Angiogenese i coloncancer

Professions Bachelor Projekt 2012 Immunhistokemiske farvninger med markørerne Endocan, CD105 og CD34 Bioanalytikerstuderende: Studienummer: 96420 Vejledere: Judith Jensen, Klinisk Patologisk Afdeling, Vejle Sygehus Louise Nørgaard, VIA University College, Århus Antal tegn: 50.080 tegn inkl. mellemrum

Indhold Forord...2 Resumé...3 Introduktion...4 Problemformulering...5 Målformulering...5 Teoretisk baggrund...5 Angiogenese...5 Immunhistokemisk teknik...8 Immunhistokemiske markører...11 Statistik...14 Materialer...15 Metode...16 Før projektstart 19.03.2012...16 Efter projektstart d. 19.03.2012...17 Immunfarvninger...17 Optælling i mikroskop...17 Statistiske beregninger...19 Resultater...20 Immunfarvninger...20 Optællinger...22 Statistiske beregninger...26 Intraobservant sammenligning...26 t-test...27 MVD sammenligningsplot...28 Histogrammer...30 Differensplot...32 Procentvise afvigelser...33 Diskussion...34 Immunfarvninger...35 Statistik...39 Endocan...39 CD105...40 CD34...41 Dobbeltbestemmelse med Endocan...41 Perspektivering...42 Konklusion...42 Referencer...44 Bilag...47 1

Forord Denne projektrapport er resultatet af 9-10 ugers studietid, modul 14 på bioanalytikeruddannelsen. Tiden blev dels brugt på praktisk laboratoriearbejde, på Klinisk Patologisk Afdeling (KPA) på Vejle Sygehus og dels rapportskrivning. Det praktiske arbejde foregik i samarbejde med M14-bioanalytikerstuderende Anette W.R. Larsen. Følgende personer vil jeg gerne sige tak for vejledning, hjælp og mange gode råd: Forskningsbioanalytiker Birgit Sørensen, bioanalytiker Helle Johnsen, bioanalytiker Lone Nielsen, alle KPA i Vejle. Tak til professor Flemming Brandt Sørensen for ide og opstart af projekt og uvurderlig undervisning undervejs. En stor tak til Troels Wind, VIA University College, der ledte mig igennem statistikkens begrebsjungle. En særlig tak til Judith fordi hun holdte os ud og holdt mig oppe., 96420@viauc.dk Dato Underskrift 2

Resumé Dette projekt omhandler en sammenligning af 3 immunhistokemiske markører, Anti- Human Endocan, CD105 og CD34. Alle tre antistoffer er rettet mod antigener på endothelceller. Vores undersøgelse gik på, om Endocan var bedre og lettere at reproducere resultaterne for end de 2 gammelkendte markører. Vi undersøgte omkring 150 colorectal cancer snit fra 50 patienter, som i 2004 var blevet opereret på Vejle Sygehus. Snittene var skåret som nabosnit for at øge sammenligningsgraden. Vi brugte Micro Vessel Density (MVD) metoden til at tælle karrene efter. Vi brugte et okular med et tællekammer med et areal på 0,06825 mm 2. Vi var 2 i gruppen og talte alle 150 snit uafhængigt af hinanden og sammenlignede først til slut resultaterne. Vi brugte samme mikroskop og samme okular. Vi skulle hver finde 3 hotspots i overgangen mellem normalvæv og cancervæv og så tælle ved 200x forstørrelse. Resultaterne viste sig at være så forskellige, at vi må sige, at reproducere hinandens resultater, kunne vi ikke. Som en lille ekstra undersøgelse, prøvede jeg om jeg kunne reproducere mig selv. Jeg lavede en dobbeltbestemmelse på 20 Endocan snit, hvor jeg på 2 forskellige dage talte karrene på disse. Resultaterne var noget bedre end ved interobservant, men der var stadig store differencer på enkelt tilfælde. Endocan var lettere og mere behagelig at tælle, da cellerne her var mere afgrænset og lettere at skelne, end for de andre 2 markører. Men ikke lettere at reproducere resultaterne for. 3

Introduktion En af de hyppigst forekommende cancerformer i verden i dag er colorectal cancer, i Danmark er der hvert år ca. 2700 nye tilfælde, på verdens plan omkring 1 million (Zou, et al., 2008) (Kræftens-Bekæmpelse). På trods af mange gode og nyttige medicinske såvel som kirurgiske behandlingsformer, er det alligel en cancerform med forholdsvis kort overlevelsesrate efter diagnosen er stillet, over 40% er døde, som følge af sygdommen efter 5 år. Angiogenese er nydannelsen af blodkar ud fra eksisterende blodkar (Foghsggaard, et al., 2001). Denne funktion er meget vigtig også for tumorer, da al vækst afhænger af tilførsel af næringsstoffer og drænage af affaldsstoffer. Dette kræver en konstant nydannelse af endothelceller, som danner grundlaget for nye kapillærer. Hurtigt voksende tumorer kræver en øget mængde næringsstoffer og derfor vil angiogenesen naturligt være større i disse tumorer. Ved immunhistokemisk farvning anvendes antistoffer mod helt specifikke antigener i cellerne. Ved at vælge et antistof mod et antigen på nydannede endothelceller, kan farvningen give et billede af, hvor stor angiogenesen er i vævet og dermed, hvor hypervaskulær og aggressiv canceren er. Denne udvælgelse af antistoffer er imidlertid ikke så enkelt, da de nuværende kendte antigener ikke kun findes dette ene sted eller de udtrykkes ikke på alle nydannede endothelceller, nogle er vævsspecifikke. Vi har udvalgt 3 angiogenese immunmarkører for at sammenligne disse og vi har lagt vægten på antallet af kapillærer i overgangen mellem cancervæv og normalvæv. Dette har vi valgt, da det er blodtilførslen udenpå tumoren, der er afgørende for væksten (Foghsggaard, et al., 2001). Differentieringen mellem de forskellige tumor-typer kan gøre det muligt, for lægerne, at tilbyde en mere målrettet, men også kostbar antistof-behandling (antineoplastiske antistoffer) til patienter med en særligt hurtigt voksende cancer. Behandlingen virker antiangiogenetisk ved at nedregulere vækstfaktorerne på endothelcellerne (DLI). Vi vælger at bruge den differentieringsmetode, der i en årrække har været anset som morfologisk guld standard på dette område, Micro Vessel Density (MVD) (Nico, et al., 2008). 4

Problemformulering Hvorledes adskiller Endocan sig i evnen til at farve specifikt for angiogenese i coloncancer i forhold til CD34 og CD105, og hvor godt kan det lade sig gøre at reproducere resultatet? Målformulering Begge gruppemedlemmer vil, uafhængigt af hinanden, finde 3 hot-spots og tælle endothelceller på alle 150 glas. Derefter vil jeg udføre forskellige statiske beregninger såsom t-tests og optegne differensplots på disse resultater. Her ud fra vil jeg vurdere reproducerbarheden. Jeg vil måle objektivets tællekammer op ved hjælp af et micrometer grid og beregne arealet. Dette skal bruges til beregning af Micro Vessel Density (MVD), for hvert enkelt snit. Jeg vil give min vurdering af, hvilken markør, der er mest reproducerbar ved angiogenese i coloncancer. Teoretisk baggrund Angiogenese Angiogenese er nydannelse af blodkar ud fra eksisterende blodkar. Der forskes meget i dette område især inden for cancerbiologien. En tumor kan ikke vokse sig større end 1 mm 3, hvis ikke den kan formå at tiltrække sig nye blodkar. Hvis en tumor skal kunne metastasere kræver det, at den har forbindelse ud til resten af organismen via kapillærnettet. Men tumorer stimulerer ikke kun til den almindelige form for angiogenese, de kan også opnå kapillærer med flere specialiseringer og anderledes udseende end ikkepatologiske kar (Azam, et al., 2010). Angiogenese er en kompliceret proces, hvor mange proangiogene og antiangiogene faktorer spiller ind, se figur 1. 5

Figur 1: Oversigt over nogle af de faktorer, der spiller ind ved angiogenesen, både for og imod (InforMEDical). Behovet for angiogenese opstår oftest, når der opstår hypoksiske tilstande, altså iltmangel i vævet. Hypoksi stimulerer til en mængde forskellige faktorer og signalveje, jeg vil i det følgende kun koncentrere mig om 2 af de vigtigste, nemlig Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) og NitrogenOxid (NO). I cellerne i det hypoksiske væv opreguleres ekspressionen af VEGF og der secerneres store mængder af dette protein ud i den ekstra cellulære matrix. Hvor stor effekt VEGF får på endothelcellerne bestemmes af receptorerne på cellerne. Der findes 2 slags receptorer til VEGF, VEGFR-1 og VEGFR-2. VEGFR-1 sender ikke signalet fra VEGF ind i cellen, det gør kun VEGFR-2, receptor-1 virker altså hæmmende på VEGF, ved at binde det uden signalafgivelse. Det signal VEGF blandt andet sender medvirker til at endothelcellen stimuleres til at danne nogle actinholdige udløbere, filopodia. Derved bliver cellen til en endothelial tipcelle, der kan migrere mod det hypoksiske væv ved hjælp af kemotaxi. Disse nydannede blodkar er meget skrøbelige og kræver stabilisering og modning for ikke at undergå apoptose, programmeret celleselvmord. Dette sker blandt andet ved, at tipcellen udskiller Plateled derived Growth Factor (PdGF), der tiltrækker pericytter, der omgiver og støtter endothellaget. VEGF har også en anti-apoptosisk virkning på disse nye endothelceller (Ferrara, et al., 2003) (Azam, et al., 2010). 6

Figur 2: Illustration over angiogenesen (Folkman, 2007) Som tidligere nævnt spiller NO også en rolle i angiogenesen. NO udskilles fra cellerne i det hypoksiske væv og VEGF stimulerer yderligere endothelcellerne til syntese af dette stof. VEGF blev tidligere kaldt Vascular Permeability Factor (VPF) på grund af dens stimuli mod at gøre karret mere permeabelt. NO indvirker yderligere på denne funktion blandt andet ved at få karret til at dilatere og nedsætte blodtrykket i det omkringliggende område. Det betyder, at flere små plasmaproteiner kan passere ud gennem blodkarrets væg og ud i vævet. Nogle af disse plasmaproteiner er vigtige komponenter flere steder i processen, som er langt mere kompliceret end her opgjort i hovedtræk (Olsson, et al., 2006). Tumorceller benytter sig af de veje og signalstoffer, som ovenfor beskrevet, der er den normale vej til angiogenese. Men tumorceller kan opregulere syntesen nogle af signalstofferne fx VEGF (Hansen, 2010). Denne massive udskillelse af VEGF har 4 7

hovedfunktioner: Anti-apoptose virkning på de nydannede endothelceller Forhindre modning af dendritiske celler, som har en vigtig funktion i immunforsvaret Gøre blodkarrene mere permeable og derved flere plasmaproteiner i den ekstra cellulære matrix, som blandt andet kan bruges til tumor vækst Stimulerer til lymfe-angiogenese, hvor der dannes nye lymfekar og altså mulighed for integrering af lymfekar i tumoren og derved øget risiko for metastasering. Immunhistokemisk teknik Immunhistokemiske teknikker er en række af forskellige parametre, der tilsammen betyder, at mængden af et bestemt antigen i et givent væv kan ses og vurderes i lysmikroskop. Processen kan opdeles i trin, og den valgte oversigt viser den anbefalede vej til de to detektionssystemer vi anvendte, ultraview og EnVision+. Forudsætningen er: Vævsudsnit, der er fikseret i 4% neutral buffet formaldehyd i mindst 12 timer Dehydreret og indstøbt i paraffin Paraffin-snit Varmebehandling Afparaffinering og rehydrering Blokering af naturlig aktivitet Naturligt forekommende peroxidase HRP Blokering af naturlig aktivitet: Peroxidase er naturligt forekommende i granulocytter, monocytter og makrofager og erythrocytter har en virkning, der minder om peroxidases, pseudopeoxidase aktivitet. I formalinfikserede præparater er det hovedsagligt erythrocytterne pseudoaktivitet, der skal blokeres. Men da de valgte detektionssystemer benytter Horse-Radish-Peroxidase (HRP) i 8

visualiserings-systemet, skal den naturligt forekommende peroxidase aktivitet blokeres. Hvis ikke blokeringen sker effektivt kan der forekomme uspecifik farvning i de områder, hvor den naturligt forekomne peroxidase befinder sig. Blokeringen sker ved at udsætte vævet for brintperoxid og derved forbruge peroxidasen. Demaskering HIER ph, temperatur og tid Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) er som navnet siger en demaskering af epitoper, altså at gøre dem immunaktive igen, ved hjælp af varmebehandling (Nielsen, 2005). Indvirkningen på vævet er følgende: Tværbindinger (methenbroer) mellem proteiner i vævet fjernes. Disse bindinger er opstået i forbindelse med formalinfikseringen, hvor aminosyrer kan reagere med formaldehyd: Figur 3: Methenbro mellem 2 proteiner under formalinfiksering (ICHS) Kationer, især Ca + -ioner, danner komplekse bindinger til epitoperne og derved afskæres de fra at reagere med antistoffet. Ved at bruge et kogemedium tilsat enten Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA) eller Ethylen-Glycol-Tetra-Acetat (EGTA) udnyttes disse saltes store affinitet for metalioner. Derved bindes Ca + - ionerne og epitoperne fritlægges. Proteindenaturering kan blotlægge maskerede epitoper. 9

Primært antistof - monoklonalt Inkubationstid Koncentration Skylleprocedure ph og tid Bindingerne mellem antigen og antistof eller nærmere mellem epitop og paratop baserer sig hovedsagligt på elektrostatiske kræfter, forårsaget af elektrostatisk ladning (Boenisch, 2006). Disse kræfter er meget svage og kræver at epitop og paratop er fysisk meget tæt på hinanden før, der vil dannes et kompleks og at de naturligvis har modsat ladning. Den binding, der opstår kaldes ofte for ionbinding. Boenisch et al lægger stor vægt på ph i forbindelse med styrken på disse ladninger. Hvis ph ligger omtrent midt mellem epitopens og paratopens isoelektriske punkter, vil kræfterne imellem dem være stærkest. Mange proteiner har deres isoelektriske punkt omkring ph = 6-7, positivt ladet under og negativt over (Hallager, et al., 2006). ultra View (Endocan CD34) Multimer / HRP Kromogen: DAB Kobbersulfat Kernefarvning Sekundært antistof, antimus HRP- molekyle Linker, Roche oplyser ikke hvad det består af. Figur 4: Multimer molekyle konjugeret med HRP og sekundært antistof, bruges i detektionssytemet ultraview. Frit tegnet efter (Roche) 10

EnVision+ (CD105) Polymer / HRP Kromogen: DAB+ Kobbersulf at Kernefarvn ing Enzym, HRP Dextran polymer Sekundært antistof Figur 5: EnVision+ detektionssystemet: Polymer dextan, carbonhydrat, konjugeret med HRP og sekundært antistof (Wiedorn, et al., 2001) HRP er et enzym, der reducerer brintperoxid til vand og samtidig oxiderer en hydrogendonor (Andersen, et al., 2008): 2 Donor-H + H 2 O 2 2 Donor ox + 2 H 2 O Denne evne udnyttes ved at tilsætte en opløsning af et positivt ladet kromogen (DAB + ) og H 2 O 2 efter inkubationen med det sekundære antistof (Nielsen, 2005). HRP vil oxidere brintperoxid ved at bruge H + fra kromogenet og derved udfældes DAB som et brunt tungtopløseligt stof. Dette vil ske i umiddelbar nærhed af antigen-antistofkomplekset. Det er dette brune farvestof, der kan ses i lysmikroskop. Immunhistokemiske markører Der er rigtigt mange immunhistokemiske markører, der bruges til undersøgelse for angiogenese kan opdeles i følgende kategorier (Duff, et al., 2003) (R&DSystems): En øget mængde markører ved endothel celledeling eller øget aktivitet Fx Endocan 11

Opregulering af en markør forårsaget af stress på grund af for lavt iltindhold i væv, hypoxi Fx CD105 Vækstfaktor-receptorer Fx VEGF Udefinerede endothel celle antigener Fx CD34 Proteiner udtrykt på nydannede eller re-modellerede basal membraner Endocan, ESM-1 Endothelial cellespecifik molekyle-1, (ESM-1) også kaldet Endocan er et proteoglykan (Lunginnov). Et proteoglykan er komplekse makromolekyler, der er karakteriseret ved at indeholde en proteinkæde med ofte flere lange kæder af glykosaminoglycan bundet kovalent på. Endocan er påvist at blive opreguleret i voldsom grad ved tilstedeværelse af pro-angiogene molekyler, som fx VEGF eller pro-inflammatoriske molekyler som fx Tumor Nekrose Faktor-ά (TNF-ά) (Sarrazin, 2010). Endocan vil altså være tilstede både i tumorvæv og inflammatorisk væv. Sarrazin et al. har fundet en overekspression af Endocan i tumorvæv fra flere forskellige vævstyper blandt andre mamma, nyrer og lever og at tilstedeværelsen, der betyder en dårligere prognose for patienten. Zho et al. har undersøgt forekomsten af Endocan i colorectal cancervæv (Zou, et al., 2008). Deres konklusion er, at Endocan er rigt udtrykt i normal colonslimhinde og i højt og moderat differentieret colorectalt cancervæv. Men i lavt differentieret cancervæv var det kun svagt udtrykt. Grunden til det høje indhold af Endocan i normal colonslimhinde er ifølge Zou et al. det høje indhold af mikroorganismer i tyktarmen og dens indhold. Mikroorganismerne producerer nogle virulente stoffer, som tiltrækker og aktiverer fx makrofager og monocytter. Aktiveringen består blandt andet i produktion af Interleukin-1 (IL-1), som er et meget vigtigt enzym i den inflammatoriske kaskade. Som tidligere nævnt kan de proinflammatoriske molekyler være årsag til opregulering af Endocan og derfor kan Endocan forefindes i normalt colonslimhinde. 12

Figur 6: IHC farvning, Endocan. Venstre: negativt kontrolsnit fra snit nr. 16021. Højre: Normal væv fra snit nr. 25018. Tydelig immunreaktion i epitelcellerne. CD105, Endoglin CD105 er et transmembrant glykoprotein, der er udtrykt på angiogenetiske endothel celler i rigelige mængder (Duff, et al., 2003). Det fungerer blandt andet som receptor for vækstfaktor-familien, Transforming Growth Factor (TGF-β). Hvordan og om CD105 er involveret i signalvejen for TGF-β er endnu ikke afklaret. Men at CD105 er en vigtig komponent i receptorkomplekset til TGF-β er der ingen tvivl om. Men dette vil være for komplekst at komme ind på her. Immunhistokemisk har CD105 vist sig, at være stærkt udtrykt på endothel celler i tumor væv. CD105 findes i vaskulære endothelceller, hematopoietiske progenitor celler, fibroblaster, stromal og vaskulær glat muskulatur, makrofager og mesangiale celler. Da CD105 ikke er specifikt på nydannede endothelceller, benyttes der ofte en dobbeltfarvning med fx Caldesmon, som farver glatmuskulatur fx rundt om blodkar. Figur 7: CD105 IHC farvning. Det store kar til venstre er ikke svært at tælle forbi, men de små blodkar til højre havde været lettere med en Caldesmon dobbeltfarvning. 13

CD34 CD34 kaldes også myeloidt stamcelle antigen (NordiQC). Det er et stort glycosyleret transmembranprotein med en molekylevægt på 110 kda. Hvilken funktion CD34 egentlig har, er ukendt, men et forslag er, at det har en hæmmende indvirkning på hæmatopoiesen. CD34 findes især i stamceller, megakaryocytter og endothelceller. I endothelcellerne udtrykkes det hovedsagligt på den luminale overflade på hvilende endothelceller (Siemerink, et al., 2012). Ny hollandsk forskning viser, at endotheliale tipcellers filopodia udtrykker CD34, hvilket er nyt i forhold til den hidtidige opfattelse, at CD34 kun udtrykkes i hvilende endothelceller. Filopodia vender væk fra lumen og ind mod hypoksiske væv. Karakteristisk er det, at CD34 kun udtrykkes på endothelceller i små kar, ikke i vener og arterier. Statistik Om forskellen mellem 2 populationers middelværdier er signifikant forskellige, kan afgøres ved hjælp af en t-test, der er en hypotesetest (Bendsen, 2012). Differencerne mellem middelværdierne beregnes og en t-test med én stikprøve benyttes. Signifikantniveau sættes til 5%, det betyder, at hvis differencerne afviger med mere end 5% er der signifikant forskel på populationerne. Opstilling af hypoteser gøres ud fra betragtningen om, at populationerne gerne skulle være ens, derfor sættes den sande værdi til 0: H 0 : µ = 0, hvor µ er middelværdien af differencerne H 1 : µ 0 En forudsætning for at bruge den test er, at stikprøven skal stamme fra en population, der er normalfordelt. Differencer, der udelukkende stammer fra analyseusikkerheder, altså i vores tilfælde, hvordan vi fx har fået placeret tællekammeret, stammer altid fra en normalfordelt population. t-værdien beregnes ud fra følgende formel: hvor x er 0, da dette er den sande værdi for differencer, når min hypotese er opstillet som 14

den er. µ o er den beregnede middelværdi af differencerne. (SD/ ) kaldes også SEM, Standard Error of Mean analyseusikkerheden på middelværdien. n er lig antallet af målinger. Hvis den beregnede t-værdi er større end den værdi, der findes i en tabel ved 5% signifikantniveau og det rette antal frihedsgrader, må H 0 forkastes. Der er altså signifikant forskel på de 2 populationer. Materialer 4x50 coloncancer vævssnit, 3µm. Snittene er skåret som 4 nabosnit. Skåret på rotationsmikrotom. 150 Dako Flex glas til immunfarvninger 50 Thermo Scientific Superfrost glas til HE-farvning Lunginnov Anti-Human Endocan antistof (klon-mep08). Monoklonalt IgG2a, kappa Dako CD34 antistof (klon:qbend-10) Kode: M7165. Monoklonalt mus IgG1, kappa Trichem CD 105 antistof (klon: 4G11) Kode: JA01 08/09 Lot nr. 6007746. Monoklonalt mus IgG2a Dako Antibody Diluent, Kode S2022, ph=7,2 (Dako) Reagenser til Ventana BenchMark ULTRA, UltraView detektionssystem til Anti- Human Endocan og CD34 Reagenser til farvning med CD105, EnVision+ (T-EG buffer med EGTA ph=9; 3% H 2 O 2 ; TBS-Tween vaskebuffer; EnVision+ reagenser (Linker/polymer og DAB+); CuSO 4 ; Mayers sure Hæmalun) PAP-pen Varmeskab til varmebehandling af snit Sæbe til afvaskning af glas Tissue Tek Prisma-maskinen til afparaffinering af CD105-snit og dehydrering og påsætning af dækfilm på alle 150 glas 15

Olympus mikroskop med tællekammer-okular Pannoramic Viewer Excel 2010 og Analysis toolpack til statistikberegninger Metode Før projektstart 19.03.2012 Vi udvalgte lidt over 60 blokke med coloncancer fra patienter opereret i 2004, de havde tidligere været brugt, som en del af et ph.d. studie. Vi skar 4 nabosnit á 3µm, for på den måde at sikre størst mulig sammenlignelighed. Det første snit farves på Tissue Tek Prisma umiddelbart efter skæring med en Hæmatoxylin-Eosin farvning (HE), der er en oversigtsfarvning. De andre 3 snit mærkes med rækkefølge straks efter skæring (Endocan - CD34 - CD105). Rækkefølgen på snittene valgte vi ud fra CD34 markøren. Den farver flest strukturer og bruges som en gylden standard til farvning af endothelceller. Derfor valgte vi at bruge det midterste af de 3 snit, til CD34. Indtil farvningen nedfryses disse ca. 180 snit til -20 C, individuelt indpakket i stanniol. Ved optøning forbliver snittene indpakkede indtil alle har nået stuetemperatur, dette for at undgå kondensdannelse. På glassene til immunfarvning blev der påsat kontrolsnit fra en blok vi selv fremstillede. Den bestod af 2 udstansninger, én med tumorvæv fra colon, med angiogenese, og én med normalvæv fra colon, uden angiogenese. Før udstansningerne farvede vi snit fra de oprindelige blokke med Endocan og CD34 og fandt de bedst egnede områder til udstansning, altså et område med mange positive celler og et område uden positive celler. Vi havde desværre ikke CD105 til rådighed på det tidspunkt. Men da vi senere farvede med CD105, viste det sig, at den var positiv i det samme område som de 2 andre farvninger. Vi sikrede os, at der var endothelceller hele vejen igennem kontrolblokken ved at farve et af de sidste snit inden vi satte colonvæv på glassene. Vi vurderede de farvede HE-snit for at frasortere de blokke, hvor overgangen mellem cancervæv og normalvæv var svær at skelne eller ikke-eksisterende. Numre på disse 16

blokke blev noteret og så kunne immunfarvningssnittene tages fra inden farvning. Efter denne sortering endte vi på 50 blokke. Som Modul13 projekt validerede vi Anti-Human Endocan MEP08 på Ventana BenchMark ULTRA. CD34 er valideret på samme maskine, som en rutinefarvning. Begge farvninger bruger detektionssystemet UltraView. CD105 skal farves i hånden med detektionssystemet EnVision+. Den multiblok vi brugte i vores validering af Endocan afprøvede vi også på farvninger med CD34 og CD105. Dette som en sammenligning af farvningerne og for at lære disse farvningerne at kende. Vi farvede også snit fra en vilkårlig blok med alle 3 farvninger til dette formål. Efter projektstart d. 19.03.2012 Immunfarvninger Farvning af alle 3x50 snit med Endocan, CD34 og CD105. De 2 førstnævnte på Ventana BenchMark ULTRA og sidstnævnte som håndfarvning, protokoller se bilag 2-4. Vi vurderede alle færdigt farvede snit med henblik på: Kvalitet af snit, fx artefakter Kvalitet af farvningen, fx store farveudfældninger Kontrolsnit, var endothelcellerne farvet i de områder, hvor vi vidste de skulle være, fra de tidligere farvninger, eller var der andre celler der var farvet eller var der slet ingen farve? Var kontrolsnittet fra det normale væv farvet mere end der, hvor det var forventet? Optælling i mikroskop Jeg opmålte tællekammeret i 2 dimensioner ved 200xforstørrelse ved hjælp af et micrometer grid, der er et objektglas med en målestreg på. Professor Flemming Brandt Sørensen, underviste os i teknikkerne for optælling i mikroskop med tællekammerokular: 1. Morfologisk overblik ved hjælp af HE-snit, find overgangen mellem cancervæv og normalvæv (grænsezonen) ved 40xforstørrelse 2. Immunfarvet snit: finde hotspots ud fra erfaringen fra HE-snittet på 40xforstørrelse. Ved 100xforstørrelse rettes objektbordet ind, så flest 17

mulige endothelceller er med i tællekammeret. Derefter til 200xforstørrrelse og her må objektbordet ikke flyttes. Antal kar blev talt og noteret. 3. Hotspots skulle ligge +/- 1 mm fra skellet mellem normalvæv og tumorvæv. 4. Hvis ikke der var hotspots i præparatet, udvalgte vi 3 forskellige steder i grænsezonen, og proceduren fra punkt 1 og 2 blev fulgt. 5. Snittene fra samme præparat måtte ikke mikroskoperes efter hinanden. 6. Vi skulle tælle blodkarrene uafhængigt af hinanden og først til sidst sammenligne resultaterne. 7. Samme mikroskop og okular. Vores regler for tællingen af antal blodkar var følgende: Hvis vi var i tvivl om antallet af kar, talte vi kun ét. I mange tilfælde var det svært at vurdere, om endothelcellerne rørte hinanden eller om der var afstand mellem dem, det var i disse tvivlstilfælde vi brugte denne regel. De kar der krydsede den øvre kant i tællekammeret, talte vi med De kar der krydsede den højre kant, talte vi med. Hvis karret igen krydsede forlængelsen af enten højre eller øvre kant, talte vi det ikke med. Figur 8: CD105 farvning med indtegnet tællekammer. De stiplede linier markerer, de "åbne" linier, altså der, hvor kar måtte krydse og stadig tælles med. 18

Både Anette og jeg talte på alle knap 150 snit og vores tidsforbrug var 15-20 minutter pr. snit. Vi mikroskoperede højst 4 timer på en dag, for ikke at koncentrationen skulle svigte undervejs. Derudover valgte vi at mikroskoperede 20 snit 2 gange til sammenligning af egen reproducerbarhed. Vi noterede datoerne ned for hvornår vi mikroskoperede de enkelte snit. Statistiske beregninger Jeg har valgt at lave en t-test på én stikprøve til at kontrollere om der er signifikant forskel på Anettes og mine optællingsresultater. Beregning af t-værdien vælger jeg at gøre ud fra differencerne, jeg kunne også vælge at opstille en parret t-test, hvor Analysis Toolpack (tilføjelsesprogram til Excel) fodres med vores MVD-værdier. Resultatet bliver det samme. Jeg har valgt at lave 4 forskellige grafiske afbildninger, der siger noget forskelligt om vores optællinger: 1. En grafisk sammenligning af vores beregnede MVD. Laves ved at sætte mine MVD-værdier i forhold til Anettes tilsvarende værdier. Værdierne på x-aksen burde i denne slags plot være en uafhængig variabel, altså sande værdier (Bendsen, 2012). Sådanne værdier findes ikke i vores forsøg, så resultatet vil kun være et estimat af den sande værdi. I plottene har jeg, ved hjælp af en funktion i Excel, indsat en tendenslinie, der laves som bedste rette linie ud fra middelværdier for hvert snit. Korrelationskoefficienten (R 2 ) beregnes ud fra tendenslinien og den koefficient siger noget om sammenhængen mellem de 2 tal-serier. Jo tættere den koefficient er på 1 jo større sammenhæng er der mellem serierne. Ved at omregne R 2 til procent fås den procentsats af variationen mellem værdierne, der svarer til biologisk variation, altså variationen mellem snittene. Den resterende del af variationen svarer til analyseusikkerheden af vores tællinger. 2. Histogrammer for differencerne mellem Anettes og mine målinger. Dels for grafisk at kunne vurdere forholdet mellem positive og negative differencer, da alle beregninger er foretaget ved at trække Anettes tal fra mine. Samtidig giver histogrammerne også overblik over, hvordan fordelingen af differencerne er i givne 19

intervaller. Angiogenese i coloncancer Herudfra kan normalfordelingsforholdene også ses, som den klokkeformede kurve. 3. Differensplot. Her sættes differencen som funktion af middelværdien for at kunne vurdere om antal kar/mm 2 har betydning for størrelsen af differencen. 4. Den procentvise afvigelse sat i forhold til middelværdien af differencerne. Jeg har udført følgende beregning: %-vis afvigelse = * 100% Resultater Immunfarvninger Efter vores gennemgang af alle snittene efter immunfarvningen måtte vi tage nogle få snit fra. Især var der nogle CD105-snit, der var blevet skadet under farvningen, vi endte op med 47 snit af Endocan og CD34 og 45 snit af CD105. Figur 7-9 er eksempler på farvningerne: Figur 9: IHC farvning Endocan. Pilene markerer eksempler på endothelceller/blodkar. 20

Figur 10: IHC farvning, CD105. Pilene markerer nogle eksempler på endothelceller/kar. Lidt uskarpe i kanterne og hvis de lå tættere kunne det give problemer med at skelne antallet. Figur 11: IHC farvning CD34. Pilene markerer nogle eksempler på endothelceller/blodkar. Vanskelig at skelne hvor, der er én eller to celler. Fnuller i kanterne. 21

Optællinger Opmåling af tællekammeret gav følgende resultat: 0,21mm x 0,325mm = 0,06825 mm 2 Dette resultat bruger jeg til beregning af MVD, kar/mm 2 som er den værdi, jeg vil lave mine beregninger ud fra. Eks på beregning: Blok nr. 4642 farvet med Endocan havde jeg talt følgende: 2,3,2 middelværdi =2,33 kar MVD ved 1 mm 2 = 2,33 kar/0,06825 mm 2 = 34,19 kar/mm 2 Tabel 1-4 viser MVD resultaterne og de beregnede differencer for hver af de 3 farvninger og mit eget forsøg med 20 Endocan snit. Jeg har for hver af de 3 farvninger beregnet differencen ved at trække Anettes resultater fra mine. Endocan: Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference 4642 34,19 107,45-73,26 17540-1 117,22 97,68 19,54 6458 63,49 107,45-43,96 17540-2 53,72 126,98-73,26 8252 73,26 68,38 4,88 17619 112,33 78,14 34,19 8604 53,72 102,56-48,84 18019 53,72 58,61-4,88 9462 29,30 53,72-24,42 18089 73,26 175,82-102,56 10656 107,45 234,43-126,98 18632 78,14 131,87-53,72 11417 112,33 102,56 9,77 19903 102,56 141,64-39,07 12093 92,80 131,87-39,07 20542 48,84 73,26-24,42 12612 341,88 244,20 97,68 20593 141,64 180,71-39,07 12731 200,24 385,84-185,59 20701 68,38 190,48-122,10 13337 170,94 185,59-14,65 20796 13343 405,37 307,69 97,68 21919 180,71 385,84-205,13 13950 73,26 92,80-19,54 22073 122,10 117,22 4,88 14097 122,10 87,91 34,19 22968 112,33 117,22-4,88 14649 97,68 185,59-87,91 23381 78,14 166,06-87,91 15950 58,61 92,80-34,19 24881 29,30 24,42 4,88 16021 234,43 278,39-43,96 25018 317,46 156,29 161,17 16559 87,91 122,10-34,19 25161 83,03 122,10-39,07 16565 73,26 97,68-24,42 25162 73,26 92,80-19,54 16617 24,42 39,07-14,65 25875 190,48 190,48 0,00 16874 58,61 63,49-4,88 26126 268,62 141,64 126,98 16876 263,74 263,74 0,00 30973 29,30 117,22-87,91 16962 229,55 249,08-19,54 31869 166,06 166,06 0,00 17267 34,19 97,68-63,49 31928 68,38 92,80-24,42 Tabel 1: Beregnet MVD/mm2 ud fra optællingerne og disses middelværdi på Endocan-snit 22

CD105: Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference 4642 17540-1 131,87 87,91-43,96 6458 156,29 112,33-43,96 17540-2 112,33 78,14-34,19 8252 97,68 102,56 4,88 17619 8604 53,72 63,49 9,77 18019 39,07 87,91 48,84 9462 170,94 87,91-83,03 18089 122,10 87,91-34,19 10656 117,22 122,10 4,88 18632 97,68 58,61-39,07 11417 126,98 112,33-14,65 19903 12093 146,52 92,80-53,72 20542 39,07 53,72 14,65 12612 141,64 214,90 73,26 20593 73,26 68,38-4,88 12731 307,69 229,55-78,14 20701 63,49 73,26 9,77 13337 39,07 112,33 73,26 20796 73,26 43,96-29,30 13343 175,82 210,01 34,19 21919 107,45 117,22 9,77 13950 87,91 83,03-4,88 22073 73,26 19,54-53,72 14097 53,72 43,96-9,77 22968 78,14 78,14 0,00 14649 312,58 224,66-87,91 23381 102,56 39,07-63,49 15950 63,49 87,91 24,42 24881 175,82 102,56-73,26 16021 195,36 136,75-58,61 25018 53,72 102,56 48,84 16559 190,48 122,10-68,38 25161 73,26 58,61-14,65 16565 97,68 87,91-9,77 25162 175,82 87,91-87,91 16617 68,38 68,38 0,00 25875 136,75 92,80-43,96 16874 102,56 102,56 0,00 26126 87,91 78,14-9,77 16876 63,49 53,72-9,77 30973 126,98 87,91-39,07 16962 97,68 78,14-19,54 31869 73,26 112,33 39,07 17267 53,72 97,68 43,96 31928 97,68 126,98 29,30 Tabel 2: Beregnet MVD/mm2 ud fra optællingerne og disses middelværdi på CD105-snit 23

CD34: Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference Blok nr. MVD kar/mm 2 Tina MVD kar/mm 2 Anette Difference 4642 214,90 268,62 53,72 17540-1 175,82 185,59 9,77 6458 258,85 332,11 73,26 17540-2 337,00 234,43-102,56 8252 586,08 307,69-278,39 17619 151,40 229,55 78,14 8604 224,66 190,48-34,19 18019 180,71 234,43 53,72 9462 263,74 239,32-24,42 18089 297,92 380,95 83,03 10656 156,29 234,43 78,14 18632 161,17 200,24 39,07 11417 327,23 341,88 14,65 19903 293,04 244,20-48,84 12093 156,29 214,90 58,61 20542 200,24 175,82-24,42 12612 20593 205,13 185,59-19,54 12731 332,11 385,84 53,72 20701 131,87 224,66 92,80 13337 200,24 253,97 53,72 20796 332,11 219,78-112,33 13343 317,46 249,08-68,38 21919 200,24 263,74 63,49 13950 249,08 219,78-29,30 22073 263,74 224,66-39,07 14097 156,29 293,04 136,75 22968 180,71 185,59 4,88 14649 332,11 493,28 161,17 23381 239,32 175,82-63,49 15950 249,08 293,04 43,96 24881 229,55 268,62 39,07 16021 361,42 219,78-141,64 25018 219,78 234,43 14,65 16559 210,01 229,55 19,54 25161 307,69 346,76 39,07 16565 112,33 253,97 141,64 25162 341,88 253,97-87,91 16617 297,92 219,78-78,14 25875 156,29 283,27 126,98 16874 136,75 312,58 175,82 26126 273,50 239,32-34,19 16876 151,40 205,13 53,72 30973 244,20 175,82-68,38 16962 151,40 312,58 161,17 31869 146,52 180,71 34,19 17267 107,45 214,90 107,45 31928 180,71 268,62 87,91 Tabel 3: Beregnet MVD/mm 2 ud fra optællingerne og disses middelværdi på CD34-snit 24

Endocan, dobbeltbestemmelse: Blok nr. MVD kar/mm 2 Endocan Tina (27. marts) MVD kar/mm 2 Endocan Tina (18.april) Tabel 4:Beregnet MVD/mm2 ud fra 2x3 optællinger på 20 Endocan-snit Difference 18019 53,72 53,72 0,00 18089 73,26 131,87-58,61 18632 78,14 97,68-19,54 19903 102,56 58,61 43,96 20542 48,84 73,26-24,42 20593 141,64 136,75 4,88 20701 68,38 58,61 9,77 21919 180,71 263,74-83,03 22073 122,10 136,75-14,65 22968 112,33 112,33 0,00 23381 78,14 107,45-29,30 24881 29,30 73,26-43,96 25018 317,46 156,29 161,17 25161 83,03 146,52-63,49 25162 73,26 58,61 14,65 25875 190,48 97,68 92,80 26126 268,62 234,43 34,19 30973 29,30 43,96-14,65 31869 166,06 146,52 19,54 31928 68,38 107,45-39,07 25

Statistiske beregninger Intraobservant sammenligning Jeg har valgt at lave et scoringssystem til sammenligning af mine MVD middelværdier, for på den måde, at vurdere om farvningerne viser samme tendens for hvert enkelt snit: Blok nr. Endocan MVD Kar/mm 2 CD105 MVD Kar/mm 2 CD34 MVD Kar/mm 2 Scoringssystem 0,1,2 4642 34,19 214,90 6458 63,49 156,29 258,85 1 8252 73,26 97,68 586,08 1 8604 53,72 53,72 224,66 1 9462 29,30 170,94 263,74 0 10656 107,45 117,22 156,29 2 11417 112,33 126,98 327,23 2 12093 92,80 146,52 156,29 2 12612 341,88 141,64 12731 200,24 307,69 332,11 2 13337 170,94 39,07 200,24 0 13343 405,37 175,82 317,46 1 13950 73,26 87,91 249,08 1 14097 122,10 53,72 156,29 1 14649 97,68 312,58 332,11 1 15950 58,61 63,49 249,08 1 16021 234,43 195,36 361,42 2 16559 87,91 190,48 210,01 1 16565 73,26 97,68 112,33 2 16617 24,42 68,38 297,92 0 16874 58,61 102,56 136,75 1 16876 263,74 63,49 151,40 1 16962 229,55 97,68 151,40 0 17267 34,19 53,72 107,45 1 17540-1 117,22 131,87 175,82 2 17540-2 53,72 112,33 337,00 1 17619 112,33 151,40 18019 53,72 39,07 180,71 0 18089 73,26 122,10 297,92 1 18632 78,14 97,68 161,17 2 19903 102,56 293,04 20542 48,84 39,07 200,24 1 20593 141,64 73,26 205,13 1 20701 68,38 63,49 131,87 2 20796 73,26 332,11 21919 180,71 107,45 200,24 2 22073 122,10 73,26 263,74 1 26

22968 112,33 78,14 180,71 2 23381 78,14 102,56 239,32 1 24881 29,30 175,82 229,55 0 25018 317,46 53,72 219,78 0 25161 83,03 73,26 307,69 1 25162 73,26 175,82 341,88 1 25875 190,48 136,75 156,29 2 26126 268,62 87,91 273,50 1 30973 29,30 126,98 244,20 0 31869 166,06 73,26 146,52 1 31928 68,38 97,68 180,71 1 Tabel 5: : Sammenligning af MVD middelværdier for de 3 farvninger. Kun mine egne tællinger er med i tabellen. 0: ingen overensstemmelse mellem resultaterne. 1: lidt overensstemmelse. 2: acceptabel overensstemmelse. t-test Endocan-værdier: Middelværdi af differencerne -26,29 kar/mm 2 Spredning, SD 67,44 SEM 9,837 Beregnet t-værdi 2,673 t-tabel, 46 frihedsgrader 2,013 CD105-værdier: Middelværdi af differencerne -14,33 kar/mm 2 Spredning, SD 42,08 SEM 6,273 Beregnet t-værdi 2,284 t-tabel, 44 frihedsgrader 2,015 CD105-værdier, hvis de 2 højeste differencer fratages: Middelværdi af differencerne -10,90 kar/mm 2 Spredning, SD 39,82 SEM 6,072 Beregnet t-værdi 1,796 t-tabel, 42 frihedsgrader 2,011 27

Tina MVD kar/mm Angiogenese i coloncancer CD34-værdier: Middelværdi af differencerne -19,12 kar/mm 2 Spredning, SD 88,47 SEM 12,90 Beregnet t-værdi 1,482 t-tabel, 46 frihedsgrader 2,013 Endocan, dobbeltbestemmelse: Middelværdi af differencerne -0,49 kar/mm 2 Spredning, SD 55,481 SEM 12,406 Beregnet t-værdi 0,039 t-tabel, 19 frihedsgrader 2,093 MVD sammenligningsplot 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Endocan interobservans 0 100 200 300 400 500 Anette MVD kar/mm y = 0,7431x + 11,137 R² = 0,4744 Figur 12: Sammenligning af MVD-værdierne for 2 observatører 28

Tina MVD kar/mm Tina MVD Angiogenese i coloncancer 350 300 250 CD105 interobservans y = 0,9544x + 18,778 R² = 0,5216 200 150 100 50 0 0 50 100 150 200 250 Anette MVD Figur 13: Sammenligning af MVD-værdierne for 2 observatører 700 600 500 CD34 Interobservans y = 0,4846x + 111,39 R² = 0,1242 400 300 200 100 0 0 200 400 600 Anette MVD kar/mm Figur 14: Sammenligning af MVD-værdierne for 2 observatører 29

Antal differencer Antal differencer Angiogenese i coloncancer Histogrammer 14 12 10 8 6 4 2 0 Histogram, Endocan ]-120 - -90] ]-90 - -60] ]-60 - -30] ]0-30] ]-30-0] Interval ]30-60] ]60-90] ]90-120] ]120-250] Figur 15: Fordeling af differencer ved Endocan optællingerne Fordeling, Endocan: 20 ud af 47 målinger ligger i området 0 ± 30 kar/mm 2 = 42,6 % 10 ud af 47 målinger ligger i området 0 ± 10 kar/mm 2 = 21,3 % Ved 8 ud af 47 målinger er differencen > 90 kar/mm 2 = 17,0 % Histogram, CD105 12 10 8 6 4 2 0 ]90-120] ]60-90] ]30-60] ]0-30] ]-30-0] ]-60 - -30] ]-90 - -60] ]-120 - -90] Interval Figur 16: Fordeling af differencer ved CD105 optællingerne Fordeling, CD105: 21 ud af 45 målinger ligger i området 0 ± 30 kar/mm 2 = 46,7 % 14 ud af 45 målinger ligger i området 0 ± 10 kar/mm 2 = 31,1 % Ingen værdier er > 90 kar/mm 2 30

Antal differencer Angiogenese i coloncancer Histogram, CD34 12 10 8 6 4 2 0 ]120-250] ]90-120] ]60-90] ]30-60] ]0-30] ]-30-0] ]-60 - -30] ]-90 - -60] ]-120 - -90] ] - -120] Interval Figur 17: Fordeling af differencer ved CD34 optællingerne Fordeling, CD34: 9 ud af 47 målinger ligger i området 0 ± 30 kar/mm 2 = 19,1 % 2 ud af 47 målinger ligger i området 0 ± 10 kar/mm 2 = 4,3 % Ved 12 ud af 47 målinger er differencen > 90 kar/mm 2 = 25,6 % Histogram, Endocan dobbeltbestemmelse Antal differencer 8 6 4 2 0 ]-120 - -90] ]-90 - -60] ]-60 - -30] ]-30-0] ]0-30] ]30-60] ]60-90] ]90-120] ]120-250] Interval Figur 18: Fordeling af differencer ved Endocan dobbelt-tællingerne Fordeling, Endocan dobbeltbestemmelse: 9 ud af 20 målinger ligger i området 0 ± 20 kar/mm 2 = 45,0 % 4 ud af 20 målinger ligger i området 0 ± 10 kar/mm 2 = 20,0 % Ved 2 ud af 20 målinger ligger differencen > 90 kar/mm 2 = 10,0 % 31

Difference kar/mm2 Angiogenese i coloncancer Differensplot 200 Difference kar/mm 2 150 100 50 0-50 0 100 200 300 400-100 -150-200 Endocan -250 Middelværdi af A+T's middelværdier kar/mm 2 Figur 19: Differensplot for Endocan 150 CD 105 100 Difference kar/mm 2 50 0-50 -100-150 0 50 100 150 200 250 300 Middelværdi af A+T's middelværdier kar/mm 2 Figur 20: Differensplot for CD105 350 300 250 200 150 100 50 0-50 -100-150 -200 CD34 0 100 200 300 400 500 Middelværdi af A+T's middelværdier kar/mm2 Figur 21: Differensplot for CD34 32

%-afvigelse %-afvigelse Angiogenese i coloncancer 200 Differensplot, dobbeltbestemmelse Differencer kar/mm 2 150 100 50 0 0,00-50 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00-100 Middelværdien af middelværdier for de 2 tællinger Figur 22: Differensplot over de 2x20 Endocan snit. Talt uafhængigt af hinanden Procentvise afvigelser 70 60 50 40 30 20 10 0 Endocan 0 100 200 300 400 Middelværdi af Anette +Tinas middelværdier Figur 23: Procentvise afvigelser som funktion af middelværdien for Endocan optællingerne 70 60 50 40 30 20 10 0 CD 105 0 50 100 150 200 250 300 Middelværdi af Anette + Tinas middelværdier Figur 24: Procentvise afvigelser som funktion af middelværdien for CD105 optællingerne 33

%-vise afvigelser %-afvigelse Angiogenese i coloncancer 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 CD34 0 100 200 300 400 500 Middelværdi af Anette + Tinas middelværdier Figur 25: Procentvise afvigelser som funktion af middelværdien for CD34 optællingerne 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 %-afvigelse, dobbeltbestemmelse 0 50 100 150 200 250 300 Middelværdi af middelværdierne fra de 2 datoer Figur 26: Procentvise afvigelser i det intraobservante forsøg, hvor 20 snit blev mikroskoperet og talt 2 gange uafhængigt af hinanden Diskussion Patologisk histologi er på mange måder et speciale med mange subjektive vurderinger, udfaldet afhænger af øjnene, der ser. De små detaljer i vævet kan let opfattes forskelligt afhængigt af hvilken person, der studerer det. Erfaring indenfor området, både med hensyn til vævstype og den specifikke farvning har meget stor betydning. Hverken Anette eller jeg var i besiddelse af nogen erfaring, hverken med hensyn til colonvæv eller nogle af de 3 immunfarvninger. Dette kommer også til udtryk i vores resultater. Kun ved én af de tre farvninger er der ikke umiddelbart signifikant forskel på vores differencer. Men mere om statistikken senere. Vermeulen et al. har, for år tilbage, opstillet et forsøg, hvor observatørernes ekspertise blev 34

sat i forhold til hinanden (Vermeulen, et al., 1997). 3 erfarne og 1 uerfaren observatør talte kar i hotspots på 38 præparater ved x200 forstørrelse. Forsøget var sat op på den måde, at hotspots var udvalgt på forhånd og fotograferet og så skulle de 4 observatører bagefter tælle karrene. På den måde er det kun de tælletekniske differencer, der observeres. Den uerfarne observatør klarer sig rimeligt og derfor konkluderes det, at det ikke er i det tælletekniske vanskelighederne er, men derimod i det at finde og udvælge hotspots. I samme undersøgelse sættes fokus på, hvilken indflydelse tællekammerets størrelse har på korrektheden. Alle de studier de henviser til har et tællekammer, der er større end vores, de fleste er endda væsentligt større. Ifølge Flemming Brandt Sørensen skyldes det, at man tidligere ofte talte i hele synsfeltet, fremfor i et markeret tællekammer. Tællerammen blev indført for at gøre tællingen nemmere og mere overskuelig. Vermeulen et al. konkluderer i deres forsøg, at et tællekammer på under 0,61 mm 2 er for lille og vil betyde tab af vigtig information. Da vores tællekammer kun er en tiendedel af dette, kan det ikke andet end give stof til eftertanke, hvor stor en del af analyseusikkerheden, der skyldes størrelsen på tællekammeret. Immunfarvninger Da vores kliniske periode af Modul 13 også foregik på KPA i Vejle havde vi mulighed for at forberede en del til dette projekt. Det betød for eksempel, at vi havde tid til at fremstille vores egen kontrolklods. Vi ville gerne have haft væv med fra flere patienter, men i den periode, var der ikke meget coloncancervæv til rådighed. Derfor måtte vi nøjes med en enkelt patient. Vi valgte at lave vores negative kontrol fra samme patient, bare fra noget ikke-patologisk colonvæv. Vi kunne også have valgt noget tumorvæv uden angiogenese eller en helt anden type væv. Vi havde den negative kontrol med for at kontrollere om den epiteliale farvning var for fremherskende. Endocan er i et forsøg af Zhang et al og Zou et al. fundet at være udtrykt i ikke-patogene epitelceller i mavetarmkanalen (Zhang, et al., 2011) (Zou, et al., 2008). Der var ikke tale om den samme antistofklon, som i vores forsøg og protokollen var på nogle punkter anderledes end vores. Men tendensen til at farve noget i epitelcellerne, var også noget vi observerede i vores validering af Endocan i Modul13, og som figur 6 også viser. Den positive kontrol kunne have været udvidet med flere typer væv, fx ulcusvæv, hvor angiogenesen må formodes at være fremtrædende. På den måde havde vi fået en mere sikker kontrol, især fordi den skulle bruges til 3 forskellige farvninger. Men af tidsmæssige årsager valgte vi løsningen med colonvæv alene. Hvis vi skulle lave udstandsninger i 35

gamle patientblokke, ville det kræve forskellige tilladelser og et stort forarbejde med at finde frem til et godt snit. Vigtigt for en positiv kontrol er også at have væv med, hvor ekspressionen i vævet er sparsom, da man så må formode, at hvis de celler er farvet, vil langt de fleste celler i vævet også være det (Ventana). Der er rigtigt mange parametre i dette forsøg, hvor kvaliteten kan forskydes i enten positiv eller negativ retning. Jeg vil her forsøge at komme ind på nogle af de vigtigste: Præanalytisk: Skæring Vævet i colon er ofte fedtrigt, hvilket besværer skæringen, da det adipøse væv krakelerer, når det kommer i forbindelse med det ca. 40 C varme vand på rotationsmikrotomen. Men dette kunne til dels løses ved at skære manuelt, altså ved at undlade at lade maskinen skære. Det betød så desværre, at noget af nøjagtigheden på snittykkelsen forsvandt, idet manuel skæring ikke sker med samme kraft hele vejen igennem snittet og derfor ikke samme tykkelse. Hvis nogle snit har været 1-2 µm tykkere end andre i samme serie, vil der være flere celler i det tykke snit og derved flere, der er farvet. Dette er en fejlkilde, der er rigtig svær at undgå, men alligevel en fejlkilde. Hvor stor betydning, det har haft i vores forsøg er umuligt at sige, men vores manglende erfaring med at skære, vil jo være en indvirkende faktor. Til gengæld har vi talt på de samme snit, så tælleteknisk har det ikke stor indflydelse. Analytisk: Håndfarvning af CD105 Manuel farvning vil altid medføre en større risiko for fejl end maskinel farvning. Dermed ikke sagt at maskinel farvning nødvendigvis er bedre end håndfarvning, men risikoen for usystematiske fejl er størst ved håndfarvning. Flere af vores reagenserne fremstillede vi lige inden brug og her vil der altid være risiko for fejlopmåling/vejning og regnefejl. Ved at bruge kontrolsnit vil de fleste fejl kunne opdages. Et andet meget vigtigt parameter ved immunfarvning er udtørring (Nielsen, 2005). Snittene må ikke udtørre efter HIER, da udtørring kan føre til uspecifik farvning og en højere grad af baggrundsfarvning. Vi brugte fugtkamre og var meget 36

omhyggelige med at dryppe reagenserne på hele snittet. Vi så heller ingen artefakter, der kunne minde om fejl af denne type. Farvning på Ventana Benchmark ULTRA Vi kunne disponere frit over én immunfarvemaskine i 1½ døgn og der farvede vi de 2x50 snit. Det betød, at vi kunne farve 30 af samme serie ad gangen og altså mindske analytiske fejlkilder betydeligt. Der var ingen skift af reagenser undervejs, så alle havde samme lot-nummer ved alle farvninger. Vi observerede ingen uregelmæssigheder under kørslerne og har derfor ingen grund til at tro, at der skulle være sket noget uforudset undervejs. Efterfølgende vurdering af snittene gav heller ikke grund til at tro det. Forskellen på de 2 detektionssystemer er måden HRP er bundet til det sekundære antistof. Roche, Ventana sætter de 2 metoder op mod hinanden og ikke overraskende postulerer de, at deres eget alternativ med multimer er mest sensitiv (Roche). Polymer har en tendens til at binde sig til sig selv og dermed begrænse funktionaliteten og sensitiviteten. Ved at kigge på de intra-observante optællinger har jeg ikke kunnet finde nogen forskel, der giver grund til at tro, at CD105 skulle være farvet mindre sensitivt. Jeg har optalt de tilfælde hvor en af farvningernes MVD er væsentligt mindre end de andre: CD105 ligger i 8 tilfælde væsentligt lavere end Endocan og CD34 Endocan ligger i 10 tilfælde væsentligt lavere end CD105 og CD34 Grunden til, at denne forskel i så mange tilfælde er så stor, er svær at finde. Men en grund er jo nok de utrænede øjne, der talte. Ved CD105 og Endocan, bestod hotspots i mange tilfælde ikke af ret mange endothelceller og derfor kan selv en lille tællefejl have store konsekvenser. En anden parameter er tællekammerets placering. Vi valgte altid at sætte det horisontalt, men hvis vi havde placeret det skråt eller vertikalt, havde vi i mange tilfælde øget antallet af endothelceller i tællekammeret. 37

15 10 Figur 27: IHC farvning af CD34. Forsøg med at placere 2 tællerammer vilkårligt og antallet af kar er noteret i rammen. Men også intra-observant har placeringen af tællekammeret betydning. Hvis ikke koncentrationen er i top, når kammeret indstilles ved 100x forstørrelse, kan det betyde af måske 2-3 endothelceller ikke ligger indenfor rammen, ved 200x, og derfor ikke skal tælles med. Hvis de andre snit med samme nummer, er talt med friske øjne, kan differencen blive udtalt. Ud fra min intra-observante bedømmelse fik jeg følgende resultater: 0 - ingen overensstemmelse mellem resultaterne: 8 snit 1 - lidt overensstemmelse mellem resultaterne: 23 snit 2 - acceptabel overensstemmelse mellem resultaterne: 12 snit Kun 2 ud af 3 farvninger, bedømmes ikke: 5 snit Kun ved en fjerdedel af snittene (12/48) finder jeg, at der er acceptabel overensstemmelse mellem mine resultater. Min vurdering har taget udgangspunkt i, at alle 3 farvningers MVD enten skulle ligge ret højt eller ret lavt og samtidig i nærheden af samme værdi. Da CD34 farver flere celler, ligger den også generelt en del højere end de andre 2. Bedømmelsen har altså været ud fra en vurdering af tendenserne. Når jeg har kigget på 38

rådata (bilag 1) for de 12 snit, er der, for de fleste af dem, noget der minder om et system, i hotspots. Enten er der ét eller to hotspot, der ved alle 3 farvninger er en del større end de andre. Eller også er de 3 hotspots omtrent lige store, gælder for 2 eller 3 af 12 snit. For kun ét snit (nr. 16565) er de 3x3 tællinger meget ens og her er alle tællinger under 10 kar i tællekammeret. Det betyder, at alle hotspots har været overskuelige og sandsynligvis lette at tælle. Altså også et præparat med begrænset angiogenese. Statistik Ved de grafiske afbildninger histogram og differensplot er det tydeligt, at mine optællinger i de fleste tilfælde er mindre end Anettes. Hvad dette skyldes ved jeg ikke. Vi har brugt samme mikroskop, samme okular, samme tælleregler. Vi talte på nogle snit, sammen med Flemming Brandt Sørensen, inden vi begyndte for at øve os i teknikken og for at se om vi kunne ramme samme antal og det gik rimeligt. Men igen må tællerammen og indstilling af den stå for skud, måske satte jeg den generelt lavere eller højere end Anette og når vi så øgede forstørrelsen, betød det så dette udsving. Den ene af os, kan også have haft en tendens til at søge længere ind i cancervævet for at finde hotspots, men det ville næppe have haft så stor betydning. Figur 28: Endocan. Acceptabelt at sætte tællekammeret, dette stykke inde i tumorvævet Endocan t-testen for Endocan optællingerne viser, at den beregnede t-værdi er højere end tabel- 39