Genregulering og fedt

Transkript

1 Sciencedag 6. november 2008 Genregulering og fedt Susanne Mandrup Institut for Biokemi og Molekylær Biologi

2 BMI= Vægt i kg (Højde i m) 2 Overvægt (overweight): BMI>25 Fedme (obesity): BMI>30 DR % af den voksne danske befolkning er overvægtige 10-13% af danskerne er svært overvægtige 75% flere overvægtige siden især i de yngste aldersgrupper.

3

4

5 Dårlige prognoser for bekæmpelse af fedmeepidemien DR WHO skønner, at: 75% af den amerikanske befolkning vil være overvægtige i % af alle europæere vil være overvægtige i 2030.

6 Fedmerelaterede sygdomme Hjertekarsygdomme og åreforkalkning Insulin resistens og type II diabetes Galdesten Leverproblemer Lungelidelser Slidgigt Urinsyregigt Cancer Psykiske problemer Hvordan kan udviklingen af fedme begrænses? Hvorfor har nogle mennesker større tendens til udvikling af fedme end andre? Hvordan påvirker fedme funktionen af andre væv (signaltransduktion, genregulering, metabolisme etc.)? Hvordan kan følgevirkningerne af fedme forhindres?

7 Udvikling af hvide og brune fedtceller Fibroblast Hvid adipocyt Oplagring af energi? Brun adipocyt Forbrænding af energi Forstadie tættere på myoblast (præmuskelcelle)?

8 Differentiering af 3T3 L1 preadipocyter dage Eksponentiel vækst Konfluens Klonal ekspansion Vækst stop Adipocyt fænotype Inducere: Insulin (dag 0 4) Dexamethasone (dag 0 2) MIX (dag 0 2) FCS (dag 0 )

9 Differentiering af 3T3 L1 celler in vitro ingen farvning + oil red-o dag 0 dag 2 dag 4 dag 10

10 Fedtcelle udvikling Preadipocyt Ændring af genudtryk Adipocyt Akutte effekter af signaler Effekter på funktion eller aktivitet af eksisterende proteiner: Enzymaktivitet Ionkanaler Cytoskelet Langtidseffekter af signaler Effekter på genudtryk og dermed syntese af nye proteiner: Ændring af aktivitet af transkriptionsfaktorer En celles fænotype er et produkt af, hvilke gener der udtrykkes.

11 DNA aflæses v.h.a. proteiner kaldet transkriptionsfaktorer

12 Kromatin struktur Stephen B. Baylin & Kornel E. Schuebel, 2007 Nature

13 Aktivering af eukaryot transkription Aktiverende transkriptionsfaktorer Åbner kromatinstrukturen via remodellering og histonmodifikation Fremmer rekrutteringen af preinitieringskomplekset via mediatorkomplekset Näär et al. Ann. Rev. Biochem. 70, 475, 2001

14 PPARγ en nøgle transkriptionsfaktor i adipocyt differentieringen Adipogenese C/EBPδ PPARγ RXR Adipocyt gener C/EBPβ KLF15, CREB SREBP 1 etc. C/EBPα

15 Nukleære receptorer AF 1: Ligand uafhængig transaktivering AF 2: Ligand afhængig transaktivering

16 Olefsky (2001) JBC 276,

17 PPAR er er transkriptionsfaktorer der aktiveres af fedtstoffer PPARer spiller vigtig rolle i regulering af fedtmetabolisme. PPARγ er essentiel for udvikling af fedtvæv. PPARγ øger fedtophobningen i fedtceller. PPARγ binder og aktiveres af antidiabetiske medikamenter. PPAR = peroxisom proliferator aktiveret receptor

18 PPARγ agonister Syntetiske tzd agonister Insulin sensitiverende medikamenter Naturlige agonister PUFAs & eicosanoider Willson et al. (2000) J. Med. Chem. 43, 527

19 Insulin er nødvendig for at opretholde normal koncentration af sukker i blodet Diabetes Insulin resistens

20 Insulin resistens fører ofte til type II diabetes Fedme Genetiske faktorer Højt lipidniveau i blodet Insulin resistens Forhøjet insulin Svigt af β-celler Forhøjet glukose /type II diabetes

21 Insulin resistens i muskler fører til vaskulær hypertriglyceridemia og fremmer udviklingen af metabolsk syndrom Åreforkalkning og hjertekarsygdomme Petersen et al. (2007) PNAS 104,

22 Behandling af insulin resistens/ type II diabetes Kostændring og motion. Medikamenter der øger insulin sekretion (ex. Sulfonylurea). Insulin sensitiverende stoffer øger insulin følsomhed i target organer (især fokus på muskel, lever og fedtvæv).

23 Hvordan øger PPARγ ligander insulinfølsomheden? Adiponectin Effekter på fedtvævet Mindre fedtceller Flere brune fedtceller Højere mitokondriel aktivitet Nedsat cytokin-produktion Øget adiponectin udtryk Øget udtryk af proteiner der indgår i insulinsignalering og glucoseoptag Anti-inflammatorisk Nedsat lipolyse (frigivelse af fedtstoffer fra fedtcellen) Øget optag af fedt fra blodbanen Effekter på muskler Indirekte effekt via fedtvævet: Fedtstoffer optages i fedtvævet nedsat fedtmængde i blodbanen mindre fedt i muskler bedre insulinsignalering i muskler) Øget udtryk af adiponectin i fedtvæv Direkte effekt på insulinfølsomhed (PPARγ i muskler, aktivering af AMPK) Rosen & Spiegelman (2001) JBC 276,

24 Hel genom kortlægning af PPARγ:RXR og RNA polymerase II binding under fedtcelleudvikling

25 PPARγ en nøgle transkriptionsfaktor i adipocyt differentieringen Adipogenese C/EBPδ PPARγ RXR Adipocyt gener C/EBPβ KLF15, CREB SREBP 1 etc. C/EBPα

26 Induktion af fedtcelleudvikling og PPARγ udtryk i 3T3 L1 celler days Exponential growth Confluence Clonal expansion Induction of differentiation Growth arrest Inducers: Insulin (day 0-4) Dexamethasone (day 0-2) MIX (day 0-2) FCS (day 0 onwards) Acquire adipocyte phenotype

27 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 1,2 Southern Blot Recovery (% af input) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Binding af en specifik faktor til et givent sted på DNA strengen til et givent tidspunkt i en population af celler. Non binding site Factor X target site

28 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) ChIP ed PPARγ:RXR target sites αpparγ (SC-7196) αrxr (SC-774) Southern Blot

29 PPARγ aktiverer fedtcelle specifikke gener gennem PPARγ:RXR binding til target sites PPARγ mrna Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 6 ChIP ed PPARγ:RXR target sites αpparγ (SC-7196) αrxr (SC-774) PPARγ Protein PPARγ2 PPARγ1 TFIIB Induktion af PPARγ target gener Binding af PPARγ og RXR til target sites Rel expression A FABP mrna D0 D1 D2 D3 D4 D6 Perilipin mrna Recoveries ( % input) 2 1,5 1 0,5 0 2,5 2 1,5 1 0,5 day 0 day 6 No Gene Myog ex2 A-FABP Perilipin day 0 day 6 αpparγ αrxr 0 0 D0 D1 D2 D3 D4 D6 No Gene Myog ex2 A-FABP Perilipin

30 ChIP seq analyse af PPARγ:RXR targets sites gennem 3T3 L1 adipogenese ChIP ed PPARγ:RXR target sites apparg (SC 7196) arxr (SC 774) Solexa sekventering Decross linking Isolation of fragments Cluster growth Adapter ligation Sequencing of clusters Image acquisition Base calling Deep sequencing: ~ 10 mill 32bp seq tags per ChIP Mapning til genomet, forlænges til 200 baser Tælling af antal sequence tags i et glidende vindue på 10 baser

31 PPARγ og RXR ChIP seq profil gennem adipogenese Chromosome 17 ( bp) PPARγ RXR D6 D4 D3 D2 D1 D0 D6 D4 D3 D2 D1 D Genes:

32 PPARγ og RXR ChIP seq profil gennem adipogenese :5.000bp Day 6 Day 4 RXR Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Day 6 Day 4 PPARγ Day 3 Day 2 Day 1 Nyt site Kendt site Day 0 Perilipin Pex 11a

33 Antal af PPARγ og RXR target sites gennem 3T3 L1 adipogenese Peak detektion med FindPeaks ved FDR < 0.001

34 Placering af PPARγ:RXR bindings sites i forhold til gener Distant 5 Far 5 Near 3 Near 3 Far

35 Mange gener har flere PPARγ:RXR target sites :5.000bp Day 6 Day 4 RXR Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Day 6 Day 4 PPARγ Day 3 Day 2 Day 1 Nyt site Kendt site Day 0 Perilipin Pex 11a

36 Bioinformatisk søgning efter sekvensmotiver afslører DR1 sekvens som det dominerende motiv ved PPARγ:RXR bindings sites DR 1 sekvens 1 C/EBP consensus 15 25bp 8 10bp

37 PPARγ en nøgle transkriptionsfaktor i adipocyt differentieringen Adipogensis C/EBPδ C/EBPβ PPARγ RXR Adipocyte genes C/EBPα

38 Konfirmering af C/EBPβ binding til formodede C/EBP sites gennem fedtcelleudvikling Recovery (%) Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 6 C/EBPβ ChIP på 3T3-L1 cells (D0, D1, D2+D6) No Gene Sox9 PPARγ2 Cav2 mboat5 SCD1 Insig1 Acsl1 Neg. control C/EBP cons. only C/EBP cons. + DR-1

39 Konfirmering af C/EBPα binding til formodede C/EBP sites gennem fedtcelleudvikling Day 0 Day 6 Recovery (%) No Gene Sox9 PPARγ2 Cav2 mboat5 SCD1 Insig1 Acsl1 Neg. control C/EBP cons. only C/EBP cons. + DR-1

40 PPARγ a key regulator of adipocyte differentiation Adipogensis C/EBPδ C/EBPβ PPARγ RXR Adipocyte genes C/EBPα

41 Kvantificering af RNA polymerase aniver transkriptionel aktivitet over et gen Day bp Day 4 Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 PPARγ1 PPARγ2

42 chr.6 Day 6 Day 4 chr.7 Day 6 Day PPARγ RXR Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Day 6 Day 4 Day 3 Day 2 PPARγ RXR Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Day 6 Day 4 Day 3 Day 2 Day 1 Day 1 Day 0 Day 0 Day 6 Day 6 Day 4 Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 RNAPII Day 3 Day 2 Day 1 Day 1 Day 0 Day 0 PPARγ1 PPARγ2 Cebpa

43 Kvantificering af RNA polymerase aniver transkriptionel aktivitet over et gen Tælling af sequence tags over gener (+250 til enden af genet) Day bp Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 DGAT2

44 Regulerede gener kan opdeles i 5 clustre RNAPII sequence tags i annoterede gener I forhold til dag 0 GO analyse: Cell cycle Cytoskeleton Cell Proliferation 1650 signifikant regulerede gener i 5 clustre 556 af disse er i to opregulerede clustre Cell cycle Cytoskeleton Cell Proliferation Cell cycle Ribosome Protein-DNA assembly Translation factor activity RNA processing Genes needed during clonal expansion on Day 0-2 Lipid metabolism Glucose metabolism Mitochondrion Oxidative phosphorylation Lipid metabolism Glucose metabolism Mitochondrion Oxidative phosphorylation 74% (D) and 47% (E) of genes have close by PPARγ:RXR binding sites

45 Gener involveret in glycerolipid syntese hører til cluster D og er associeret med med PPARγ:RXR RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 LPL bp

46 Gener involveret in glycerolipid syntese hører til cluster D og er associeret med med PPARγ:RXR RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Acsl bp

47 Gener involveret in glycerolipid syntese hører til cluster D og er associeret med med PPARγ:RXR RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 1 Day 0 RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 1 Day 0 RXR D6 PPARγ D6 Day 6 Day 4 RNAPII Day 3 Day 2 Day 3 Day 2 Day 3 Day 2 Day 1 Day 0 Gpat3 Agpat2 Lpin1 Dgat2

48 Metaboliske pathways associeret med PPARγ:RXR bindings sites

49 Opsummering Global profil af RXR og PPARγ bindings sites gennem fedtcelleudvikling: >5000 PPARγ:RXR bindings sites i muse fedtceller Mange gener har adskillige PPARγ:RXR bindings sites Mange PPARγ:RXR bindings sites binder også C/EBP proteiner. Global profil af RNA polymerase II gennem fedtcelleudvikling: Angiver transkriptionel aktivitet 1650 signifikant regulerede gener i 5 forskellige clustre 556 af disse findes i to inducerede clustre. >50% af de inducerede gener (især gener involveret i glukose og lipid metabolisme) har PPARγ:RXR bindings sites i nærheden Unikt værktøj til forståelse af PPARγ funktion i fedtceller og virkningsmekanismerne for anti diabetiske farmaka.

50 Acknowledgements Financial support: EU FP6 X TRA NET The Danish Natural Science Research Council The Danish Diabetes Foundation The Lundbeck Foundation

51 Acknowledgements Susanne Mandrup Thomas Å. Pedersen Ronni Nielsen SDU, Odense, Denmark (Coordinator) Hinrich Gronemeyer Marco Mendoza IGBMC, Strasbourg Henk Stunnenberg Dik Hagenbeek NCMLS, Nijmegen, Netherlands Bart Staels Barbara Gross Pasteur Institute Lille Dean Hum Stephane Helleboid John Brozek Genfit, Lille

52

53 Adiponectin fra fedtvævet øger insulinfølsomheden og forbrændingen i lever og muskler Kadowaki et al. (2005) Endocrine Rev. 26,

54 Fedme fører til nedsat adiponectin udtryk Kadowaki et al. (2005) Endocrine Rev. 26,

55 Hvordan bidrager fedme til udviklingen af type II diabetes? Store fedtceller producerer mindre adiponectin end små fedtceller. Store fedtceller er mindre insulin følsomme end end små fedtceller. Dette fører til: Lipolysis Cytokiner Frigivelse af fedtsyrer, cytokiner FFA og cytokiner fra fedtvævet hæmmer insulinsignalering i muskler og fedtvæv. Cytokiner er små hormonlignende proteiner der er involveret i immunresponset.

56 Makrofager rekrutteres til fedtvævet under fedme MCP-1 : macrophage chemoattractant protein 1 Wellen & Hotamisligil 112, , 2003

57 Cross-talk mellem fedtceller og makrofager I fedtvævet Forstadie til fedtcelle Fedtsyrer Fedtcelle IRS TNFα Leptin +? MCP-1 ICAM-1/ PECAM Endotel celle APOPTOSIS Monocyt/makrofag Knoglemarv

58 Hvordan bidrager fedme til udviklingen af type II diabetes? Store fedtceller producerer mindre adiponectin end små fedtceller. Store fedtceller er mindre insulin følsomme end end små fedtceller. Dette fører til: Lipolysis Cytokiner Frigivelse af fedtsyrer, cytokiner Store adipocytter /meget fedtvæv rekrutterer makrofager til fedtvævet cytokiner insulin resistens af fedtceller lipoyse etc.. FFA og cytokiner fra fedtvævet hæmmer insulinsignalering i muskler og fedtvæv.

59 Hvordan øger PPARγ ligander insulinfølsomheden? Adiponectin Effekter på fedtvævet Mindre fedtceller Flere brune fedtceller Højere mitokondriel aktivitet Nedsat cytokin-produktion Øget adiponectin udtryk Øget udtryk af proteiner der indgår i insulinsignalering og glucoseoptag Anti-inflammatorisk Nedsat lipolyse (frigivelse af fedtstoffer fra fedtcellen) Øget optag af fedt fra blodbanen Effekter på muskler Indirekte effekt via fedtvævet: Fedtstoffer optages i fedtvævet nedsat fedtmængde i blodbanen mindre fedt i muskler bedre insulinsignalering i muskler) Øget udtryk af adiponectin i fedtvæv Direkte effekt på insulinfølsomhed (PPARγ i muskler, aktivering af AMPK) Rosen & Spiegelman (2001) JBC 276,

60 PPAR agonists in the treatment of insulin resistance and the cardiovascular disease

61 Insulin resistance is a multifactorial disease Silvia Corvera et al. Genes Dev. 2006; 20:

62 Insulin resistance in muscles leads to vascular hypertriglyceridemia and promotes the development of the metabolic syndrome Inflammation Cardio vascular diseases Petersen et al. (2007) PNAS 104,

63 Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing overview Step 1 ChIP (αpparγ, αrxr, αpol II) Step 3 Step 4 Purified DNA Step 2 Clusters Adapters Laser TAA... Step 5 Image acquisition Base calling Map sequence onto genome