Parmaskinker og de andre

Parmaskinker og de andre Eleonora Miquel Becker og Leif H. Skibsted, Fødevarekemi, Institut for Fødevarevidenskab, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet. Farven på kød og kødprodukter byder på interessante kemiske problemstillinger velegnet til undervisning. Tilsætningsstoffet nitrit er særlig interessant, da det sammen med myoglobin (MbFe(II)) danner det holdbare røde pigment nitrosylmyoglobin (MbFe(II)NO), der ved varmebehandling omdannes til det lyserøde pigment, nitrosylmyochrom (dmbfe(ii) NO), hvor globindelen er denatureret, men det frie radikal NO binder stadig til jern. Disse pigmenter giver kødprodukter som tørsaltet skinke, bacon, spegepølse og kogt skinke hver deres karakteristiske farve. Ulempen ved nitrittilsætning er, at nitrit er mistænkt som carcinogent, og faktisk karakteriseret som giftigt, det vil derfor være oplagt at udvikle nye nitritfrie kødprodukter. Men uden tilsætning af nitrit får forarbejdede kødprodukter en mat brungrå farve og en kedelig kogt smag på grund af lipidoxidation. Parmaskinke er kendt for en frisk og appetitlig farve, som dannes under en lang tørsaltningsproces på op til 18 måneder uden tilsætning af nitrit, og smagen er enestående. Mysteriet om den specielle røde farve i lufttørret skinke er fornyeligt blevet opklaret. Disse legendariske skinker, er fremstillet med havsalt som eneste tilsætningsstof og har en ensartet og stabil rød farve. I modsætning til nitritsaltede skinker er farven af Parmaskinker og tilsvarende Serranoskinker fra Spanien ikke lysfølsom. Men hvordan dannes den specielle farve, og hvad er dens kemiske natur? Farve i fersk kød Myoglobin er et lille globulært protein bestående af ca. 150 aminosyrer og en molekylevægt på omkring 17 kd. En porphyrinring, protoporphyrin IX, findes i proteinets inderlomme. Koordineret til denne prostestiske gruppe er et jernatom som tilsammen danner hæmgruppen og molekylets aktive centrum. Proteinet er koblet til hæmgruppen via en binding mellem histidin94 og hæmjern samt hydrofobe interaktioner mellem vinylsidekæder fra den prostetiske gruppe og hydrofobe aminosyrer fra proteinet. I nyskåret fersk kød fordeles farvepigmenterne således: på overfladen findes den oxygenerede form af myoglobin, MbFe(II)O2, med en kirsebærrøde farve, dernæst i et tyndt lag findes den oxiderede myoglobinform, metmyoglobin MbFe(III)OH2, som er brunt, efterfulgt af en stor kerne reduceret deoxymyoglobin, MbFe(II), som er violet. I den levende muskel og under lagring af kød sker der omdannelser mellem disse myoglobinformer. Enzymsystemet metmyoglobin reduktase er stadig aktiv i kød lige efter slagtning og kan dermed reducere metmyoglobin til deoxymyoglobin som så kan koordinere oxygen og danne oxymyoglobin. Figur 1 viser denne farvecyklus. Den ikke katalyserede autoxidation af oxymyoglobin danner superoxid radikalanionen (O 2 - ) I det følgende vil vi beskrive kødets farvekemi med fokus på nitritsaltede versus ikke nitritsaltede skinker og deres pigmenter. For ikke nitritsaltede kødprodukter sættes farvedannelse i Parma skinke i sammenhæng med den langvarige produktionsproces med stor betydning for pigmentdannelsen, dernæst vil forskellige mekanismer for dannelsen af Parma pigmentet blive diskuteret. Til sidst vil vi beskrive forsøg velegnet til undervisningsbrug. Figur 1. Farvecyklus der viser omdannelsen af de forskellige myoglobinformer i fersk kød under lagring. Det violette MbFe(II) ses i vakuumpakket kød og kød pakket i nitrogen, det røde MbFe(II)O2 dominerer i frisk kød og kød pakket i høj-oxygen atmosfære, men det brune MbFe(III) indikerer oxideret (gammelt) kød. 44 LMFK-bladet, nr. 6, november 2009

som kan dismutere vha. superoxid dismutases aktivitet eller via syrekatalyse til hydrogenperoxid (H 2 O 2 ) og oxygen. Farveforskellen mellem de to Fe(II)-former, begge d 6 -elektronsystemer, skyldes at MbFe(II) er højspin, mens MbFe(II) O 2 er lavspin (Møller & Skibsted, 2006). Farve i nitritsaltede kødprodukter Nitritsaltning af kød har en farvegivende effekt, men har også en positiv indvirkning på den oxidative stabilitet og forhindrer vækst af pølseforgiftningsbakterien Clostridium botulinum. Hovedpigmentet i nitritsaltede kødprodukter er nitrosylmyoglobin, MbFe(II)NO, som dannes gennem en kompleks serie af reaktioner mellem tilsat nitrit/nitrat og enten endogene (NADH) eller tilsatte reducerende stoffer (ascorbinsyre) som danner nitrogenmonoxid (NO), der associerer til hæm-fe(ii) i myoglobinet. Den detaljerede reaktionsvej er stadig ukendt, men ved tilsætning af nitrit, oxideres oxymyoglobin til metmyoglobin: som dannes ved varmebehandling af den native form MbFe(II)NO (reaktion 4). Varme MbFe(II)NO dmbfe(ii)no (4) Nitrosylmyochrom oxideres termisk ved tilstedeværelse af oxygen, men i en langsom proces (reaktion 5), og fotokemisk (reaktion 6) til det gråbrune pigment metmyochrom (dmbfe(iii)). dmbfe(ii)no + O 2 dmbfe(iii) + ONOO - / NO 3 - (5) hv dmbfe(ii)no dmbfe(iii) + ukendte produkter (6) Ved termisk oxidation (reaktion 5) er den meget reaktive forbindelse peroxynitrit påvist som produkt sammen med nitrat, der tilsyneladende er et omlejringsprodukt af den isomere peroxynitrit. 4 MbFe(II)O 2 + 4 NO 2 - + 2 H 2 O 4 MbFe(III)OH + 4 NO 3 - + O 2 (1) Reaktion 1 resulterer i kortvarig brunfarvning af kødets overflade lige efter tilsætning af nitrit. Det vides ikke, hvilket stof der virker nitrosylerende, men forskellige stoffer er blevet foreslået som den konjugerede syre, salpetersyrling (HNO 2, pka 3.4), men den findes i kødet kun i en lille procentdel. Ascorbat (asc) er ofte det stof der virker reducerende, og ascorbats reduktion af salpetersyrling (reaktion 2) danner NO, der med sine elleve elektroner er et frit radikal, der bindes reversibelt til deoxymyoglobin (reaktion 3). Herved dannes det dybtrøde pigment nitrosylmyoglobin (MbFe(II)NO), idet her også er et skifte fra højspin til lavspin. 2 HNO 2 + asc 2 NO + dehydroasc + 2 H 2 O (2) MbFe(II) + NO MbFe(II)NO (3) Det farvegivende pigment i pasteuriseret skinke er det lyserøde nitrosylmyochrom (dmbfe(ii)no), Farve i kødprodukter uden nitrit Kødprodukter uden tilsætning af nitrit få normalt en mat brungrå farve. Lufttørring af skinke med havsalt som eneste tilsætningsstof, som det er praksis for Parma skinke og enkelte Serranoskinker, der fremstilles uden nitrit og nitrat, giver derimod en tiltalende rød farve. Tørsaltningsprocessen ved fremstilling af Parma skinke indledes med tilsmøring med salt af skinkens overflade. Derefter følger udligningsperiode og en længere modningsperiode, hvor temperaturen samt den relative luftfugtighed (RH %) styres i tørringstårne i bjergene eller i klimakamre. Under den lange fremstillingsproces sker en række fysisk-kemiske forandringer, der afhænger af skinkens ph-værdi, mængden af intramuskulært fedt samt temperaturen og luftfugtigheden. De fysiske forandringer skyldes vandtab og diffusion af salt gennem skinken, som medfører en gradvis sænkning af vandaktiviteten og stabilisering af produktet. Samtidig foregår komplicerede kemiske processer som proteolytiske og lipolytiske modifikationer, der resulterer i Parmaskinkens farve og aroma. Tørsaltningsprocessen kan inddeles i følgende procestrin: LMFK-bladet, nr. 6, november 2009 45

Udvælgelse, køling og trimning Skinkerne stammer fra grisen af racen Italiensk Landrace, Large White, Duroc eller krydsning mellem disse. Grisene er på slagtertidspunkt 9 måneder gamle og vejer min. 150 kg. Skinkerne vejer mellem 11 til 13 kg og trimmes ved afskæring af fedt. Saltning Ved første saltning bliver skinkernes overflade gnubbet med salt fra Middelhavet tilsat 20% vand, hvorefter der drysses et tyndt lag tør salt over. Efterfølgende lagring ved 75-90% RH og en temperatur på 1-4 C; den anden saltning består af en gentagelse efter 5-7 dage, med lagring i 7-10 dage ved lavere luftfugtighed (70-80%). Udligningsperiode Skinkerne hænger ved 1-4 C i 2 til 3 måneder i den efterfølgende udligningsperiode. De første to uger sænkes luftfugtigheden drastisk til 50-60% RH for at opnå udtørring, hvorefter den relative luftfugtighed øges til 70-90% RH. I denne periode udlignes saltgradienten, og vandaktiviteten sænkes. Vask og tørring For at fjerne overskydende saltkorn samt bakterielt dannet slim vaskes skinkerne med varmt vand og tørres efterfølgende ved 20 C i 12 timer, hvorefter temperaturen gradvis sænkes til 15 C over 6 dage. Modning og smøring Det sidste og mest tidskrævende trin er modning af skinkerne. Modningen foregår mellem 15 og 18 C ved omkring 75% RH og varer oftest 6 til 11 måneder afhængig af skinkernes vægt. Skinkerne har ved slutningen af modningen mistet omkring 28% af deres oprindelige vægt. hesteknogle og ved at lugte til knoglen, bedømmes aroma og mikrobiel vækst. Ved godkendelse påbrændes den karakteristiske Parma-krone. Parmapigmentets kemiske struktur Mange forskellige hypoteser vedrørende Parmapigmentets kemiske natur har været opstillet i tidernes løb: 1. Virgili et al. (1999) foreslog forbindelser med lav molekylevægt dannet ved proteolytiske processer under den lange modningsperiode, hvor basiske peptider og aminosyrer bliver ligander for jern i myoglobinet. 2. Morita et al. (1996) foreslog, at pigmentet var en nitrosyleret myoglobinform forskelligt fra den kendte form i nitritsaltet kød, dannet ved bakteriel aktivitet. At bakterierne alene var ansvarlige for farvedannelsen blev dog snart betragtet som usandsynligt, idet bakterier findes på overfladen, mens farven er ensartet fordelt i skinken. 3. Det har også været diskuteret, om forurening af havsalt med nitrit og nitrat fra fuglegødning kunne være kilden til dannelse af et rødt NOkompleks, men analyser af saltet har vist, at nitrit og nitrat forekommer i utilstrækkelige mængder (Sakata, 2000). 4. I 2003 blev det vist, at pigmentet består af et polært og et apolært pigment, og at andelen af apolært pigment øges under fremstillingsprocessen (Parolari et al., 2003). 5. Forsøg udført vha. Electron Spin Ressonance (ESR) spectroscopi viste, at Parma pigmentet på intet tidspunkt i den lange fremstillingsproces er et nitrosyleret myoglobinkompleks (Møller et al., 2003). Fra ESR-spektre vist i Kontrol Afslutningsvis bliver farve og smag organoleptisk bedømt af en autoriseret person. Bedømmelsen udføres vha. en heste-fibula (en nål fremstillet af en hesteknogle), der indføres på 5 steder omkring lårbenet, hvor der er størst risiko for bakteriel vækst. Aromaen sætter sig i den porøse Figur 2. ESR-spektre ved 150 K i området 3200 til 3450 gauss (Møller et al., 2003) 46 LMFK-bladet, nr. 6, november 2009

figur 2, ses det tydeligt, at spektret af Parma pigmentet adskiller sig fra spektre af det paramagnetiske nitrosylmyoglobin og nitritsaltede kødprodukter. 6. En japansk forskningsgruppe viste i 2004, at pigmentet i Parmaskinke er et zink-kompleks af protoporphyrin IX (Wakamatsu et al., 2004a). Under Parmaskinkens lange fremstillingsproces udskiftes jern i hæmgruppen med zink (figur 3). Men hvor kommer al den zink fra? I en velafblødt muskel er der faktisk mere zink end jern. Skinkemusklen semimembranosus indeholder 3,6 mg zink/100 g kød og 0,66 mg jern/100 g kød. Selv om porphyriner har en stærk rød autofluorescens, forsvinder fluore scensen ved kompleksbinding af metaller som jern, men ikke for zink-, magnesium- og cadmium. Det ekstraherede pigment fra Parma skinker har et fluorescensspektrum som zink protoporphyrin IX. Mekanismen for udbytningen af jern med zink Mekanismen for udbytning af jern med zink er endnu ukendt, men tre forskellige mekanismer er blevet foreslået (Wakamatsu et al., 2004a): 1. En ikke-enzymatisk reaktion, hvor Fe(II) bliver udskiftet med Zn(II) under anaerobe forhold med efterfølgende dissociation af hæmgruppen fra proteinet. Figur 3. Ombytning af jern med zink i hæmgruppen 2. En bakteriel enzymatisk reaktion efterfulgt af metaludbytning, hvor bakterievækst først nedbryder kødproteinerne inklusiv pigmentet. 3. En enzymatisk reaktion, hvor det endogene enzym ferrochelatase udbytter jern med zink. Ferrochelatase er det terminale enzym i hæmdannelsen og katalyserer indføring af Fe(II) i protoporphyrin IX. Zn(II) kan også blive indført vha. det samme enzym. At enzymer er involveret i dannelsen af zinkprotoporphyrin i Parmaskinke, og at enzymet muligvis er ferrochelatase er baseret på forskellige forsøg: Opvarmning af kødhomogenat (40 til 80 C) før inkubering inhiberer dannelse af zink-komplekset (Wakamatsu et al., 2004b). I en blanding af protoporphyrin IX og Zn(II) dannes zink protoporphyrin kun, hvis der er tilsat kødhomogenat (Benedini, Raja & Parolari, 2008). Tilsætning af antibakterielle stoffer til kødhomogenatet påvirker ikke dannelsen af zink protoporphyrin, hvilket peger på, at enzymer frigivet fra kødet snarere end bakterielle enzymer er involveret i udbytningsmekanismen (Wakamatsu et al., 2004b). LMFK-bladet, nr. 6, november 2009 47

Tilstedeværelse af nitrit inhiberer dannelsen af zink-protoporphyrin (Adamsen et al., 2006), muligvis pga. af dannelsen af NO, der vides at inhibere pattedyrs ferrochelatase (Sellers et al., 1996). Ferrochelatase har ca. 20% af den oprindelige aktivitet ved afslutning af Parma skinkens produktionsproces (Parolari et al., 2009). Alligevel er dette næppe ført endeligt bevis for ferrochelatasens rolle i dannelsen af Parmapigmentet: Ferrochelatase er kun påvist at indføre jern eller zink i protoporphyrin og ikke at katalysere den modsætte reaktion, nemlig fjernelse af metaller. Indsættelse af Fe(II) i protoporphyrin er blevet påvist i modelsystemer, og den ikke-enzymatiske reaktion var lige hurtigt eller sågar hurtigere end den enzymatiske (Kassner & Walchak, 1973). Nitrogenmonoxids inhiberende effekt skyldes måske binding til jern i myoglobin. Nye typer forsøg er derfor nødvendige for at fastslå mekanismen for dannelsen af Zn-protoporphyrin i Parmaskinke og i almindelighed i lufttørret skinke produceret uden tilsætning af nitrat/nitrit. Forsøg til undervisningsbrug Der foreslås tre nemme forsøg: 1. Indflydelse af oxygen og lys på kogte skinkers farve: Til dette forsøg bruges fire pakker skiveskåret, vakuumpakket kogt skinke. Pakkerne lagres ved stuetemperatur i 3 timer og udsættes for 1) oxygen og lys, 2) fravær af oxygen og lys, 3) oxygen i fravær af lys og 4) lys i fravær af oxygen. Pakkerne, der ikke skal udsættes Figur 5. Violet LED belysning af salami fremstillet med nitrit (venstre) og fremstillet uden nitrit (højre). for lys, pakkes under en sort affaldssæk eller i stanniol, mens de andre to pakker ikke dækkes til og lægges under en skrivebordslampe ( arkitektlampe ) eller i vinduet, uden at de opvarmes. I pakkerne med oxygen, prikkes hul i indpakningen. Efter en time bedømmes skinkens farve. Figur 4 viser den kogte skinke efter lagring under de nævnte betingelser. Som det kan ses af figuren, er det kombinationen af oxygen og lys, der ændre farven, oxygen alene har ingen effekt. Forsøget kan evt. gentages for Parma skinke, der kan købes pakket i oxygen-fri atmosfære (modificeret atmosfære). Her er effekten langt mindre, Parma pigmentet er helt anderledes. Parma skinke udsat for lys og ilt ændrer dog sin farve fra rødt til brunt over flere dage. 2. Fluorescens af Zn-protoporphyrin: to typer lufttørret skinke købes: en uden tilsætning af nitrit, fx Parmaskinke og en med tilsætning af nitrit/ nitrat (relevante E-numre er E249: Kaliumnitrit, E250: Natriumnitrit, E251: Natriumnitrat, E252: Kaliumnitrat). I et mørkt rum belyses begge skinketyper med violet LED lys eller en lampe til at se på tyndlagschromatografi-plader (bøl- + O 2 + lys O 2 + lys + O 2 lys O 2 lys Figur 4. Kogt skinke lagret ved stuetemperatur med eller uden oxygen og med eller uden lys. 48 LMFK-bladet, nr. 6, november 2009

Figur 6. Oksekød med myoglobinfarver (til venstre), skitse af myoglobinformer set ved tværsnit (til højre). gelængde peak: 400 nm) og foto tages med digitalt kamera. Zn-protophorphyrin har en rød autofluorescens som ville kunne ses tydeligt på billedet. Figur 5 viser et eksempel på en salami fremstillet med nitrit (billedet til venstre) og en italiensk salami fremstillet uden nitrit (billede til højre). Det kan tydelig ses, at salami uden nitrit har en rød fluorescens som indikerer tilstedeværelse af Zn-protoporphyrin. 3. Et stykke skært oksekød udtages fra køleskabet. Kødstykket skal være rødt af MbFe(II)O 2 som det ses i figur 1. Det skæres over med en skarp kniv og farven af stykkets indre iagttages. Farven skifte fra violet af MbFe(II) til rødt af MbFe(II)O 2. Prøv også at se efter et brunt bånd af MbFe(III) lidt under den oprindelige overflade som det ses i Figur 6. Referenceliste Adamsen, C. E., Møller, J. K., Laursen, K., Olsen, K., Skibsted, L. H. (2006). Zn-porphyrin formation in cured meat products: Effect of added salt and nitrite. Meat Science, 72, 672-679. Benedini, R., Raja, V., & Parolari, G. (2008). Zinc-protoporphyrin IX promoting activity in pork muscle. Lwt-Food Science and Technology, 41(7), 1160-1166. Kassner, R. J. & Walchak, H. (1973). Heme Formation from Fe(II) and Porphyrin in Absence of Ferrochelatase Activity. Biochimica et Biophysica Acta, 304(2), 294-303. Møller, J. K. S. & Skibsted, L. H. (2006). Myoglobins The link between discoloration and lipid oxidation in muscle and meat. Quimica Nova, 29(6), 1270-1278. Møller, J. K., Adamsen, C. E., & Skibsted, L. H. (2003) Spectral characterization of red pigment in Italian-type dry-cured ham. Increasing lipophilicity during processing and maturation. European Food Research and Technology, 216, 290-296. Morita, H., Niu, J., Sakata, R., & Nagata, Y. (1996). Red pigment of parma ham and bacterial influence on its formation. Journal of Food Science, 61(5), 1021-1023. Parolari, G. Gabba, L., & Saccani, G. (2003). Extraction properties and absorption spectra of dry cured hams made with and without nitrite. Meat Science, 64, 483-490. Parolari, G., Benedini, R., & Toscani, T. (2009). Color Formation in nitrite-free dried hams as related to Zn-protoporphyrin IX and Znchelatase activity, Journal of Food Science, 74(6), C413-C418. Sakata, R. (2000). Studies on physiological characteristics of red pigments in meat products. Animal Science Journal, 71(1), 1-16. Sellers, V. M., Johnson, M. K., & Dailey, H. A. (1996). Function of the [2Fe-2S] cluster in mammalian ferrochelatase: A possible role as a nitric oxide sensor. Biochemistry, 35(8), 2699-2704. Virgili, R., Parolari, G., Bordini, C. S., Schiva zappa, C. Cornet, M. & Monin, G. (1999). Free amino acid dipeptides in dry-cured ham. Journal of Muscle Foods, 10, 119-130. Wakamatsu, J., Nishimura, T., & Hattori, A. (2004a). A Zn-porphyrin complex contributes to bright red color in Parma ham. Meat Science, 67(1), 95-100. Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T., & Hattori, A. (2004b). Establishment of a model experiment system to elucidate the mechanism by which Zn-protoporphyrin IX is formed in nitrite-free dry-cured ham. Meat Science, 68(2), 313-317. LMFK-bladet, nr. 6, november 2009 49