Forberedelse til erhvervspraktikophold i fluelaboratoriet

Transkript

1 Forberedelse til erhvervspraktikophold i fluelaboratoriet Efteråret 2012 Ole Kjærulff 1

2 Om bananfluen Mød den sortmavede elsker! Bananfluen hedder på latin Drosophila melanogaster, med tryk på so og ga (DroSOphila melanogaster). Det betyder direkte oversat den sortmavede elsker af morgendug. På engelsk hedder den fruit fly eller vinegar fly (vinegar = vineddike), da den holder meget af gæret frugt. I det fri findes Drosophila stort set over hele verden. De voksne fluer ser sådan ud: Billede 1. Bananfluen, Drosophila melanogaster Når man skal krydse fluerne med hinanden, må man selvfølgelig kunne kende forskel på de to køn. Det er nemt! Hannerne er mindre, og deres sorte tegning på bagkroppen er mere koncentreret end os hunnerne (det vises tydeligt nederst til venstre på forsiden af dette hæfte). Desuden har hannerne sexkamme på forbenene. Det er områder med tætte sorte hår, der ses som et sort punkt på hvert forben. Bananfluers livscyklus er vist her: Billede 2. Bananfluens livscyklus Som det første lægger hunfluen et befrugtet æg. Det kaldes et embryo. Efter et døgn klækker ægget, og ud kommer en lille fluelarve, en halv millimeter lang. Larven foretager sig stort set kun en ting: den æder! Resultatet er, at den vokser 10 gange i længden, altså til fem millimeter. Den er beskyttet af en robust hud (kutikula). Huden skiftes to gange, og hudskifterne danner overgang 2

3 mellem tre larvestadier, som kaldes instars på engelsk. Efter tredje larvestadium indtræder forpupningen, hvor larven undergår en fuldstændig forvandling (metamorfose). Når den voksne flue kryber ud af puppen, kaldes det eclosion. Afhængig af temperaturen tager udviklingen fra embryo til voksenstadiet ca. 10 dage. Bananfluer har været anvendt i biologisk forskning siden ca. 1910, altså mere end 100 år. Den forsker, der for alvor fik sat det hele i gang, hed Thomas Hunt Morgan. Ham ser du her: Billede 3. Thomas Hunt Morgan Mennesket har også et latinsk navn. Det er Homo sapiens, som betyder Det vidende menneske. Ligesom bananfluer findes vi også over hele kloden. Og ligesom bananfluer holder vi meget af gæret frugt, dog helst på flaske. Celler, proteiner og gener Kroppen er opbygget af celler. De har en cellekerne, hvor arvematerialet findes i form af DNA: Billede 4. Gener og kromosomer Proteiner (æggehvidestoffer, ikke vist på billedet) er kroppens byggesten og styrer også dens kemiske processer. Et protein er opbygget af en lang kæde af forskellige aminosyrer. Proteiner kan 3

4 foldes sammen på mange interessante måder, og de kan gøre et utal af forskellige ting. Et gen er en opskrift på, hvordan cellerne skal lave et bestemt protein. Genet fortæller, i hvilken rækkefølge aminosyrerne skal sættes sammen. Genet er et stykke DNA, der er opbygget af mange nukleotider (se billede). Tre nukleotider danner en codon, som koder (altså angiver opskriften) for en bestemt aminosyre. Samlet koder genet for et helt protein. Generne er fordelt på kromosomer. Kromosomer betyder farvelegemer, fordi de skal farves med bestemte kemiske stoffer for at kunne ses i mikroskopet. Det var Thomas Hunt Morgan og hans medarbejdere, der ved at studere bananfluer opdagede kromosomerne! En bananflue har i alt ca gener. De er fordelt på 4 par kromosomer: Hunner Første kromosom (kønskromosom) Andet kromosom (autosom) Tredie kromosom (autosom) Fjerde kromosom (autosom) X X Hanner X Y Billede 5. Kromosomerne i Drosophila melanogaster Det første kromosom kaldes også X-kromosomet. Det har hunnerne to af, så hunner er XX. Hanner har et X-kromosom og et Y-kromosom, så de er XY. X og Y kaldes kønskromosomer. De andre (andet, tredje og fjerde kromosom) kaldes autosomer. Generne sidder på kromosomerne som perler på en snor (generne er ikke vist på billede 5). Det fjerde kromosom har kun meget få gener og spiller ikke nogen rolle i praksis. Mennesket har ca gener, altså ikke så forfærdeligt mange flere end Drosophila. Vi har til gengæld flere kromosomer, nemlig 46. De er fordelt som 44 autosomer (22 par) og to kønskromosomer, der hedder X og Y ligesom hos Drosophila. Mænd er XY og kvinder XX igen ligesom hos fluerne. Det er vigtigt at have det rigtige antal kromosomer. For eksempel kan man være uheldig at blive født med tre udgaver i stedet for to af kromosom nummer 21 (så man har 47 kromosomer i alt). Så får man en sygdom, der hedder Downs syndrom. Down var navnet på en læge, og syndrom betyder, at man har mange forskellige sygdomsproblemer. Personer med Downs syndrom har for eksempel nedsat intelligens og forandret udseende, deriblandt en øjenfold, der ligner den, der ses hos asiater. Derfor er mongolisme et ældre navn for Downs syndrom. 4

5 Mutationer En ændring i et gen kaldes en mutation. Det betyder forandring. Mutationen kan opstå spontant (af sig selv, altså uden ydre påvirkning) eller på grund af ioniserende ( radioaktiv ) stråling eller cellegifte, der angriber DNA. Da et gen koder for et protein, vil en mutation også kunne ændre proteinet. Nogle gange forårsager mutationen en vrøvlekode, så der slet ikke dannes noget protein. Andre gange forandres proteinets funktion. Det sker som regel på en måde, så proteinet fungerer dårligere end det normale protein. Men i enkelte tilfælde er mutationen gavnlig. I forskningen kan vi bruge mutationer til at forstå virkningen af et protein, f.eks. et tænkt ukendt protein, vi kan kalde Mystin (proteinnavne ender ofte på -in ). Vi kan mutere genet, der koder for Mystin, så Mystin ikke længere dannes. Lad os sige, at vi derefter kan se, at cellerne i vingerne vokser dårligt. Forsøget har lært os, at Mystin-proteinet må have noget at gøre med cellevækst. Det svarer lidt til, at en Marsmand tog mine briller af og så observerede, at jeg gik ind i væggen i stedet for gennem døren. Han har lært, at briller må være noget, der hjælper jordboerne med at se! Som det ses på billede 5, optræder kromosomerne i par. Lad os se nærmere på det andet af de fire kromosompar, som bananfluerne har: vg vg vg Billede 6. Den recessive mutation vestigial Vi starter med venstre side. Øverst ses kromosomparret. De to kromosomer i sådan et par kaldes homologe. Det betyder ensdannede. De indeholder nemlig de samme gener (men i forskellige versioner), og ligner på den måde hinanden. Cirklen i midten af kromosomerne kaldes centromeret. På billede 6 sidder det i midten og deler det enkelte kromosom i en venstre og en højre arm. På den højre arm sidder - blandt mange andre gener - et gen, der kaldes vg. Det er en forkortelse for vestigial, som (lidt forenklet) betyder underudviklet på engelsk. Det navn skyldes, at når vg er muteret på begge kromosomer i parret, udvikles vingerne ikke ordentligt. Det kan du se på fluen til venstre (du kan også se det, hvis du igen ser på billedet af Thomas Hunt Morgan. Bag ham, øverst til højre, er der nemlig en tegning af en flue med de samme små, ynkelige vinger). Fluen i midten på billede 6 har pæne, normale vinger. Den har ganske vist det muterede vg gen på det ene af de to kromosomer, men det andet det homologe - kromosom har en normal version af 5

6 genet, hvilket efter gammel tradition er vist med symbolet. Med et udtryk fra computerverdenen har det nederste kromosom en backup-kopi af det normale gen, der kan erstatte det dårlige, muterede gen på det øverste kromosom. Derfor ser vingerne normale ud på midterfluen. Forskellige versioner af det samme gen kaldes alleler. Midterfluen har to alleler af vg genet, en muteret (vg) og en normal (). Den normale allel kalder man for vildtype-allelen. Det lyder måske pudsigt, men giver god mening. Det er nemlig den version af genet, der er mest almindelig hos dyrene i den vilde natur. De skal jo helst skal have de gode, normale alleler for at klare sig i kampen for overlevelsen! Fluen til højre har vildtype-allelen på begge kromosomer, så den har selvfølgelig normale vinger. På billede 6 kan man altså se, at en flue skal have den muterede version (allel) af vg-genet på begge kromosomer for at få underudviklede vinger (som fluen til venstre). Hvis kun den ene allel er muteret, er vingerne normale (som midterfluen). Man siger, at mutationen vg er recessiv i forhold til vildtype-allelen. Recessiv betyder vigende, fordi effekten af vg pænt må vige for effekten af vildtype-allelen. Vildtype-allelen vinder så at sige over den muterede allel, og kaldes dominant. Der er en anden vigtig ting vist på billede 6. Man siger, at når den samme slags allel sidder på begge de to homologe kromosomer, er fluen homozygot for allelen. Homo betyder ens eller samme (du mødte allerede ordet i udtrykket homolog ). Hvad zygot betyder, er lidt indviklet, så det venter vi med. Fluen til venstre er homozygot for den mutante allel vg. Man siger, at den har genotypen vg/vg. Fluen til højre er homozygot for vildtype-allelen. Dens genotype skriver man /. Hvad så med fluen i midten, der har to forskellige alleler? Jo, den er heterozygot (hetero betyder netop forskellig ), og har genotypen vg/. Når vi beskriver en flues udseende i relation til genotypen, taler vi om dens fænotype. Fænotypen af fluen til venstre i billede 6 (den med genotypen vg/vg) er: underudviklede vinger. Fænotypen af fluerne med genotyperne /vg og / er den samme: normale vinger. Se nu på billede 7. Her har vi igen det andet kromosompar. Men denne gang ser vi på et nyt gen, kaldet. Det er en forkortelse for Curly, som er det engelske ord for krøllet. Billede 7. Den dominante mutation Curly 6

7 Fluen til venstre er normal, da den er homozygot for vildtype-allelen (genotype: /). Læg mærke til vingerne. De er plane (altså flade), hvilket er det normale. Fluen i midten har dels en muteret allel (), dels en vildtype-allel (). Den er altså heterozygot: /. Og se, den har krøllede vinger! De skyldes den muterede allel,. Læg mærke til, at vingerne er krøllede, selv om der er en vildtype-allel på det homologe kromosom. Her hjælper det ikke at have en god backup-kopi - vingerne bliver alligevel krøllede. Her er -allelen altså dominant. Den tvinger vingerne til at blive krøllede, selv om vildtype-allelen også er der. Vildtype-allelen over for er recessiv. Fluerne med krøllede vinger som den i midten af billede 7 har det fint. De er også fertile, hvilket betyder, at de kan få afkom. Men hvad sker der, hvis en flue er homozygot for allelen, og altså har på begge kromosomer (genotype: /)? Ak, det går ikke godt, som vist til højre i billede 7. Man siger, at -allelen er homozygot letal (letal betyder dødelig. At få en dødelig indsprøjtning hedder på engelsk lethal injection ). Arvelighed Billede 8. Ingen kommentarer Fluer kender ikke til prævention, så når de gør som på billede 8, kommer der fluebørn ud af det! 1 Som du kan se, har både hannen og hunnen på billedet krøllede vinger. Ud fra det, vi lærte i billede 7, må de derfor have genotypen / (de kan jo nemlig ikke være /, for så ville deres vinger være normale. Og de kan heller ikke have genotypen /, for så ville de være døde!) Spørgsmålet er nu: Vil alt afkommet fra fluerne i billede 8 få krøllede vinger? For at kunne svare på det, må vi se på, hvordan fluer egentlig laver afkom, genetisk set. 1 Der er den undtagelse, at enten hannen eller hunnen (eller begge) er sterile. Det betyder, at de ikke kan få afkom. 7

8 Lad os starte med hunnen, altså moderfluen. I de fleste celler i hendes krop (kropscellerne) optræder kromosomerne i dobbelt udgave, nemlig som par af homologe kromosomer. Det har jeg allerede vist på billede 5. Men udover kropscellerne findes der en anden type celler i hunnens ovarier (æggestokke). De kaldes kimceller. De danner nemlig kimen til en ny flue. De kaldes også kønsceller, og bliver til ægceller i hunnen. De har kun een udgave af alle kromosomerne. Det skyldes, at kønscellerne dannes ved, at kropscellerne deler sig, så antallet af kromosomer halveres. Denne deling kaldes meiose eller kønscelledeling 2. Lad os se på meiosen i vores krølvingende / hunner. For nemheds skyld viser jeg kun, hvad der sker med det andet af de fire kromosompar: Kønscelle Kropscelle Kønscelle Billede 9. Meiosen (kønscelledelingen) Som du kan se på bilede 9, kan der dannes to slags kønsceller, der pænt deles om de to kromosomer i kropscellen: den ene får kromosomet med, og den anden får kromosomet med. At de to homologe kromosomer i kropscellen på denne måde adskilles ved kønscelledelingen kaldes segregering, og er kendt blandt genetikere som Mendels første lov. Forekomsten af segregering blev nemlig regnet ud af en klog munk i Østrig, der hed Gregor Mendel. Han var tidligt på den og kendte hverken til kønscelledeling eller kromosomer, og for ham var gener kun et abstrakt begreb. Men munke er jo gode til at tro på ting, selv om de ikke kan se dem Vores krølvingede fluer danner mange kønsceller i alt. Hvis man bestemte deres genotype, ville man finde, at antallet af celler med et -kromosom og antallet af celler med et -kromosom ville være det samme (måske med en smule variation), som følge af Mendels første lov. Hannen, altså faderfluen på billede 8, har samme genotype som moderfluen, nemlig /. Han danner derfor genetisk set samme slags kønsceller som på billede 9, enten eller. Hannens 2 Navnet kønscelledeling kan narre dig til at tro, at det er kønscellerne, der deler sig. Men det er altså den deling af kropscellerne, der danner kønscellerne. Der er også en anden slags celledeling som kroppen bruger, når den bare skal lave flere celler. Den hedder mitose. Ved mitose sker der ikke nogen halvering af kromosomantallet. 8

9 kønsceller bliver til sædceller. Dem tegner jeg med blåt i næste billede, så man kan kende dem fra hunnens ægceller (tegnet med sort): Moderfluen Faderfluen Kønscelle 1 Kønscelle 1 Kropscelle Kropscelle Kønscelle 2 Kønscelle 2 Billede 10. Meiosen hos begge køn Når fluerne parrer sig, bliver ægcellerne befrugtede. De betyder, at hver af den smelter sammen med en sædcelle. Det kan her ske på fire forskellige måder: Kønscelle 1 Kønscelle 1 Kønscelle 1 Kønscelle 2 Kønscelle 2 Kønscelle 1 Kønscelle 2 Kønscelle 1 Billede 11. De zygoter, der kan dannes ved befrugtning En fælles betegnelse for sædceller og ægceller er gameter. Når de smelter sammen, dannes en zygote (det ord, jeg lovede at forklare længere oppe i teksten). Zygoten udvikler sig til et embryo og til sidst til en ny voksen flue, som du allerede har set på billede 2. Billede 11 viser alle den slags zygoter, vores krølvingede fluer kan få. Den øverste er homozygot for, altså /. Så kommer der to, der er heterozygote (/), og den sidste er homozygot for vildtype-allelen (/). Hele det indviklede forløb, du har set i billede 9, 10 og 11, kaldes for kønnet formering, fordi der indgår to køn, hvis afkom dannes ved sammensmeltning af gameter. 9

10 Læg mærke til, at mens begge forældre kun havde en og samme genotype, nemlig /, kan deres forkælede unger få hele tre forskellige genotyper, nemlig /, / og / (her ser vi lige bort fra, at / vil dø, som vi så i billede 7). Og mens forældrene kun har een fænotype (krøllede vinger), så kan deres deres afkom få en af to forskellige fænotyper: enten flade vinger eller krøllede vinger. Det er en fordel for fluer (og for alle andre dyr og planter), at deres afkom bliver så forskelligartet som muligt. Så er der en bedre chance for, at de overlever som art, hvis det miljø, de lever i, skulle ændre sig. Der vil nemlig være mulighed for, at i det mindste nogle af de mange forskellige fænotyper hos afkommet er tilpasset det nye miljø. Det svarer til, at du bliver inviteret til en temafest, men ikke ved på forhånd, hvad temaet bliver. Derfor køber og medbringer du både en fin kjole, slidte cowboybukser (med tilhørende guitar og tjaldpipe) og en indisk sari. Så er du forberedt på temaet Prinsessebal På Slottet, men også på De Fede Tressere og Fjernøstens Mystik. Ulempen er, at du må bruge en masse penge. Det svarer til, at fluerne skal bruge en masse energi og kræfter på den indviklede kønnede formering (og de kan ikke plage om hjælp hos deres forældre, som visse andre). Transgener En af de gode ting ved at arbejde med bananfluer er, at man let kan sætte nye gener ind i dem. Sådanne gener, der kommer udefra, kaldes transgener. Trans betyder på den anden side og det hentyder til, at transgenet ikke stammer fra fluens eget DNA, men er et fremmed gen. Man sætter et transgen ind i Drosophila ved at sprøjte et plasmid ind i et embryo. Plasmidet er cirkelformet DNA, der indeholder transgenet. Ved hjælp af en særlig teknik kan man få transgenet til at hoppe ind i et af fluens kromosomer, som det så bliver siddende på - sammen med fluens egne gener. Og transgenet nedarves til næste generation som ethvert andet respektabelt gen. Et transgen, som vi Drosophila-forskere meget gerne bruger, hedder UAS-GFP. Den sidste del af navnet, altså GFP, står for Green Fluorescent Protein. Det er det engelske navn for det protein, som UAS-GFP genet koder for. GFP er et meget smukt protein, som du kan se på billede 12. Det har en tøndeformet struktur og består mest af, hvad biokemikerne på engelsk kalder beta strands. Det er de flade pile, som danner væggen af tønden. Billede 12. Green fluorescent protein, forkortet GFP 10

11 GFP har den meget nyttige egenskab, at det kan udsende grønt lys, når man lyser på det med ultraviolet eller blåt lys. Det er denne evne, fluorescens, som har givet proteinet navn. Fluorescens kan også ses hos andre stoffer, f.eks. visse mineraler. Men mineraler er jo faktisk sten, og dem kan man ikke sådan uden videre anbringe inde i bananfluerne. Det geniale er, at GFP er et protein. Og opskriften på proteiner kan vi som nævnt ovenfor sætte ind i fluerne i form af et transgen. GFP er ugiftigt, så man kan se på det i levende fluer. GFP stammer oprindeligt fra et havdyr, en gople (vandmand) ved navn Aequorea victoria. Den ser du her. Smuk, ikke sandt? Billede 13. Aequorea victoria UAS/GAL4-systemet Nu skal vi bestemme, hvor i fluerne, vi gerne vil have GFP til at gløde. For at forklare hvordan det gøres, skal vi have fat i den første del af navnet UAS-GFP, altså UAS. Det står igen på engelsk - for Upstream Activating Sequence. Det vigtigste er activating. UAS er et stykke DNA, som er placeret foran opskriften på GFP-proteinet. Det, der skal aktiveres eller sættes i gang, er produktionen af GFP ud fra denne opskrift. Du kan opfatte UAS som en knap, der skal trykkes på for at tænde for GFP-genet, så vi får lavet GFP-protein. Man siger i øvrigt, at et gen bliver udtrykt eller undergår ekspression, når genet bliver tændt, så det protein, det koder for, bliver produceret. Fingeren, der trykker på UAS-knappen, er et andet protein, der hedder GAL4. Det virker ved at binde sig til UAS-sekvensen. Årsagen til navnet GAL4 er indviklet, så den vil jeg ikke forklare nu. Men jeg kan dog fortælle, at både UAS- og GAL4-komponenterne oprindeligt stammer fra gærceller, altså en hel anden art end Drosophila. Sammen kalder vi dem for UAS/GAL4-systemet. 11

12 Hvorfra kommer så den GAL4, der skal tænde for UAS-GFP-genet? Jo, GAL4 er jo et protein, så der findes selvfølgelig et gen, der koder for det. Men i modsætning til UAS-GFP-genet skal GAL4- genet ikke tændes; det starter ekspressionen af sig selv 3. Og nu kommer en af fiduserne ved at bruge Drosophila til at studere biologi. Der findes nemlig en hel masse forskellige fluelinier 4, som hver især udtrykker GAL4-genet (og altså laver GAL4-protein) i bestemte celler eller kropsvæv. Vi kalder dem GAL4-linier. F.eks. laver fluerne fra en af linierne GAL4 i alle nervecellerne (men ikke andre steder). Dem fra en anden linie laver GFP i nogle bestemte muskelceller, dem fra en tredje GFP i vingerne, osv. Vi kan derfor få tændt for produktionen af GFP enten i nervecellerne, eller i muskelcellerne, eller i vingerne, eller Jeg vil nu forklare UAS/GAL-systemet endnu grundigere, med et virkeligt eksempel. Min plan er, at du skal lave forsøg med en bestemt slags celler, der hedder gliaceller. Glia betyder lim på græsk. Gliacellerne beskytter nervecellerne og hjælper dem med at udføre deres funktion. Der findes en særlig type gliaceller, der laver et protein kaldet Gliotactin. Gliotactin er med til at danne blod-hjerne-barrieren, som beskytter fluehjernen mod giftige stoffer i kropsvæsken. Mennesket har også en blod-hjerne barriere (forkortet BBB). Den kommer i stand ved, at de små blodkar i nervesystemet danner en meget tæt væg, som er svær at trænge igennem. BBB forhindrer giftige stoffer eller farlige mikroorganismer i at bevæge sig fra blodet over i hjernen. Men den gør det desværre også vanskeligt at få medicin, der skal virke i hjernen, overført fra blodet. Vi har i laboratoriet en fluelinie, som flittigt laver GAL4 i Gliotactin-cellerne. Denne linie er opkaldt efter det gen, der er ansvarligt for GAL4-produktionen. Det sidder på det andet af de fire kromosompar (ligesom vg og, men et andet sted på kromosomet 5 ). Genet hedder Gliotactin- GAL4, forkortet, og er et transgen. Det er vigtigt at forstå, at selv om findes på andet kromosom i alle cellerne hos disse fluer, bliver det kun aktiveret (udtrykt) i Gliotactincellerne. Hvorfor det er sådan, vil jeg vente med at forklare, til du kommer i laboratoriet. Det fænomen, at et gen kan udtrykkes i forskellig grad i forskellige celletyper, er meget vigtigt, også i mennesket. Det er for eksempel grunden til, at nerveceller er helt anderledes opbygget end muskelceller. Selv om de to celletyper faktisk begge er udstyret med alle de gener, som bananfluen (eller mennesket) har, bliver de enkelte gener aktiveret i forskellig grad. Dermed kommer cellerne også til at adskille sig med hensyn til hvilken slags proteiner de laver mest af, og det er egentlig det, der gør dem forskellige. Det svarer til, at Albert Einstein og Arnold Schwarzenegger har nøjagtigt den samme kogebog stående i køkkenet. Men mens Albert holder sig til opskrifter på komplicerede desserter, bruger Arnold kun opskrifterne på saftige hvalbøffer og wienerschnitzel. 3 Dette er ikke helt rigtigt, men ellers bliver det hele for indviklet at forklare. 4 En linie er betegnelsen for fluer, der er beslægtede og har den samme genotype. 5 Det sted på kromosomet, hvor et gen sidder, kaldes dette gens locus. Flertalsformen er loci. 12

13 Oplysningstid Hvis du krydser -fluerne med de fluer, der har UAS-GFP-genet, kan du få Gliotactincellerne til at lyse grønt! Lad os se på genetikken bag denne tryllekunst. P UAS-GFP X F1 UAS-GFP Her sker ikke noget særligt. Gå hellere over på den anden side.. Larver med GFP! Billede 14. De lysende larvers kryds Øverst ser du, at vi parrer eller krydser en han (til venstre), der er heterozygot for og UAS- GFP (genotype: /UAS-GFP) med en hun (til højre), der er homozygot for (genotype: /). Ifølge Mendels første lov modtager hannens kønsceller ENTEN kromosomet med, ELLER det homologe kromosom med UAS-GFP. Det må vi lige gemme i hukommelsen, for kønscellerne er jo ikke vist på billedet. Også ifølge Mendels første lov får hunnens kønsceller ENTEN kromosomet med Gli-Gal4, ELLER det med..øh, hov! Det homologe kromosom i hunnen har jo også. Hunnen kan altså kun danne een slags kønsceller. Men det gør faktisk kun det hele lidt simplere. Hvilket afkom kommer der nu ud af det hele? 13

14 Jo, for det første kan vi få afkom (både hanner og hunner), der har fra faderen og Gli-Gal4 fra moderen. Det er vist i midten til venstre. De fluer er ærlig talt lidt kedelige. De har ganske vist Gli- Gal4, der kan tænde for UAS-GFP, men hvad nytter det, når UAS-GFP mangler? Sort uheld For det andet kan vi få afkom, der både har UAS-GFP fra faderen og Gli-Gal4 fra moderen (i midten til højre). De fluebørn er der mere musik i! De har jo begge de magiske ingredienser både nitro (Gli-Gal4) og glycerin (UAS-GFP): GAL4-proteinet bliver lavet i Gliotactin-cellerne, hvor det tænder for GFP-genet. BUM! Gliotactin-cellerne lyser grønt! Det kræver et kraftigt mikroskop at se de lysende celler, men man kan snyde lidt. Når sandheden skal frem, bliver Gliotactin-GAL4 nemlig ikke kun produceret i Gliotactin-cellerne. Der bliver faktisk også lavet noget i spytkirtlerne. Derfor udtrykkes UAS-GFP også i spytkirtlerne, og det kan man nemt se, selv i et svagere mikroskop. Du kan foreløbigt se det nederst til højre, hvor tre fluelarver med flotte grønne spytkirtler har poseret for fotografen. Det er endnu smukkere i virkeligheden! Nu er du forresten ved at blive så dygtig, at vi kan begynde at skrive som rigtige genetikere. Derfor har jeg i øverste linie til venstre skrevet P. Det står for parental, som er forældre-generationen. Ud for næste linie står der F1. Det står for første filial, den første generation af afkom 6. Overkrydsning Jeg omtalte tidligere, at det er en fordel for enhver dyreart at kunne få så varieret afkom som muligt. Naturen har udviklet en sindrig mekanisme, der tjener dette formål. Den hedder overkrydsning. Den er ret vanskelig at forklare og forstå, så jeg har gemt den til sidst. Vi skal se på meiosen kønscelledelingen igen. Nu skal vi følge to gener på samme kromosompar. Og så er det tid til at indrømme, at meiosen faktisk er endnu mere kompliceret, end jeg har vist på billede 9 og 10. For eksempel er der i virkeligheden to kønscelledelinger, ikke kun en. Det undlod jeg at nævne i første omgang for at gøre det lettere for dig. Men nu kommer hele historien. Hold på hat og briller! Billede 15 viser de første faser af kønscelledelingen, sådan som den virkelig foregår. En ny ting er, at hvert af kromosomerne som det første danner en helt nøjagtig kopi af sig selv. Man siger, at de replikeres. Resultatet ses i tegningen øverst til højre. De to helt ens kopier af et replikeret kromosom kaldes søsterkromatider. Som det næste lægger de to homologe kromosomer sig tæt op ad hinanden. Og nu sker det forunderlige: To af kromatiderne, et fra hvert af de to kromosomer, udveksler stykker af sig selv med hinanden. De bytter altså DNA, med gener og det hele. Stykkerne kommer fra det samme område af de to kromosomer. Det svarer til, at dine forældre byttede næsen eller det højre ben med hinanden (eller næsen OG det højre ben kromosomerne kan nemlig godt udveksle mere end et stykke DNA). Resultatet: nye spændende forældre 7. Og for kromosomernes vedkommende: nye spændende kombinationer af gener. På billede 15 (nederst til venstre) kan du se, 6 Afkommet af afkommet, altså børnebørn til P-generationen, skrives F2, men det behøver vi ikke her. 7 Vi er nok enige om, at det ville være mest synd for din mor. 14

15 hvor overkrydsningen sker - det er markeret med et rødt X. Og den sidste tegning viser resultatet: to af kromatiderne er uændrede (helt sort eller helt hvid), og to er nye (både sort og hvid). De uændrede kromatider kaldes parentale, da de ligner dem forælderen (moderen) havde. De to nye kromatider kaldes rekombinante. At rekombinere betyder, at man sætter noget sammen på en ny måde. Og det er jo præcist, hvad der er sket med dem. Men hvorfor er det nu så interessant? Jo, fordi overkrydsning kan vende alvorligt op og ned på generne, som vi skal se på om lidt. Men lad mig lige gøre meiosen færdig først: På billede 16 fortsætter vi, hvor vi slap i billede 15. Kropscellen med de to kromosomer bestående af fire kromatider deler sig nu i to kønsceller, som ifølge Mendels første lov hver modtager et af de to homologe kromosomer. Det har jeg vist før på en mere enkel tegning (billede 9). Der kaldte vi det bare for meiosen, men det helt rigtige navn er den første meiotiske deling. Den anden meiotiske deling består i, at kønscellerne deler sig en gang til. Den er også vist på billede 16. Denne gang er det de to kromatider, der går hver til sit. Når det er sket, kalder man dem kromosomer igen. Som resultat har vi nu i alt fire kønsceller eller gameter, hver med indhold af et af de to homologe kromosomer. Og på grund af overkrydsningen er de genetisk forskellige fra hinanden vi har altså opnået god genetisk variation! I Drosophila er det kun hos hunner, der sker overkrydsning. Hos mennesket er der også overkrydsning, og her forekommer det hos begge køn, både damer og mænd. UAS-GFP UAS-GFP UAS-GFP Replikation af kromosomerne med dannelse af søsterkromatider UAS-GFP UAS-GFP UAS-GFP Overkrydsning mellem to af kromatiderne, et fra hvert kromosom Resultatet af overkrydsningen: en ny sammensætning af generne på to af de fire kromatider Billede 15. Replikation og overkrydsning 15

16 Første meiotiske deling UAS-GFP UAS-GFP Anden meiotiske deling UAS-GFP Efter befrugtning UAS-GFP Billede 16. Første og anden meiotiske deling, og befrugtning af kønscellerne Lad os nu sige, at vi krydser vores hun med en han, der på sit andet kromosom (altså kromosom nr. 2 af de i alt fire) hverken har Gli-Gal4 eller UAS-GFP. Så får vi de fire zygoter, der er vist nederst i billede 16. Kromosomet fra hannen er tegnet blåt. På billede 15 og 16 har jeg indtegnet to gamle kendinge på kromosomerne, nemlig generne Gli- Gal4 og UAS-GFP. Læg mærke til, at den moderflue, som vi startede med, havde Gli-Gal4 på det ene kromosom og UAS-GFP på det andet (øverst til venstre på billede 15). De to gener er altså adskilte. Det gælder også hos zygote nr. 1 og 4 (billede 16, nederst), der i øvrigt kun har fået et af de to kromosomer, enten det med Gli-Gal4 eller det med UAS-GFP. Zygote nr. 2 er rigtigt blevet snydt. Den mangler begge generne. Zygote 3 er derimod anderledes heldig! Den har modtaget begge generne, og oven i købet samlet på det samme kromosom. Når den udvikler sig til en larve og senere til en voksen flue, vil den lyse grønt i spytkirtlerne og Gliotactin-cellerne, alt sammen takket være generne fra moderen (Gud velsigne det gamle liv!). Derfor er denne zygote farvet grøn på tegningen. 16

17 Overkrydsning som velsignelse Vi Drosophila-nørder har ofte brug for at undersøge hvad der sker, når forskellige mutationer og transgener optræder i den samme flue. Vi konstruerer sådanne samspilsramte fluer ved hjælp af genetiske krydsninger, der kan være ret indviklede og gå igennem mange generationer. Her kan overkrydsningen være til stor gavn. Vi kan nemlig udnytte den til først at rekombinere to gener hen på det samme kromosom, ligesom i billede 15 og 16. Så kan vi bagefter meget nemmere føre flere gener ad gangen ned gennem generationerne. Det svarer til at samle alt servicet på en bakke, før man bærer det ud i køkkenet man slipper for at gå flere gange 8. Overkrydsning som forbandelse Overkrydsningen og den dertil knyttede rekombination kan også være irriterende. Næppe har vi fejret, at det er lykkedes at samle Gli-Gal4 og UAS-GFP på samme kromosom, før det med gru går op for os, at overkrydsningen også kan adskille de to gener igen. Det kan jo ske, hvis zygote nr. 3 fra før er en hun (husk, at der ikke sker overkrydsning i hanfluerne). Som man sagde i gamle dage: Herren gav, og Herren tog. Balancer-kromosomer Der findes heldigvis en effektiv måde at løse problemet med uønsket overkrydsning på. Vi kan nemlig bruge et særligt kromosom, som kaldes et balancer-kromosom eller bare en balancer. Det er et kromosom med mange inversioner. En inversion (en omvendthed ) er et stykke af et kromosom, der er skåret ud og vendt om, så generne kommer i modsat rækkefølge end normalt. Inversioner kan man lave ved hjælp af gamma-stråling (som netop er farlig, fordi den kan lave om på kromosomerne). Her er et kromosom med tre inversioner: B a n a n F l u e B a l l e t B a n a n F l u e B a l l e t ( ) ( ) ( ) n a B a n F e u l B a l t e l Billede 17. Kromosom udsat for tre inversioner På kromosomet er der indtegnet 15 tænkte gener. Deres normale rækkefølge er vist øverst. Læg mærke til, hvordan rækkefølgen ændres dramatisk efter de tre inversioner 9. 8 Det ved du selvfølgelig alt om. Det gør du jo hver dag derhjemme 9 På tegningen er der gener på forskellige loci med samme navn. Sådan er det normalt ikke i virkeligheden. 17

18 De mange inversioner på balanceren blokerer for overkrydsningen. Derfor bliver det homologe kromosom med de to fine gener Gli-Gal4 og UAS-GFP ikke brudt i stykker, men forbliver uændret: Kun replikation Overkrydsning BLOKERET Første meiotiske deling Anden meiotiske deling Billede 18. Blokade af overkrydsning ved hjælp af balancer-kromosom På billede 18 kan man se, at kromosomet nedarvet fra moderen ligner sig selv, og derfor stadig har både Gli-Gal4 og UAS-GFP, som vi gerne ville have. Balanceren (tegnet med rødt) er også uændret. Lad os nu sige, at kønscellerne i billede 18 bliver befrugtet og vokser op, og at vi gerne ville arbejde videre med de fluer, der har kromosomet med både Gli-Gal4 og UAS-GFP. Hvordan kan vi egentlig kende dem fra deres søskende uden Gli-Gal4 og UAS-GFP? Jo, vi kigger da bare efter i mikroskopet, om de gløder grønt. Denne form for direkte udvælgelse kaldes positiv selektion. Den er vist i venstre halvdel af billede 19. Men tænk, hvis mikroskopet er gået i stykker. Panik! Hvad gør vi nu? Jo, vi kommer i tanker om, at vi tilfældigvis har brugt en balancer med -mutationen på. Det er med på billede 18 og 19. De zygoter, der efter befrugtning kommer ud af kønscelle 3 og 4, og som ikke har fået det gode 18

19 kromosom med Gli-Gal4 og UAS-GFP, må have fået balanceren. Og har de fået balanceren, har de også fået -allelen. Og har de fået den, kan vi kende dem på de krøllede vinger 10. Altså: hvis vi holder fingrene fra krølvingerne, og kun tager fluer med flade vinger, ved vi, at vi har fået det rigtige kromosom, selv om vi skulle være forhindret i at se GFP-signalet. Denne form for indirekte udvælgelse kaldes negativ selektion, og er vist på højre halvdel af billede 19. Den bruges meget flittigt i Drosophila-laboratorier verden over. Larver uden GFP Billede 19. Positiv og negativ selektion Der er en sidste snedig ting ved balancer-kromosomer. Det er, at de kan bruges til at forhindre, at man mister en spændende og lærerig mutation gennem naturlig udvælgelse. Lyder det som sort snak? Så få hele forklaringen, når vi ses i laboratoriet! Overkrydsning som målebånd Hvis to gener eller transgener er placeret på det samme kromosom, kan man bruge overkrydsning til at bestemme, hvor tæt de sidder på hinanden. Sidder de langt fra hinanden, er der stor chance for, at der sker overkrydsning imellem dem (når afstanden er stor, er det jo på en måde nemmere at komme imellem med det røde kryds, jeg viste på billede 15). Så kommer der næsten lige så mange gameter med rekombinante kromosomer som med parentale. 10 Man bruger det udtryk, at er en dominant markør for balancer-kromosomet. 19

20 Sidder de to gener derimod tæt på hinanden, er chancen lille for at få overkrydsning. Så kommer der kun få rekombinante gameter i forhold til de parentale. Man siger, at de to gener er genetisk koblede ( linked på engelsk). Det er som at spise en af din mors rosinboller. Hun er jo måske lidt sparsommelig, så der ikke er så mange rosiner. Tager man en stor bid (langt mellem generne), er der dog nok en rosin (overkrydsning) med, eller måske ligefrem flere. Tager man en lille bid (generne tæt på hinanden), er der derimod kun en lille chance for overhovedet at få en rosin (overkrydsning). Her slutter denne lille indføring i bananflue-genetik. Teori er godt, men der skal ikke være alt for meget af det, før man prøver i praksis. På gensyn i laboratoriet! 20