Dako LSAB2 System-HRP Kode K0672 15 ml Kode K0673 15 ml Kode K0675 110 ml Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug. Denne vejledning gælder for Universal Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP). Systemet er beregnet til anvendelse sammen med primære antistoffer fra kanin og mus, som brugeren leverer, til kvalitativ identifikation af antigener ved hjælp af lysmikroskopi og immunhistokemi i paraffinindstøbt væv, kryostatvæv eller cellepræparater som hjælp til diagnosticering af patologiske sygdomme. Væv, som er behandlet i fiksativer såsom ethanol, B-5, Bouins, zinkformalin og neutral bufferet formalin, kan anvendes. Se Dakos Generel vejledning i immunhistokemisk farvning eller detektionssystemets vejledning for IHC-procedurer vedrørende: 1) Princip for proceduren, 2) Nødvendige materialer, der ikke medfølger, 3) Opbevaring, 4) Klargøring af præparater, 5) Farvningsprocedure, 6) Kvalitetskontrol, 7) Fejlfinding, 8) Fortolkning af farvning, 9) Generelle begrænsninger. Resumé og forklaring LSAB2 System, HRP er baseret på en modificeret, mærket avidin-biotin (LAB)-teknik, hvori et biotinyleret sekundært antistof danner et kompleks med peroxidasekonjugerede streptavidinmolekyler. 1 LAB/LSAB-metoden er, sammenlignet med ABC-metoden, blevet rapporteret som værende fire til otte gange mere sensitiv. 2 Giorno, et al 2 tilskriver den øgede sensitivitet til den mindre størrelse af det enzymmærkede (strept)avidin-kompleks fra LAB/LSAB-metoden sammenlignet med avidin-biotin enzymkomplekset fra ABC-metoden. Den kliniske fortolkning af en eventuel positiv farvning eller mangel på samme skal sammenholdes med morfologiske og histologiske undersøgelser med korrekte kontroller. Evalueringerne skal foretages af en kvalificeret person i relation til patientens kliniske forhistorie og andre diagnostiske analyser. Principper for proceduren LSAB2 System, HRP er en sensitiv og alsidig IHC-procedure, der tillader samtidig behandling af adskillige præparater med primære antistoffer fra kanin eller mus på mindre end en time. Endogen peroxidaseaktivitet standses ved at inkubere præparatet i 5 minutter med 3% hydrogenperoxid. Derefter inkuberes præparaterne med et korrekt karakteriseret og fortyndet primært kanin- eller museantistof efterfulgt af sekventielle 10-minutters inkubationer med et biotinyleret link-antistof (der indeholder anti-mus og anti-kanin immunglobuliner) og peroxidasemærket streptavidin. Farvningen fuldendes efter en inkubation med substratkromogenet (AEC eller DAB). For AEC i K0672 er det en inkubation på 10 minutter med 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) substratkromogenet, hvilket medfører et rødt præcipitat på antigenstedet. For DAB i K0673 er det en inkubation på 5 10 minutter med 3-3'-diaminobenzidin (DAB) substratkromogenet, hvilket medfører et brunt præcipitat på antigenstedet. Leverede reagenser Kode K0672 Sættet indeholder følgende materialer, der rækker til 150 vævssnit ved 100 µl pr. snit: Mængde Beskrivelse Peroxidaseblokker 3% hydrogenperoxid i vand. Link-antistof Biotinmærkede affinitetsisoleret ged-antikanin og ged-antimus immunglobuliner i fosfatbufferet saltvand (PBS), der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugeret til peberrodsperoxidase i PBS, der indeholder stabiliserende protein og antimikrobielle stoffer. AEC-substratkromogen AEC i N,N-dimethylformamid (DMF) og acetatbuffer, ph 5,0, der indeholder hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. Opbevares ved 2 8 C. (107424-003) 302289DK_001 s. 1/8
Kode K0673 Sættet indeholder følgende materialer, der rækker til 150 vævssnit ved 100 µl pr. snit: Mængde Beskrivelse Peroxidaseblokker 3% hydrogenperoxid i vand. Biotinyleret link Biotinmærkede affinitetsisoleret ged-antikanin og ged-antimus immunglobuliner i fosfatbufferet saltvand (PBS), der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugeret til peberrodsperoxidase i PBS, der indeholder stabiliserende protein og antimikrobielle stoffer. Substrat 1x18 ml Imidazol-HCl buffer, ph 7,5, indeholdende hydrogenperoxid og et antimikrobielt stof. DAB-kromogen 1x1 ml 3,3'-diaminobenzidin i kromogenopløsning. Tilbehør 1 Reagensglas med skala 1 Pasteur-pipette af plast Kode K0675(11) Sættet indeholder følgende materialer, der rækker til 1100 vævssnit ved 100 µl pr. snit: Mængde 1x110 ml Beskrivelse Biotinyleret link Biotinmærkede affinitetsisoleret ged-antikanin og ged-antimus immunglobuliner i fosfatbufferet saltvand (PBS), der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1x110 ml Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugeret til peberrodsperoxidase i PBS, der indeholder stabiliserende protein og antimikrobielle stoffer. Kode K0675(89) Sættet inkluderer følgende materialer, der er pakket til brug med Dako Autostainer (kode S3400): Mængde 10x11 ml Beskrivelse Biotinyleret link Biotinmærkede affinitetsisoleret ged-antikanin og ged-antimus immunglobuliner i fosfatbufferet saltvand (PBS), der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 10x11 ml Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugeret til peberrodsperoxidase i PBS, der indeholder stabiliserende protein og antimikrobielle stoffer. (107424-003) 302289DK_001 s. 2/8
Nødvendige materialer, der ikke medfølger Absorberende servietter Antistoffer: Brugsklar N-serie eller koncentrerede antistoffer opløst i Antibody Diluent (kode S0809 eller S3022) Antibody Diluent (kode S0809 eller S3022) Positive og negative kontrolvæv Kontrastfarve; vandbaseret, som f. eks. Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3309) Dækglas Destilleret vand Tørreovn, der kan holde en temperatur på 60 C elle r mindre. Ethanol, absolut og 95% Lysmikroskop (20x 800x) Monteringsmedium såsom Faramount (kode S3025) eller Glycergel (kode C0563) Negative kontrolreagenser Objektglas, poly-l-lysinbelagte eller Silanized Slides (kode S3003) Farvningsglas eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2-10 minutter) Vaskeflasker Vaskebufferopløsning Xylen, toluen eller xylenerstatninger Følgende reagenser er påkrævede til K0675 LSAB2-systemet (110 ml) udover ovenstående: Hydrogenperoxid, 3% opløsning eller Peroxidase Block (kode S2001) Substratkromogenopløsning som f. eks. AEC Substrate-Chromogen (kode K3464, 110 ml, brugsklar) eller Liquid DAB (kode K3466) Valgfrie materialer, der ikke medfølger Buffere: Wash buffer (kode S3006) til automatisk og manuel brug Phosphate buffered saline (kode S3024) Tris-buffered saline (kode S3001 eller S1968) Proteolytiske enzymer: Pepsin (kode S3002) Proteinase K (kode S3004 eller S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (kode S3007) Andre: Positive kontrolobjektglas (kan rekvireres fra Dako) Target Retrieval solution (kode S1699 eller S1700) Target Retrieval Solution, High ph (kode S3307 eller S3308) Target Retrieval Solution, ph 9 (kode S2367 eller S2368) Fugtkammer Ammoniumhydroxid 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l Forholdsregler Produktspecifik 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemikalie, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skal der skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb. 3,4 3. AEC- og DAB-substratkromogener er følsomme over for kontaminering fra flere forskellige oxiderende stoffer, såsom metaller, bakterier, støv og almindelige laboratorieglasting. Undgå kontaminering og for lav holdbarhed ved at undlade at udsætte AECeller DAB-opløsningerne for potentielle kontamineringskilder, og pipettér aldrig direkte fra flasken. Hæld den påkrævede mængde ud i en ren beholder og pipetter herfra. Hæld aldrig overskydende AEC- eller DAB-opløsning tilbage i den oprindelige opbevaringsbeholder. 4. De medfølgende reagenser er fortyndet optimalt. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvning. Sådanne evt. ændringer skal godkendes af brugeren. Forskelle i vævsbehandlingen og de tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. 5. Udskift ikke med reagenser fra sæt med andre partinumre eller fra andre producenter. 6. Andre inkubationstider eller -temperaturer end de angivne kan give fejlbehæftede resultater. Enhver ændring skal valideres af brugeren. 7. Enzymer og kromogener kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke sættets komponenter, og udfør ikke farvning i stærkt lys, f.eks. direkte sollys. Generelt 1. Som med alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 2. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser, ellers kan der forekomme fejlagtige resultater. 3. Undgå plasken med reagenser og dannelse af aerosoler. 4. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugere skal have omhyggelige anvisninger om den korrekte procedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger. 5. Anvend hensigtsmæssigt personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. Ubrugte reagenser skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. 6. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. (107424-003) 302289DK_001 s. 3/8
Risiko- og sikkerhedssætninger K0672 - AEC Substrate-Chromogen System Ready-to-Use: 1-<10% N,N-dimethylformamid / faresymbol: Giftigt R61 S35 S45 S53 Kan give fosterskader. Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig (vis etiketten, hvis det er muligt). Undgå enhver kontakt indhent særlige anvisninger før brug. Udelukkende til professionel brug. K0673 - DAB Chromogen: 1-5% bifenyl-3,3,4,4 -tetrayltetraammonium tetraklorid / faresymbol: Sundhedsskadelig R40 Mulighed for kræftfremkaldende effekt. R43 Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. R68 Mulighed for varig skade på helbred. S35 Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. S36/37 Brug særligt arbejdstøj og egnede beskyttelseshandsker. Opbevaring Reagenser til LSAB2 System, HRP skal opbevares ved 2 8 C. Må ikke fryses. Må ikke anvendes efter udlø bsdatoen på flasken og sættets etiket. Hvis reagenser opbevares under andre forhold end dem, der er specificeret, skal de godkendes af brugeren. 5 AEC- og DAB-substratkromogenopløsningerne er ustabile ved temperaturer over 8 C. Anvend og opbevar AE C- og DABsubstratkromogenopløsningerne ved den anbefalede temperatur på 2 8 C. Opløsningerne skal anvendes umi ddelbart efter, at de er taget ud af køleskabet. Efter brug skal de så hurtigt som muligt anbringes i en opbevaringstemperatur på 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der testes positive og negative kontroller samtidig med patientpræparaterne. Hvis der observeres en uventet farvning, som ikke kan forklares med forskelle i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om, at der er en defekt i sættet, skal Dakos tekniske serviceafdeling kontaktes. Klargøring af reagens Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen. Vaskebufferopløsning TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kode S3006), er den anbefalede vaskebuffer til den automatiske og manuelle IHCdetektion. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kode nr. S1968), og PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kode nr. S3024), er ligeledes egnede vaskebufferopløsninger til manuel farvning. Vaskebufferopløsninger, der indeholder natriumazid, frarådes. Natriumazid inaktiverer peberrodsperoxidase (HRP), hvilket medfører negativ farvning. Opbevar ubrugt buffer ved 2 8 C. Kassér bufferen, hvis den er uklar. Destilleret vand kan anvendes til skylning af peroxidaseblokkeren, substratkromogenopløsningen og kontrastfarvestoffet. Primært antistof Der fås en lang række brugsklare primære antistoffer fra N-serien samt negative kontrolreagenser til brug sammen med LSAB2-system. Koncentrerede antistoffer fås også fra Dako. Optimale fortyndinger skal imidlertid bestemmes eksperimentelt af brugeren. Fortyndinger skal klargøres med Antibody Diluent (kode S0809), der indeholder 0,05 mol/l Tris-HCl buffer, ph 7,2 7,6, med 1% bovint serumalbumin (BSA). BSA fungerer som en proteinblokker, og eliminerer behovet for en separat inkubation med proteinblokkerende reagens. Antibody Diluent with Background Reducing Components (kode S3022) er også egnet som fortynder. En fortynder uden transportprotein anbefales ikke. En inkubationstid på 10 minutter er tilstrækkelig for de fleste primære antistoffer, der anvendes sammen med LSAB2-systemet. Negativt kontrolreagens Et ideelt negativt kontrolreagens indeholder antistof, der ikke udviser en specifik reaktivitet over for humant væv (ikke-humant reaktiv) i den samme matrix/opløsning som det primære antistof. Det ikke-humant reaktive antistof skal være af samme underklasse og dyreart som det primære antistof, fortyndet til den samme immunglobulin- eller proteinkoncentration som det fortyndede primære antistof og med den samme fortynder. Afhængigt af, hvilken type primært antistof/antiserum der anvendes, kan normalt/ikke-immunt serum fra samme art som det primære antistof i en proteinkoncentration, der svarer til det fortyndede primære antistof i den samme fortynder, være egnet til brug. Inkubationsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof/antiserum. Når der anvendes brugsklare antistoffer fra Dakos N-serie, anbefales Universal Negative Control som negativ kontrolreagens. Disse kontroller er optimeret til anvendelse sammen med enten muse (kode N1698) eller kanin (kode N1699) brugsklare antistoffer fra N- serien. Substratkromogenopløsning K0672 LSAB2-systemet indeholder brugsklar AEC, der er klar til at blive påført vævs- eller cellepræparater. K0673 LSAB2-systemet indeholder DAB, der klargøres som følger: Tilsæt 1 dråbe (eller 20 µl) DAB-kromogen pr. ml substratbuffer. Afmål den nødvendige mængde substratbuffer med det medfølgende glas med skala. Bland grundigt, og påfør opløsningen med den medfølgende overførselspipette. Efter brug skylles reagensglasset med skala og pipetten grundigt med destilleret vand. Ubrugt DABarbejdsopløsning er stabilt i op til 2 uger, hvis det opbevares ved 2 8 C. Hvis der dannes udfældning, skal det blandes godt før brug. Det anbefales at bruge Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (kode K3464, 110 ml) eller Liquid DAB (kode K3466) sammen med LSAB2 System, HRP, 110 ml (kode K0675). Følg vejledningen, der følger med hvert substratkromogensystem for klargøring af substratkromogenet. (107424-003) 302289DK_001 s. 4/8
Kontrastfarve DAB-kromogen giver et slutprodukt, der er uopløseligt i alkohol, og kan anvendes sammen med alkoholbaseret hæmatoxylin. Når AECsubstratkromogen anvendes, er det farvede slutprodukt fra farvningsreaktionen opløseligt i alkohol og må kun anvendes sammen med vandbaseret kontrastfarve, som f. eks. Mayer s Hematoxylin. Kontrastfarvningen med hæmatoxylin efterfølges af en grundig skylning i destilleret vand, hvorefter objektglassene nedsænkes i et bad med 0,037 mol/l ammoniakvand. 0,037 mol/l ammoniakvand klargøres ved at blande 2,5 ml 15 mol/l (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter vand. Ubrugt 0,037 mol/l ammoniakvand kan opbevares ved stuetemperatur (20-25 C) i en flaske med tætsl uttende prop i maks. 12 måneder. Se producentens retningslinjer vedrørende alternative procedurer for kontrastfarvning. Monteringsmedie Monteringsmedier såsom Faramount Aqueous Mounting Medium, brugsklar (kode S3025) eller Glycergel Mounting Medium (kode C0563), anbefales til vandbaseret montering. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40 (±5) C inden brug. Klargøring af præparater Se Generel vejledning i immunkemisk farvning og/eller antistoffets specifikationsark. Inden IHC-farvningen skal væv fikseres og behandles. Fiksering forhindrer autolyse og forrådnelse af ekscideret væv, bevarer antigenicitet, forbedrer det refraktive indeks af vævsbestanddelene og øger de cellulære elementers resistens over for vævsbehandling. Vævsbehandling omfatter dehydrering, rensning af dehydrerede stoffer, infiltrering af indstøbningsmedier, indstøbning og udskæring af væv. De mest almindelige fiksativer til IHC-vævsklargøring er beskrevet i Generel vejledning i immunhistokemisk farvning. Ovenstående er kun ment som en vejledning. Optimale procedurer skal fastsættes og verificeres af brugeren. Farvningsprocedure Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning omhyggeligt og gøre sig fortrolig med systemets indhold inden brug. Reagenserne og vejledningen i dette system er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af systemets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige resultater. Alle systemets reagenser, undtagen AEC-substratkromogen, skal tilpasses stuetemperatur (20 25 C) inde n immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. AEC-substratkromogenet kan anvendes umiddelbart efter, at det er taget ud af køleskabet, og det behøver derfor ikke at have stuetemperatur inden brug. Skal opbevares ved 2 8 C efter brug. Opbevaring ved temperaturer over 8 C kan have en negativ virkning på AEC-substratkromogenet. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise øget, uspecifik farvning. Dæk objektglas, der er udsat for træk. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævet anbringes i et fugtigt miljø. Hvis farvningsprotokollen skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af link-antistoffet (trin 3) i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at farvnin gsfunktionen påvirkes. Sensitiviteten for LSAB2 System, HRP kan øges yderligere ved at forlænge inkubationstiderne i trin 2, 3 og 4 til 30 ±5 minutter for hvert trin. Farvningsprotokol TRIN 1 PEROXIDASE-BLOKKER Bank overskydende væske af. Brug en fnugfri klud (f.eks. Kimwipe eller gaze), og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Påfør en tilstrækkelig mængde peroxidaseblokker, så præparatet er dækket. Inkuber i 5 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret vand eller en bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at ramme vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer. TRIN 2 TRIN 3 TRIN 4 PRIMÆRT ANTISTOF ELLER NEGATIVT KONTROLREAGENS Bank overskydende væske af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Tilsæt primært antistof eller negativt kontrolreagens, så præparatet er dækket. Inkuber i 10 (±1) minutter, medmindre andet er specificeret. Skyl forsigtigt med bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at ramme vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer. BIOTINYLERET LINK Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som beskrevet tidligere. Påfør tilstrækkeligt med GULE dråber fra link-antistoffet, så præparatet er dækket. Inkuber i 10 (±1) minutter. Skyl objektglassene som i trin 2. Hvis farvningsprotokollen skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af link-antistoffet (trin 3) i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at farvningsfunktionen påvirkes. STREPTAVIDIN-HRP Tør objektglassene som beskrevet tidligere. Påfør tilstrækkeligt med RØDE dråber fra streptavidinreagenset, så præparatet er dækket. Inkuber i 10 (±1) minutter. Skyl objektglasset af som beskrevet tidligere. (107424-003) 302289DK_001 s. 5/8
TRIN 5 TRIN 6 TRIN 7 SUBSTRATKROMOGENOPLØSNING Tag AEC- eller DAB-substratkromogenopløsningen ud af opbevaringen ved 2 8 C. Se afsnittet Klargøring af reagens for klargøring af DAB. Tør objektglasset af som beskrevet tidligere. Tilsæt en tilstrækkelige mængde AEC- eller DAB-sustratkromogenopløsning, så præparatet er dækket. Sæt AEC- eller DABsubstratkromogenet tilbage i køleskabet. Inkuber i 10 (±1) minutter ved AEC eller 5 10 minutter ved DAB. Skyl forsigtigt med destilleret vand fra en vaskeflaske (undgå at ramme vævet direkte). Affald fra AEC- eller DABsubstratkromogen opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. HEMATOXYLIN KONTRASTFARVE (VALGFRI) Nedsænk objektglassene i et hæmatoxylinbad. Inkuber i to til fem (2 5) minutter afhængigt af styrken af den anvendte hæmatoxylin. Skyl forsigtigt i et bad med destilleret vand. Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 0,037 mol/l ammoniakvand (valgfrit). Skyl objektglassene i et bad med destilleret eller deioniseret vand i to til fem (2 5) minutter. MONTERING Prøverne kan monteres, og der kan sættes dækglas på med et vandbaseret monteringsmedie som Faramount (kode S3025) eller Glycergel (kode C0563). Bemærk: AEC-reaktionsproduktet kan opløses i organiske opløsningsmidler og er derfor ikke kompatibelt med toluen- eller xylenbaseret permanent monteringsmedium. Bemærk: DAB kan monteres med ethvert monteringsmedie. Bemærk: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene udsættes for kraftigt lys i en periode på mere end en uge. Dette kan minimeres ved at opbevare objektglassene mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). Kvalitetskontrol Forskelle i vævsbehandlingen og de tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Se kvalitetskontrolvejledningen i College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry og brug 6 til 8 som reference for yderligere oplysninger. Se indlægssedlen til hvert primært antistof, der anvendes vedrørende detaljer om sensitivitet og immunreaktivitet. Se Generel vejledning i immunhistokemisk farvning vedrørende yderligere oplysninger om positive og negative kontroller. Fortolkning af farvning Se Generel vejledning i immunhistokemisk farvning vedrørende retningslinjer for fortolkning. Generelle begrænsninger Se Generel vejledning i immunhistokemisk farvning vedrørende generelle begrænsninger. Produktspecifikke begrænsninger Dako leverer LSAB2-systemets reagenser i en optimal fortynding til brug ifølge vejledningen for IHC på paraffinindstøbte vævssnit, kryostater og blodudstrygninger. Enhver afvigelse fra de anbefalede analyseprocedurer kan gøre erklærede, forventede resultater ugyldige. Egnede kontroller skal anvendes og dokumenteres. Brugere, der afviger fra de anbefalede analyseprocedurer, vil under disse betingelser være ansvarlige for fortolkningen af patientresultater. Der er fundet endogen avidinbindende aktivitet (EABA) i frosne snit af lever (hele leverknuden) og nyre (tubulusepitel), såvel som i frossent og formalinfikseret lymfevæv (parakortikale histiocytter). 9-12 EABA kan undertrykkes af sekventielle 20-minutters inkubationer, først med 0,1% avidin og derefter med 0,01% biotin i 0,05 M Tris-HCl buffer, ph 7,2 7,6, inden farvning, eller brug Biotin Blocking System (kode X0590). Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidaseaktivitet kan ses i hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin, cytokrom og katalase samt i eosinofiler. 13.14 Denne aktivitet kan hæmmes i formalinfikseret væv ved inkubation af præparater med 3% hydrogenperoxid i fem minutter inden tilsættelse af det primære antistof. Blod- og knoglemarvsudstrygninger samt frosne vævssnit, kan behandles med Peroxidase Blocking Reagent (kode S2001). Proceduren fjerner imidlertid ikke det rødbrune pigment i hæmoproteiner. Alternativt kan en opløsning af methanolhydrogenperoxid anvendes. Visse antigener kan blive denatureret med denne procedure. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i væv, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner i testede vævsgrupper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. 8 Kontakt Dakos teknisk support med dokumenterede uventede reaktioner. Vævsprøver fra personer, som er inficeret med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), kan udvise uspecifik farvning med peberrodperoxidase. 15 (107424-003) 302289DK_001 s. 6/8
Fejlfinding Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen farvning af objektglas. 1a. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1a. Gennemgå påføring af reagenser. 1b. Natriumazid i bufferbadet. 1b. Brug frisk buffer uden azid. 1c. Substratkromogenreagenset er blandet forkert. 1c. Lav en frisk substratkromogenopløsning iflg. 2. Svag farvning af alle objektglas. 3. For høj baggrundsfarvning af alle objektglas, inklusiv negative kontrolobjektglas. 4. Vævssnittene løsner sig fra objektglassene. 5. For kraftig specifik farvning. 2a. Der er for meget opløsning tilbage i snittene efter vaskebadet. 2b. Objektglassene har ikke inkuberet længe nok med reagenserne. 2c. Ikke-kompatibel kontrastfarve eller monteringsmedie, der opløser reaktionsproduktet. 3a. Prøverne indeholder en høj endogen peroxidaseaktivitet. sættets protokol. 2a. Bank forsigtigt overskydende opløsning af, inden der tørres rundt omkring snittet. 2b. Gennemgå de anbefalede inkubationstider. 2c. Brug kun vandbaseret kontrastfarve og monteringsmedie til AEC immunfarvede objektglas. 3a. Inkuber objektglassene med friskt hydrogenperoxid. 3b. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3b. Anvend friske xylen- eller toluenbade. 3c. Objektglassene er ikke skyllet 3c. Anvend friske opløsninger i ordentligt. bufferbade og vaskebade. 3d. Hurtigere substratreaktion 3d. Anvend kortere inkubationstider end normalt på grund af for med høj stuetemperatur. substratkromogenopløsning. 3e. Snittene er tørret ud under farvningen. 3f. Uspecifik reagensbinding til vævssnittet. 3g. Det primære antistof er for koncentreret. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 5a. Det primære antistof er for koncentreret. 5b. Inkubationen af det primære antistof, biotinylerede link eller streptavidin-hrp er for lang. 3e. Anvend fugtkammer. Tør kun tre til fire objektglas af ad gangen, inden der tilsættes reagens. 3f. Brug Dakos antistoffortynder, eller tilsæt 1% BSA til antistoffortynderen. Alternativt kan der anvendes 0,05 mol/l Tris indeholdende 0,3 mol/l NaCl og 0,1% Tween 20, ph 7,2-7,6 (kode S3306) som vaskebuffer. Det kan også være nødvendigt at inkubere et separat proteinblokerende reagens (kode X0909) inden påføring af det primære antistof. 3g. Anvend en større fortynding af det primære antistof. 4a. Brug poly-l-lysin belagte objektglas til den kraftigste farvning. Brug Silanized Slides til primære antistoffer, der kræver target retrieval teknikker. 5a. Udfør serielle fortyndinger af primært antistof for at fastlægge den optimale fortynding. 5b. Fastlæg den korrekte farvningsprotokol for antistoffet, dvs. længden af inkubationen af det primære antistof, biotinylerede link og steptavidin-hrp Bemærk: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. Yderligere oplysninger om farvningsteknikker og klargøring af præparater kan ses i Immunochemical Staining Methods 10 (kan fås hos Dako), Atlas of Immunohistology 16 og Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 17 (107424-003) 302289DK_001 s. 7/8
Referencer 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8):1131-9 2. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3):161-6 3. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, 1976 4. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 5. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, 1992 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6):836-43 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4):194-9 9. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81 10. Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako 2006 11. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10):1196-204 12. Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2):223-5 13. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20 14. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; 46 15. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5):626-32 16. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press 1986 17. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986 Udgave 05/07 (107424-003) 302289DK_001 s. 8/8