U n d e r s ø g e l s e a f F o l a t - a n a l y s e m å l t p å A u t o D e l f i a o g A r c h i t e c t i 2 0 0 0 SR

U n d e r s ø g e l s e a f F o l a t - a n a l y s e m å l t p å A u t o D e l f i a o g A r c h i t e c t i 2 0 0 0 SR a. ) E r c s - F o l a t e r o g P - F o l a t m å l t p å A u t o D e l f i a b. ) P - F o l a t m å l t p å A u t o D e l f i a o g A r c h i t e c t i 2 0 0 0 SR c. ) S a m m e n l i g n i n g a f B i o R a d s o g A b o t t s k o n t r o l l e r d. ) H o l d b a r h e d s f o r s ø g a f P - F o l a t Profesionsbachelorprojekt 2009 Bioanalytikeruddannelsen København, Metropolitan University College Klinisk Biokemisk Afdeling, Frederiksberg Hospital Udarbejdet af: Maureen Joy Inventor Hansen, 1.september 1985 Projektperiode: 6.april 2009 til 9.juni 2009 Hovedvejleder: Bivejleder: Susanne Wahl Anette Glibstrup

Forord Dette bachelorprojekt er udført i perioden 6. April 2009 til 9. Juni 2009 i samarbejde med Klinisk Biokemisk Afdeling, Frederiksberg Hospital. Først og fremmest ønsker jeg at takke mine vejledere, Susanne Wahl og Anette Glibstrup, for deres vejledning og støtte gennem hele bachelorprocessen. Det har været en fornøjelse at have jer som vejledere. En stor tak til Susan Nørrekjær, Birgit Borggaard, og alle fra Klinisk Biokemisk Afdeling, Frederiksberg Hospital som har været yderst behjælpelig med de praktiske gennemførsel af forsøget. En særlig tak til en rigtig god veninde og labpartner, Aasma Jabeen Khan. Tak for støtten, og tak for al hjælp til udarbejdelse af den praktiske del af projektet. Tak til venner og familien for deres støtte og hjælp gennem hele uddannelsesproces. MAUREEN JOY INVENTOR HANSEN

Resumé Problembaggrund På klinisk biokemisk afdeling Frederiksberg Hospital analyseres folat på fuldblod, og der ønskers at overføre folatanalysen som folat i plasma. Først undersøges der om evt. sammenhæng mellem folat på fuldlod og plasma malt på aparattet AutoDelfia. Bagefter sammenlignes apparaterne AutoDelfia og Architect i2000 SR plasmafolat analyseresultater. Architect i2000 SR præcision ønskers også at undersøges. Der undersøges hvilket kontrolsæt, Abotts eller BioRads, er bedst egnet til plasma folate analysen mht analysekvaliteten som afdelingen kræver. Til sidst undersøges holdbarheden af plasma folate i 24 under 2 forskellige temperatur forhold: plasma prøver opbevaret på køl og plasma prøver opbevaret ved stuetemperatur. Metoder Til sammenligning af folat på fuldblod og plasma blev der udtaget 50 prøver, hvor fuldblod folat allerede er analyseret. Folat plasma blev herefter analyseret på AutoDelfia, og Architect i2000 SR. Kontroller fra Abott og BioRad blev analyseret hverdage i 20 dage på apparatet Architect i2000 SR. Kontrol low og kontrol high fra Abotts blev målt 10 gange efter hinanden som udtrykker Architect i2000 SR impræcision. Til holdbarhedsforsøg blev der udtaget 2 blodprøver taget i litium heparin gelglas fra 28 patienter. Plasma folat resultater fra første anses til at være sande værdi. Der måles plasma folat efter 24 timer på prøver som blev opbevaret på køl og ved stuetemperatur. Resultater Der er fundet en lineær sammenhæng mellem folat målt på fuldblod og folat i plasma i apparatet AutoDelfia som beskrives af ligning y = 20,42 x + 397,21. Plasma folat målt på AutoDelfia og Architect i2000 SR viser en signifikant forskel, hvoraf AutoDelfia plasma folatresultater er forhøjet i forhold til Architect i2000 SR. Kontroller fra Abott og BioRads har en CV% som lever op til afdelingens kontrolanalysekvalitets krav. Holdbarheden af plasma folat påviser ingen signifikant forskel, hvis dette er opbevaret i 24 timer enten på køl eller ved stuetemperatur. Konklusion Ud fra resultater af folat på fuldblod og plasma målt på AutoDelfia, kan jeg konkludere, at der er en sammenhæng mellem de to komponenter. Resultater fra metodesammenligning påviser en signifikant forskel mellem Architect i2000 SR og AutoDelfias plasma folatresultater. Ud fra resultater af inter- og intraseriel præcision, kan jeg konkludere, at plasma folat målt Architect i2000 SR kan erstatte folat på fuldblod. Da kontroller fra Abott og BioRads er lige god, tager der hensyn til de praktiske fordele, og hermed kan jeg konkludere at Abotts kontroller bruges i stedet for BioRads. Ud fra holdbarhedsforsøg resultater kan jeg konkludere, at opbevarings temperatur ikke påvirker plasma folate analyseresultater.

Indholdsfortegnelse 1.0 Introduktion... 1 1.1 Baggrund... 1 1.2 Problemformulering:... 2 1.3 Målformulering:... 2 1.4 Hypoteser... 3 1.5 Teori... 3 1.5.1 Folat... 3 1.5.2 Antigen-Antistof... 6 1.6 Analyseprincipper... 6 1.6.1 AutoDELFIA analyseprincip... 6 1.6.2 Architect i2000 SR analyseprincip... 8 1.7 Metodevalg... 10 1.7.1 Metodesammenligning... 10 1.7.2 Kontroller... 11 1.7.3 Holdbarhedsforsøg... 12 2.0 Materialer... 12 2.1 Metodesammenligning... 12 2.2 Holdbarhedsforsøg... 12 2.3 BioRads kontroller... 12 2.4 Apparatur... 13 2.4.1 AutoDELFIA... 13 2.4.2 Architect i2000 SR... 14 3.0 Metode... 15 3.1 Forsøgsbeskrivelse... 15 3.2 Prøveindsamling/Prøvebehandling... 16 3.2.1 Metodesammenligning... 16 3.2.2 Holdbarhedsforsøg... 16 5.0 Resultater... 18 5.1 Ercs-Folat og P-Folat målt i AutoDelfia... 18 5.2 Metodesammenligning af P-Folat på hhv, AutoDelfia og Architecti2000 SR... 19 5.3 Kontrol resultater... 20 6.0 Diskussion... 24 6.1 AutoDelfia måling af Ercs-Folater og P-Folat... 24 6.2 P-Folat analyseret på AutoDelfia og Architect i2000 SR... 29 6.2.1 Architecti2000 SR præcision... 32 6.3 Kvalitetssikring... 33 6.4 Holdbarhedsforsøg... 35 7.0 Konklusion... 38 8.0 Perspektivering... 39 Litteraturliste... 39

1.0 Introduktion 1.1 Baggrund På Klinisk Biokemisk afdeling, Frederiksberg Hospital(KBA) analyseres folat på fuldblod (Ercs-Folater) ved brug af apparatet AutoDelfia fra PerkinElmer. Ercs-Folater analyseres 4 gange om ugen på KBA. Før der kan fortages en analyse af Ercs-Folater, er der et stort forarbejde, da erythrocytterne først skal klargøres til hæmolysering og herefter henstå til næste dag. D.v.s. at forbehandlingen til analysering i alt tager 2 dage at udføre. I.h.t. forskrifterne fra PerkinElmer kan analysen af folat også udføres på plasma som P-Folat på AutoDelfia, denne metode tager kun få timer at udføre(10).ud fra dette undrer jeg mig over, hvorfor man på KBA ikke udfører analysen P-Folat i stedet for Ercs-Folater på AutoDelfia. Jeg vil derfor undersøge om analysen af P-Folat kan erstatte Ercs-Folater, således at der kan spares tid. I mit 6.semester på KBA, har jeg arbejdet med Architect i2000 SR fra Abott, hvor der bl.a. analyseres for ferritin og B12 i forbindelse med anæmi-udredning. Til anæmi udredning på KBA, tages der 2 ekstra lilla EDTA-glas til AutoDelfia til Ercs-Folat analyse, og et ekstra LH-glas til B12 og ferritin til Architect. anæmi udredning. Architect i2000 SR er et apparatur fra Abott, som har den fordel hvis folat analysen bliver overført, at alle analyser til anæmi udredning bliver analyseret i et apparat, og at der kun anvendes ét glas grønt Lithiumheparin (LH-glas) til anæmi udredning. Jeg er dog i tvivl om resultaterne af de to metoder, P-Folat målt hhv. AutoDelfia og Architect i2000 SR er lige pålidelige, og jeg vil derfor udføre en parallel-analyse af P-Folat på henholdsvis AutoDelfia og Architect i2000 SR. Jeg er blevet opmærksom på at der på KBA analyseres prøver for bla. Ercs-folate, ferritin og B12 dels fra ambulatoriet og sengeafdelingen, og dels fra nærområdets praktiserende læger, hvilket medfører at prøverne skal transporteres, enten med bud eller med PostDanmark. Jf. Vejledningen fra Abott, til P-Folat analysering, skal plasmaet afpipetteres straks efter blodprøvetagning, og herefter kan prøven henstå op til 24 timer ved 2 8 C, hvis analysen ikke foretages omgående. Jeg vil derfor undersøge om prøverne tager skade af at blive opbevaret ved stuetemperatur under forsendelsen. Til denne undersøgelse vil jeg analysere holdbarheden af P-Folat på Architect i2000 SR henholdsvis ved en opbevaring på stuetemperatur i ét døgn og henholdsvis ved opbevaring 1

ved 2 8 C i henhold til vejledningen fra Abott. Med det formål at registrere om resultaterne udviser en signifikant forskel. Til analysen P-Folat på Architect i2000 SR bliver kontroller fremstillet og leveret fra firmaet, Abott. Afdeling ønskes at afprøve P-Folat kontroller Lypocheck, fra firmaet BioRad, da der i forvejen nogle analyse f.eks B12 og ferritin, hvor BioRads kontroller bliver brugt. Der undersøges om BioRads kontroller kan erstatte Abotts kontroller. 1.2 Problemformulering: Hvilken betydning har det for folat analyseresultater, hvis P-Folat erstatter Ercs-Folater målt på AutoDelfia og hvilken korrelation er der mellem analyseresultater? Er der en signifikant forskel mellem P-Folat analyseresulater målt på hhv. Architecti2000 SR og Autodelfia? Hvilken betydning kan det have for kvalitetssikring af P-Folat analysen på Architect hvis der i stedet for Abotts kontroller anvendes BioRads kontroller? Hvilken betydning har det for analyseresultaterne af P-Folat målt på Architect i2000 SR, hvis prøvematerialet taget i LH-gelglas opbevares i køleskabet og ved stuetemperatur i 24 timer? 1.3 Målformulering: Formålet med bachelorprojektet er: at undersøge om der er en korrelation mellem resultater af Ercs-Folat og P-Folat som påvises ved hjælp af statistiske metoder. at undersøge om der opnås ens resultater til måling af P-folat analyseret på hhv. AutoDelfia og Architect i2000 SR ved hjælp af regressionsanalyse. at undersøge præcision og akkuratesse af apparatet Architect i2000 SR i forhold til Abbotts anbefaling og afdelingens krav. At undersøge om BioRads kontroller kan anvendes i stedet for Abotts kontroller på Architect i2000 SR at undersøge om P-Folats resultater målt på Architect i2000 SR påvirkes af præanalytisk forhold som opbevaring af prøvematerialet i 24 timer ved køl og ved stuetemperatur 2

1.4 Hypoteser Til metode sammenligning forventer jeg, at: 1.) Der er en korrelation på Ercs-Folat og P-Folat målt på AutoDelfia. 2.) Der er ingen signifikant forskel på P-Folat koncentrationen målt på Architect i2000 SR sammenholdt med P-Folat koncentrationen målt på AutoDELFIA. Kontroller: 1.) BioRads kontroller sagtens kan erstatte Abotts kontroller, hvor der tages hensyn til kontrol kvaliteten. Til holdbarhedsforsøg forventer jeg, at: 1.) Der er ingen signifikant forskel på P-Folats måleresultaters middelværdier målt efter 24 timer på køl. 2.) Der er en signifikant forskel på P-Folats måleresultaters middelværdier målt efter 24 timer ved stuetemperatur. P-Folat resultaters middelværdi bliver lavere i forhold til den sande værdi. 1.5 Teori 1.5.1 Folat Folat er et vandopløseligt vitamin, som hører under B-vitamingruppen. Folat findes i to former: Folat, som er den naturlige forekommende form og folinsyre eller pteroylglutamic acid som den syntetiske form af folat(19). Folat findes bl.a. i grøntsager, frugter, bønner og korn som alle er gode folatkilder. Folinsyre findes i berigede fødevarer og i kosttilskud (1,6,8). Folat findes også i kød, men ødelægges ved høje temperaturer f.eks. ved kogning eller stegning. Det er påvist at mængden af folat i maden er afhængig af hvordan man tilbereder maden (9). Folats opbygning Folinsyre er opbygget af 3 dele: enpteridine ring, 6-methylpterin; P-aminobenzosyre; og Glutaminsyre(1,6,7). 6-methylpterin er bundet til P-aminobenzosyre via en methylene-bro, og P-aminobenzosyre er bundet til glutaminsyre via en peptid til alfa-delen af glutamat. Folat og folinsyre fælles har som fællestræk en pteridine-ring samt stoffet P- aminobenzosyre. Forskellen mellem folin og folat afhænger af hvor mange 3

glutaminosyreenheder de er koblet på (1). Figur 1: Struktur af Folinsyre (29) Folat spiller en rolle i en række kemiske processer i kroppen, såsom 1-carbon units donering, methionine syntesering og DNA-syntesering. Den er metabolisk inaktiv, indtil den bliver omdannet til tetrahydrofolat (THF), som er kemisk aktiv. Før optagelse af folat i jejunum eller tyndtarmen, spaltes dette til folylmonoglutamater, og ved hjælp af enzymer i tarmenes børstesøm og lysosomer, metaboliseres den til 5-methylTHF. Det er i denne form folat cirkulerer rundt i plasmaet(1,3). En del af folaten deponeres i leveren, og senere frigives i galden og bliver reabsorberet i jejunum og i ileum. Dette kaldes enteropatisk cirkulation, som er nødvendig til balancen af normal folat niveau i blodet(6,8). 15 minutter efter indtagelse, er folat allerede nået portalvene, og 1 time efter indtagelse er P-Folat i blodet nået en maksimum koncentration (8). Den aktive form for folat, THF s vigtigste funktion er overførsel af 1-carbon units, som er bundet på et N10 eller N5 atom af THF eller på en binding af begge to. Folats donering af 1-carbon unit er nødvendig for biosyntese af aminosyrer og nukleinsyrer ved at danne puriner og thymin nukleotider, som indgår i RNA og DNA syntesering. 1-carbon unit er bundet til THF i forskellige oxidationsniveauer inde i cellen, hvilket kan ske ved 5 reaktioner f.eks. ved serins omdannelse til glycin, histindine katabolisme, og synthese af tymin, methionin og purine(1,2,6). Reaktionerne bliver katalyseret af forskellige enzymer og coenzymer som FADH 2 og NADH(2,8). Folat i plasma og i erytrocytter Da folat har betydning for kroppens celledeling, er folat også vigtig under dannelse af røde blodlegemer (erytrocytter) i knoglemarven ved erytropoiesen. Folat bliver optaget af erytroblasterne under modning. Folat i erytrocytter er i form af 5-methyl-THF (26).Modne erytrocytter afgiver eller modtager ikke folat, når de cirkulerer i vores krop i 120 dage. Derfor har Ercs-Folaterne en langsigtet virkning for folatdepotet i kroppen. Erytrocyt-folat 4

har ingen metabolisk rolle, men er kun et depot af vitaminet(6,15). Folater i inde i erytrocytter er højere end folat i plasma, medmindre man har spist folatrig mad de sidste par dage(3,7,8). Den form for folat, der findes i plasma, er den inaktive form 5-methyl-THF, som indikerer P-Folat koncentration(3,26). En del af folat i plasma er bundet til proteiner med lav affinitet, som albumin og folatbindende protein(8). P-Folat er afhængig af folatindtagelse via føden, og derfor ikke et mål for folatdepotet, ligesom erytrocyt-folatet(15). Et lavt resultat af P-Folat, kan være en indikation af lavt folat-indtag de sidste par dage. Dette kan dog bruges til screening af folat-mangel, da P-folat falder før erytrocyt-folat, som først falder efter 17 uger.(16) Grunden til dette er, at erytrocytter har en levetid på 120 dage, og den daglige folatindtagelse således ikke påvirker koncentration af folat ind i erytrocytterne(6). Referenceinterval Ercs(B)-Folater, stofk. > 0,41 µmol/l (28) Folater-Serum 5-30 nmol/l (3) Spædbørn <1 år (Folater-Serum) > 20 nmol/l (3) I praksis bruges måling af folat-niveauet i både serum og røde blodlegemer til en vurdering af folat-status. Målingen foretages, hvis der er mistanke om folatmangel anæmi. Det er vigtig for især ældre og gravide at få tjekket folatstatus for at herved at kunne forhindre komplikationer så som anæmi, og neauralrørdefekt hos gravide. På KBA bruges Ercs- Folater især til anæmiudredning, og for at tjekke folatdepoterne i erytrocytter(3). Biologisk variation Årsager til nedsat folat kan være: Malabsorption i tarmen Dårlig og ensidig kost Alkoholmisbrug Leversygdom 5

Hvis folatmangel ikke opdages i tide, kan patienten risikere at udvikle megaloblstær anæmi, misdannelse af foster hos gravide eller neuralrørsdefekt, og hjerte-kar sygdomme. Megaloblastær anæmi er en anæmitilstand hvor DNA syntesen er hæmmet, mens der er normal udvikling af cytoplasma. Dette fører til unormalt store erytrocytter, hvor kernene ikke er fuldt udviklet. Neuralrørsdefekt er en medfødt sygdom, hvor der er misdannelse i den nyfødtes hjerne og rygmarv. Resultatet af målingen er således særdeles vigtig i forhold en korrekt diagnosticering og i forhold til den videre behandling(3,6,8). 1.5.2 Antigen-Antistof Antigen er et molekyle som kan fremmer dannelser af antistoffer. Antigener er stoffer som proteiner, polysaccharider, toxiner og mikroorganismer. Antistoffer er proteiner eller immunglobuliner, der findes i blodet og vævsvæsker. Antistoffer kan anvendes til analytisk formål f.eks. ved at fremstille eller producere et antistof som er rettet til et specifik antigen, som man vil gerne måle. Til fremstilling og produktion af disse antistoffer bliver immunisering af dyr oftest brugt. Til immunisering bliver f.eks en rotte eller en kanine sprøjtet med et immunogen stof, som er indeholder et antigen som kan derefter aktivere dyrets immunforsvar, herved dannelser af antistoffer, som man ønsker at få dannet. Til immunkemiske analyse bliver antigen/antigstof principper brugt til måling af de ønskede komponent fra patient prøven(5). 1.6 Analyseprincipper 1.6.1 AutoDELFIA analyseprincip AutoDelfia anvender et fastfase-, tidsforsinket flouroimmunoassay til Ercs-Folater og P- Folat analyser. Ud fra det kompetitive princip mellem europium-mærket pteroylglutaminsyre (Eu-mærket folat), og prøvefolat konkurrerer disse komponenter om det begrænsede antal bindingssteder på folatbindingsproteinet (FBP)(10). Først bliver sker der en kemisk forbehandlingstrin, som adskiller prøvefolat fra FBP til en stabil form. I den første inkubation bliver antistof mod den antifolatbindendeprotein (anti-fbp-igg) inkuberet i en mikrotiterplade, som er dækket med anti-mus-igg. Antistoffet binder sig her til anti-mus-igg. 6

Figur 2: (10) I den anden inkubering bliver der tilsat folatbindende reagens som indeholder FBP og folat fra prøven. FBP binder specifikt til anti-fbp-igg, og folat fra prøven binder sig til FBP. Bagefter bliver der tilsat en kendt mængde Eu-mærket folat-tracer, som binder sig til de frie bindingssteder på FBP. Figur 3: (10) Der bliver vasket efter hver inkubering for herved at vaske de ubundne materialer væk. Der tilsættes enhancement-solution, som gør at Eu bliver frigivet fra reaktionen. Derefter sker der en reaktion, mellem de frie Eu 3+ og Enhancement-solutionen som medfører en flourescerende Eu-(2-NTA) 3 (TOPO) 2-3. Til sidst måles fluorescensen ved hjælp af et indbygget fotometer (10). Figur 4: (10) Måleprincip Princippet flouroimmunosaasay er måling af emissionen fra Eu, som udsættes for lys. Når Eu udsættes for lys og har absorberet en bølgelængde, henfalder dette til sin grundtilstand ved emittering af fotoner. Fastfase-tidforsinket assay er muligt hvis den flouroscerende label f.eks. europium har en lang henfaldstid, som ca. 10-10.000 mikrosekunder. Lige efter 7

tilsætningen af enhancement solution, måles fluorescensen i 400 µs efter en forsinkelse af 400 µs i henfaldstiden. Da vi måler flourenscensen af Eu fra mærket folat-tracer er mængden af folat i prøven omvendt proportionelt med folat i prøven(11). 1.6.2 Architect i2000 SR analyseprincip Architect i2000 SR anvender teknologien, Chemiluminescens Mikropartikel ImmunoAssay (CMIA) til måling af folat i plasma. CMIA benytter mikropartiklerne til at fange analyten og derefter binde til konjugat som har en kemiluminescens effekt, når en trigger tilsættes. Prøven bliver forbehandlet før en analyseprocedure. P-Folat analysen er baseret på en to-trinsanalyse procedure, som tager 40 minutter (12,13). Folaten på plasma som er bundet på et folatbindingsprotein (FBP) bliver frigivet ved hjælp af 2 forbehandlingstrin; Figur 5: Analysering af folat, billedet viser forbehandling step 1 og 2 (13). Pre-treatment Step 1: Patientens plasma bliver pipetteret og blandet med forbehandlingsreagens ditiotreitol(dtt). Blandingen bliver bagefter dispenseres i en reaction-vessel celle (RVcelle). Blandingen bliver inkuberet i 7 minutter. Ved inkuberingen spalter DTT binding mellem folat og FBP Pre-treatment Step 2: Derefter bliver der aspireret en mængde af prøven fra forbehandling trin 1 i en anden RVcelle, hvor der bliver tilsat forbehandlingsreagens 1 kaliumhydroxid(10). Blandingen inkuberes i 7 minutter. Ved inkubering sker der en denaturering af FBP, som umuliggør yderligere binding med folat (12,13). Reaktionen: Step 1: 8

Figur 6: Step 1 til P-Folat analysering (13) a.) Der bliver aspireret en vis mængde af den forbehandlede prøve fra 2. forbehandlingstrin til en ny RV-celle. Der bliver tilsat fortyndingsreagens og paramagnetiske mikropartikler coatede med folatbindingsprotein. Reagenset blandes og blandingen inkuberes i 18 minutter. Ved inkubation dannes der et immunkomplex, hvor analysekomponenten, folat, fra patientprøven vil binde sig til mikropartiklen, som bindes specifikt til folat. b.) Efter inkubation bliver der placeret en magnet nær RV-cellen, som tiltrækker de mikropartikler som er bundet til den specifikke analysekomponent til indersiden af RVcellen. Ubundne mikropartikler bliver vasket væk. Step 2: Figur 7: Step 2 til P-Folat analysering (13) a.) Efter udvaskningen tilsættes der reagens med pteroisk syre-acridin mærket konjugat, som binder sig til de frie pladser på FBP i immunkomplekset under 4 minutters inkubation. Bagefter bliver det ubundene materiale vasket væk med vaskebufferen 3 gange. Den eneste der er tilbage i RV-cellen er immunkomplekset som er bundet med folat og acridinium mærket konjugat. b.) Der tilsættes pre-trigger, som indeholder hydrogenperoxid, i RV-cellen med immunkompleksblandingen. CMIA systemets optiksystem laver et baggrundstjek/måling. Prætriggerens funktioner er (14): - Den gør miljøet surt, så der ikke dannes lys for tidlig. - Den forhindrer mikropartiklerne med i klumpe sammen. 9

- Den adskiller det lysemitterende stof acridin fra konjugat, så at den er frit til stede i opløsningen. Der tilsættes triggeropløsning(natriumhydroxid) til reaktionsblandingen, hvorved der sker en oxidation af acriditin, da dette bliver udsat for hydrogenperoxid og en alkalisk opløsning. Reaktionen medfører kemiluminescensreaktion. Måleprincip: Der dannes et ustabilt stof: N-metylacridon, som henfalder under dannelsen af lys, som måles i et givet tidsrum og som afhænger af analysen og inkubationstiden. Lyset detekteres af det optiske system. Kemiluminiscensreaktionen bliver målt i form af RelativeLysUnits (RLU). Der benyttes datareduktionsberegning, hvor baggrundsmåling trækkes fra den aktiverede måling, for at få det endelig resultat. Det lys som produceres er omvendt proportionelt med mængden af folat i prøven. Det betyder at jo højere signal, der opfanges, jo lavere koncentration af folat i prøven (14). 1.7 Metodevalg Statistiske test og beregninger: Alle statistiske beregninger så som middelværdi, standarddeviation eller varians (SD), variationskoefficient (CV%) og statistiske test som, og T-test, laves vha. Microsoft excel og analyse-it. 1.7.1 Metodesammenligning a.) Til sammenligning af resultater af Ercs-Folater og P-folater analyseret på AutoDelfia, skal P-folat resultater først omregnes til µmol/l, da Ercs-Folater er opgivet i µmol/l. Som sand værdi, vælges Ercs-Folat koncentrationen målt på AutoDELFIA, da man på afdelingen anser dette for at være den sande værdi. Resultaterne behandles grafisk vha. et differensplot, og resultaterne plottes ind i en X,Y plot, hvor P-folat er funktionen af Ercs- Folater. X,Y plot vil vise om der er en lineær sammenhæng mellem de to stikprøver. Der findes korrelationskoefficient, R 2, som vil kunne vise om der er overensstemmelse mellem de to resultater. Dette bruges til vurdering af den lineære sammenhæng mellem de to metoder. Hvis R 2 er lig med 1 betyder dette en perfekt lineære sammenhæng mellem de to stikprøvers. Dvs, jo tættere R 2 til 1, jo større er sammenhængsgraden mellem de to metoder(26,27). 10

b.) Til sammenligning af P-Folat resultater analyseret på AutoDelfia og Architect i2000 SR skal resultaterne først plottes ind i et differensplot eller bias plot for at få et visuelt overblik mellem de to stikprøvers differenser, og forskydninger af koncentration. Derefter skal de forskellige statistiske tal som SD og middelværdier beregnes i et regneark. Der laves en regressionsanalyse, da jeg ønsker at sammenligne P-Folat analyseresultater fra to forskellige metoder. Der beregnes 95% konfidensintervaller af hældningskoefficient og skæring for at undersøge om den usikkerhed som er beheftet med regression til sammenligning af de to metoder. Hældning undersøges for om den er signifikant forskellige fra 1, dvs. om 95% konfidensinterval ekskluderer tallet 1 og vha. en t-test. Skæring undersøges om den er forskelligt fra den ideale interceptet 0, dvs. om 95% konfidensinterval ekskluderer tallet 1 og vha. en t-test(26,27). 1.7.2 Kontroller Til sammenligning af kontroller fra Abott og kontroller fra BioRad, beregnes der CV%, SD, og middelværdi for hvert kontrolniveau. Der sammenlignes SD og CV% af hvert kontrol niveauer fra Abott til det tilhørende niveau fra BioRad. Hvert kontrolniveau fra Abott sammenlignes med det tilhørende niveau fra BioRad. Der vurderes ud fra de 3 forskellige kontrol kort niveauer, hvordan BioRads kontroller ligger i forhold til kontroller fra Abott. Kontrolkortet tegnes ud fra de forskellige statistiske beregninger fra Abotts og BioRads kontrol analysering 20 dages. Der indtegner middelværdi, +/-1SD, +/-2SD og +/- 3SD grænser. Architecti2000 SR interserielle præcision Til vurdering af Architects præcision udføres en interseriel analysering af P-Folat, hvor der analyseres kontroller fra Abott en gang dagligt i 20 dage. Der beregnes SD og CV% og sammenlignes med de opstillede kravspecifikationer fra KBA. CV% af hver kontrolniveauer sammenlignes med den totale impræcision fra indlægssedlen af P-Folat og krav fra KBA. Architecti2000 SR intraserielle præcision Den intraserielle præcision undersøges ved at måle 10 gange på to af Abotts kontrol niveau. Level low og High vælges til forsøget. Der beregnes middelværdi, SD og CV% for at få udtrykt på præcisionen. 11

1.7.3 Holdbarhedsforsøg P-Folat som er analyseret den første dag anses som den sande værdi til forsøget, forbeholdt at kalibrering er godkendt og at alle kontroller ligger i acceptgrænser. Først laves der et differensplot mellem den sande værdi hhv. resultater af P-Folat, hvor prøverne blev gemt på køl i 24 timer og prøver som blev opbevaret ved stuetemperatur inden analyse. Dette er for at få et grafisk over overblik over hvordan resultaterne forholder sig til den sande værdi(26). Der undersøges om alle P-Folat-resultater er tilnærmet normalfordelingen, hvilket er en forudsætning for at kunne lave en parret-test. Hvis alle stikprøver er normaltfordelte kan en dobbeltsidet parret T-test udføres. Begrundelsen for valget af denne test er at målingerne er parvis samhørende, da de to folatresultater kommer fra den samme patient og der er anvendt samme metode og samme analyse. T-test udføres for at kunne vurdere om der er en signifikant forskel på stikprøvernes middelværdier, P-Folat resulater på køl og P-Folat resultater ved stuetemperatur, i forhold til P-Folat resultatet målt den første dag (sand værdi). 2.0 Materialer 2.1 Metodesammenligning AutoDelfia: 50 plasma prøver afpipitteret fra LH-glas til de brune reagensglas. Architecti2000 SR : 50 plasma prøver afpippiteret fra LH-glas til almindeligt reagensglas. 2.2 Holdbarhedsforsøg 2 blodprøver som kommer fra samme patient taget i LH-gelglas. Der bliver taget fra 28 patienter, dvs. 56 blodprøver taget i gelglas. 2.3 BioRads kontroller Lypochek Immunoassay Plus Control Lotnr: 40220 Level 1 (Low) 40221 Level 2 (Medium) 40222 Level 3 (High) 40223 12

Iht. BIO-RAD pakningsindlæg er kontroller til folat analyse kun holdbar 3 dage på køl ved 2-8 C og 20 dage ved -10 til -20 efter rekonstituering. 2.4 Apparatur 2.4.1 AutoDELFIA Reagenser AutoDELFIA Folate reagent kit Lotnr : 495309 Produkt nr. : B072-201 Udløbsdato : 2009-09 Reagens til Ercs-Folater Lotnr BSA opløsning 509487 Ascorbinsyreopløsning Indhold Fresmtilles samme dag, hvor der hæmolyseres der skal hæmolyseres erytrocytter. Fælles reagenser til Ercs-Folater og P-Folat Folat-Eu-Tracer-stamopløsning Bovinserum albmuin (BSA) og dextran 487910 Anti-FBP-opløsning BSA og diethylentriaminpentaacetatsyre 480684 (DTPA) Folat Assay Buffer 490685 BSA, DTPA, og Tween 20 Folat bindende reagens 487911 BSA og folatbindende protein Anti-mus-IgG mikrotiter strips 487701 Folat standarder 487701 Andre fælles reagenser Delfia Wash Concentrate 484209 Tris buffer, ph 7,8, Tween 20 Enhancement Solution 490701 Triton X-100, eddikesyre og chelatorer Diluent II 509484 Tris-buffer, BSA og natriumazid Kalibratorer Der kalibreres med en standardkurve i dobbeltbestemmelse hver gang der kører en serier med Ercs-Folater. Lotnummer: 495309 Udløbsdato: 2009-09 13

Kontroller Da P-folat ikke normalt analyseres på KBA, blev Lypochek Immunoassay Plus kontroller brugt. 2.4.2 Architect i2000 SR Reagenser Architect i2000 SR Architect Folate reagent kit Lotnummer : 70914JN00 Udløbsdato : 29.09.2009 Reagenser Microparticles Conjugate Assay Specific Diluent Pre-treatment reagent 1 Pre-treatment reagent 2 Specimen Diluent Architect i-præ Trigger Solution Architect i-trigger Solution Wash Buffer Indhold Anti-folatbindingsprotein bundet til mikropartikler Pteroisk syre som er acridinmærket konjugat Folat fortyndingsopløsning med boratbuffer Forbehandlings reagent med kaliumhydroxid Forbehandlings reagent med ditiotreitol Fortyndingsopløsning med TRIS-buffer Andre reagenser 1,32% (w/v) hydrogenperoxid 0,35 M natriumhydroxid Vaskebuffer med saltvandsopløsning i fosfatbuffer Kalibratorer Lotnummer : 69063JN00 Udløbsdato : 19.07.2009 Folat analysen benytter en 6 punkts kalibrering, og ved dette bliver der brugt 6 kalibratorer. Derfor bliver der sat 6 punkter på kalibreringsgraf. Kontroller Lotnummer : 70611JN00 Udløbsdato : 9.11.09 Kontroller Target Koncentration, (nmol/l) Acceptinterval, (nmol/l) Kontrol Low 5,7 3,4 8,0 Kontrol Medium 17,0 12,4 21,8 14

Kontrol High 34,0 24,8 43,2 Kontrollerne opbevares i en mørk æske i køleskabet ved 2-8ºC. Før analysering blandes kontrollerne forsigtigt. 3.0 Metode 3.1 Forsøgsbeskrivelse Før analysering af kontroller på Architect i2000 SR, skal der den daglige vedligeholdelse udføres til opstart hver dag. Der tjekkes om den daglige vedligeholdelse er blevet gjort. Hvis dette ikke er blevet gjort skal den daglige vedligeholdelse udføres. Dag 1 Kalibrering af Architect i2000 SR og kontrol analysering i 3 niveauer. Dag 2 Opsamling af 56 blodprøver taget i LH-gelglas fra 23 patienter fra ambulatorium kl.8 kl.10. Prøverne blev centrifugeret lige efter. Rekonstituering af kontroller fra BioRad. Kontroller fra Abott i 3 niveauer analyseres på Architect i2000 SR. 23 LH-gelglas analyseres for P-Folat i Architect i2000 SR efter kl. 15 og gemmes i en mørk æske. De resterende prøver gemmes i en mørk æske og sættes ind i køleskabet. BioRads kontroller i 3 niveauer analyseres på Architect i2000 SR. Kontrollerne fra Abott og BioRad blev analyseret hver dag i 20 dag på Architect i2000 SR. Dvs. fra dag 1 til dag 20. Dag 3 Analysering af 23 prøver som blev opbevaret ved stuetemperatur kl. 11 Dag 15 Dag 19 Dag 20 Analysering af 23 prøver som blev opbevaret i køleskabet efter kl. 12 Analysering af 50 P-Folat prøver på AutoDelfia om formiddagen. Analysering af 50 P-Folat prøver på Architect i2000 SR efter kl.15 Opsamling af 10 blodprøver taget i LH-gelglas fra KBA personale. 5 LH-gelglas analyseres for P-Folat i Architect i2000 SR og gemmes i en mørk æske. De resterende prøver gemmes i en mørk æske og sættes ind i køleskabet. Analysering af 5 prøver som blev opbevaret ved stuetemperatur. Analysering af 5 prøver som blev opbevaret i køleskabet. Kontrol High fra Abott blev målt 10 gange efter hinanden på Architect i2000 SR Kontrol Low fra Abott blev målt 10 gange efter hinanden på Architect i2000 SR 15

3.2 Prøveindsamling/Prøvebehandling 3.2.1 Metodesammenligning Der opsamles 50 prøver fra rutinen, ved at vælge prøver som allerede er blevet analyseret for Ercs-Folater på AutoDELFIA, så der kan undlades at analysere for Ercs-Folater på disse. På de udvalgte prøver er der også taget et ekstra LH-glas. Resultaterne af Ercs- Folater findes via EDB-systemet og noteres i skemaet (se rådata på Bilag 1). Alle plasmaprøver tjekkes visuelt for hæmolyse, lipæmi og icterus. Hvis en af de førnævnte visuelt kan ses, kasseres prøven. Plasma fra LH-glasset afpippeteres til 2 reagensglas vha. engangs pipetter og fryses indtil det skal bruges. Ét almindeligt reagensglas til architect P-Folat-analyse og ét brunt reagensglas til AutoDelfia s P-Folat analyse. Alle glas nummeres tilfældigt fra 1-50. Prøvematerialet fryses ned ved mindst -10 C op til 7 dage inden analyse. Frysning og optøning fortages kun én gang. Til forsøget medtages blodprøver hvor Ercs-Folater ligger både i og udenfor referenceintervallet, hvorved hele måleintervallet dækkes. Blodprøverne er udtaget uden hensyn til patientens køn eller alder. Der medtages kun de prøver hvor AutoDELFIAs kontrolresultater ligger indenfor acceptintervallet og hvor kalibreringen er godkendt. 3.2.2 Holdbarhedsforsøg Der opsamles 2 ekstra LH-glas fra 28 patienter som kommer til blodprøvetagning i ambulatoriet på KBA til holdbarhedsforsøg af P-Folat. Alle blodprøver tages i henhold til afdelingen vejledning for blodprøvetagning. Efter blodprøvetagning bliver alle LH-gelglas centrifugeret i 10 minutter ved 3500 rpm. De 28 antal bliver analyseret første dag og bruges som P-Folat sande resultatværdier. Prøverne som bliver analyseret og bruges som sande P-Folat værdi bliver opbevaret ved stuetemperatur indtil analysering som sker ca. Efter kl.15. Bagefter de analyserede blodprøver opbevares ved stuetemperatur i en æske til næste dag inden analysering. De resterende 28 bliver gemt på køl i en æske til næste dag inden analysering. 3.3 Forberedelse af plasma prøver 16

Plasma prøver som skal bruges til analysering tages ud af frysen 1 time før analysering. Efter optøning blandes prøven forsigtig vha. vortex mixeren. Alle plasma prøver centrifugeres ved 3500 rpm i 10 minutter for at fjerne eventuel udfældninger. (Se centrifugerings vejledning fra for nærmere detaljer på bilag 5). Autodelfia Til analysering af Ercs.Folater henvises til AutoDelfias betjeningsvejledning (Bilag 6, 7.1.1) Til P-Folat analysering med AutoDelfia blev vi hjulpet af en superbruger fra Sektions 2. Den daglige vedligeholdelse er udført vha. AutoDelfias betjeningsvejledning (Se bilag 6 7.1.2). Prøverne blev bestilt og sat ind i apparatet ifølge Autodelfias brugervejledning (Se Bilag 6). Architect i2000 SR a.) Den daglige vedligeholdelse For nærmere detaljer se Bilag 7 for Architect i2000 sr brugervejledningen b.) Bestilling af kontroller/prøver Der henvises til Architects brugervejledningen (Se Bilag 8) c.) Bestilling af intraserielle kontroller Der henvises til Architect i2000 SR brugervejledningen (Bilag 9) Konstituering af BioRads kontroller i 3 niveauer: 1.) Der tilsættes 5 ml destilleret vand til hver kontrol ampul og ampullerne skal henstå i 15 minutter. Bagefter blandes kontroller forsigtigt. 2.) I hver kontrol niveau afpippetteres der 600 µl kontrolmaterial til 7 små brune cryrør. 3.) De resterende 800 µl af hver kontrol niveau afpippetteres i en brun cryrør, som skal bruges som kontrol på AutoDelfia, når P-folat skal analyseres. 4.) Alle kontrol materialer opbevares i en mørk æske i fryseren ved -10 til -20ºC grader. 5.) Hver 3 dage tages der et brunt rør fra hver kontrol niveau ud af fryseren. Der afpippetteres 200 µl fra hver kontrol niveauer til de små analysering rør, der passer til Architect i2000 SR prøveracks. 6.) Alle kontroller i 3 niveauer bliver analyseret hver dag i 20 dage på apparatet Architect i2000 SR. 17

Ercs-Folater i nmol/l [MAUREEN JOY HANSEN 5.0 Resultater 5.1 Ercs-Folat og P-Folat målt i AutoDelfia X,Y plottet er lavet på baggrund af rådata fra BILAG 1, hvor Ercs-Folater er afbildet på Y- aksen og P-Folat på X-akse 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Ercs-Folater som funktion af P-Folat 0 20 40 60 80 P-Folat i nmol/l y = 20,42x + 397,21 R² = 0,65225 Ercs-Folat Figur 8: X,Y plot, hvor ErcsFolater er funktion af P-folat. P-Folat resultater målt på architect er anført på x-aksen. Ercs-Folater resultater målt på AutoDelfia er anført på y-aksen. Linjesammenhængen er beskrevet med ligningen y = 20,42x + 397,21 og korrelationskoefficienten er 0,65 18

P-Folat malt Architect i2000sr i nmol/l P-Folat Architect - P-Folat AutoDelfia [MAUREEN JOY HANSEN 5.2 Metodesammenligning af P-Folat på hhv, AutoDelfia og Architecti2000 SR Bias Plot 5,0 0,0-5,0-10,0-15,0-20,0-25,0-30,0-35,0 Differens Plot 5 15 25 35 45 55 Middelværdi i nmol/l Figur 9: Differensplot viser differenserne mellem P-Folats resultater fra Architect i2000 SR minus P-Folat resultater fra AutoDelfia. Gennemsnittet af datapars P-Folat analyseresultater, dvs. middelværdien, er anført i x-aksen. Differenserne mellem Architecti2000 SR og AutoDelfias P-Folat resulatater. Den grå linje er 0 bias. Differenserne er beregnet ud fra rå data, hvor P-Folat resultater på Architect i2000 SR minus P-Folat resultater på AutoDelfia (Se Bilag 2, side 1) Regressionsanalyse Til sammenligning af de to metoders P-Folat analyseresultater, har jeg valgt at lave en regressionsanalyse. Først bliver resultaterne afbildet i et X,Y plot for P-Folat resulater fra Architect er afbildet på Y-akse og P-Folat resultater fra Autodelfia er afbildet på x-akse. 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 X,Y plot over P-Folat (Autodelfia) og P-Folat (Architect) y = 0,7104x + 2,3125 R² = 0,89329 0 20 40 60 80 P-Folat målt på AutoDelfia i nmol/l Figur 10: X,Y plot, hvor P-Folat malt på Architect i2000 SR som funktion af P-Folat malt på AutoDelfia. Korrelationskoefficient på 0,89 som beskriver graden af den lineær sammenhæng. 19

Bagefter undersøges hældning og skæring om de er forskellige fra hhv. fra 1 og 0, for at undersøge om resultaterne er signifikant forskellige fra hinanden ved 95% konfidensinterval. Regressionsanalyse resultater vha. excel Resultater Krav Korrelationskoefficient 0,89 1 Skæring 2,31 T-testen viser at det er signifikant forskellig fra 0. 0 skal ligge i flg. interval: 95% konfidens:[0,73-3,88] Skæring skal ikke være signifikant forskellig fra 0. Hældningskoefficient 0,71 T-testen at det er signifikant forskellig fra 1. 1 skal ligge i flg. interval: 95% konfidens:[0,64-0,78]. Hældning skal ikke være signifikant forskellige fra 1. Tabel 1 5.3 Kontrol resultater Alle kontroller resultater (rådata) findes i bilag 3. a.) Kørsel af kontrollerne i 20 dage Abotts kontroller Low Medium High Middelværdier 5,36 16,42 34,44 SD 0,48 0,59 0,62 CV% 8,9% 3,6% 1,8% Tabel 2 Der beregnes middelværdi, SD og CV% for at få udtryk på den interserielle impræcision. BioRads Kontroller Low Medium High Middelværdier 6,9 14,97 30,24 SD 0,40 0,79 0,85 CV% 5,7% 5,3% 2,8% Tabel 3 b.) Intraseriele præcision Kontrol Low Kontrol High Target koncentration 5,7 nmol/l 34 nmol/l SD 0,29 0,30 CV% 5,5% 0,89% Tabel 4 20

P-Folat i nmol/l [MAUREEN JOY HANSEN Kontrolkort til Abotts kontrolresultater Ud fra P-Folat kontroller rådata og beregninger fra Bilag 3, Tabel 3 og 4, er kontrolresultaterne i 3 forskellige niveauer plottet ind i Levey-Jennings kort. Kontroldagenes nummer er anført i x-akse, og P-Folat koncentration i y-akse. P-Folat i nmol/l P-Folat i nmol/l 6,7 6,2 5,7 5,2 4,7 4,2 3,7 18,5 18 17,5 17 16,5 16 15,5 15 14,5 14 Kontrol Kort: Low Level 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dag nummer Kontrol Kort: Medium Level 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 +/-2SD Serie4 Serie7 +/- 1SD Serie1 Abotts kontrol Serie3 Middelværdi Serie9 -/+ 3SD Lineær (Serie9) Serie4 +/-2SD +/- 1SD Serie6 Abotts kontrol Serie1 middelværdi Serie3 -/+ 3SD Figur 11: Kontrol kort over kontrol niveau LOW. De blå punkter er Abotts kontrolværdier. Vi kan se at alle resultater ligger indenfor +/- 2SD, og punkterne fordeler sig jævnligt mellem middelværdien. Figur 12: Kontrol kort over kontrol niveau MEDIUM. De blå punkter er Abotts kontrolværdier. Alle resultater ligger indenfor +/- 2SD undtagen dag Nr. 2. Som falder udenfor -2SD. Dag nummer 37 36 35 34 33 32 Kontrol Kort: High Level 1 3 5 7Dag 9nummer 11 13 15 17 19 +/-2SD Serie4 Serie6 +/- 1SD Abotts kontrol Serie1 middelværdi Serie3 Serie8 -/+ 3SD Figur 13: Kontrol kort over kontrol niveau HIGH. De blå punkter er Abotts kontrolværdier. Alle punkterne falder indenfor +/- 2SD, dog der er skred i dag. Nr 13, hvor kontrol resultater ligger tæt på -3SD. Kontrolkort til BioRads kontrolresultater 21

P-Folat i nmol/l P-Folat i nmol/l P-Folat i nmol/l [MAUREEN JOY HANSEN Ud fra P-Folats kontroller kontroller rådata og beregninger fra Bilag 3, Tabel 5 og 6, er kontrolresultaterne i 3 forskellige niveauer plottet ind i Levey-Jennings kort. 7,9 7,4 6,9 6,4 5,9 5,4 Kontrol Kort: Low Level 11 l 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dag nummer Seri e3 Seri e5 Seri e1 Seri e2 Seri e7 +/-2SD +/- 1SD BioRads kontrol middelværdi -/+ 3SD Figur 14: Kontrol kort over kontrol niveau LOW. De grønne punkter er BioRads kontrolværdier. Alle punkterne fordeler sig omkring middelværdien, dog kontrol i dag 19 er udenfor +2SD. 17,2 16,2 15,2 14,2 13,2 12,2 Kontrol Kort: Medium Level 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dag nummer Serie 1 Serie 3 Serie 5 Serie 2 Serie 16 BioRads kontrol +/-2SD +/- 1SD Middelværdi -/+ 3SD Figur 15: Kontrol kort over kontrol niveau MEDIUM. De grønne punkter er BioRads kontrolværdier. Alle punkterne fordeler sig omkring middelværdien, dog kontrol i dag 12 er udenfor -2SD. 33,4 32,4 31,4 30,4 29,4 28,4 27,4 Kontrol Kort: High Level 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dag nummer Seri e3 +/-2SD Seri e5 +/- 1SD BioRads Seri e1 kontrol Seri e13 middelværdi -/+ 3SD Seri e8 Figur 16: Kontrol kort over kontrol niveau MEDIUM. De grønne punkter er BioRads kontrolværdier. Alle punkterne fordeler sig omkring middelværdien og indenfor +/- 2SD, dog kontrol i dag 5 er udenfor +2SD. 5.4 Holdbarhedsforsøg 22

Differens P-Folat- P-Folat st.t Differens P-Folat- P-Folat Køl [MAUREEN JOY HANSEN Bias plots differenser er beregnet ud fra rådata i Bilag 4. Bias plot 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,5-3,0 Differensplot (køl) 0 10 20 30 40 Middelværdi i nmo/l Figur 17: Biasplottet konstrueres ud fra resultater i Bilag 4, tabel 8. Plottet viser 0-linjen eller bias, differenserne mellem P-Folat sandeværdi og P-Folat resultat efter 1 døgn på køl. Differenserne ser ud til at fordele sig jævnt i 0- linjen. Det ser ud som om at differenserne stiger i P-Folats højere koncentration niveau. Differensplot (stuetemperatur) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0 0 10 20 30 40 Middelværdi i nmol/l Figur 18:Plottet konstrueres ud fra resultater i Bilag 4, tabel 8. Plottet viser 0-linjen eller bias, differenserne mellem P-Folat sandeværdi og P-Folat resultat efter 1 døgn ved stuetemperatur. Differenserne ser ud til at fordele sig jævnt omkring 0-linjen. a.) Dobbeltsidet parret T-test Ud fra figur 4, 65 og i Bilag 4, ses P-Folat sande værdi resultater, P-Folat resultater opbevaret på køl og P-Folat opbevaret ved stuetemperatur. Der udføres en dobbeltsidet parret T-test udføres. Hypoteser for T-testen, hvor signifikansniveau sættes til α = 0,05, dvs, at der er 5% risiko for fejlagtigt forkastelse af H 0 : H 0 : μ 1 = μ 2, den observerede forskel i middelværdierne er tilfældig H 1 : μ 1 μ 2, den observerede forskel i middelværdierne er ikke tilfældig, dermed signifikant forskel P-Folat (Sand P-Folat P-Folat (Sand P-Folat (gemt v, 23

værdi) (gemt på køl) værdi) stuetem.) Middelværdier 17,78 18,07 17,78 17,32 Observationer (n) 28 28 28 28 Frihedsgrad(n-1) 27 27 27 27 T(obs) 1,96 1,82 T=p(tabel) 2,052 2,052 Tabel 5 o T-test resultat til P-Folat og P-Folat gemt på køl. T obs < T (f) p > H o ikke forkastet, T obs > T (f) p < H o forkastes H 1 gælder. T obs = 1,96 T = 2,052, Dvs. T obs < T (f) 1,96 < 2,052 H o ikke forkastet, dvs der er ingen signifikant forskel mellem den sande P-Folat værdi og P-Folat resultater som er analyseret efter 24 timer og gemt på køl. o T-test resultat til P-Folat og P-Folat ved stuetemperatur. T obs < T (f) p > H o ikke forkastet, T obs > T (f) p < H o forkastes H 1 gælder. T obs = 1,82 F = 2,052, Dvs. T obs < T (f) 1,82 < 2,052 H o ikke forkastet, dvs der er ingen signifikant forskel mellem den sande P-Folat værdi og P-Folat resultater som er analyseret efter 24 timer og opbevaret ved stuetemperatur 6.0 Diskussion I diskussionen vil jeg først komme ind på forsøget af Ercs-Folater og P-Folat målt på Autodelfia. Bagefter vil jeg diskutere resultaterne af P-folat målt på hhv. Autodelfia og Architecti2000 SR. Herefter vil jeg komme ind på kontrolresultater fra Abotts og BioRads. Til sidst vil jeg diskutere holdbarhedsforsøget på baggrund af mine resultater. 6.1 AutoDelfia måling af Ercs-Folater og P-Folat I dette afsnit, bygger diskussionen primært på undersøgelsen mellem Ercs-Folater og P- Folat analyseret på AutoDelfia. Herefter skal andre undersøgelser diskuteres i forhold til mine fundne resultater. 24

Regressionsanalyse Ved analyse foretaget på AutoDelfias af Ercs-Folater og P-Folat ses der ud fra rå data jf. Bilag 1, at resultaterne af Ercs-Folater, som er målt i området[250:1750]nmol/l er tydeligt højere end P-Folat som er målt i området [7,15:70,8]nmol/l. De to stikprøver er analyseret på to forskellige komponenter: Den ene population er målt på fuldblod og den anden på plasma, hvilket også medfører at referenceintervallet på begge to er forskellige, og at dette medfører en forskel på resultaterne (3, 28). På baggrund af min teori om at der er en forskel mellem folat i erytrocytter og folat i plasma, ses det at folat i erytrocytter er højere i forhold til folat i plasma, hvilket betyder at disse to komponenter ikke er koncentrationsmæssigt sammenlignelige med hinanden. Erytrocyt folat afspejler kroppens folat depot, hvorimod plasmafolat afspejler den øjeblikkelige folatstatus (3,26). I for at undersøge om der en lineær sammenhæng, udførte jeg et X,Y plot (Figur 8) for at visualisere om der er en evt sammenhæng mellem P-Folat og Ercs-Folater. Når vi kigger på regressionslinjen på grafen i figur 8, kan vi se at punkterne er spredt over retlinjen, samt at Y-værdierne, hvor Ercs-Folater blev anført, ligger højere end x-værdierne, hvor P-Folat analyseresultater blev anført. Dette mener jeg understøtter min teori om at der er en lineær sammenhæng mellem Ercs-folater og P-folat. For at finde ud af om der er en overensstemmelse mellem de to stikprøver, er korrelationskoefficienten eller R 2 beregnet. Ud fra grafen (Figur 8) har de to stikprøver en R 2 som giver 0,65, hvilket beskriver sammenhængsgraden mellem Ercs-Folater og P- Folater. Dette bruges til en vurdering af den lineære sammenhæng mellem de to stikprøver. Jo tættere R 2 er på 1, jo større er sammenhængsgraden mellem to stikprøver. R2 er ikke helt tæt på 1, men vurderet ud fra undersøgelsen, hvor vi sammenligner Ercs-folat og P- folat, vurderer jeg alligevel en god lineær sammenhæng på trods af, at det er to forskellige og ikke direkte sammenlignelige komponenter. Korrelationskoefficient tyder på at 65% overensstemmelse mellem de to stikprøver, mens resterende 35% er forskellige hvilket kan skyldes andre faktorer, som senere vil blive diskuteret. Ud fra resultaterne kan vi antage, at der er en lineær sammenhæng mellem de to stikprøver. Denne sammenhæng kan beskrives ud fra regressionsligningen: y = 20,42x + 397,21. Ligningen beskriver den tilnærmede rette linie, gennem punkterne mellem Ercs-Folater- og P-Folatresultaterne. Da P-Folat er anført på x-aksen, skal man ud fra ligningen, altid multiplicere P-Folat med en faktor på 20,42 og addere konstanten 397,21 for at få Ercs- 25

Folater-resultatet. Som det ses i ligningen er Ercs-Folater- altid højere end P- Folatresultaterne, hvilket igen bekræfter teorien om, at Ercs-Folat er højere end P-Folat. Ligningen bør dog ikke bruges til at beregne Ercs-Folat, hvis der foretages en måling af P- Folat fra en patient. Hvis en person har normalt Ercs-Folatniveau kan man altså ikke regne med at P-Folatniveauet også ligger normalt i forhold til referenceintervallet af plasmafolat. Ud fra teorien om Ercs-Folat og P-Folat, har jeg skrevet at Ercs-Folat først falder efter 17 uger, hvis patienten har folatmangel. Dvs. at man kan få et P-Folatresultat som ligger udenfor referenceintervallet samtidig med et normalt Ercs-Folatresultat. Derfor kan regressionsligningen og R 2 kun bruges til at beskrive den lineære sammenhæng. Ifølge en undersøgelse lavet af D. Drogen et al (16), viser at der er en lineær korrelation mellem Ercs-folater og P-folater, hvor 160 kvinder og 203 mænd blev undersøgt. Disse mænd og kvinder er mellem 40-65 år og er ikke fastende til forsøget. Undersøgelsen gav en lineær regressionsligning på EF(Ercs-Folater)= 277,3 +27,4 PF(P-Folat) og R 2 = 0,63. Ligningen fra deres undersøgelse (16) og fra mit forsøg ligner meget hinanden, og de viser begge en korrelation mellem Ercs-Folater og P-Folat. Dette giver et indtryk at forsøgene, hvor patienterne ikke er fastende, får man en næsten ens resultater og de to R 2 værdier, 0,63 og 0,65 ligger igen tæt på hinanden. Ifølge undersøgelsen (17) er der også andre som har undersøgt sammenhængen af Ercs-Folat og P-Folat, men har fået korrelationskoefficient mellem 0,41-0,52, dvs. der er en korrelation men lavere end den ideal R 2 som er 1. Dette fortæller at undersøgelserne, som er blevet lavet, hvor sammenhæng mellem Ercs-Folater og P-Folat sat i fokus, har givet lave korrelationskoeficienter. Selvom jeg kun har 50 personer til mit forsøg i forhold til deres 363 personer, har jeg stadig fundet noget lignende resultat, hvilket vil sige, at andre også har undersøgt sammenhængen mellem Ercs-Folater og P-Folat underbygger mit forsøg. Folat er et livsnødvendigt vitamin, og det er derfor vigtig at få tjekket folat-status hos lægen. Analysering af Ercs-Folater på KBA er tidskrævende, og der ønskers derfor at undersøge om Ercs-Folater kan erstattes med P-Folat. Hvis man kigger på de to komponenters reference intervaller ligger Ercs-Folat på >0,41 µmol/l (eller 410 nmol/l) og P-Folats reference interval på >5 nmol/l. Ercs-Folat og P-Folat har forskellige reference interval som er højere i forhold til P-Folat reference interval, som henvises til teorien, hvor referenceintervallene er opgivet. Teorien hvor forskellen mellem P-Folat og Ercs-Folater understøtter vores resultater, hvor Ercs-Folater er væsentlige højere end P-Folat. Hvis vi kigger på nogle eksempler af Ercs-Folater og P-Folat resultater; f.eks. prøv nummer 23, Ercs-Folater er på 0,25, og ifølge KBA referenceinterval har patienten, faktisk Folat- 26

mangel. Patienten P-Folat gav 8,32, som ifølge Lyngeby (3) har patienten ikke folat mangel, men har dog en lav folat status. Til de patienter som har normal Ercs-Folater, viser deres P-Folat også en høj P-Folat. Ud fra dette kan vi jo se, at P-Folat resultat afspejler patientens Ercs-Folat resultat, hermed kan afdeling enten vælger om de beholder Ercs- Folat eller indfør P-Folat. Faktorer der påvirker P-Folat analysen Der er dog nogle forskellige faktor, der skal tages hensyn til, når P-Folat skal erstatte Ercs- Folat. En af de vigtige faktorer f.eks. er, om patienten skal være fastende til blodprøvetagning. Ifølge teorien, påvirker madindtagelse øjeblikkelig P-Folat resultater, hvor folat allerede måles i ca. 1 time efter indtagelse(8). I mit forsøg er der ikke taget hensyn til om patienterne er fastende på de udvalgte blodprøver. Denne faktor kan have påvirket P-Folat analyseresultater, hvis nu patienter har spist mad før de har fået taget blodprøve. Ifølge artiklen fra Århus amt (24), og retningslinje fra København Praktiserende Lægers Laboratoriet (KPLL)(25), er det ikke nødvendig for patienten at komme fastende, hvis der fortages Folat-analyse. Århus Amt har valgt at lave analysen på ikke fastende patient, da de nu mener at ulemperne ved en faste-prøve var større end betydningen af faste. KPLL har dog en forholdsregel til analysen P-Folat, at patienter bør undgå B-vitamin piller 2 dage før blodprøvetagning. I vores forsøg er der ikke taget hensyn til om patienterne er fastende, dvs. vi kan hellere være sikker på om de fundne P-Folat analyseresultater er påvirket af madintagelse. Efter at have læst KPLL s retningslinje og artiklen fra Århus amt laboratoriet, undrer jeg mig over hvorfor patienter ikke skal være fastende. Hvis vi kigger kritisk på deres retningslinjer og sammenholder dette med teorien om Folat, kan mad indtagelse påvirke P-Folat resultater. Dette vil går ud over patientens diagnosticering, hvor P-Folat resultat bliver forhøjet, hermed der ikke opdages hvis patienten har folat mangel. Da jeg undrer mig meget over, hvad madindtagelse kan have betydning for P-Folat analysen, fandt jeg frem til en artikel lavet af Candito M. Et al (4), hvor forsøget gik ud på at undersøge, hvordan morgenmad og frokost påvirker P-Folat koncentration. P-Folat blev målt 4 gange med 2 timers mellemrum, og patienter var fastende til den første blodprøvetagning. Herefter har patienten fået morgenmad og fik målt P-Folat efter 2 timer, og fik igen målt P-Folat 2 og 4 timer efter frokost. Undersøgelsen påviser, at P-Folat efter madindtagelse påviser ingen signifikant forskel i forhold til den fastende blodprøve. Undersøgelsen har vist, at det er ikke nødvendigt for patienter at komme fastende til blodprøvetagning. Dette vil sige, at ca. 2 timer efter et 27

måltid bliver P-Folat resultater ikke påvirkes. Dvs. at til patienter som har fået taget blodprøver uden at faste og har folat mangel, vil resultaterne stadig vise at de har folat mangel, hermed får en korrekt diagnosticering og behandling. Patienterne i studiet (4)fik ikke taget en blodprøve >2 timer efter de fik morgenmad eller frokost. Derfor kan vi hellere ikke vide med sikkerhed, om det giver en signifikant forskel på resultater, hvis patienterne fik taget blodprøve i de 2 timers tidsrum efter spisning. Hvis afdeling skal erstatte Ercs-Folater med P-Folat, behøves der ikke at tage hensyn til om patienter skal være fastende eller ej, da P-Folat ikke bliver påvirket af folatindtagelse. Der skal måske lave en retningslinjer, at de bør undgå mad lige før de skal have fået en blodprøve, da folat i portalveneblodet stiger 15 minutter efter man har spist og efter ca. 1 time opnår der maksimum P-Folat koncentration i blodet(8). Det er dog op til afdelingen, hvad for nogle forholdsregler, de vil tage hensyn til angående P-Folat analysen. Det vil dog være bedst, hvis afdelingen tager P-Folat ca. 2 timer efter spisning. Da Ercs-Folat og P-Folat, ud fra resultaterne, viser en god sammenhæng med hensyn til folat resultat at give folat status, er der nogle fordele hvis Ercs-Folat analyse erstattes med P-Folat: P-folat analysen er automatiseret, dvs. der vil være mindre arbejdsbyrde i laboratoriet, hvor der ikke behøves at lave en manuel lysering af erytrocytter til Ercs-Folater analysen. Arbejdsproceduren vil ikke være forskelligt fra Ercs-Folater når der skal analyseres P-Folat. Der er mange på afdeling der beskæftiger sig med AutoDelfia vedr. Ercs-Folat analysen, derfor behøves personalet ikke at blive oplært fra bunden af til P-Folat analysen. P-Folat analysen tager få timer at analysere på AutoDelfia, derfor får patienten en hurtigere svar og hermed en hurtigere behandling. En normal Ercs-Folater kan ikke udelukke folat mangel, da dette først falder efter 3-4 måneder(8). Dvs. en aktuelt P-Folat resultat kan bruges til screening af folatmangel. Patienter, som er ved at udvikle folatmangel, kan undgå komplikationer som megaloblastær anæmi ved hurtigere behandling. Til kvinder som har tænkt sig at blive gravid, eller dem der er under graviditet som har folatmangel, kan få folat tilskud, hvis der opdages at de har folat mangel eller på vej til at få en folat mange (7,8). Anvendelse af P-Folat kan mindske analyse usikkerhed. Der er altid usikkerheder på Ercs-Folater analyse procedure, da forarbejde til analysen gøres manuelt. Dette kan f.eks. være usikkerhed på fortyndinger og afpipettering. 28

Resultater fra min undersøgelse tyder på, at der er en lineær sammenhæng mellem Ercs- Folater og P-Folat malt på AutoDelfia. Det vil være op til afdeling, hvis de vælger at erstatte Ercs-Folat med P-Folat, begge tal er et mål for folat. Ercs-Folater som mål for folatdepot og P-Folat som den aktuelle folatstatus. Hvis de forskellige fordele, ved indførelse af P-Folat analysen, tages i betragtning vil det være bedste, hvis P-Folat erstattes Ercs-Folater. 6.2 P-Folat analyseret på AutoDelfia og Architect i2000 SR I dette afsnit, vil resultater fra differensplottet og T-testen af P-Folat analyseret på AutoDelfia og Architect i2000 SR blive diskuteret. Til vurdering af hvordan P-Folat resultater fra AutoDelfia ligger i forhold til P-Folat resultater fra Architect i2000 SR, er der udført en metodesammenligning. Ud fra dette bliver forskellen mellem de to metoders P- Folatanalyse påvist. Differensplot Differensplottet for P-Folat som ses ud fra figur 9 er bestemt fra den samme patient på hhv. AutoDelfia og Architect i2000 SR. På x-aksen ses den gennemsnitlige middelværdi og på y- aksen ses der differenserne. Plottet, viser at der er en negativ bias mellem de to forskellige metoder, dvs. der er en overvægt af negative differenser. Apparatet AutoDelfia måler altså højere end Architect i2000 SR hvilket betyder, at der er en systematisk forskel mellem metoderne. Differensplottet kan dog ikke påvise om der en signifikant forskel på de to stikprøver, da dette kun giver en grafisk vurdering af, hvordan differenserne mellem middelværdierne ligger omkring 0-bias. For at finde ud af om der en sammenhæng mellem de to metoders P-Folat analyseresultater er der lavet regressionsanalyse. Regressionsanalyse Ud fra figur 10 ses der X,Y plottet, som viser en lineær sammenhæng mellem P-Folat resultater målt på Architect i2000 SR som afbildet på y-akse og P-Folat resultater målt på AutoDelfia i x-akse. Sammenhængen mellem de to stikprøver beskrives af regressionsligningen: y = 0,7104x + 2,3125. Den lineære sammenhænggraden mellem de to metoder er beskrevet vha. R 2 som gav 0,89 som jeg vurder at være en god sammenhængsgrad, da dette er tæt på den ideale 1. Dette tyder på, at de to apparater har en overensstemmelse på 89%, men at de er 11% forskellige, som skyldes andre faktorer som senere bliver diskuteret 29

For at kunne finde ud af om de to stikprøver er signifikant forskellige, blev skæring om den er forskellig fra 0 og hældning testes om den er forskellig fra 1. Ud fra resultaterne tabel 1 ses der at 95% konfidensinterval omkring hældning [0,64-0,78] ikke indeholder den ideale hældning 1, derfor adskiller regressionslinjens hældning sig signifikant på det valgte niveau. Dette bekræftes af T-testen som påviser, at hældning er forskellige fra 1. 95% konfidensinterval omkring skæring [0,73-3,88] indeholder ikke den ideal skæring 0, derfor kan man sige, at der med 95% sandsynlighed er de to metoder signifikant forskellig. Da T- testen igen påviser, at skæringen er forskellig fra 0, bekræftes at 0 ikke er indeholdt i 95% konfidensintervallet. 95% konfidensintervallerne af hældning og skæring underbygger, at der er ingen overensstemmelse i den lineære regression på trods af, at der er en korrelation på 89%, herved er der påvist en signifikant forskel i den lineær regression. Dette vil sige, at der er 95% sandsynlighed for, at der er en signifikant forskel på P-Folat målt på AutoDelfia og Architect i2000 SR. De to sammenhørende observationers variationernes kan skyldes flere parameter såsom analyseusikkerhed eller de to apparaters forskellige analyseprincipper og måleprincipper. Der benyttes antigen-antistof reaktion til analyseprincipper til begge apparater, men bruges forskellige reagenser til at fange folat fra prøven. Dette kan være årsagen til, at der er en signifikant forskel på de to observationer. En af årsager kan være måleprincipperne, som er også forskellige. I AutoDelfias bliver henfaldstiden målt af den flourescerende label europium, hvorimod der måles henfaldstiden af acridin ved chemiluminescens i Architecti2000 SR. Begge apparater måler flourescenssignal eller chemiluminescenssignal i forskellige specifikke tidsrum. Da Architect i2000 SR måler lavere end AutoDelfia, kan det være at chemiluminescensen af acridin bliver målt længere end flouroscensen af Eu, som kun bliver målt i 400µs. Ud fra måleprincipper af AutoDelfia og Architect i2000 SR, er folat i prøven omvendt proportionalt med lyset som bliver emitterede fra enten acridin eller Eu. Dette kan jo være årsagen, at der er en signifikant forskel på analyseresultaterne fra de to stikprøver. Den systematisk forskel af de to metoder som ses i differensplottet (figur 9) bekræftes af regressionsanalyse resultater, som påviser at de to metoder er signifikant forskellige ved 5% signifikant niveau. Da AutoDelfia måler væsentlig højere P-Folat resultater, vil dette være problematisk for patienter som har folat mangel. Det analyserede P-Folat resultat er højere end det skulle har været, og dem der har folat mangel ikke opdages. Dette vil igen give en klinisk betydning, hvor patienten bliver fejldiagnosticeret, og hermed ikke får den korrekte 30

behandling. Hvis patienten har folatmangel i virkeligheden, kan det føre til øget risiko for megaloblastær anæmi, neuralrørsdefekt hos gravid og hjerte-karsygdom hos ældre(4,8). Da vi hellere ikke have et apparat der måler P-Folat i forvejen, har vi ikke noget resultater som vi kan sammenligne mod AutoDelfia og Architect i2000 SR. Derfor kan vi hellere ikke vide med sikkerhed om Architect i2000 SR måler rigtigt eller for lav i forhold til det sande P-Folat resultat. Hvis Architect i2000 SR måler for lav, kan dette igen give en klinisk betydning for patienterne. Dvs. patienten, som ikke har folat mangel i virkeligheden, har fået diagnosticeret folat mangel. Dette vil dog ikke føre til livstruende tilstand for patienten, fordi hvis der er overskuddet af folat, bliver dette deponeret i leveren til senere brug. Jeg synes selv, at det vil være bedre at få et apparatur som måler lavere P-Folat end et apparatur der måler højere P-Folat værdi. På denne måde opdages der med sikkerhed patienter med P-Folat mangel eller dem hvis P-Folat koncentration er på vej mod de lave værdier. Til fordele ved indførelsen af AutoDelfia til P-folat analysen henvises til diskussionsafsnit sidste del af AutoDelfia måling af Ercs-Folater og P-Folat, hvor det er diskuteret. Fordele og ulemper ved indførelse af P-Folat analysen til Architect i2000 SR En af fordele vil være, at der kun bruges et grønt heparin glas til anæmi udredning analyser; B12, ferritin, og folat, som bliver analyseret i Architecti2000 SR. Dvs. afdeling sparer glas og tid, og lægen får analyseresultater samtidig. En af fordele vil være, at der behøves ikke at oplære personalet mht. P-Folat analysering over i Architect i2000 SR, da apparatet allerede står på KBA og er i brug. Analysen procedurer er ikke forskellige end de andre analyser som allerede udføres på apparatet. Der kræves ikke specielle procedurer til P-Folat analysen mht. kalibrering, kontrol kørsel, prøvekørsel, og resultatafgivelse. En af fordelene vil være er, at indførelsen af P-Folat på Architect i2000 SR vil betyde hurtigere svar, og hermed hurtigere behandling til patienten. Nogle gang, hvis kontrollerne af Ercs-Folat analyse ikke er godkendt, skal bioanalytiker igen hæmolysere erytrocytter, hermed tager analysen dobbelt så langtid at udføre. En af ulemper vil være at der bruges LH-glas til anæmi udredning på afdeling. Dette kan påvirke resultater af P-Folat, da plasma ikke bliver afpippetteret efter centrifugering. Forskellige faktorer, der påvirker P-Folat analysen bliver diskuteret længere i diskussion til holdbarheden af P-Folat. 31

6.2.1 Architecti2000 SR præcision Hvis an analyse skal indføres på afdeling er der retingslinje, der indeholder hvilke parametre der skal bestemmes ved en validering. Dette ses ud fra dokumentet Validering af analysemetoder på afdeling. Vi har dog kun lavet interseriel og intraseriel præcision af apparatet, da vi ønsker at udføre en præcision forsøg på apparatet. Interseriel og intraseriel præcision Undersøgelser forgår i 20 dage, hvor kontrollerne fra Abott i 3 niveauer blev målt. Resultater ses i tabel 3 i resultat afsnit. Opgivet i CV% er impræcision ved det low level på 8,9%, medium level på 3,8% og high level på 1,8 %. De opgivne værdierne fra fabrikanten for måleområder 10,9 45,24 nmol/l ligger 10%, men måleområder mellem 3,4-10,88 nmol/l er 0,58%. Der ses ud fra variationskoefficienterne at medium og high level passer godt med CV% fra fabrikanten da de begge giver en CV% på 8,9% og 1,8%. SD af level low som er på 0,48 passer godt i forhold til den opgivne værdi fra fabrikanten. Der kan være mange årsagerne til at mine resultater ligger lidt forskellige fra hvad fabrikanten oplyser, f.eks det kan godt være pga. antallet af målinger. Fabrikanten har lavet deres forsøg i 20 dage, hvor de har taget 5 forskellige prøver og blev testet i 3 kørsel med dobbelt bestemmelser, 2 gange om dagen. Antallet af hvor mange målinger der er fortaget på en prøve, kan være med til at mindske variationer, der kan påvirke præcisionen. Ud fra CV% for de forskellige kontrol niveauer fra mit forsøg, ses der at medium og high level har en lav CV%, som kan tyde på at disse kontrolniveauerne er meget mere stabil end det lave kontrolniveau. I afdeling er der dog nogle forskellige CV grænser som er tilladt, f.eks. der er nogle analyser som kræver en maksimal CV% på 5% og andre analyser som har en krav på maksimum 10%. De tilladte maksimal CV% afhænger af hvilken analyser der er tale om, og der tages hensyn til biologisk variation, og til P-Folat analysen vil det være fornuftig at vælge en CV% på maksimum 10% pga. de forskellige biologiske variation, som er om talt i teorien. Udover den interserielle impræcision, er den intraserielle impræcision også fundet. Til intraseriel impræcision blev kontrol low og kontrol high fra Abotts brugt. Ud fra tabel 5, blev den intraserielle impræcision udgivet på CV% på kontrol low blev til 5,5% og kontrol High på 0,89%. Ud fra dette tyder det på, at Architect i2000 SR måler stabilt i de høje niveauer end det lave niveau. 32

Ifølge en undersøgelse lavet af Owen, W.E. et al. (18) viser at Architect i2000 folat analysen den bedste analytisk metode i forhold til 5 andre biokemiske apparater. Studiet er bygget på at undersøge linearitet og impræcision af 5 aparatter i forhold til erytrocyt folat og plasma folat. Der er også en anden artikel(19) skrevet af Hubl, W. et al. hvor de har evalueret den analytisk metode processen af Architect ci8200. Apparatet er også fra Abott og forskellen mellem Architect i2000 SR og Architect ci8200 er, at den anden nævnte er en større og bedre udgave af Architect serien. Analyseprincip for Folat analysen er dog den samme. De har lavet en intraseriel impræcision ud fra Architect kontroller, en low og en high. De har fået intraseriel impræcision at være på ca. 5,7% på den lave værdi og 5,9% på den høje værdi. Deres forsøg viser, at Architect giver en lav og accepteret CV%. Ifølge mine og andres (19) fundne resultater er Architect interseriel og intraseriel præcion ligger i under den maksimal CV% som er på 10%, herved har Architect i2000 SR udviser en god og acceptabel præcision til analysen P-Folat, som lever op til både firmaet og afdelingens krav på CV%. 6.3 Kvalitetssikring Inden analysering af P-Folat på både Architect i2000 SR, blev der på hver analysedag analyseret en lav, mellem og høj kontrol. For hver kontrol niveau er der angivet et accept interval, som kontrolværdier skal ligge indenfor, og kontrolværdier bliver plottet ind i Levey-Jennings kort. Disse kontrolgrænser er fastlagt fra Abott, hvor kontrollerne blev fremstillet. Til vurdering af Levey-Jennings kort, er det ikke nok med visuel vurdering, men Westgaards-regler bliver anvendt. På KBA anvendes forskellige Westgaards-regler til at acceptere eller forkaste den fundne kontrolværdi (14)(Bilag 10). Ud fra Levey-Jenningskort, som er tegnet ud fra Abotts fastlagte grænser til hver kontrol niveauer, blev punkterne fra dag-til-dag analysering (se Bilag 3 side 2) anført i kontrolkortene. Alle kontrol resultater for Low, Medium og High ligger indenfor +/- 2SD i alle 20 dage og fordeler sig omkring middelværdien. Det viser at analysen er under statistiske kontrol, da alle kontrol værdierne for de tre niveauer ligger alle sammen mellem de accepterede grænser, som er opgivet fra Abott. Ud fra Tabel 2, ses der de fundne SD og CV% fra de 3 kontrolniveauer fra Abott, som er blevet analyseret i 20 dage på Architect i2000 SR og der ses også i samme tabel de fastlagte SD fra Abott af de 3 kontrolniveauer. Vi kan se ud fra de forskellige resultater, at de forskellige SD fra Abott ligge højere end de beregnet SD fra hver kontrolniveau analyseret 33

i 20 dage. En af årsager til en stor SD fra Abott er, at de måske har beregnet SD ud fra en længere tid dag-til-dag måling, hvor jeg i forsøget kun har analyseret kontroller i 20 dage. En stor SD fra firmaet vil kun betyde, at kontrol acceptintervaller er meget bredt, hvilket gør, at kontrol resultater falder inden for de accepterede grænser. Hvis de analyserede kontroller har forskellige variation end de opgivne værdier fra firmaet, plejer afdelingen at lave deres eget kontrol kort. Der foretages 20 eller flere målinger i en periode, og herved kan laboratoriet selv fastsætte kontrol grænser til de forskellige kontrol niveauer. Ved at fastlægge egne kontrol grænser afdelingen sikrer sig at apparatet lever op til de kvalitetskrav, som laboratoriet har fastlagt, og at hvis grænserne bliver snævere, kan det kun betyde at analysen er meget mere sikker. En af fordele ved dette, er at laboratoriet selv kan afsløre hvis der er fejl på apparatet ved at se hvordan kontrol resultater ligger i en periode. For at sikre sig at kvaliteten lever op til de fastlagte krav, kan der nogle gang ske, at laboratoriet ændre analyse proceduren, eller vælge andre kontroller end fra firmaets, som er meget mere sensitive. Jeg vil gerne sammenligne kontrolkortene fra Abotts kontroller og BioRads kontroller, i forhold til hvordan kontrolresultater fra hver niveauer ligger i kontrolkort. Kontrolkortene er lavet, hvor kontrolgrænserne blev beregnet fra dag-til-dag målinger af kontroller i 20 dage. Ud fra de forskellige kontrol kort, som er lavet fra Abotts kontroller fra figur 11,12 og 13 er der kun 1 kontrol skred fra kontrol i det mellemste niveau, og 1 kontrol skred fra i det høje niveau. Begge kontroller overstiger ikke +/- 3SD, ifølge de regler som bruges til vurdering af kontrolkort (Bilag 10), kan kontrolanalyseresultater accepteres. Denne regel siger, at kontrolresultatet accepteres, hvis det falder over +/- 2SD en gang, men indenfor +/-3SD. Hvis vi kigger på BioRads kontrolkort som ses i figur 14, 15 og 16, er der kun 1 kontrolresultat fra hver af de forskellige kontrolniveauer, som overskrider +/- 2SD. Disse kontrol resultater overskrider dog ikke +/-3SD grænse, og derfor kontrolresultater accepteres. Hvis vi kigger på de forskellige kontrollers SD eller spredning ud fra tabel 3 og 4, giver Abotts kontrol i det lave niveau 0,48 og en CV% på 8,9% og BioRads kontrol i det tilsvarende niveau 0,40 og en CV% på 5,7%. I mellem niveau, er SD og CV% fra Abotts ligger på hhv. 0,59 og 3,6%, mens BioRads niveau ligger på 0,79 (SD) og 5,6%. I det høje niveau, ligger Abotts kontrollers SD på 0,62 og CV% på 1,8%, imens BioRads SD og CV% ligger på hhv 0,85 og 2,8%. 34

En af årsagerne, at BioRads kontroller har en større spredning end Abotts måske er pga. BioRad kontrollers holdbarhed. I forsøget har vi taget et nyt sæt BioRads kontroller fra fryseren hver 3 dage. Proceduren har vi gjort, fordi ifølge BioRads pakningsindlæg, er kontrollerne kun holdbare 3 dage på køl ved 2-8 C og 20 dage ved -10 til -20 efter rekonstituering. Set fra denne betragtning kan holdbarheden være årsagen til BioRads spredning. F.eks. hvis vi nu kigger på Figur 13 som er kontrolkort til BioRads høj niveau, kan vi se, at kontroller gå op og ned hele tiden. Hver 3. dage falder kontrollernes koncentration i forhold til den første dag. Kontrolresultaterne fra første dag (hvor kontroller er taget ud fra fryseren) til anden dag falder i koncentration, og koncentration falder igen i 3.dag. Dette kan tyder på, at BioRads kontroller er ikke så holdbare i forhold til Abotts, som f.eks. kan holde i lang tid. Ud fra forskellige SD af kontrol resultater, kan vi se at spredning af BioRads kontroller i det mellemste og høje niveau er højere end Abotts kontroller. I kontrolniveau low, er det Abotts kontroller der er højere end BioRads. SD og CV% af hver kontrol niveau giver os en idé om, hvilken reagensgrupper der vælges som kontrol til P-Folat analyse. Da vi tidligere diskuteret at et bud på en maksimal CV% af kontrollerne vil være på 10%, kan jeg jo ud fra vores resultater sige, at begge kontrolsæt er lige gode, da alle CV% af de forskellige kontrolniveauer ligger under 10%. Hvis nu afdelingen skal vælge om de vil bruge Abotts eller BioRads kontroller til P-Folat analysen, kan de måske kigge på nogle fordele og ulemper ved begge kontroller. Det vil være en fordele på KBA, hvis Abotts kontroller bruges i stedet for BioRads, da dette vil betyde mindre arbejdsbyrde. Abotts kontrollerne er klar til brug ved levering, dvs. kontrollerne slet ikke skal rekonstitueres. Der skal slet ikke tages hensyn til, hvornår kontrollerne er lavet, hvornår det blev frosset ned eller hvornår de er tages i brug. Et fornuftigt valg vil være at vælge Abotts kontroller frem for BioRads. 6.4 Holdbarhedsforsøg Diskussion bygger primært på de to forsøg hvor vi sammenligne resultater hhv. af P-Folat opbevaret på køl i 24 timer og P-Folat opbevaret ved stuetemperatur. Forsøgets formål var at finde ud af om der en signifikant forskel på P-Folats resultater, hvis prøven bliver opbevaret i forskellig opbevaringstemperatur. 35

Differensplot For det første, havde jeg afbildet resultater i et differensplot for at få et grafisk overblik, hvordan de to forskellige P-Folats resultaters middelværdier ligger i forhold til den sande værdi. Figur 17 viser differensplot, hvor differenserne mellem den sande P-Folat værdi og P-Folat resultater efter 24 timer som blev opbevaret på køl. Ud fra differensplot ses der, at der er 7 målinger, som ligger over bias, og de resterende målinger som ligger under bias som er 0- linjen. De ligger mellem intervallet [-2,6:1,1] nmol/l. Ud fra en grafisk vurdering kan vi se, at P-Folat resultater opbevaret på køl har en tendens til at stige efter 24 timer. Figur 18 viser differensplottet, hvor differenserne mellem den sande P-Folat værdi og P- Folat resultater efter 24 timer som blev opbevaret ved stuetemperatur. Punkterne i differensplottet er fordelt over og under 0-linjen. 17 resultater dog ligger over 0-linjen som tyder på at P-Folats resultater har en tendens at falde efter opbevaring ved stuetemperatur i 24 timer. Vi kan dog ikke se fra differensplotte, om der er en signifikant forskel på de to stikprøver, da de to differensplotter er brugt til grafisk vurdering om hvordan differenser ligger omkring 0-bias. Dobbeltsidet parret T-test I resultatafsnittet tabel 5, ses der at middelværdier for alle P-Folats stikprøver ligger tæt på hinanden, hvor forskellen mellem den sande P-Folat middelværdi og P-Folat på køl er på - 0,29 nmol/l. Differensen mellem den sande P-Folat middelværdi og P-Folat ved stuetemperatur er 0,46 nmol/l. Differenserne tyder på, at der er en observerede forskel på middelværdierne og T-test bruges til at finde ud af om der er en signifikant forskel. Til sammenligning af den sande P-Folat middelværdi og P-Folat på køl, bruges t-værdier, T obs = 1,96 og T tabel = 2,052. T obs < T tabel, dvs. p > 0,05, dermed forkastes H 1 hypotesen og der påvises ingen signifikant forskel mellem de to stikprøvers middelværdierne. T-testen mellem den sande P-Folats middelværdi og P-Folats middelværdi som blev opbevaret ved stuetemperatur, påviser ingen signifikant forskel. T obs = 1,82 og T tabel = 2,052, dvs T obs < T tabel og p > 0,05, dvs H 0 hypotesen ikke forkastes. Alle t-test beregninger viser, at opbevaring af prøven, enten på køl eller ved stuetemperatur, har ingen påvirkning til P-Folats resultater. Dvs. selv om prøven ikke bliver opbevaret på køl, som firmaets anbefaler, er der ikke signifikant forskel på P-Folats 36

resultater efter 24 timer. Som nævnt under vores problembaggrund, vil vi undersøge hvordan temperaturen påvirker P-Folats holdbarhed, hvis man nu sender prøven via posten. Vi har dog kun undersøgt temperaturens påvirkning, og fjernet yderligere faktorer som kan påvirke analyseresultat, f.eks. lys, da prøverne blev opbevaret i en mørk æske. Prøverne blev ikke transporteret, derfor præanalytisk forhold, som behandling af prøven under transport, der kan påvirker resultatet også er fjernet. Blodprøverne blev samlet om morgen fra kl.8-10, og centrifugeret efter kl. 10. Prøverne blev først analyseret efter kl. 15, dvs. først ca. 7 timer efter prøvetagning. Vi har ikke gemt prøverne, som var de sande P-Folat værdi, på køl imens vi ventede på, at de bliver analyseret, men de blev beskyttet mod lys. Dette kan påvirke P-Folat resultat, da lyset får folat koncentration at falde. Det samme sker på KBA s rutine i laboratoriet, hvor prøverne bare henstår i et stativ indtil de skal analyseres. Der skal også nævnes, at blodprøverne ikke blev beskyttet mod lys, da vi var i gang med tage blodprøver i ambulatorium. Ifølge firmaets anbefaling, bør plasma prøver afpipetteret, beskyttet mod lys, og opbevaret på køl efter modtagelsen. På baggrund af den praktiske gennemførsel af forsøget, er jeg lidt kritisk, om vi kan stole på den sande P-Folat værdi, da de blev opbevaret ved stuetemperatur i 6-7 timer før analysering. Derfor undersøgte jeg om der var andre der har undersøgt påvirkning af lys og temperatur, og jeg fandt frem til 3 artikler (20,21,22). Artiklernes pålidelighed og validiteten blev vurderet før brug af artiklerne. Ud fra en undersøgelse lavet af Kösem A. et al(20) og Mastropaolo W. et al (22), er det undersøgt, at P-Folat prøver ikke behøves at beskytte mod lys, hvis denne bliver analyseret samme dag, prøven bliver taget. Ifølge undersøgelser af Mastropaolo (22), at P-Folat som opbevares 8 timer uden lys beskyttelse, ikke giver en klinisk signifikant på resultater, dvs ingen påvirking på P-Folat resultater. Ifølge disse undersøgelser, kan afdeling holde fast på rutinen på ambulatorium, hvor prøverne ikke beskyttes mod lys lige efter blodprøvetagning og centrifugering. P-Folat opbevaret på køl blev først analyseret efter ca. 25 timer efter blodprøvetagning og P-Folat ved stuetemperatur først analyseret næste dag ca. 26 timer efter blodprøvetagning. Vores formål var jo at undersøge P-Folat efter 24 timer ved forskellige temperatur, men der gik ca. 25-26 timer mellem blodprøvetagning og analysering. Dette var uundgåeligt, da det tog lidt tid for apparatet at starte op og før kontrollers resultater var færdig. De er disse ting som man altid skal tage hensyn til når man kører på Architecti2000 SR. Dette kan jo have en betydning for resultater hvis nu T-testen viser en signifikant forskel på forskellige 37

opbevarings temperatur. Men da der ikke var nogen signifikant forskel mellem P-Folat opbevaret ved forskellige temperatur i forhold til de sande P-Folat resultater, er det påvist at temperaturen eller hvor lang tid der gik før analysering, ikke påvirker P-Folat resultater. Hvis P-Folat bliver indført på KBA, kan afdeling rolig fortsætte med laboratoriets rutine, uden at der tages specielle hensyn til P-Folat prøver. Ud fra vores resultater, viser de at forskellige temperaturopbevaring i 24 timer har ingen betydning til P-Folat resultater, dvs. afdeling kan validere og frigive en korrekte P-Folat svar og patienten får en rigtig diagnose og behandling. Ifølge et forsøg lavet af Komaromy G.et al (21), hvor de har undersøgt holdbarhed af folate i serum(s-folat), er folat koncentration stabil i køleskabet op til 7 dage, hvis prøven er beskyttet mod lys. Til de prøver som ikke blev beskyttet mod lys, viser resultater en signifikant forskel mellem den sande S-Folat og S-Folat værdi først efter 3.døgn i køleskabet. Ifølge Abotts P-Folats pakningsindlæg, at hvis P-Folat ikke analyseres omgående, er P-folat kun holdbart hvis den er beskyttet mod direkte sollys i 24 timer i køleskabet, og op til 7 dage ved -20ºC. Dog hvis det er serum så er det holdbart 7 dage i køleskabet og 30 dage ved < -10ºC. Uf fra undersøgelsen af S-Folat(21), kan afdeling jo overveje at benytte S-Folat i stedet for P-Folat, sådan så at rutinen ikke ændres ved analysering af folat. På afdeling bliver analyserede prøver gemt i køleskabet i 3 døgn, som en sikkerhed på, hvis der er f.eks noget galt med apparatet og først bliver fikset næste dag. Eller hvis der er en ekstra rekvirering på prøven. Det vil være en stor fordele for afdeling at benytte serum i stedet for plasma til P-Folat analysering. 7.0 Konklusion På baggrund af mine resultater målt på AutoDelfia, er der fundet en lineær sammenhæng mellem Ercs-Folater og P-Folat vha. regressionsligning y = 20,42x + 397,21 og en R 2 på 0,65%. Jeg kan hermed konkludere, at P-Folatanalysen kan erstattes Ercs-Folateranalysen. Ud fra regressionsanalyse til sammenligning af P-Folatresultater målt på AutoDelfia og Architect i2000 SR, er der en lineær sammenhæng mellem de to metoder, som fremgår af korrelationskoefficienten. Ud fra de 95% konfidensintervaller af den lineære regression, kan jeg konkludere, at der er signifikant forskel mellem de to apparater. Min hypoteser, at der er ingen signifikant forskel på P-Folat måling målt på Architect i2000 SR og AutoDelfia, hermed forkastes. AutoDelfia måler P-Folat højere end Architect i2000 SR, og dette bekræfter af differensplottet. Ud fra præcision undersøgelse af Architect i2000 SR, kan vi konkludere at analysen P-Folat kan overføres til Architect i2000 SR. 38

Undersøgelsen som opfatter hvilket sæt kontroller, Abotts kontroller eller BioRads kontroller vælges, kan vi konkludere at kontroller fra begge firmaer, lever op til afdelingens analysekvalitets krav. Dette er på baggrund af resultater til sammenligning af hver kontrolniveauers SD og CV%. Dog Abotts kontroller er bedst, hvis der tages hensyn til kontrollens holdbarhed, og at den er nemmere til praksis brug. Ud fra dobbeltsidet parrede T-test, er der påvist ingen signifikant forskel på måleresultaternes middelværdier mellem de sande P-Folat resultater i forholdt til plasma prøver som er opbevaret hhv. på køl og ved stuetemperatur i 24 timer. Det stemmer overens med min hypotese, at hvis plasma prøver opbevares på køl, vil dette ikke give en signifikant forskel på analyseresultater. Hypotesen, hvor der er en signifikant forskel på P- Folat resultater som er opbevaret ved stuetemperatur i forhold til den sande værdi, forkastes 8.0 Perspektivering Hvis afdeling skal indføre P-Folat analysen på Architect i2000 SR, skal afdeling lave en fuld metodevalidering ud fra Validering af analysemetoder, som indeholder hvilke parametere, der skal undersøges før opsætning af en ny analyse. Litteraturliste (1) Van Holde, M.: Biochemistry (Second Edition), Benjamin/Cunnings Publishing Company (1996) (2) Stryer, L. : Biochemistry (Fourth Edition), Sixth Printing (1999) (3) Lyngebye, J. :Dansk laboratoriemedicin-en håndbog, København Nyt Nordisk Forlag (2001) (4) Candito M., et al: Influence of Meal on Plasma Folate and Vitamin B12, by Three Methods - and on Vitamin B6, Homocysteine and Red Blood Cell Folate. Pteridines/Vol. 16/No. 4 (5) Andersen H., et al: Immunkemiske metoder. Teori og Praksis. Nucleus (1991) (6) Lucock, M. : Folic Acid: Nutritional Bichemistry, Molecular Biology, and Role in Disease Processes. Molecular Genetics and Metabolism (2000); 71, 121-138 (7) Moat, S,J., et al, : Folate, homocystein, endothelial function and cardiovascular disease, Journal of Nutritional Biochemistry (2004)15; 64-79 (8) Orkin, S.H., et al: Nathan and Oski s hematology of Infancy and childhood 7 th edition. Elsivier Inc. (2007) (9) Mckillop D.J., et al : The effect of different cooking methods on folate retention in various foods that are amongst the major contributors to folate intake in the UK diet. British Journal of Nutrition (2002) 88, 681 688 (10) AutoDelfia pakningsindlæg for Folat analyse (11) Wallac Autodelfia Instrumental Manual (12) Architect pakningsindlæg for Folat analyse 39

(13) Architect troubleshooting guide for Folat analyse (14) Architect i2000 SR bruger manual (15) Galloway M., et al: Red cell or serum folate? Results from the National Pathology Alliance benchmarking review. J Clin Pathol (2003)56:924-926 (16) Drogan, D., et al: Plasma folate as marker of folate status in epidemiological studies: the European Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)-Potsdam study). British Journal of Nutrition (2004) 92, 489 496 (17) Gunter E.W., et al: Results of an internation round robin for serum and whole-blood folate. Clinical Chemistry (1996)42:10 1689-1694 (18) Owen, W.,et al: Comparison of Five Automated Serum and Whole Blood Folate Assays. Am J Clin Pathol (2003) 120:121-126 (19) Wilson, D., et al: Issues in Immunoassay Standardization: The Architect Folate Model for international Harmonization. Clinical Chemistry (2005) 51, No. 4 (20) Kösem, A. et al: Effect of Light on Serum Vitamin B and Folate Levels. Turkish Journal of Biochemistry Turk J Biochem (2007); 32 (2) ; 61 64. (21) Komaromy-Hiller G. Effect of storage on serum vitamin B12 and folate stability. Annals of Clinical and Laboratory Science, Vol 27, Issue 4, 249-253 (1997) (22) Mastropaolo, W., et al: Effect of Light on Serum B12 and Folate stability. Clinical Chemistry (1993) Vol. 39 no.5 (23) Nelson, B., et al: Affinity extraction combined with stable isotope dilution LC/MS for the determination of 5-methyltetrahydrofolate in human plasma. Analytical Biochemistry Volume 313, Issue 1, side 117-127 (2003) (24) H. A.M., et al: I Århus analyserer vi P- Folater i stedet for Ery-Folater DSBK Nyt 5 (2004). (25) KPLL nyt. Tekst fra KPLL-info (26) Lauritsen, O.S.: Statistikbog for Bioanalytiker. 2.udgave, Bioanalytikeruddannelsen KBH (2006) (27) Hansen, J.B. : Statistik for praktikere. Naryana Press, Gylling (2002) (28) KBA Frederiksberg hospital Datablad for Ercs(B)-Folater, stofk. (29) http://www.dentistry.leeds.ac.uk/biochem/lectur e/nutritio/nutritio.htm 40

Bilag 1 Ercs-Folat og P-Folat målt i AutoDelfia P-Folat Prøv nr. Ercs-Folater (µmol/l) Ercs-Folater (nmol/l) (nmol/l) 1 0,62 620 13,1 Tabel 6: Resultater for Ercs-Folater og P-Folat 2 1,02 1020 41,2 3 1,02 1020 17,4 4 1,75 1750 34,6 5 1,04 1040 18,5 6 0,71 710 21,3 7 0,6 600 8,14 8 0,34 340 8,74 9 1,29 1290 48,2 10 0,69 690 13,7 11 0,56 560 7,15 12 0,62 620 16,6 13 0,62 620 10,2 14 1,6 1600 70,8 15 0,42 420 7,75 16 0,64 640 20,2 17 0,6 600 16,6 18 0,88 880 12,7 19 0,56 560 9,86 20 0,74 740 13,9 41

21 1,29 1290 47,3 22 0,75 750 18,2 23 0,25 250 7,58 24 0,53 530 9,04 25 0,77 770 15,9 26 1,12 1120 36,2 27 1,04 1040 30,1 28 0,38 380 8,32 29 0,52 520 11,4 30 0,72 720 11,1 31 0,67 670 8,91 32 0,55 550 13,3 33 0,55 550 11,6 34 0,51 510 7,86 35 0,81 810 14,7 36 0,58 580 19,2 37 1,06 1060 15,3 38 0,44 440 8,61 39 0,52 520 10,3 40 0,98 980 26,9 41 0,5 500 10,8 42 1,16 1160 24,9 43 0,9 900 25,2 44 0,67 670 11,1 45 0,85 850 21,2 42

46 0,48 480 10 47 0,58 580 14,8 48 0,79 790 15,2 49 1,31 1310 18,3 50 0,92 920 19,7 43

P-folat P-Folat Prøv nr, (architect) (autodelfia) Differens 1 10,2 13,1 2 32,6 41,2 3 12,6 17,4 4 31,9 34,6 5 15,8 18,5 6 20,9 21,3 7 5,4 8,14 8 6,5 8,74 9 37,2 48,2 10 11,8 13,7 11 5,7 7,15 12 16,2 16,6 13 8,5 10,2 14 39,7 70,8 15 5,5 7,75 16 18,8 20,2 17 13,9 16,6-2.9-8.6-4.8-2.7-2.7-0.4-2.7-2.2-11.0-1.9-1.5-0.4-1.7-31.1-2.3-1.4-2.7 Bilag 2 side 1 44

18 10,9 12,7 19 7,5 9,86 20 8,8 13,9 21 35,3 47,3 22 17,1 18,2 23 6,6 7,58 24 6,6 9,04 25 12,8 15,9 26 32,0 36,2 27 29,0 30,1 28 6,1 8,32 29 9,6 11,4 30 10,6 11,1 31 7,3 8,91 32 10,0 13,3 33 9,6 11,6 34 5,8 7,86 35 13,2 14,7 36 19,6 19,2 37 13,9 15,3 38 5,5 8,61 39 8,7 10,3 40 26,0 26,9 41 8,8 10,8 42 24,9 24,9-1.8-2.4-5.1-12.0-1.1-1.0-2.4-3.1-4.2-1.1-2.2-1.8-0.5-1.6-3.3-2.0-2.1-1.5 0.4-1.4-3.1-1.6-0.9-2.0 0.0 45

43 24,4 25,2 44 9,1 11,1 45 22,9 21,2 46 8,3 10 47 15,0 14,8 48 12,0 15,2 49 14,4 18,3 50 19,2 19,7-0.8-2.0 1.7-1.7 0.2-3.2-3.9-0.5 P-Folat analysering på hhv, AutoDelfia og Architecti2000 SR Tabel 7: P-Folat resultater malt på Architect og AutoDelfia. P-Folat Architect P-Folat AutoDelfia Middelværdi 15,30 18,27 Standardafvigelse 9,39 12,49 46

Bilag 2 Side 2 Regressionsanalyse fra excel Koefficienter Standardfejl t-stat P-værdi Nedre 95% Øvre 95% Skæring 2,32 0,78 2,96 0,0048 0,73 3,88 Hældning 0,7104 0,035 20,04 5,75E-25 0,64 0,78 T-test for hældning Signifikansniveau α = 0,05 Hypoteser: H 0 : hældning = 1 H 1 : Hædning 1 P = 0,0048, dvs. p < α H 0 forkastes, dermed er hældning signifikant forskellige fra 1 T-test for skæring Signifikansniveau α = 0,05 H 0 : Skæring = 0 H 1 : Skæring 0 P = 5,75E-25, dvs. p < α H 0 forkastes, dermed er skæring signifikant forskellige fra 0 47

Bilag 3 side 1 Architect kontroller (nmol/l) Dag Low Medium High 1 4,6 16,3 35,0 2 5,6 15,3 34,6 3 5,5 16,7 34,7 4 5,6 16,2 35,4 5 5,2 17,2 33,9 6 5,7 16,7 34,1 7 5,7 17,1 34,8 8 5,0 16,2 34,9 9 6,3 17,2 34,6 10 4,5 15,2 34,6 Low Medium High Middelværdier 5,36 16,42 34,44 SD 0,48 0,59 0,62 CV% 8,9% 3,6% 1,8% Middelvæerdi + 1 SD 5,84 17,01 35,06 Middelvæerdi - 1 SD 4,88 15,83 33,82 Middelvæerdi + 2 SD 6,32 17,06 35,68 Middelvæerdi - 2 SD 4,4 15,24 33,2 Middelvæerdi + 3 SD 6,8 18,19 36,3 Middelvæerdi - 3 SD 3,92 14,65 32,58 Tabel 9: Beregninger af forskellige statistiske tal til Abotts kontroller vha. excel 11 4,8 16,3 34,0 12 5,1 16,0 33,3 13 5,1 16,0 32,7 14 5,6 16,1 34,9 15 5,8 16,8 34,3 16 5,3 16,7 34,5 17 6,0 17,1 34,8 18 4,9 16,4 34,4 19 5,8 17,0 35,0 20 5,1 15,8 34,3 48

Tabel 8: Kontrol resultater for Abott i 20 dage BioRad kontroller(nmol/l) Dag Low Medium High 1 7,0 14,4 30,1 2 7,0 14,7 30,1 3 6,8 14,9 29,4 4 6,9 15,3 31,0 5 6,7 15,3 32,0 6 6,7 14,4 29,5 7 6,7 15,5 31,7 8 7,0 15,5 30,1 9 7,7 14,9 29,5 10 6,6 15,3 30,6 11 6,4 13,9 29,8 12 6,4 13,3 29,0 Low Medium High Middelværdier 6,9 14,97 30,24 SD 0,40 0,79 0,85 CV% 5,7% 5,3% 2,8% Middelvæerdi + 1 SD 7,3 15,76 29,39 Middelvæerdi - 1 SD 6,5 14,18 31,09 Middelvæerdi + 2 SD 7,7 16,55 31,94 Middelvæerdi - 2 SD 6,1 13,39 28,54 Middelvæerdi + 3 SD 8,1 17,34 32,79 Middelvæerdi - 3 SD 5,7 12,6 27,69 Tabel 11: Beregninger af forskellige statistiske tal til BioRad kontroller vha. excel 49

P-Folat i nmol/l [MAUREEN JOY HANSEN 13 6,5 16,2 30,6 14 6,8 13,9 29,6 15 7,4 14,1 29,0 16 6,8 15,5 31,1 17 7,5 15,8 30,6 18 7,1 14,6 29,6 19 7,8 15,9 31,2 20 7,0 16,0 30,3 Tabel 10: Kontrol resultater for Abott i 20 dage Bilag 3 side 2 Ud fra Abotts kontroller rådata fra Bilag 4, bliver de kontrol resultater i 3 forskellige niveauer plottet ind i Levey-Jennings kort. 8 7 6 5 4 3 Kontrol Kort: Low Level 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920 Serie +/-2SD 4 Serie 7 Serie 1 +/- 1SD Serie Abotts kontrol 3 Serie Forventede 9 middelværdi -/+ 3SD 50