Nauta et al, 2006]. De mesenchymale stamceller (uafhængigt oprindelse) kan isoleres fra de fleste væv, herunder knoglemarven, fedt, lever, amnionvæske, lungerne, skeletmuskulatur samt nyrerne. I denne forbindelse er kriterier omhandlende mesenhymale stamcellers karakteristika som følger: Plastisk adhærens Have ekspression af markørerne CD73 og CD105 Mangle markørerne CD14, CD34 samt CD45 Skal være i stand til at differentiere sig til osteoblaster, adipøse celler eller chondroblaster [Dominici et al, 2006]. Adipøse stamceller Stamceller kan som nævnt isoleres fra forskellige typer væv. ASC er lettere tilgængelige end MSC [Baer, Geiger, 2012], da ASC kan oprenses via fedtsugning, hvor subkutane adipøse depoter tømmes. Foruden dette er det for ASC ydermere gældende, at: Der er mangel på markørerne CD14, CD34, CD4, CD11b, CD14, CD31 samt HLA- DR De er i stand til at differentiere til osteoblaster, adipøse celler og chondroblaster De har ekspression af markørerne CD10, CD13, CD29, CD 44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA klasse I [Baer, Geiger, 2012]. 11/43

12 En af forskellene mellem ASC og MSC er deres ekspression af CD34- antigen, som ASC er udtrykker. Des- uden har det vist sig, at ASC har en stærkere immunsupprimerende effekt end MSC. Det eksakte grundlag herfor er ukendt, men en mulig årsag kan være, at ASC i højere grad secenerer opløselige faktorer [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Dendritiske celler DC, der som de øvrige leukocytter, stammer fra de hæmatopoietiske, pluripotente stamceller i knoglemarven, betragtes som immunsystemets mest potente antigenpræsenterende celler [Lillevang, Møller, 2009; Jiang et al, 2005]. DC udtrykker konstant MHC I og MHC II (HLA- DR), men disse bliver yderligere opreguleret ved stimulering, i modsætning til andre antigenpræsenterende celler, som ikke har MHC med videre, udtrykt før stimulering [Geneser, 2011]. De findes primært i de sekundære lymfoide organer, men også i ikke- lymfoide organer. Med deres plads i det innate immunsystem er de vigtige celler i initieringen af det adaptive immunrespons blandt andet i kraft af deres evne til at stimulere hvilende T- celler. DC kan opdeles i to hovedkategorier: umodne samt modne, og disse har i deres respektive differentieringstrin forskellige egenskaber. Modningen fra umoden til moden DC kan ske, hvis en umoden DC udsættes for et stimulus, eksempelvis LPS [Agger et al, 2011; Zhang et al, 2004]. Umodne DC har et middelhøjt niveau af MHC I og MHC II på deres overflade og er specialisere- de i antigenoptagelse, hvilket sker ved pinocytose [Geneser, 2011]. CD1a er en typisk markør for DC på dette differentieringstrin [Zhang et al, 2004], men nogen egentlig markør herfor er ikke klarlagt [Agger et al, 2011]. De umodne celler findes i lymfe- og blodcirkulation, men også i alle typer væv. [Gyldendals Åbne Encyklopædi - DC*]. Modne DC findes primært i de sekundære lymfoide væv, hvortil de vandrer til efter påvirkning af maturerende signaler og her venter på at præsentere antigen for en T- celle [Garbi, Kreutberg, 2012]. De optager antigen mindre effektivt, men de kan derimod stimulere T- lymfocytter på grund af en kraftig opregulering af MHC I og MHC II og co- stimulatoriske molekyler (CD80 og CD86) [Agger et al, 2011]. Markører specifikke for modne dendritiske celler i forhold til umodne DC er er således CD80, CD86, HLA- DR og CD83, hvorimod de modsat monocytter, ikke udtrykker CD14 +. Derudover bør det nævnes, at DC ydermere udtrykker forskellige receptorer, heriblandt Fc- receptorer [Jiang et al, 2005]. 12/43

13 I blodet findes hovedsagligt DC er af myeloid oprindelse. Myeloide DC er kan dyrkes fra CD14 + monocytter in vitro ved tilstedeværelse af granulocyt makrofag colony stimulating factor (GM- CSF) og interleu- kin- 4 (IL- 4), hvilket kan udnyttes eksperimentielt [Jiang et al, 2005]. Celleinteraktioner mellem ASC og DC Celler kan interagere med hinanden, men for ovenstående celletyper er det er dog stadig ukendt, hvorledes denne interaktion foregår - der er dog to muligheder: Via direkte celle- celle kontakt Via sekretion og optagelse af ulige opløselige faktorer [Agger et al, 2011]. Celle-celle kontakt Begrebet celle- celle kontakt refererer til direkte interaktioner mellem celler, der etableres i form af forskellige celle- junctions ved hjælp af overflademolekyler. Disse celle- junctions kan være permanente, såsom tight- junctions mellem epitelceller, eller de kan være midlertidige, hvilket er tilfældet for immunceller, som medierer deres respons ud fra ændringer i omgivende mikromiljø eksempelvis ved in- flammation [Cooper, 2000]. ASC besidder flere adhæsionsmolekyler, der er involveret i T- celle interaktioner, herunder vaskulær celle ad- hæsions molecule- 1 (VCAM- 1), intercellular adhæsions molecule- 1 (ICAM- 1), og leukocyte function- associated antigen- 3 (LFA- 3) (se figur 6.1) [Jiang et al, 2005]. Ud- trykning af disse molekyler på ASC kan forklare, at ASC inhiberer T- celler i mixed lymfocyt reaktion (MLR) i stør- re grad, hvor celle- cellekontakt er tilladt (co- cultur) sammenlignet med forhold, hvor kun cytokin- påvirkning var mulig (transwell- insert og konditoneret medie) [Puissant et al, 2004]. Dog har studierne med Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.1. Illustrationen viser, hvordan en T- celle og en mesenchymal stamcelle (MSC) kan adhærere til hinanden vha. adhæsionsemolekylerne (ICAM- 1 og LFA- 1), og danner et begrænset kontaktområde [Agger et al, 2011]. MSCs påvirkning af DC er vist andre resultater. Ligeledes har konditioneret medie fra MSC vist varierende effekt på DC, men denne var generelt mindre inhiberende end hos co- kultur [Nauta et al, 2006; Zhang et al, 2004]. Mere interessant er, at den inhibitoriske effekt var i samme størrelsesorden, selvom 13/43

14 cellekontakten var hindret ved hjælp af transwell- insert, hvis ratio MSC:monocyt var 1:10 eller større [Jiang et al, 2005]. Dette indikerer, at cytokinpåvirkning kan have større betydning end celle- celle kontakt i relation til MSCs påvirkning af DC er. Opløselige faktorer Opløselige faktorer er et vidt begreb, der refererer til blandt andet humorale komponenter. Dette er eksempelvis cytokiner, som spiller en væsentlig rolle i den immunologiske cellulære kommunikation [Agger et al, 2011]. Cy- tokiner er intracellulære signalmolekyler, der kan udøve deres virkning gennem autokrin, endokrin eller parakrin stimulation [Cannon, 2000]. Cytokinpåvirkningen kan un- dersøges ved at bruge transwell- inserts, hvor muligheden for celle- celle kontakt fjernes, mens muligheden for cyto- kinpåvirkning bibeholdes. Herved tillades parakrin cyto- kinstimulation via DC til MSC og via MSC til DC (se figur 6.2). Derimod kan der ved brug af konditioneret medie ikke være en påvirkning af MSC fra DC, da mediet høstes uden at være i kontakt med monocytter/dc, men de spontant secernere- de cytokiner fra MSCs medie kan påvirke DC (se figur 6.3). Flere studier har indikeret, at cytokiner har en stor betydning i differentieringen af monocytter samt modningen til DC [Jiang et al, 2005; Nauta et al, 2006]. TGF- β er et cytokin, som har adskillige funktioner. Heriblandt er det i stand til at hæmme cellers aktivering og differentiering og derved mu- ligvis udøve en immunsupprimerende effekt [Puissant et al, 2004]. Det udskilles af flere celletyper, hvor det for DC, leukocytter og makrofager virker både auto- og parakrint [Let- terio, Roberts, 1998]. Tidligere studier har forsøgt at påvise Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.2 Billedet illustrerer, hvorledes to celletyper kan påvirke hinanden gennem parakrin og autokrin stimulation af cytokiner, men hvor en mikroporøs transwell- membran ikke tillader celle- celle kontakt. Der dannes heller ikke et lukket rum mellem adhæsionsmolekyler, som cytokinudveksling kan begrænses til. DC = dendritisk celle. MSC = mesenchymal stamcelle[agger et al, 2011]. Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.3 Illustrationen viser, hvordan spontant secer- nerede cytokiner i konditoneret medie fra mesenchymal stamcelle (MSC) kan påvirke dendritisk celle (DC). Det er dog en envejs- påvirkning, da DC ikke kan på- virke MSC til sekretion. ændringer i nævnte cytokins ekspression ved tilstedeværelse af MSC. Resultaterne har været varierende, da et studie ikke har observeret en målbar cytokinkoncentration hverken fra ACS eller MSC [Puissant et 14/43

15 al, 2004], mens andre studier har påvist øget mængde af de immunsupprimerende cytokiner [Jiang et al, 2005; Ivanova- Todorova et al, 2009]. Det overvejes, hvorvidt MSC gennem secernering af TGF- β kan påvirke monocytter samt DC immunsup- rimerende, imens monocytter og DC ligeledes kan secernere cytokiner, der påvirker både dem selv og MSC. Monocytter kan eksempelvis secernere IL- 6, IL- 10 og IL- 12, mens DC især secernerer IL- 10 og IL- 12 [Agger et al, 2011]. IL- 12 er blandt andet vigtig for modningen af DC. Med henblik på at vurdere hvilken type cellekontakt, der medierer ASCs formodede immunsupprimerende virkning, kan der ved hjælp af flowcytometri undersøges for ekspression af relevante overflade- markører. Mesenchymale stamcellers påvirkning af dendritiske celler MSCs påvirkning på differentieringen fra monocytter til umodne DC er Flere studier har vist, at MSC inhiberer differentionen og funktionen af DC [Zhang et al, 2004; Jiang et al, 2005; Ramasamy et al, 2006; Nauta et al, 2006]. I tre studier blev det undersøgt, hvorvidt samt hvordan monocytter ændrede sig, når disse var dyrket med GM- CSF samt IL- 4 med eller uden MSC. Studierne viste, at humane MSC inhiberede differentieringen af DC, når disse var dyrket in vitro [Zhang et al, 2004; Jiang et al, 2005; Ramasamy et al, 2006]. Et af studierne viste ydermere, at i en co- kultur med MSC og monocytter tilsat førnævnte cytokiner, udtrykte størstedelen af monocytterne ikke CD1a, hvilket bety- der, at monocytterne ikke havde differentieret sig til umodne DC, hvilket vil kunne forklares med, at MSC i stor grad inhiberer denne differentiering. I co- kulturen viste det sig dog, at MSC ikke påvirkede CD14- markør [Zhang et al, 2004]. Et andet studie viste ligeledes, at monocytter dyrket med MSC samt cytokiner ikke udtrykte CD1a samt bevarede deres høje niveau af CD14 +. Samme studie viste ydermere, at der var en nedregulation af MHC II antigen ekspressionen samt, at CD80 og CD86 ikke blev opreguleret [Jiang et al, 2005], hvilket også har vist sig gældende for CD40 [Zhang et al, 2004]. Den standsede udvikling af monocytter til DC er ydermere blevet undersøgt i et studie, hvor det blev konkluderet, at det skyldtes en nedregulering af cyclin D2 således, at monocytterne ikke kunne indtræde i cellecyklussens G 1 - fase [Ramasamy et al, 2006]. 15/43

16 Mesenchymale stamcellers påvirkning af modningen af DC Ligeledes er det blevet undersøgt, hvorvidt MSC påvirker modningen af DC. Her viser et studie, at MSC er kan hindre opreguleringen af CD40, CD86 samt CD83 signifikant samt, at sekretionen af IL- 12 vil være reduceret [Zhang et al, 2004]. Et andet studies resultater viste, at der er en beskeden opregulering af CD14 samt en mindre reduktion af CD83. Sidstnævnte studie viser ydermere, at umodne DC evne til endocytose var signifikant reduceret, hvilket der i studiet påpeges, at der formodentligt skyldes MSC. Studiets data indikerer ligeledes, at umodne DC enten vil konvertere til CD14 + celler (formodentligt makrofager) eller ophøre med udviklingen til modne DC. Slutteligt bliver det i selvsamme studie konkluderet, at den inhibitoriske effekt MSC havde på monocytterne var reversibel [Jiang et al, 2005]. Mesenchymale stamcellers påvirkning af modne dendritiske celler MSCs påvirkning af modne DC er er ligeledes blevet undersøgt. Det viste sig, at DC, der havde været udsat for MSC under differentieringen var blevet dårlige til at fremkalde en T- cellestimulation. Studiet viste, at MSC samt dets supernatant inhiberede frigivelsen af IL- 12 og derved differentieringen af naive T- celler til Th1- celler [Zhang et al, 2004]. De samme konklusioner er blevet draget i et andet studie, hvor der også har kunnes observeres en mindsket sekretion af IL- 12 samt en undertrykkelse af T- celle profila- tionen [Jiang et al, 2005]. Mekanismerne bag MSCs påvirkning af DC Hvorledes den immunsupprimerende effekt opstår, bliver ligeledes diskuteret i de forskellige studier. Nogle resultater viser, at den immunsupprimerende effekt opstår på baggrund af opløselige faktorer. Dette blev konkluderet på baggrund af brugen af transwell- culture system, hvor det kunne konkluderes, at MSC undertrykkede udviklingen af DC i ligeså stor grad, som hvis MSC havde været i co- kultur med monocytterne. Samme studie viste ydermere, at supernatant fra MSC- kultur ligeledes havde en inhibitorisk effekt på modningen af DC, men at denne var mindre markant samt mere variabel. Supernatanten påvirkede ikke differentionen af monocytter til DC [Nauta et al, 2006]. Dette stemmer overens med andre studier, hvor der ligeledes blev undersøgt MSC samt supernatants rolle i forbindelse med den im- munsuppremerende effekt [Zhang et al, 2004]. Andre resultater viser, at den inhibitoriske effekt ligeledes kan komme som følge af cytokinpåvirkning, men nemmere opstår ved celle- celle kontakt - der kan dog opstå fuld inhibitorisk effekt ved ændret ratio. [Jiang et al, 2005]. Dette er der dog uenighed om, da et andet studie mener, at celle- celle kontakt er nødvendigt for, at der vil optræde en fuld inhibitorisk effekt [Puissant et al, 2004]. 16/43

17 MSC versus ASC Slutteligt skal det nævnes, at der ligeledes har været forsket i, hvorvidt ASC skaber et ændret immuno- regulatorisk udfald sammenlignet med MSC. I 2004 blev det første gang klarlagt, at ASC udtrykker lig- nende immunosuppressive egenskaber in vitro som MSC [Puissant et al, 2004]. Senere hen er det endvidere vist, at ASC er er bedre til at inhiberere differentieringen af DC er sammenlignet med MSC [Ivano- va- Todorova et al, 2009]. Mesenchymale stamcellers kliniske relevans På baggrund af MSCs immunsuppressive effekt samt evne til at differentiere sig til andet væv, er der potentiale for at anvende disse i klinikken. MSC kan til dels anvendes som et regenerativ medikament, men kan også bruges i kraft af dets evne til at supprimere immunsystemet. Dette projekt lægger som tidligere nævnt vægt på MSCs evne til immunsuppressionen. Da ASC er mere tilgængelige end MSC, er der større indikation for anvendelse af disse i klinikken. Et af de områder, hvor de adipøse stamceller i høj grad kan anvendes er i forbindelse med organtransplantationer, hvor det centrale problem er af- stødning grundet et immunrespons. Dette immunrespons skyldes alloantigener (fremmede antigener). Disse alloantigener stammer fra proteiner i celler, som medfører en genetisk variation imellem donor- væv og recipienten. Disse vævstyper, som danner grundlag for den immunologiske afstødningsreaktion, opdeles i to grupper: MHC - antigener, som opdeles i klasse I og klasse II. MHC I antigener findes på kerneholdige cel- lemembraner, mens MHC II kun findes på visse af immunsystemets celler og herunder særligt de antigenpræsenterende celler. Minorvævstyper - de svage vævstyper, som er peptidfragmenter fra celleproteinsyntese, der er bundet til klasse I antigener. Disse to væsentlige begreber kan illustreres med følgende eksempler af hudtransplantation: Ved transplantation mellem MHC identiske vævstyper, men forskelle i de minorvævstyperne, ses en afstødning efter cirka dage. Ved forskelle i minorvævstyperne, men ens MHC- antigener, vil der ses en afstødning efter dage. I denne anledning blev der i 2001 lavet et forsøg med bavianer, hvor der rejektionstiden mellem histoinkompatible hudtransplantationer blev testet. I forsøget blev der anvendt seks bavianer, hvoraf fire fik injiceret MSC intravenøst, og de to sidste fungerede som kontrolgruppe ved 17/43

18 at injicere isotonisk saltvand. Kontrolgruppen havde en transplant overlevelsestid på syv dage. To af dyrerne, der fik injiceret MSC subkutant, oplevede en afstødningsreaktion grundet tekniske fejl. For de resterende fire gjaldt det, at de fik MSC injiceret intravenøst således, at hudtransplantatet overlevede i 11,3 dage. Det kan ud fra forsøget med bavianer konkluderes, at MSC har en immunsupprimerende effekt under afstødningsreaktioner i forbindelse med hudtransplantationer. Dette kan ses i forhold til daglig anvendelse af fludarabine, der er et lægemiddel, som inducerer T- lymfocyt død, hvilket forlænge- de overlevelsestiden af det transplanterede hud til cirka 14 dage. Det samme gælder anvendelsen af cyclosporine, som sammen med anti- CD- 80 antigener forlængede overlevelsestiden af huden til 14 dage [Bartholomew et al, 2002]. Desuden kan der tales om GvH, som er en type reaktion, der udløses ved, at T- celler overføres fra donor til recipient. T- cellerne vil herefter udøve en immuninflammation, der stort set strækker sig over alle kroppens væv. Dette er grundlaget for, at der i forbindelse med knoglemarvstransplantationer kræves stor forlignelighed mellem donor og recipient. Transplantatsimmunitet kan deskriptivt opdeles i immuniteringsfasen og effektorfasen. I immuniserings- fasen aktiveres naive T- celler. Disse vil vandre til thymus og har her forklonet deres T- celle- antigen- receptor, og det samlede spektrum af antigenreceptorer i de eksportede naive T- celler dækker det anti- gene univers. Ved transplantation er der to veje for alloimmunisering: den direkte og den inddirekte. Ved den direkte alloimmunisering vandrer donorderiverede DC fra transplantatet til drænerende værtslymfeknuder, hvor de naive T- CD4 + - celler aktiveres. Herefter vil der fremkomme effektor- T- celler. Disse celler vil med- føre ekspansion og differentering til aktive cytotoksiske T- celler [Abdi et al, 2008]. Ved den inddirekte alloimmunisering sker der en immunreaktion, som udløser et immunrespons, der er identisk med virusantigener i forbindelse med virusinfektion. Det er således recipientens egne DC, som optager antigenerne og præsenterer dem på egne HLA- antigener [Bartholomew et al, 2002]. På baggrund af organtransplantation og ASC evne til at hæmme differentering af monocytter til DC er det interessant se på, hvilken effekten denne mangel på differentiering medfører. Det er her klart, at der ved den direkte stimulering sker en interaktion imellem naive- CD4 + - celler samt DC. En aktiveret CD4 + - celle vil herefter udskille IL- 2, som stimulerer ekspansion af T- celler [Annenberg Learner*]. Baseret på ovenstående kapitel kan det opsummeres, at ASC har flere egenskaber, der er eftertragtede indenfor et bredt spektrum af terapeutisk medicin. De multifaktorielle egenskaber og deres nemme 18/43

19 tilgængelighed danner grundlaget for dette projekt. Det er fortsat mange uafklarede aspekter omkring ASCs virkning herunder de immunregulerende karakteristika [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Flowcytometri For at undersøge cellerne nærmere kan de analyseres ved hjælp af FCM. Dette er en måde, hvor- på der måles fysiske eller kemiske karakteristika på celler eller andre partikler i en væskestrøm [Shapiro, 2003]. FCM er en hyppigt brugt metode i immunfluorescensundersøgelser, hvor immun- cellernes specifikke markører konjugeres med fluorescerende molekyler [Agger et al, 2011]. Målinger foretages ved, at celler og/eller partikler Figur 6.4. Her vises princippet bag flourescerende lys. [In- i en suspension enkeltvis sendes gennem et elek- vitrogen flourescence*]. 1) Viser flourokromets excitation trisk felt eller fokuseret lysstråle, hvilket sker i et ved en given bølgelængde. 2) Viser flourokromets energi- flowcytometer. Sidstnævnte går ud på, at cellen tab, som fører til 3) hvor emission optræder ved en given bølgelængde, hvorved lys udsendes. passerer gennem et måleområde i flowcytomete- ret, hvor væskestrømmen af celler bliver ramt af laserstråler. Det spredte laserlys bliver samlet af linser. Dikroiske spejle filtrerer og separerer lyset på baggrund af størrelse, granularitet og eventuelt den type fluorescens cellerne er konjugeret med [Agger et al, 2011]. Herefter vil lyspulsene blive omdannet til elektroniske signaler ved hjælp af fotoforstærkere, hvorefter data vil kunne analyseres på en computer [Kielberg et al, 2012]. Fordelen ved FCM er, at det giver mulighed for at analysere hver enkelt celle eller partikel. Herefter kan de kategoriseres i populationer baseret på forskellene i cellernes eller partiklernes variable, hvorved de kan inddeles og analyseres [Robinson, 2004]. En måde, hvorpå FCM kan udføres, er ved at farve for overflademarkører, markører i cytoplasma samt markører i nucleus [Kielberg et al, 2012]. Baseret på FCM og dets data vil det herefter være muligt at vurdere, hvorvidt cellen udtrykker de markører, der blev farvet[robinson, 2004]. De fænotypiske over- flademarkører på immunceller kan udtrykkes ved at farve dem med heterogene fluorokromer. Fluoro- 19/43

20 kromer er molekyler, der udsender lys af en bestemt bølgelængde, når disse bestråles, hvorved det exciteres for herefter at resultere i emission (se figur 6.4) [Biotech Academy*]. Det er flere måder at mærke et ønsket antistof med fluorokromer - eksempelvis den direkte metode, hvor der konjugeres antistoffer med fluorescens, som derefter kan bindes til en specifik receptor. Såle- des kan en bestemt celletype kvantificeres på baggrund af deres unikke overflademarkører (se figur 6.5). Figur 6.5 1) En heterogen cellepopulation (hvor en eller flere celletyper er konjugeret med fluorescerende antistoffer) suges ned i maskinen. 2) Cellerne passerer et måleområde, hvor de bliver bestrålet af en laser. Det spredte laserlys samt fluorescen- sen bliver samlet af linser. 3) Dikroiske spejle separerer det heterogene lys og sender det til detektorer: 4) Forward Scatter (FCS) måler cellestørrelse. 5) Side Scatter (SSC) måler granularitet 6) Detektorer der måler orange og grønn fluorescens. 7) Detektorer digitaliserede elektroniske signalere, og sender dem til en computer for lagring og opsamling. 8) Den opsamlede data kananalyseress på flere måter. 9) Diagrammet viser hvordan cellerne bliver kvantificeret ud fra cellestørrelse (X- aksen, FSC) og cellegranularitet (Y- aksen, SSC). [Agger et al, 2011] 10) Dotplot, hvor FITC- fluorekrom (grøn fluorescerende, kortere bølgelængde højere energi) konjugeres antistof mod CD3, og dermed illustrerer T- hjælpeceller. fpe- fluorkrom (orange fluorkrom) konjugeres med antistoffer mod CD19- markør på B- celler. PE- fluorescerende lys har længere bølgelængde og lavere energi end FITC- fluorescerende lys [Nerliens Meszansky*] (Figuren er modificeret fra Agger, 2010). Antistoffer samt isotyper Der findes både mono- og polyklonale antistoffer. Polyklonale antistoffer binder på forskellige specifikke epitoper af samme antigen, mens monoklonale antistoffer kun binder sig på én specifik epitop [Biome- dical Instrumentation Center*]. Et problem med binding af antistoffer er, at der ofte opstår uspecifikke bindinger, eksempelvis på Fc- receptoren. Grundet dette skal der anvendes kontroller af samme Ig- isotyper, men hvor den variable del ikke er intakt. Ved hjælp af isotyperne kan det vurderes, hvor stor mængde af antistofferne, der er bundet specifikt samt hvor stor del, der har indgået uspecifikke bindinger [Kielberg et al, 2001]. 20/43

21 De fluoroscerende antistoffer findes i forskellige udgaver. De exciteres og emmiteres ved forskellig bøl- gelængder (se figur 6.6). Som nævnt findes der forskellige udgaver: 1 Enkelt fluorescerende antistoffer, som direkte exciteres og emmiteres og derved udsender fluorescerende lys. 2 Tandemskonjugerede antistoffer, som omhandler, at første fluorochrom videresender sin energi fra emissionen til andet flourokrom, som exciteres og slutteligt selv vil skabe emission med læn- gere bølgelængde, lavere energi samt anden farve [Life Technologies*]. Figur 6.6. Her ses farvespektret over de forskellige bølgelængder illustreret. nm = nanometer. qpcr: Ligesom flowcytometri er nyttig til at kvantificere de forskellige overflademarkører, der er specifikke for cellerne, kan quantitative polymerase chain reaction (qpcr) bruges til at undersøge kvantitativt, hvor meget af et specifikt protein, der udtrykkes af cellerne. Denne metode bygger på oprensning af mrna fra de celler, der ønskes undersøgt, og der laves reverstransskription således, at cdna dannes, hvorpå der kan laves qpcr. qpcr opdeles i flere trin, hvilket i det følgende gennemgås. Trinene i qpcr Først tilsættes den mængde template, som skal mængdeundersøges for udtrykkelse af det givne gen samt de andre komponenter, som er angivet ovenfor. Der kan nu påbegyndes denatureringstrinnet, hvor hele qpcr- blandingen varmes op til cirka C, og polymerasen aktiveres. Hermed vil den dob- beltstrengede cdna- streng åbnes, da hydrogenbindingerne mellem de to strenge denatureres ved denne temperatur. Herefter indstilles temperaturen til cirka 60 C - også kaldet annealing temperaturen. Når denne temperatur nås, vil primerne påhæfte sig cdna, da de er designet til at passe på specifikke nukleotidkombina- 21/43

22 tioner. Disse er nødvendige for, at DNA- polymerasen kan opbygge den komplementære streng, da de fungerer som startsted. Ved to- trins PCR finder elongering ligeledes sted herunder. Under elongerin- gen vil deoxyribonukleotider, som er byggestenene, opbygge den komplentærestreng fra 3 mod 5 enden af den komplementære streng til cdna ved hjælp af DNA- polymerasen. Der benyttes en varme sta- bil Taq- polymerase, som har aktivitet fra 5 mod 3 - enden. Efter dette trin er en cyklus overstået, og dette kan gentages efter ønske. Der benyttes SYBR- Green, et molekyle, som ved binding flourocerer grønt. SYBR- Green binder sig til dobbelstrenget DNA. Efter hver cyklus registreres mængden af fluroscense, som er lig med mængden af dobbeltstrenget DNA [LifeTechnologies qpcr*]. 22/43

23 8. Metode Nedenfor ses en oversigt over forsøgsdagene samt et kort overblik over deres indhold. Dag - 5 Dag - 2 Dag - 1 Dag 0 Dag 2 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 16 Tilvænne stamceller og HEK- celler RP10- medie (RP10:α- MEM = 50/50) Tilsæwe 100 % RP10 yl ASC og HEK- celler ASC/HEK- celler bliver talt og sået ud Oprensning af PBMC fra fuldblod Monocyt oprensning ved adhærens Afvask af lymfocywer Tilsætning af RP10 medium + cytokiner + co- cultur etablere Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Modning - ylsætning af LPS Høst af celler + flowcytomey PCR Cellekulturer ASC er tidligere i Laboratoriet for Stamcelleforskning blevet isoleret fra det cellulære affaldsprodukt, som fås ved fedtsugninger og blev til dette projekt udleveret i en T75- flaske (Greiner Bio- One Gmbh, kat. nr.: ). ASC anvendt i dette forsøg var af type ASC- 21 isoleret fra abdomen og hofteregionen på en 52- årig mand med BMI 28. Donoren var endvidere ikke- ryger og benyttede ikke medicin. ASC var GFP (green flouroscense protein)- transfekterede. Transfektionen med GFP gør det muligt at udnytte cellernes grøntflouroscerende egenskab under den senere flowcytometri Som kontrolceller anvendtes Human Embryon Kidney celler (HEK) oprenset af Frank Graham i 1970 erne (eksperimentnummer 293) ligeledes udleveret i en T75- flaske til dette projekt. Disse celler blev valgt som kontrolceller, da de er humant deriverede, ikke er stamceller og ligeledes er de GFP-

24 transfekterede. Begge celletyper blev dyrket i mediet α- MEM (100%, 89 %) (Gibco/Invitrogen, kat.nr.: 32561) samt gentamycin (0,5 %) (cas.nr.: ). Monocytter blev isoleret fra fuldblod fra raske donorer ved Aalborg Universitet dog anvendtes blod fra samme donor til hvert forsøgsopsæt. Disse celler blev på alle stadier dyrket i RP- 10- medie, bestående af RPMI 1640 med 25mM HEPES uden glutamin (Invitrogen/Life Technologies, kat.nr.: ) + 1 % Penicillin/Streptomycin (P:10,000 μl/ml, S:10,000 μl/ml) (Sigma- Aldrich/Invitrogen, kat.nr.: P433) samt FCS (10 %) (Kia Sygehus Nord Lotte Hat- ting) og glutamin (1 %) (cas.nr.: ). Alle cellekulturer blev dyrket i en inkubator (ESCO- cellculture 170b) ved 37 C samt 5 % CO 2 og humidifi- ceret luft. Under arbejdet med cellerne uden for inkubatoren benyttedes en LAF- bænk (Holten Lamin Air model 1,5). Klargøring af ASC, HEK og konditioneret medie samt tilvænning til medie Dag -5 Fem dage før, at diverse testkulturer skulle opstartes, skulle ASC og HEK- celler tilvænnes DCs medie. Grunden til, at ASC og HEK- celler skulle tilvænnes RP- 10, og ikke omvendt, er, at monocytterne ikke tri- ves i α- MEM. Derfor blev der foretaget en gradvis koncentrationsændring således, at ASC samt HEK- cellerne kunne tilvænne sig RP- 10. Dette blev gjort ved at lave en 50/50- blanding af RP- 10 og α- MEM, som blev tilsat T75- flaskerne indeholdende ASC og HEK- celler efter først at have fjernet deres α- MEM (se appendix 3a). Dag -2 Tre dage senere blev der igen foretaget medieskift ved ASC samt HEK- celler - denne gang til 100% RP- 10 medie. Høst af konditioneret medie Dag -1 Dagen før test af kulturerne skulle etableres, blev der høstet konditionerede medie fra ASC og HEK- cellerne. Mediet blev centrifugeret i 10 minutter ved 1400 rpm (Hettlich- zentrifugen universal 32OR), og 24/43

25 herefter sterilfiltreret med sterilfiltre (Q.max syringe filter, kat. nr.: CAPS S). Mediet blev opbe- varet i inkubator. Høst af celler Herefter blev cellerne i kulturflasken aftrypsineret. Dette blev gjort ved først at foretage to skylninger med s- PBS (Gibco/invitrogen, cas.nr.: ) og efterfølgende tilsætning af trypsin (cas.nr.: )/EDTA (cas.nr.: ). Herefter blev cellerne inkuberet i fem minutter, hvorefter cellerne løsnedes. RP- 10 blev tilsat og blev sammen med cellerne suget fra T75- flaske. Herefter blev trypsin/edta, RP- 10 samt celler centrifugeret i 3 minutter, 25 C, 1200 rpm. Herefter blev supernatant hældt fra ASC samt HEK- celler. Der blev tilsat yderligere RP- 10 til HEK- cellerne samt til ASC. En mængde RP- 10 indeholdende celler blev tilsat trypanblåt (0,2%) (cas.nr.: ) og blev talt ved hjælp af et tæl- lekammer med henblik på at vurdere antal levende celler inden efterfølgende inaktivering. Inaktivering Med henblik på at inaktivere ASC og HEK- cellerne blev disse bestrålet med gammastråling i 2x7,5 minutter ved 40 Gy for at hindre videre celledeling. Udsåning af ASC/HEK celler Cellerne i co- kultur blev udsået i 6- brøndsbakker (Corning, kat. nr.: 3506). Baseret på tidligere forsøg blev det bestemt, at forholdet mellem ASC/HEK- celler og monocytter skulle være 1:10. Der blev taget udgangspunkt i, at der skulle tilsættes 8*10 6 monocytter i brøndene, men det forventedes, at kun 10 % ville adhærere svarende til monocytter. Som før nævnt skulle forholdet være 1:10, svarende til, at der skulle være henholdsvis ASC er og HEK- celler. Der ønskedes samlet 4 ml RP- 10 inklusiv cellesuspension i hver brønd, hvoraf 42,1 μl af de 4 ml udgjordes af cellesuspensionen for at kunne opnå ønskede koncentration (se appendix 3b). Udsåning af ASC/HEK- celler blev gjort således, at brønd 1+2 indeholdte ASC, brønd 3+4 HEK- celler, imens brønd 5+6 var tom (se figur 8.1). Figur 8.1. Brønd 1 og 2 indeholder biologiske replikater af adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC), brønd 3 og 4 indeholder biologiske replikater af human embryonic kidney celler (HEK), brønd 5 og 6 var foreløbig tomme. 25/43

26 Monocyt og ASC/HEK- celle forholdet var gældende for alle fire forsøgsopstillinger, dog blev forsøgene udført med forskellige metoder, hvilket i det følgende gennemgås. CO-kultur Co- kulturen bestod af monocytter med ASC eller HEK- celler i hver sin separate brønd samt en brønd kun indeholdende monocytter (se figur 8.2). Formålet med denne forsøgsopstilling var at undersøge en potentiel immunregulerende effekt på differentiering, hvor intercellulær celle- celle kontakt var mulig. Brønden med monocytter alene var kontrol, således, at det kunne undersøges, hvordan disse opførte sig spontant. Figur 8.2. Dette viser en illustration over opsætning, hvor monocytter dyrkes i co- kultur med enten adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) eller human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur. Transwell-insert På samme måde som i co- kultur opsætningen udsåedes ASC, HEK- celler samt monocytter ligeledes i transwell- insert. Monocytter og ASC/HEK- celler blev adskilt af en mikroporøs membran, som hindrede celle- celle kontakt, men tillod en celle- celle interaktion ved, at et mikromiljø etableredes af opløselige faktorer fra begge celletyper. Der var igen to brønde kun med monocytter, der fungerede som kontrol for deres mulige spontane reaktioner (se figur 8.3) [Corning*]. Formålet med dette forsøgsopsæt var at undersøge den immunregulerende effekt uden celle- celle kontakt, men hvor påvirkning af substanser mellem de to celletyper fortsat var mulig, da de kunne passere 26/43

27 den microporøse transwell- membran [Puissant et al, 2004]. Figur 8.3. Dette viser en illustration over transwell- opsættet med monocytter og adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) eller human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur som kontrol. Konditioneret medie 1 Forsøgsopsættet med konditioneret medie 1 blev sat i gang på dag 0 - samme dag monocytterne blev oprenset og skulle dyrkes. Konditoneret medie var det cellefrie medie, hvor ASC eller HEK- cellerne blev dyrket i et stykke tid, hvilket i dette forsøg var svarende til cirka 24 timer. Mediet ville dermed indeholde en række opløselige faktorer som ASC eller HEK- cellerne havde udskilt. Som gældende for ovenstående blev der i dette forsøg ligeledes dyrket i et sæt separate brønde kun med monocytter (se figur 8.4). Formålet med metoden var at undersøge, hvorvidt de opløselige faktorer var tilstrækkelige i forhold til at hæmme differentiering af monocytter til DC eller om celleinteraktion er nødvendig for dette [Puissant et al, 2004]. 27/43

28 Figur 8.4. Dette viser en illustration over opsætningen med konditioneret medie for adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) og human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur. Ilustrationen er gældende for både forsøgsopsættet konditioneret medie 1 og konditioneret medie 2, hvor forskellen i de to forsøg er tilsætningstidspunktet for det konditionerede medie. Konditioneret medie 2 I det sidste forsøgsopsæt, konditioneret medie 2, blev det konditionerede medie fra ASC samt HEK- cellerne først tilsat til monocyt kulturerne på dag 6. Formålet med først at tilsætte mediet på dag 6 var at undersøge, hvorvidt de opløselige faktorer var tilstrækkelige i forhold til at hæmme modning af dendritiske celler eller om celleinteraktion var nødven- dig for dette. Opsætningen i dette forsøg var magen til konditioneret medie 1 (se figur 8.4). Som tidligere nævnt var forsøgene et samarbejde mellem fire grupper - kun co- kultur forsøget gennem- gås yderligere i det følgende, men princippet bag dem alle er det samme. Undersøgelse af immunsupprimerende effekt Dag 0 Oprensning af PBMC Fuldblod á 6 rør indeholdende heparinkugler blev overført til seks centrifugerør. Der blev fortyndet med RPMI 1640 og derefter lymfoprep (Medinor, kat.nr.: ) i de samme rør. Herefter centrifugeredes rørene i 20 min, 180 xg, C, bremse 0. 28/43

29 Supernatanten blev suget fra, efterfulgt af 20 minutters centrifugering, 380xg, C, bremse 0. Her- efter høstedes interfase PBMC med kanyle (Misawa, kat.nr.: ), og to interfaser samledes i ét TPP- rør med PBS (cas.nr: )/EDTA (cas.nr: ). Efterfølgende blev der foretaget vask ved centrifugering i 10 min, 300xg, 4 C, bremse 0, hvorefter supernatanten blev hældt fra, og der blev tilsat PBS til to TPP- rør med PBMC, som overførtes til det tredje TPP- rør med PBMC, som derudover også blev tilsat PBS/EDTA, således der samlet var ét rør med PBMC samt PBS/EDTA. Dette rør blev centrifugeret i 10 minutter, 300xg, 4 C, bremse 2 efter tilsætning af PBS+EDTA. Efter tredje vask med centrifugering i 10 min, 200xg, 4 C, bremse 2, frahældtes supernatant og tilsattes RP- 10. Med henblik på derefter at tælle antal monocytter blev methylviolet (cas.nr.: ) tilsat til tilsvarende mængde cellesuspension, hvorefter cellerne taltes i tællekammer. Baseret på antallet af talte celler, blev cellesuspension fortyndet for at opnå den ønskede koncentration af celler (se appendix 3d). Herefter blev det eksisterende medie fjernet med cellerne sået ud dagen før, og cellesuspension svarende til 8 millioner celler per brønd blev sået ud i hver af de seks brønde. Med henblik på monocytadhærens blev bakken inkuberet i 1½ time. Derefter blev mediet fjernet, og brøndene blev skyllet to gange med cytokinfrit RPMI % pen/strep. Herefter tilsattes RP- 10 medie samt cytokinerne IL- 4 (stock 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.: #200-04) og GM- CSF (stock. 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.:# ) med henblik på fremme differentiering mod DC er (se appendix 3e). Herefter blev brøndene inkuberet. Slutkoncentration af cytokiner i hver brønd var 60 ng/ml GM- CSF og 100 ng/ml IL- 4. Dag 2 og 5 Der blev tilsat RP10- medium inklusiv GM- CSF samt IL- 4 (se appendix 3f), så koncentrationen på dag 2 for GM- CSF var 360 ng/ml og koncentrationen for Il- 4 var var 600 ng/ml. På dag 5 halveredes koncentratio- nerne (se appendix 3g). Dag 6 Den sjette dag blev modningen af DC erne i alle 6 brønde stimuleret ved at tilsætte LPS til mediet, så slut koncentrationen var 10 ng/ml (se appendix 3h). 29/43

30 Dag 7 På dag syv blev cellerne høstet, og de biologiske replikater poolet således, at suspensionen fra henholdsvis brønd 1+2, 3+4 samt 5+6 blev overført til tre TPP- rør. Via spulning med RPMI 1640 blev semi- adhærente celler løsnet og derefter overført til førnævnte rør efterfulgt af centrifugering i 10 minutter, 300xg, 22 C, bremse 2. Herefter blev supernatant frahældt, og cellerne blev resuspenderet i PBS + 0,5 % BSA +0,01% sodium azid (cas. nr.: ). Herefter blev cellerne testet med FCM. Flowcytometri Cellesuspensionerne i de tre rør repræsenterede de tre grupper blev overført til 8 forskellige FACS- rør grundet FCM, hvortil antistoffer samt isotypekontroller for markører blev tilsat. En oversigt over disse ses nedenfor: ANTISTOFFER CD80- PE- Cy5 HLA- DR- APC- H7 CD86- PE CD83- APC CD14- FITC ISOTYPER PE- Cy5 isotype APC- H7 isotype PE isotype APC isotype FITC isotype Tilsætningen foregik således, at 4 rør indeholdt ét antistof, imens de andre 4 indeholdt isotypen for anti- stoffet (se figur 8.5). 30/43

Vis mere