udelukke diagnosticeringen af GIST, og det samme gælder for Gleevec/Glivec

c-kit pharmdx Kode K1907 35 analyser til brug på Dako Autostainer Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug. c-kit pharmdx -analysen er et kvalitativt immunhistokemisk (IHC) sætsystem, som bruges på Dako Autostainer til identificering af c-kit protein/cd117 antigen (c-kit protein) ekspression i normalt og neoplastisk formalinfikseret, parafinindlejret væv med henblik på histologisk evaluering. c-kit pharmdx polyklonale, kanin antistoffer detekterer specifikt c-kit-proteinet i CD117-antigenudtrykkende celler. c-kit pharmdx indikeres som en hjælp ved differentiel diagnosticering af gastrointestinale stromale tumorer (GIST). Efter diagnosticering af GIST, kan resultaterne fra c-kit pharmdx anvendes til at identificere de patienter, der udvælges til behandling med Gleevec /Glivec (imatinib mesylat). Resultaterne ved farvning med hæmatoxylin og eosin (H&E) samt en række antistoffer kan hjælpe med differentiel diagnosticering af GIST. Resultaterne skal fortolkes i relation til patientens kliniske forhistorie og andre diagnostiske analyser af en kvalificeret patolog. Bemærk: Denne analyse er ikke beregnet til at være det eneste grundlag til diagnosticering af GIST og er ikke beregnet som eneste grundlag for valg af Gleevec/Glivec terapi. Resultatet for c-kit negative GIST patienter behandlet med Gleevec/Glivec er ikke fastlagt. Et negativt resultat ville ikke nødvendigvis 1, 2, 3 udelukke diagnosticeringen af GIST, og det samme gælder for Gleevec/Glivec Alle patienterne i de kliniske forsøg med Novartis Gleevec/Glivec blev udvalgt ved hjælp af en foreløbig Novartis klinisk undersøgelsesprotokol (Clinical Trial Protocol (NCTP)). Det primære anti-c-kit polyklonale kanin antistofreagens, der blev anvendt ved NCTP, blev købt hos Dako. Det c-kit pharmdx primære polyklonale antistofreagens gennemgik den samme metode til fremstilling, rensning og kvalitetskontrol, som det NCTP polyklonale anti-c-kit reagens. Resumé og forklaring Indledning Protoonkogenet c-kit, som også kendes under betegnelsen CD117 antigen eller stamcellefaktorreceptor, er en 145 kd, type III, transmembranreceptor-tyrosinkinase. C-kit-genet koder en transmembran-tyrosinkinasereceptor, der strukturelt ligner blodpladeudledte vækstfaktorreceptor A og B samt kolonistimulerende faktor 1-receptor og menes at spille en vigtig rolle i hæmatopoiese, spermatogenese og melanogenese. C-kit-proteinet indeholder ekstracellulære domæner med 5 Ig-lignende sløjfer, et yderst hydrofobisk transmembrandomæne og et intracellulært domæne med tyrosinkinase-aktivitet, der er opdelt i kinase-indføring i en ATP-bindende region og et fosfotransferasedomæne. Receptoraktivering følges af receptordimerisering, substratfosforylering og autofosforylering, receptorinternalisering, aktivering af proteinkinaser og fosfolipaser samt transkription af forskellige proto-onkogener. 4 C-kit-tyrosinkinase-receptorens bane har vist sig at være vigtig ved tumorvækst og udvikling ved adskillige cancertyper. 5 Mutationer i c-kit-genet medfører liganduafhængig fosforylering (aktivering) af c-kit-tyrosinkinasen og menes at spille en central patogen rolle i f.eks. gastrointestinale stromale tumorer. 6 Gastrointestinale mesenkymale tumorer har hidtil været vanskelige at differentiere og diagnosticere. I 2001 blev imatinibmesylat (Gleevec, Novartis, Basel, Schweiz) godkendt af US Food and Drug Administration til behandling af gastrointestinale stromale tumorer (GIST). Godkendelsen var baseret på en klinisk undersøgelse, hvori voksne personer med GIST, der udtrykte c-kit-protein påvist ved immunhistokemi (Novartis klinisk undersøgelsesprotokol), blev indlemmet og behandlet med imatinibmesylate. 7 GIST-tilfælde opdeles morfologisk i tre kategorier: tenformet celle, epitelcelle og blandede typer. Uanset morfologien udtrykker størstedelen af GIST-tilfældene c-kit protein i en betydelig andel af tumorcellerne. 8-11 Det bør bemærkes, at en lille procentdel af GIST-tilfældene ikke udtrykker c-kit protein. Relativt få andre tumorer kan være c-kit protein positive. Disse omfatter metastatiske melanomer, angiosarkomer, Ewing-sarkomer, mastocytomer, seminomer og carcinomer i de små pulmonære celler. GIST er normalt også positiv for caldesmon med høj molekylær vægt, ofte positiv for CD34 (60-80%) og generelt negativ for desmin og S100-protein. 12 Specificitet Polyklonalt kanin-c-kit-antistof blev fremskaffet ved subkutan injicering af et 14 aminosyre (aa) peptid (position 963-976 af C terminus af c-kit-proteinet) koblet til thyroglobulin. Antiserummet blev specielt renset gennem en antigenbundet, aktiveret thiol AvidGel F affinitetskromatografi. Man har fundet, at et mindre antal sarkomer i blødt væv er c-kit-positive. 6 Nogle af disse præparater (f.eks. leiomyosarcomer) blev testet for c-kit-proteinekspression. Undersøgelsen omfattede en sammenligning mellem c-kit pharmdx -analysen og Novartis kliniske undersøgelsesprotokol (NCTP), som blev anvendt ved udvælgelse af patienter til behandling med Gleevec i de kliniske undersøgelser, som Novartis gennemførte. To ud af i alt otteogtyve analyserede præparater viste positiv farvning. Resultatet var konsistent ved (111797-003) 305756DK_001 p. 1/14

anvendelse af de to protokoller. Al positiv immunfarvning forsvandt efter absorption af det primære antistof med et syntetisk peptid (16 aminosyre-c-terminalende af c-kit-proteinet). Således reagerede det primære antistof, der blev anvendt i c-kit pharmdx -analysen, specifikt med c-kit-proteinet i de to positivt farvede sarcomer fra blødt væv. Interne undersøgelser ved hjælp af c-kit pharmdx har vist c-kit proteinekspression i en række normale celler. Disse celler omfatter ductus- og myoepitelceller i brystet, purkinje-celleprocesser, lamina propriaceller i colon, cylinderepitel i nyrer, melanocytter og myoepitelceller i huden, Cajals interstitielle celler i tyndtarmen og mastceller. Den cytoplasmiske reaktion i granulocytter skyldes endogen peroxidase aktivitet og var synlig med negativ kontrolreagens. Reagenser Kode K1907 er beregnet til automatisk farvning med anvendelse af Dako Autostainer. De anførte materialer rækker til 35 analyser (35 patientobjektglas og 10 kontrolobjektglas inkuberet med primært antistofreagens mod c-kit-protein og 35 objektglas inkuberet med den tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af c-kit pharmdx Autostainer-protokollen med klar-til-brugreagenser. Sættet indeholder materialer til maks. 10 individuelle farvninger. Medfølgende materialer Mængde 1x9 ml Beskrivelse c-kit pharmdx polyklonalt kanin-igg 1x9 ml Polyklonalt kanin-anti-humant c-kit IgG i en Tris-HCl-buffer, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. Negativ kanin-igg-kontrolreagens 2x5 objektglas Polyklonalt kanin-igg i en koncentration, der er større end eller lig med den positive anti-c-kit koncentration, i en Tris-HCl-buffer, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. c-kit pharmdx -kontrolobjektglas Hvert objektglas indeholder snit af to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindlejrede musecellelinjer (+) og humane (-) cellelinjer, der repræsenterer et moderat niveau af c-kitproteinekspression og ingen c-kit-ekspression. IHC-farvningen af cellepillerne er 2+ og 0. Procedurens principper Nødvendige materialer, der ikke medfølger c-kit pharmdx -IHC-sættet indeholder polyklonale antistoffer og kontrolobjektglas til udførelse af en IHCfarvning af formalinfikserede og paraffinindlejrede præparater. Efter inkubering med det primære polyklonale antistof mod humant c-kit-protein er dette sæt optimeret til brug med et klar-til-brug-visualiseringsreagens, baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære gede-anti-kanin-antistofmolekyler og peberrodperoxidasemolekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbasis, hvorved behovet for sekventiel påføring af link-antistof og peroxidasekonjugat elimineres. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Kontrolglas, der indeholder to formalinfikserede, paraffinindlejrede henholdsvis muse- og humane cellelinjer med en farvningsintensitet på 2+ og 0, medfølger med henblik på kvalitetskontrol af sætreagensernes effektivitet. c-kit pharmdx -IHC-protokollen er valideret ved hjælp af nedenstående Dako-farvereagenser: Wash Buffer (kode S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (kode S2003) Target Retrieval solution (kode S1699 eller S1700) EnVision+ HRP, Anti-kanin (kode K4002 eller K4003) DAB+ (kode K3467 eller K3468) (111797-003) 305756DK_001 p. 2/14

Bemærk: For at sikre korrekte farvningsresultater må der kun anvendes disse farvereagenser sammen med c-kit pharmdx. Afvigelser fra denne anbefalede protokol er ikke valideret. Andre materialer der er nødvendige til c-kit pharmdx : Hæmatoxylin, alkohol- eller vandbaseret, som f.eks. Dako s Hematoxylin (kode S3301 eller S3302) Dækglas Vandbad, der er passende kalibreret, og som kan bevare en temperatur på 95 99 C, eller en trykkoger, d er kan kalibreres og opvarme til 125 C Destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) Tørreovn, der kan holde en temperatur på 56 60 C Ethanol, absolut og 95% Lysmikroskop (4x 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium, f.eks. Dako s Faramount (kode S3025) eller Dako s Glycergel (kode C0563) eller Dako s Ultramount (kode S1964) Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, Fisher s SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagte objektglas, ladede objektglas eller Dako s Silanized Slides (kode S3003) (se afsnittet Klargøring af præparater) Farvningsglas eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2 30 minutter) Xylen, toluen eller xylen-erstatninger 1 ml pipette Dako Autostainer Universal Staining System (kode S3400) eller Autostainer Plus (kode S3800) med Dako Autostainer softwareversion 3.0.0 eller nyere. (Se brugsanvisningen til Dako Autostainer vedrørende nødvendige komponenter). Bemærk: Alle reagenser, som medfølger eller kan købes separat, såsom Dako s Wash Buffer (kode S3006), er formuleret specifikt til anvendelse med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andre. Forholdsregler 1. Må kun anvendes af uddannet personale. Til in vitro diagnostisk brug. 2. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemikalie, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan NaN 3 reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre azidophobninger i rørene. 3. Som ved alle produkter, der er afledt af biologisk materiale, gælder det, at præparater og reagenser skal håndteres på korrekt vis. 4. Andre inkubationstider, -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 5. Undlad at udskifte primære antistoffer eller negative kontrolreagenser med primære antistoffer og negative kontrolreagenser fra andre produktionspartier (partinummeret fremgår af flaskernes etiket) eller med reagenser fra andre producenter. Dette kan give forkerte resultater. 6. Sættets reagenser er fortyndet optimalt til brug sammen med de anbefalede reagenser. Yderligere fortynding frarådes og kan medføre tab af antigenfarvning. Eventuelle ændringer skal verificeres af brugeren. 7. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 8. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. 9. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. Risiko- og sikkerhedserklæringer DAB-Kromogen* R 40 Mulighed for kræftfremkaldende effekt. R43 Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. R68 Mulighed for varig skade på helbred. S35 Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. S 36/37 Brug særligt arbejdstøj og egnede beskyttelseshandsker. Som hovedregel må personer under 18 år ikke deltage i arbejdet med dette produkt. Brugerne skal have omhyggelige anvisninger om den korrekte arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger. (*DAB Chromogen er et nødvendigt materiale, som ikke følger med dette sæt). Opbevaring c-kit pharmdx -sættet skal opbevares ved 2 8 C. Kontrolobjektglas skal ligeledes opbevares ved 2 8 C. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt udvendigt på æsken. Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og negative kontroller samtidig med patientpræparater. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er angivet på indlægssedlen, skal brugeren verificere disse betingelser. 13 Kvalitetserklæring Reagenserne i sættet c-kit pharmdx skal være kvalitetskontrolleret ved immunhistokemi under følgende forhold: target retrieval i en Pascal trykkoger (kode S2800) programmeret til 30 sekunder ved 125 C, afkøling t il 90 C efterfulgt af EnVision+ Rabbit, HRP system. (111797-003) 305756DK_001 p. 3/14

Klargøring af præparater Biopsipræparater skal behandles, så vævet bevares til IHC-farvning. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling til alle præparater. 14 Paraffinindstøbte snit Formalinfikserede og paraffinindlejrede vævsprøver er egnede til brug. Alternative fikseringer er ikke blevet vurderet og kan give forkerte resultater. Præparater fra biopsier skal skæres i blokke med en tykkelse på 3 4 mm og fikseres i en periode, der passer til fiksativet. Vævene skal derefter dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af imprægnering med smeltet paraffin. Paraffintemperaturen må ikke overstige 60 C. Korrekt fikserede og indlejrede vævsblokke, d er udtrykker c-kit-proteinet, vil holde sig uendeligt inden 14, 15 udskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares køligt (15 25 C). Vævssnit skal skæres i en tykkelse på 3 5 µm. Efter udskæringen skal vævene monteres på Fisher s SuperFrost Plus, Dako s Silanized (kode S3003), ladede objektglas eller poly-l-lysin-belagte objektglas og anbringes i tørrestativer. Objektglasstativerne skal bankes let imod et sugende klæde for at fjerne vand, der er fanget under paraffinen og på glassene, hvorefter de tørres ved stuetemperatur i en time. Stativet med objektglas anbringes derefter i en inkubator ved 56 60 C i en time. Hvis der stadig er overskydende va nd på objektglassene, når de tages ud af inkubatoren, fjernes dette ved at banke glassene let imod et klæde, hvorefter de tørres endnu en time i inkubatoren. Når glassene tages ud af inkubatoren, skal de opbevares ved stuetemperatur, indtil de er afkølet, og paraffinen er hærdet. For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, som er monteret på objektglas, farves inden 2 måneder efter udskæringen, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C). Se Dako-håndbogen: Immunochemical Stain ing Methods 16 (immunkemiske farvningsmetoder) eller reference 14 og 15 vedrørende yderligere oplysninger om klargøring af prøver. Anvendelse af afkalkede væv er ikke valideret og frarådes. Objektglas, der er påkrævet til c-kit-evaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Der skal klargøres mindst 5 objektglas, 1 objektglas til tilstedeværelse af tumorer, 2 objektglas til evaluering af c-kit-protein og 2 objektglas som reserve. Forberedelse af reagenser Følgende reagenser skal klargøres forud for farvning: Target Retrieval Solution (kode S1699) Klargør en tilstrækkelig mængde Target Retrieval Solution ved at fortynde Target Retrieval Solution 10x 1:10 med destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) til vasketrinnene. Kassér Target Retrieval Solution efter brug. Bemærk: Fortynding er ikke nødvendig ved brug af Dako s Target Retrieval Solution (kode S1700). Wash Buffer Solution (kode S3006) Klargør en tilstrækkelig mængde Wash Buffer ved at fortynde Wash Buffer 10x 1:10 med destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) til vasketrinnene. Opbevar ubrugt opløsning ved 2 8ºC i højst 7 dage. Kassér bufferen, hvis den er uklar. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (kode K3467 eller K3468) Denne opløsning skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. DAB+-substratkromogenopløsningen klargøres ved at tilsætte 1 dråbe flydende Liquid DAB+ Chromogen til én ml DAB+ Substrate Buffer og blande. Kassér eventuel ubrugt opløsning. Klargjort DAB+ er stabil i ca. 5 dage, hvis det opbevares ved 2 8 C. Vigtig bemærkning: Farven på den flydende DAB+ kromogen i flasken kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til ovenstående retningslinjer. Hvis der tilsættes for meget flydende DAB+ kromogen til DAB+ substratbufferen, vil det medføre en forringelse af det positive signal. Monteringsmedie Ikke-vandbaseret, permanent monteringsmedium, f.eks. Dako Ultramount (kode S1964) anbefales. Vandbaserede monteringsmedier såsom Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) er også egnede. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. Farvningsprocedure på Dako Autostainer Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Se brugervejledningen til Dako Autostainer, Universal Staining System. Alle reagenser skal have stuetemperatur (20 25 C) i nden immunfarvningen. Desuden skal alle inkuberinger foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non-specifik farvning. Bemærk: Reagenserne og vejledningen, der følger med dette system, er udviklet til at yde optimalt ved brug sammen med de anbefalede reagenser og materialer. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkuberingstiderne eller temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. (111797-003) 305756DK_001 p. 4/14

Afparaffinering og rehydrering Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indlejringsmedium vil medføre øget uspecifik farvning. TRIN 1. Objektglassene anbringes i et xylenbad og inkuberes i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. TRIN 2. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i absolut ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. TRIN 3. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. TRIN 4. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i vand af reagenskvalitet i 5 (±1) minutter. Begynd farvningsproceduren med Target Retrieval Xylen- og alkoholopløsningerne skal udskiftes efter 40 objektglas. Toluen- eller xylenerstatninger, så som Histoclear, kan anvendes i stedet for xylen. Target Retrieval Anbefalet procedure: Vandbad TRIN 1. Fyld farvningsglas, f.eks. Coplin-glas, med den fortyndede Target Retrieval Solution (se Forberedelse af reagenser). Anbring farvningsglassene, der indeholder Target Retrieval Solution, i vandbad. Varm et vandbad og Target Retrieval Solution til 95 99 C (m å ikke koge). Sæt låg på glassene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. TRIN 2. Nedsænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i den forvarmede Target Retrieval Solution i farveglassene. Lad temperaturen i vandbadet og Target Retrieval Solution igen nå 95 99 C. Inkubér i 20 (±1) minutter ved 95 99 C. TRIN 3. Tag hele glasset med objektglassene op af vandbadet. Lad objektglassene afkøle i Target Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved stuetemperatur. TRIN 4. Dekantér Target Retrieval Solution, og skyl snittene i Wash Buffer (se Forberedelse af reagenser). TRIN 5. Det bedste resultat opnås, hvis snittene anbringes i Wash Buffer i 5 (±1) minutter efter target retrieval og inden. Target Retrieval Trykkoger (30 sekunder ved 125 C) Det er meget vigtigt at bevare konsistensen i target retrieval-protokollen for at sikre reproducerbarheden. Trykkogeren skal kunne opnå og holde 125 C og hver trykkogning skal omfatte det totale volumen væske (Target Retrieval Solution og vand i trykkogeren) såvel som det samme totale antal objektglas. Den optimale protokol er følgende: TRIN 1. For hver kørsel tilsættes et konsistent volumen reagenskvalitetsvand til trykkogeren (500 ml eller følg producentens anvisninger). TRIN 2. Fyld hver af de to varmebestandige plastikfarvebeholdere, som kan rumme et 24-stk. objektglasstativ med 250 ml klargjort Target Retrieval Solution (se Forberedelse af reagenser). TRIN 3. Nedsænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i Target Retrieval Solution i farvningsbeholderne. Bemærk: Af hensyn til konsistensen skal der anbringes 48 objektglas i trykkogeren under hver trykkogning, hvor der anvendes tomme objektglas, hvis der er færre end 48 objektglas med prøvepræparater til behandling. Hvis der er 24 eller færre objektglas til behandling, skal den anden farvebeholder fyldes med 250 ml vand for at bevare Target Retrieval Solution. TRIN 4. Anbring de to farvningsbeholdere i trykkogeren, og skru låget godt fast. TRIN 5. Indstil trykkogeren til opvarmning til 125 C, og inkuber objektglassene ved 125 C i 30 sekund er. Lad trykkogeren afkøle i 30 minutter uden at udligne trykket, før den åbnes. TRIN 6. Sørg for, at trykket er udlignet, før trykkogeren åbnes. Fjern farvningsbeholderne, dekantér Target Retrieval Solution, og skyl snittene i Wash Buffer eller reagenskvalitetsvand). TRIN 7. Snittene anbringes i Wash Buffer i 5 (±1) minutter efter target retrieval og inden farvning. Bemærk: Target Retrieval Solution er beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Automatiseret farvningsprotokol Se brugervejledningen til Dako Autostainer, Universal Staining System. TRIN 1. Vælg protokol, og programmér farvningskørslen (fig. 1). TRIN 2. Brug Auto-programmer til at indstille programmet, og påbegynd c-kit pharmdx -programmet. TRIN 3. Anbring reagensflaskerne i reagensstativet i Dako Autostainer i henhold til det computergenererede reagenskort. TRIN 4. Anbring objektglassene i Dako Autostainer i henhold til det computergenererede objektglaskort. TRIN 5. Start kørslen. TRIN 6. Tag objektglassene ud af Dako Autostainer. Affald fra DAB+ substratkromogenopløsning opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. (111797-003) 305756DK_001 p. 5/14

Gå videre med kontrastfarvning og montering. Bemærk: Skyl objektglassene i vand af reagenskvalitet efter trinnet med DAB+-substratkromogenopløsning. (Dako Autostainer-hardware, version 02 og 03, skyller objektglassene i vand af reagenskvalitet efter substratkromogentrinnet. Hardwareversion 01 af Dako Autostainer skyller objektglassene i buffer. Derfor skal objektglas, der farves på Dako Autostaine hardwareversion 01, skylles med vand af reagenskvalitet, efter at de er taget ud af Autostainer). Figur 1. Autostainer-programmeringsgrid Gengivelse af en programkørsel på Dako Autostainer. Programmeringsgrid en (herover) er en pharmdx -masterprotokolskabelon, der indeholder protokolelementer til kørsel sammen med c-kit pharmdx -sættet. Dette eksempel viser kun c-kit-reagenser. Kontrastfarvning (vejledning til hæmatoxylin) Det farvede slutprodukt fra farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Hæmatoxylin, alkohol- eller vandbaseret, som f.eks. Dako s Hematoxylin (kode S3301, automatiseret eller S3302, manuel), kan anvendes. Der må ikke anvendes regressive kontrastfarvestoffer. TRIN 1. Objektglassene tages ud af Dako Autostainer og kontrastfarves i hæmatoxylin, som beskrevet herunder. TRIN 2. Objektglassene dyppes i et hæmatoxylin-bad. Inkubér i 2 5 minutter afhængigt af styrken af den anvendte hæmatoxylin. TRIN 3. Der skylles forsigtigt i et bad med vand af reagenskvalitet. Sørg for, at alle rester af hæmatoxylin er fjernet. Valgfrit: Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 0,037 mol/l ammoniakvand, hvilket dog ikke er et krav (se afsnittet Forberedelse af reagenser). Bemærk: Det anbefales kraftigt at anvende Dako s Hematoxylin (kode S3301). Med en 3-minutters inkubering frembringer dette kontrastfarvestof et svagt violet/blåt slutprodukt, som ikke slører specifik immunfarvning. Stærk kontrastfarvning kan maskere en svag c-kit/proteinekspression. TRIN 4. Der skylles forsigtigt i et bad med vand af reagenskvalitet i 2 5 minutter. Montering Ikke-vandbaseret, permanent montering, f.eks. Dako Ultramount (kode S1964) anbefales. Vandbaserede monteringsmedier såsom Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) er også egnede. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. Bemærk: Det anbefales at aflæse objektglassene inden for seks uger fra tidspunktet for farvningen. Der kan imidlertid opstå en vis falmning afhængig af flere faktorer omfattende, men ikke begrænset til, kontrastfarvning, monteringsmaterialer og metoder samt objektglassenes opbevaringsforhold. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). Kvalitetskontrol Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indlejring på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA konsulteres retningslinjerne for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Se også CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline 17 og reference 18-21 for yderligere oplysninger. c-kit pharmdx -kontrolobjektglas (medfølger) Hvert af de medfølgende kontrolobjektglas indeholder to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindlejrede musecellelinjer (+) og humane (-) cellelinjer med en farvningsintensitet på 2+ og 0. Der skal farves ét objektglas i hver farvningsprocedure. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. De må ikke anvendes som en hjælp til fortolkningen af patientresultaterne. (111797-003) 305756DK_001 p. 6/14

Positivt kontrolvæv Kontrollerne skal være friske autopsi-/biopsi-/kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Positivt kontrolvæv bruges som tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. Der skal foretages én positiv vævskontrol for hvert sæt af testbetingelser i hver farvningskørsel. Vævene, der bruges i de positive vævskontroller, skal give en svag positiv farvning, så de kan detektere små forandringer i følsomheden for det primære antistof. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette system, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven (-prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og verificerer ikke klargøringen af vævene. Kendte positive vævskontroller må kun anvendes til overvågning af, om de behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige. Normale celletyper, der kan anvendes som en svag c-kit-positiv kontrol, omfatter basale epidermale melanocytter og myoepiteliale kirtelceller fra huden samt epitel- og myoepiteliale celler fra brystet. Stærke interne kontroller kan være neuronale celler (interstitielle Cajal-celler) og mastceller i tarmene. Negativt kontrolvæv Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for c-kit-protein), der er fikseret, behandlet og indlejret på en måde, som svarer til patientprøven (-prøverne), i hver farvningskørsel for at verificere specificiteten af det primære antistof og tilvejebringe en indikation af specifik baggrundsfarvning. De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Vævselementer, der kan anvendes som negative kontroller, omfatter hjertets kardielle myocytter. Pankreatiske acinære celler er ligeledes c-kit-negative, mens pankreatiske epitelceller fra galdegangen farver positivt. Uspecifik negativ kontrolreagens Brug det medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non-specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for det negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Når der anvendes antistofpaneler på flere snit, kan de negativt farvede områder på ét objektglas tjene som en negativ/uspecifik bindingsbaggrundskontrol for andre antiserummer. Verificering af analysen Før et antistof eller et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren verificere antistoffets effektivitet ved at teste det på en række interne væv med kendte IHC-effektivitetskarakteristika, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne vedr. kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene til kvalitetskontrol i CAP Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 17 Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hver ny antistof-lot, eller når analyseparametrene ændres. Gastrointestinale stromale tumorer (GIST) med kendte c-kit-proteinfarvningsintensiteter og negative væv er egnede til verificering af analysen. (111797-003) 305756DK_001 p. 7/14

Tabel 1: Formålet med daglig kvalitetskontrol Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Kontrolobjektglas leveret af Dako. Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv af hensyn til følsomheden for antistofeller antigennedbrydning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Specifikt antistof & detektionssystem Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. (Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed). Kontrollerer alle trin i analysen. Validerer reagenser og procedurer anvendt ved c-kit-farvning. Detektering af utilsigtet antistofkrydsreaktivitet med celler/cellekomponenter. Baggrund: Uspecifikt antistof (kanin negativ kontrolreagens) medfølger Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Patientvæv. Detektering af specifik farvning. Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Fortolkning af farvningsprocedure En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Alle evalueringer skal baseres på præparatets tumorsektion. Et objektiv med en forstørrelse på 10x eller 20x er velegnet til evaluering af den immuncytokemiske farvning og fortolkning. Anvend intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne; nekrotiske eller degenererede celler farves ofte uspecifikt. 17 Positive og negative farvede cellelinjer medfølger i hvert c-kit pharmdx -sæt til validering af ydelsen af analysen. Hensigtsmæssig farvning af kontrolobjektglassene indikerer, at c-kit pharmdx -reagenserne fungerer korrekt, og at protokollen er overholdt præcis. farvning af HT-29-kontrolcellelinjen (0) og moderat brun cytoplasmisk eller paranuklear farvning i P815-kontrolcellelinjen (2+) indikerer, at farvningskørslen er gyldig. Afvigelse fra den optimale positive kontrolcellelinjes farvningsintensitet (for svag eller for høj), kan bevirke et fejlagtigt negativt eller fejlagtigt positivt resultat og indikerer, at analysen skal gentages. Vurdering af den positive vævskontrol, skal foretages. Svag farvning af hudens myoepitelceller indikerer, at reagenserne fungerer korrekt. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige. Det negative kontrolvæv skal undersøges efter det positive kontrolvæv for at verificere specificiteten af det primære antistofs mærkning af antigenet. Manglende specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter manglende antistofkrydsreaktivitet over for celler/cellekomponenter. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. En eventuel uspecifik farvning har normalt et diffust udseende. Sporadisk farvning af bindevæv kan også ses i snit fra for kraftigt formalinfikseret væv. Brug intakte celler til fortolkning af farvningsresultater. Nekrotiske eller degenererede celler farves ofte uspecifikt. 18 Undersøg patientens præparater til sidst. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel nonspecifik baggrundsfarvning med den negative kontrolreagens. C-kit-proteinekspression skal fortolkes i relation til tumorens generelle morfologi og kliniske kontekst. GIST opdeles morfologisk i tre kategorier: tenformet celle (70%), epitelceller (20%) eller blandede typer. 22 Uanset morfologien udtrykker størstedelen af GIST-tilfældene c- kit protein i en betydelig andel af tumorcellerne. Homogen immunfarvning med c-kit pharmdx ses primært i cytoplasma, med eller uden et golgi-/paranukleart mønster (prik-lignende), og i cellemembraner med enten fuldstændig eller ufuldstændig farvning af omkredsen. I nogle tilfælde forekommer et heterogent (en blanding af stærke eller svage cytoplasmiske og/eller membraner) farvningsmønster. Der har også været observeret farvning i de ekstracellulære rum. c-kit pharmdx -testresultater skal rapporteres som positive eller negative, baseret på evaluering af den cytoplasmiske farvning og membranfarvningen (Tabel 2). Positivitet for c-kit-proteinekspression defineres som enhver specifik cytoplasmisk og/eller membranfarvning af tumorcellerne. Fokal positivitet eller farvning af mindre end 10% af tumorcellerne skal fortolkes med forsigtighed. 23 Som det er tilfældet med enhver immuncytokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret ikke at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Det bør ligeledes bemærkes, at en lille procentdel af GIST-tilfældene ikke udtrykker c- kit-protein. Derfor udelukker en manglende c-kit-proteinfarvning ikke nødvendigvis en GIST-diagnose. (111797-003) 305756DK_001 p. 8/14

Tabel 2: c-kit pharmdx -farvningsresultater Rapporteres til den behandlende læge c-kit-protein negativ c-kit protein positiv Definition Manglende farvning af tumorcellerne. Positiv farvning defineres som enhver IHC-farvning af tumorcellecytoplasmaet og/eller membranerne over baggrundsniveauet. Farvningsintensitet: 1+, 2+ eller 3+ Om nødvendigt skal der anvendes et panel af antistoffer for at identificere fejlagtigt negative reaktioner. Når farvningen er fokalt positiv, skal yderligere analyser overvejes til bekræftelse af en GIST diagnose. Genetisk analyse såvel som de farvningsmønstre, der er angivet i Tabel 3, hjælper med at skelne mellem GIST og andre mesenkymale sarkomer. Der henvises til "Resumé og forklaring" og "Begrænsninger samt Præstationskarakteristika" for specifikke oplysninger om immunreaktivitet. Tabel 3. Immunhistokemisk skema til differentiel diagnose af tencelletumorer i GI-kanalen. 8 c-kit CD34 SMA Smooth Muscle Actin S-100 Desmin Gastrointestinal stromal 95% 60 70% 30 40% 5% 2% tumor Glat muskulaturtumor - 10 15% + Sjælden + Schwannom - Almindelig - + - Fibromatose Usikker* Sjælden + - Sjælden * De fleste, men ikke alle forfattere rapporterer, at fibromatoser er negative for c-kit. Afhængigt af inkubationstiden og den anvendte hæmatoxylins styrke vil kontrastfarvning medføre en lyse- til mørkeblå farvning af cellekernen. For meget kontrastfarvning kan påvirke fortolkningen af resultaterne. Begrænsninger Generelle begrænsninger IHC er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser; udvælgelse af væv, fiksering og behandling; klargøring af IHC-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof-trapping eller falsk negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. Produktet er ikke beregnet til flowcytometri. Præstationskarakteristika er ikke fastlagt til flowcytometri. Vævsprøver fra personer, som er inficerede med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non-specifik farvning med peberrodsperoxidase. 24 Reagenser kan udvise uventede reaktioner i væv, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævsgrupper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. 17 Kontakt Dako's tekniske support med dokumenterede uventede reaktioner. Produktspecifikke begrænsninger En lille procentdel af GIST-tilfældene udtrykker ikke c-kit-protein. Derfor udelukker en manglende c-kit-farvning ikke en GIST-diagnose. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke-immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C). 19 For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver c-kit-proteinet target retrieval, når vævene fikseres (neutral buffered formalin) og paraffinindlejres rutinemæssigt. Dako anbefaler anvendelse af c-kit pharmdx på en Dako Autostainer eller Autostainer Plus. Anvendelse af c-kit pharmdx på alternative automatiserede platforme er ikke blevet vurderet og kan give forkerte resultater. (111797-003) 305756DK_001 p. 9/14

Farvede kontrolcellelinjer skal kun anvendes til validering af farvningskørslen og ikke til bedømmelse af farvningsreaktionen i vævssnit. Præparater, der er konserverede ved rutinemæssig behandling i neutral buffered formalin, er egnede til analyse med c-kit pharmdx. Væv, der er fikserede i alternative fiksativer, er ikke valideret. Præstationskarakteristika Specificitet C-kit-antistofreagensen er testet for reaktivitet over for cellelinjer, der udtrykker c-kit-protein. I Western blotting af et lysat af SY-cellelinjer af carcinomer fra de små celler i lungerne, der overudtrykker c-kit mrna, mærker antistoffet et 145 kd-bånd, der svarer til c-kit-proteinet. Det mærkede bånd er temmelig bredt, fra 120 til 155 kd. Yderligere et bånd på 100 kd mærkes. 25 I yderligere undersøgelser med et andet antistof over for c-kit, blev et 100 kd-protein ligeledes mærket. Denne mærkning forsvandt, da antistofreagensen blev inkuberet med det syntetiske c-kit peptidantigen, der blev anvendt til immunisering. 26 I yderligere undersøgelser blev c-kit antistoffet analyseret ved hjælp af Western blotting for kryds-reaktivitet over for proteiner med fælles strukturel homologi, såsom Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFRa), makrofag kolonistimulerende faktorreceptor (c-fms) og FMS-lignende tyrosinkinase 3 (FLT-3). Der blev ikke fundet kryds-reaktivitet i disse homologe proteiner Hertil kommer, at Dako antistofreagensen i Western blotting ikke reagerede med lysatet i adenokarcinomcellelinie HS, hvilket ikke udtrykker c-kit protein. 25 Sammenlignende undersøgelser Immunfarvning med anvendelse af c-kit pharmdx -analysen blev udført på formalinfikserede, parafinindlejrede sarcomer og flervævsserier (multi-tissue arrays = MTA er), der indeholdt et udvalg af sarcomer, som omfattede positive og negative c-kit-proteinudtryk. Vævene blev analyseret med anvendelse af c-kit pharmdx -analysen efter brug af de to anbefalede metoder med varmeinduceret epitop-retrieval (HIER). Kort sagt blev vandbad (95 99 C) i 20 minutter og trykkoger (121 C) i 5 minutt ers opvarmning (begge to efterfulgt af 20 minutters nedkølinig) anvendt som varmekilder. De øvrige trin i farvningsproceduren var identiske. Disse analyser blev sammenlignet med en samtidig kørt simulering af Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP), som tidligere var blevet brugt til at udvælge patienter til den kliniske analyse, der opnåede FDA-godkendelse til brug af Gleevec/Glivec til diagnosticerede GIST-patienter. NCTP anvendte en dobbelt så stor koncentration af Dako primary polyclonal antistof i forhold til c-kit (A4502) (det samme reagens som i c-kit pharmdx) og intet HIER. Resultaterne fra sammenligningen mellem NCTP og c-kit pharmdx -analysen med trykkogeren som varmekilde er vist i tabel 4, og lignende resultater (generel overensstemmelse = 98,7%) fremkom med et vandbad som varmekilde. Procentdelen af positive og negative overensstemmelser var tilsvarende i de to sammenligninger. Tabel 4. 2x2 tabel for c-kit pharmdx -protokollen med analyseresultater med anvendelse af trykkoger sammenlignet med NCTP -analyseresultatet c-kit pharmdx - TRanalyseresultat med anvendelse af trykkoger Samtidig NCTP Analyseresultater Positiv Negativ n (%) n (%) I alt Positiv 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativ 1 (0,3) 117 (37,9) 118 I alt 189 120 309 Procentdel positiv overensstemmelse = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% præcis CI: 97,1% - 100%) Procentdel negativ overensstemmelse = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% præcis CI: 92,9% - 99,5%) Generel overensstemmelse = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% præcis CI: 96,7% - 99,7%) Et undersæt af disse præparater (35 tilfælde) repræsenterede væv fra patienter, der deltog i den kliniske Novartis Gleevec-undersøgelse. Ud af disse patienter blev 21 behandlet med Gleevec (58,3%). Da de samme præparater blev analyseret igen med simuleret NCTP og c-kit pharmdx, blev 20 fundet positive i alle tre procedurer, mens 1 præparat blev fundet negativt. Blandt de 147 patienter, der blev behandlet med Gleevec i Novartis Gleevec Clinical Trial, blev det rapporteret, at 54% oplevede en delvis respons, og 28% fik stabiliseret sygdommen. 7 For et undersæt på 259 præparater, som vist i tabel 4, blev c-kit testresultatet fastlagt på det tidspunkt, hvor præparaterne blev anbragt i MTA'erne. 35 af disse tilfælde blev indlemmet i de Gleevec kliniske undersøgelser (n=35), og de resterende blev undersøgt i de samme laboratorier, som deltog i Gleevec undersøgelserne. Resultaterne fra de 179 præparater (det samlede antal var mindre end 259 på grund af tab af præparater eller manglende tumorer i MTA'erne) er vist i tabel 5 nedenfor. Disse præparater viste en generel overensstemmelse med det oprindelige c-kit resultat på 94,9% (95% præcis CI: 90,7% - 97,7%). (111797-003) 305756DK_001 p. 10/14

Tabel 5: 2x2 tabel over trykkogerresultater sammenlignet med de oprindelige analyseresultater c-kit resultat for oprindeligt væv Trykkogeranalyseresultat Positiv Negativ I alt n n n (%) Positiv 136 3 139 (78%) Negativ 6 34 40 (22%) I alt 142 37 179 Procentdel positiv overensstemmelse = 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% præcis CI: 91,0.% - 98,4%) Procentdel negativ overensstemmelse = 34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% præcis CI: 78,1% - 98,3%) Generel overensstemmelse = (136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% præcis CI: 90,7% - 97,7%) Reproducerbarhed Reproducerbarhed mellem kørsler (manuel farvning) Reproducerbarheden mellem kørsler blev afprøvet manuelt på tre laboratorier af to teknikere på hvert laboratorium over 3 dage med 5 forskellige præparater (4 positive og 1 negativ på hvert laboratorium). For de 30 væv, der blev analyseret, varierende farvningsintensiteten ikke mere end +/- en farveintensitetsgrad med følgende undtagelser: På stederne 1 og 3 varierede ét objektglas (hvert sted) med to intensitetsgrader. Dette var resultatet af en vævsskade på sted 1. Generelt fremragende reproducerbarhed (100%) sås for positive og negative resultater. Reproducerbarheden mellem laboratorier (manuel og automatisk farvning med anvendelse med Dako Autostainer) Immunhistokemisk farvning af 30 randomiserede og maskerede præparater med forskellige ekspressionsniveauer for c-kit (10 negative og 20 positive) blev udført på tre geografisk adskilte laboratorier. Udskårne objektglas blev sendt til hvert testlaboratorium til manuel og automatisk farvning og evaluering foretaget af en patolog. På to steder var den positive/negative bestemmelse af c-kit proteinekspression perfekt (100%) inden for og mellem laboratorierne i såvel manuelle som automatiske analyseprocedurer. På sted 2 blev to dobbelte væv, udpeget til at være negative før analysen, faktisk fundet positive. Den efterfølgende analyse afslørede, at et lille område (ca. 20% af tumorcellerne) var farvet positiv. Denne del af tumoren blev ikke fundet i de analyserede præparater i de andre laboratorier. Reproducerbarhed inden for kørsler (manuel farvning) På hvert af analysestederne blev 5 objektglas med samme præparat medtaget i sættet på 30 præparater, der blev farvet manuelt. Farvningsintensiteten og procentdelen af tumorfarvning blev analyseret. Vævsresultatet forblev positivt på hvert analysested, og farvningsintensiteten forblev inden for +/- 1 intensitetsgrad. Immunreaktivitet Tabel 6 viser en oversigt over c-kit pharmdx -immunreaktiviteten på det anbefalede panel af normale væv. Alle væv blev formalinfikserede og paraffinindlejrede. De medfølgende anvisninger og anbefalede reagenser i denne indlægsseddel blev anvendt til at udføre 30 analyser af normalt væv på DAKO Autostainer. Tabel 6: Evaluering af farvning af normale væv med c-kit pharmdx * Vævstype (antal analyser) Binyre (3) Knoglemarv (3) Bryst (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Cervix (3) Colon (3) Esophagus (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunger (3) Mesotelieceller (3) Ovarier (3) Pancreas (3) Parathyreoidea (3) Farvningsmønster Sjældne mastceller (2+): cytoplasmisk Epitelceller (3+): membran og cytoplasmisk Myoepitelceller: (1+): cytoplasmisk Purkinje-celleprocesser (1+): cytoplasmisk Submukosale mastceller (2+): og Lamina propria (2+) cytoplasmisk Submukosale mastceller (2+): cytoplasmisk Cylinderepitelceller (2+): cytoplasmisk Mastceller og makrofagceller (2+): cytoplasmisk Sjældne, store kanalepitelceller (3+): Mastceller (2+): cytoplasmisk (111797-003) 305756DK_001 p. 11/14

Perifere nerver (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spytkirtel (3) Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testikler (3) Thymus (3) Skjoldbruskkirtel (3) Tonsil (3) Uterus (3) Mastceller i blødt væv (2+): cytoplasmisk Mastceller (2+): cytoplasmisk Basale epidermale melanocytter (1+): cytoplasmisk Glandulære myoepitelceller (1+): cytoplasmisk Neuronale celler (1+): cytoplasmisk Mastceller (2+): cytoplasmisk Mastceller (2+): cytoplasmisk Mastceller i lamina propria (2+): cytoplasmisk *Flertallet af de analyserede væv viste positiv farvning af fibroblaster i stromalt væv (1+, fibrøs) samt i mastceller og makrofagceller. Der har været observeret lejlighedsvis farvning af eosinofiler induceret af endogen peroxidase. Interne undersøgelser ved hjælp af c-kit pharmdx har vist c-kit proteinekspression i en række normale celler. Disse celler omfatter ductus- og myoepitelceller i brystet, purkinje-celleprocesser, lamina propriaceller i colon, cylinderepitel i nyrer, melanocytter og myoepitelceller i huden, interstitielle Cajal celler i tyndtarmen og mastceller. Den cytoplasmiske reaktion i granulocytter skyldes endogen peroxidase aktivitet og var synlig med negativ kontrolreagens. Fejlfinding Tabel 7: Fejlfinding Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 2. Svag farvning af objektglas. 1a. Programmeringsfejl. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1b. Reagensflaskerne blev ikke sat ind på de korrekte pladser i reagensstativet. 1c. Utilstrækkelig reagensmængde i flasken. 1d. Natriumazid i vaskebufferbadet. 2a. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 1a. Kontrollér programmeringsgrid'en for at sikre, at farvningskørslen blev programmeret korrekt. 1b. Kontrollér reagenskortet for at verificere korrekt placering af reagensflaskerne. 1c. Kontrollér, at der er tilstrækkeligt med reagens i flaskerne, inden kørslen startes. Se de påkrævede mængder i reagenskortet. 1d. Brug frisk vaskebuffer uden azid. 2a. Gennemgå vejledningen for farvningsproceduren. 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 2b. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2c. Utilstrækkelig target retrieval med Target Retrieval Solution. 2b. Kontrollér, at patientvævet ikke overfikseres, og at der anvendes et godkendt fiksativ. 2c. Kontroller, at vandbadet eller trykkogeren fungerer korrekt, og at target retrievalproceduren blev fulgt. (Lave temperaturer og/eller forkert tid vil bevirke svag farvning.) 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3a. Brug friske renseopløsninger, og følg proceduren, der er beskrevet i afsnittet Afparaffinering og rehydrering. 3b. Der har været anvendt stivelsesadditiver ved monteringen af vævet på objektglasset. 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3b. Undlad at anvende additiver til vedhæftning af vævssnit til objektglas. Mange af disse er immunreaktive. 3c. Sørg for, at Autostainer er korrekt primet inden kørslen. Kontrollér, at der er tilstrækkeligt med buffer til hele kørslen. Der kan anvendes yderligere skylning efter visualiseringstrinnet, hvis dette ønskes. (111797-003) 305756DK_001 p. 12/14

3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3d. Kontrollér, at der tilsættes den korrekte mængde reagens til objektglassene. Sørg for, at Autostainer kører med låget lukket, og at den ikke udsættes for overdreven varme eller træk. 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 5. For kraftig specifik farvning. 6. Svag farvning af 2+- cellelinjen på kontrolobjektglasset. 3e. Objektglassene er tørret ud under indføringen i Autostainer. 3f. Non-specifik reagensbinding til vævssnittet. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 5a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 5b. For lange reagensinkubationstider. 5c. Der er anvendt en uegnet vaskebuffer. 3e. Sørg for, at objektglassene holdes våde med buffer under indføring, og inden kørslen igangsættes. 3f. Kontrollér, om præparatet er fikseret korrekt, og/eller om der er nekrose til stede. 4a. Brug ladede (Fisher s SuperFrost Plus) eller silaniserede objektglas såsom Dako s Silanized Slides (kode S3003). 5a. Sørg for, at der kun anvendes godkendte fikseringsvæsker og -metoder. 5b. Gennemgå vejledningen for farvningsproceduren. 5c. Anvend kun den vaskebuffer, som anbefales til brug med sættet. 6a. Utilstrækkelig target retrieval. 6a. Kontrollér, at target retrieval-proceduren blev udført korrekt. 6b. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 6c. Nedbrydning af kontrolobjektglas. 6b. Kontrollér, at inkuberingstiderne er præcise, når kørslen programmeres. 6c. Kontrollér udløbsdatoen og opbevaringsbetingelserne, som er trykt på pakkens etiket. Bemærk: Se også afsnittet Fejlfinding i Dako-håndbogen: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, Atlas of Immunohistology 21 eller Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis 18 Kontakt Dako s tekniske support for at rapportere usædvanlig farvning. Referencer 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003 2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999 3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004 4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; 1882 5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486 6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188. 7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472. 8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459 9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466. 10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33:669. 11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96. 12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259. 13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 (111797-003) 305756DK_001 p. 13/14

15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001. 17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 19. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 20. Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 21. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16 22. Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement 1. 23. Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6):578 24. Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 25. Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424:135 26. Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 (111797-003) 305756DK_001 p. 14/14