Validering af hæmolysegrænsen for B12 vitamin, folat og LD på Architect

Validering af hæmolysegrænsen for B12 vitamin, folat og LD på Architect Connie Dam Lund Vilhelmsen Studienummer: 142599 Periode: 07/10-18/12 2013 K-vejleder: Bioanalytikerunderviser Anne Jaritz-Nielsen I-Vejleder: Lektor Turi Neubauer Antal tegn inkl. Mellemrum: 50.266

Indholdsfortegnelse Forord... 3 Resumé... 4 Introduktion... 6 Baggrund... 6 Problemformulering... 8 Målformulering... 8 Teori... 9 Analyseparameter og klinisk relevans... 9 Analyseprincipper... 12 Materialer og metode... 16 Design... 16 Litteratursøgning... 16 Materialer... 17 Etik... 18 Dataindsamling... 18 Pilotforsøg... 18 Udførsel af forsøget... 19 Databearbejdning... 21 Resultater... 22 Analyse af hæmolysen... 22 Resultater for B12 vitamin, folat og LD... 22 Antal prøver med svar Hæmolyse... 25 Diskussion... 26 Design... 26 Hæmolyseanalysen... 26 B12 vitamin... 27 Folat... 28 LD... 30 Antal prøver med svar Hæmolyse... 31 Konklusion... 31 Perspektivering... 32 Referenceliste... 33 Bilag... 36 Bilag 1... 36 Bilag 2... 36 Side 1 af 40

Bilag 3... 37 Bilag 4... 39 Side 2 af 40

Forord Forsøgene til denne opgave er udarbejdet ved Klinisk Biokemisk Afdeling, Hospitalsenheden Vest i Holstebro. Jeg vil gerne sige tak, fordi jeg har fået denne mulighed, for at udarbejde forsøget hos jer og benytte mig af jeres faciliteter, apparatur og materialer. Jeg vil også gerne takke mine tre samarbejdspartnere Sarah Kjeldsen Feldbak, Sine Møller Pedersen og Maria Dam Jensen, for et godt samarbejde i udarbejdelsen af pilotforsøget og udførslen af selve forsøget. Derudover vil jeg gerne takke personalet på Klinisk Biokemisk Afdeling i Holstebro for deres imødekommenhed og hjælpsomhed. Især personalet der har deres arbejdsgang ved Architect, har været med til at give os plads i en ellers travl hverdag. Jeg vil også gerne takke afdelings bioanalytikere Anders Poulsen og Lone Broe Nees, overlæge Kaj Ove Pedersen, kemikere Linda Østervig Henriksen og Mette Fogh Møller, for at hjælpe med at finde materialer samt diskussion af projekt. Såfremt en kopi af ikke vedlagte bilag ønskes, kan der rettes henvendelse til forfatteren Underskrift: Side 3 af 40

Resumé Baggrund Analyseparametrene B12 vitamin, folat og lactatdehydrogenase (LD) er problematiske i forhold til hæmolyse, da hæmolyse kan medføre falske forhøjede værdier, grundet erytrocytternes indhold af B12 vitamin, folat og LD. Erytrocytterne indeholder cirka 150 gange mere LD end plasma, og hæmolyse har derfor påvirkning på LD analysen. Der er oplyst en nultolerance for hæmolyse for overstående tre parametre fra firmaet Abbott, hvilket har resulteret i, at der månedligt er blevet afvist 200-300 prøver på KBA i Holstebro. Der blev herefter fastlagt en ny visuel hæmolysegrænse på 0,2 g/l, frem for den gamle nultolerance på 0,04 g/l. Det vides endnu ikke om den visuelt fastlagte hæmolysegrænse har haft en negativ klinisk betydning for analyseresultaterne. En vurdering af hæmolysens betydning for B12 vitamin, folat og LD er vigtig, for at kunne vurdere om hæmolysegrænsen på 0,2 g/l, som afdelingen har analyseret med, kan sættes højere, samt om den har haft en negativ klinisk relevans. En afprøvning er nødvendig, for at kunne stå inde for kvaliteten af analysesvarene. Metode For at kunne vurdere om hæmolysegrænsen har haft en negativ klinisk betydning for B12 vitamin, folat og LD, laves en hæmolyserække på ti punkter med stigende hæmolysekoncentration, ved tilsætning af hæmolysat til plasma i forskellige niveauer. Herefter måles koncentrationen på Architect fra Abbott på henholdsvis i- og c-modulet. Der laves derudover en tidobbelt bestemmelse på hæmolyseanalysen. Der laves en t-test for analyseparametrene og hæmolyseanalysen for at vurdere om middelværdien afviger signifikant fra prøvens sande værdi. Ydermere udregnes den relative ændring i form af differencen i procent, i forhold til målingen der anses som hæmolyse fri, som ikke er tilsat hæmolysat for alle analyseparametre. Derudover inddrages analyseusikkerheden i form af et 90%-konfidensinterval. Den tilladte totalfejl indføres i differenceplottet og findes på Westgard QC. Den tilladte totalfejl skal afgøre, om hæmolysen har en negativ klinisk betydning for analyseparametrene. Resultater Resultaterne viser, at der ikke forekommer nogen signifikant forskel for hæmolyseanalysen. Derimod ses en signifikant forskel for B12 vitamin ved normalt niveau, folat ved lavt niveau og LD ved normalt niveau. For B12 vitamin viser der sig ved begge niveauer et fald i koncentrationen som funktion af hæmolysen, hvor der for folat ved Side 4 af 40

lavt niveau viser sig en stor variation i resultaterne, mens LD ved normalt niveau viser sig en lineær stigning i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Den bedste rette linje der er indtegnet for LD, viser en skæring med den tilladte totalfejl ved 0,23 g/l, hvor der indtræder negativ klinisk relevans. Der ses et fald i marts ved afviste prøver med svaret hæmolyse, hvor hæmolysegrænsen blev ændret første gang. Anden gang hæmolysegrænsen blev ændret var i juni, hvor der ses et yderligere fald hos de afviste prøver. Konklusion Resultaterne viser at for lavt og normalt niveau hos B12 vitamin vil en hæmolysegrænse uden en negativ klinisk betydning være 0,58 g/l og måske endda højere. For folat ved lavt niveau, ligger hæmolysegrænsen mellem 0,13 g/l og 0,24 g/l, hos folat ved normalt niveau kan den sættes højere, da der ikke ses nogen form for negativ klinisk påvirkning af analyseresultatet, grundet folat ved lavt niveaus store variation trækker det hæmolysegrænsen ned. For LD ved normalt niveau vil en hæmolysegrænse kunne fastsættes på 0,23 g/l, uden der er negativ klinisk relevans. Hæmolysegrænsen på 0,2 g/l kan have haft betydning for folat, da resultaterne ikke viser et entydigt svar, men ikke for B12 vitamin og LD. Side 5 af 40

Introduktion Baggrund På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) under Hospitalsenheden Vest (HeV) analyseres B12 vitamin (cobalamin), folat og lactatdehydrogenase (LD) på analyseudstyret Architect fra Abbott. De tre analyseparametre er problematiske i forhold til hæmolyse, fordi hæmolyse kan medføre falske forhøjede værdier, grundet erytrocytternes indhold af B12 vitamin, folat og LD (2). Erytrocytterne indeholder cirka 150 gange mere LD end plasma, og hæmolyse har derfor påvirkning på LD analysen (3). B12 vitamin er blandt andet vigtig i forbindelse med cellernes DNA-syntese. Mangel på B12 vitamin ses ved perniciøs anæmi og absorptionsforstyrrelser i mavetarmregionen. Forhøjede værdier ses ved leverlidelse, visse myoloide sygdomme, blandt andre kronisk myoloid leukæmi og polycytæmi (2). Folat er også vigtig i forbindelse med cellernes DNA-syntese. Folat indtages via kosten, og lave værdier kan skyldes fejlernæring, absorptionsforstyrrelser samt øget forbrug af folat ved leukæmi og hæmolytisk anæmi. Der kan ses forhøjede værdier af folat ved mangel af B12 vitamin (2). LD er et enzym der findes i cellerne i meget af kroppens væv. Forhøjede værdier ses for eksempel ved celleskader i hjerte, nyre, lunge med videre samt ved blodpropper, leverbetændelse, anæmier og maligne sygdomme (4). B12 vitamin, folat og LD analyseres alle på Architect fra Abbott. B12 vitamin og folat analyseres ved en kemiluminiscensmikropartikelimmunanalyse (CMIA) på i-modulet, og LD analyseres ved fotometrisk måling på c-modulet (5). Analyse af disse analyseparametre løber årligt op i ca. 60.000 prøver (1). Firmaet Abbott har i deres brugsanvisninger for B12 vitamin, folat og LD oplyst, at disse parametre ikke må analyseres, når der er hæmolyse tilstede (4,6,7). Denne hæmolysegrænse har medvirket til, at der i gennemsnit for de tre parametre månedligt er blevet afvist 200-300 prøver på KBA i Holstebro (1). Afviste prøver kan medføre ny prøvetagning og give en forsinkelse i behandlingen. Prøver der bliver afvist, er især modtaget fra de praktiserende læger eller taget på sygehuse. Her kan prøvetagningerne have været problematiske eller der kan have forekommet præanalytiske fejl. Afdelingen har behandlet problemet med de afviste prøver, ved at fastsætte en ny hæmolysegrænse. Denne hæmolysegrænse blev fastsat ved, at en række patientprøver fik Side 6 af 40

målt hæmolysegrænsen, hvorefter de blev sat op i rækkefølge efter hæmolysegraden. Herefter blev der udvalgt personale til at vurdere hvornår hæmolysegraden var synlig. Her blev den vurderet til 0,1 g/l. Denne hæmolysegrænse gav dog stadig mange afviste prøver der ikke kunne analyseres pga. hæmolyse, samt det gav stadig mange klager fra rekvirenterne. Derefter gentog de vurderingen og accepterede en grænse på 0,2 g/l. På dette grundlag blev hæmolysegrænsen hævet fra 0,04 g/l som anses som hæmolysefri til 0,2 g/l (8). Det faktum, at den nuværende hæmolysegrænse er blevet fastlagt uden efterfølgende afprøvning af eventuel betydning for analysesvarene, er kvalitetsmæssigt problematisk, da den kan have en negativ klinisk relevans for analysesvarene, og kan derved have konsekvenser for patienten. Det vides ikke på nuværende tidspunkt om den visuelt fastlagte hæmolysegrænse har haft en klinisk betydning for analyseresultaterne, samt om firmaets krav om hæmolysefri prøver er nødvendig. Endvidere vides der ikke om det er muligt at hæve den nuværende hæmolysegrænse på 0,2 g/l, uden at det får klinisk relevans for analyseresultaterne. Der vides ligeledes ikke om hæmolysens indvirkning er niveaubestemt og derved afhængig af koncentrationen af de respektive analyseparametre. En vurdering af hæmolysens betydning for B12 vitamin, folat og LD er vigtig, for at kunne vurdere om hæmolysegrænsen på 0,2 g/l, som afdelingen har analyseret med, kan sættes højere, og om den har haft en negativ klinisk relevans. En afprøvning er nødvendig, for at kunne stå inde for kvaliteten af analysesvarene. I artiklen Effect of in vitro hemolysis on 25 common biochemical test, har de undersøgt om hæmolyse har påvirket analyseresultaterne, også grundet mange afviste hæmolyseret prøver. Deres undersøgelse viser, at hæmolyse havde størst påvirkning på LD, sur phosphatase og kalium. Derudover viste deres undersøgelse, at prøver der blot er lidt hæmolyseret må forkastes i forbindelse med analysen af LD (9). På Odense Universitetshospital har de ligeledes haft problemer med afviste prøver på grund af hæmolyse og der blev i perioden maj 2000-2005 afvist 1088 prøvesvar for kalium. De så at LD og kalium blev påvirket til falsk forhøjet, mens basisk fosfatase blev påvirket til falsk for lavt. Deres problem bestod også i, hvordan de hæmolyserede prøver skulle håndteres. Skulle de afvise dem, give svarafgivelsen, at analysen ikke kunne udføres pga. hæmolyse, eller skulle de afgive et korrigeret svar. Ingen svarafgivelse vil resultere i forsinkelse af behandling eller risikere, at man ikke opdager hvis hæmolysen sker i Side 7 af 40

kroppen (in vivo). Et korrigeret svar kan misforstås, hvis informationsudvekslingen mellem KBA og klinikere ikke er god nok (10). Formål Formålet med dette projekt er, at undersøge hvornår hæmolysegrænsen kan have en negativ klinisk relevans for B12 vitamin, folat og LD. Herudover er formålet, at se om den nuværende hæmolysegrænse på 0,2 g/l har haft en negativ klinisk relevans for analysesvarene og om hæmolysegrænsen kan sættes højere for analyseparametrene. Problemformulering Under hvilke forudsætninger kan hæmolysegrænsen sættes op for B12 vitamin, folat og LD, før det har en negativ klinisk relevans for analysesvarene, og hvilke konsekvenser har hæmolysegrænsen på 0,2 g/l haft? Målformulering Vi vil undersøge og sammenligne, hvor stor en andel af prøverne for B12 vitamin, folat og LD der blev kasseret ved hhv. nultolerance og 0,2 g/l ved at kigge på afdelingens statistik for året 2012, for at kunne vurdere hvilken indvirkning ændringen af hæmolysegrænsen har haft. Vi vil finde ud af, hvilke koncentrationsniveauer for analyserne B12 vitamin, folat og LD der er værd at undersøge. Vi vil undersøge, om hæmolyse har indvirkning på B12 vitamin, folat og LD, ved at analysere en stigende grad af hæmolyse fordelt på ti punkter i forskellige niveauer, som analyseres på Architect henholdsvis på i- eller c-modulet. Vi vil undersøge, om der er en signifikant forskel på analysesvarene for hæmolyseanalysen, ved at måle på tre forskellige hæmolysegrader gentagne gange og derefter foretage en t-test. Vi vil finde ud af, om der er en signifikant forskel på målingerne ved at foretage en t-test for analyserne B12 vitamin, folat og LD og finde ud af om der forekommer en negativ klinisk betydning, ved at opstille et differensplot med den relative ændring samt indtegne Westgards grænseværdier for tilladte totalfejl samt 90%- konfidensinterval. Side 8 af 40

Vi vil vurdere, om grænsen på 0,2 g/l har haft en negativ klinisk betydning, ved at vurdere differensplottet med den relative ændring for B12 vitamin, folat og LD, samt sammenholde mod indtegnet Westgards grænseværdier for tilladte totalfejl og 90%-konfidensinterval. Teori Analyseparameter og klinisk relevans Hæmolyse Hæmolyse er en faktorer som kan spille ind som en fejlkilde, ved mange biokemiske analyser. Hæmolyse forekommer når erytrocytterne ødelægges så der frigives hæmoglobin til plasma som afgiver den røde farve til plasmaet. Dette kan skyldes sygdomme, så beskadigelsen sker inde i patienten (in vivo), eller ved prøvetagningen som en præanalytisk fejlkilde (in vitro). Sygdomme der kan give anledning til hæmolyse in vivo er f.eks. hæmolytisk uræmisk syndrom eller fysisk beskadigelse ved f.eks. mekaniske hjerteklapper. Præanalytiske fejlkilder kan være forkert kanylestørrelse, langvarig stase, hård centrifugering og for lidt prøvemateriale i prøveglasset (10). Det kan også skyldes en svær prøvetagning, som f.eks. vanskeligheder ved lokalisering af vener eller skrøbelige vener med mere (11). Påvirkning af analyseresultaterne grundet hæmolyse kan skyldes frigivelse af celleindhold til plasma, direkte interferens med målingen eller ved, at der sker en kemisk reaktion i måleproceduren (10). Ved hæmolyse har komponenter som der kun er en lille mængde af inde i erytrocytterne en lille effekt på analysesvaret, mens der observeres en større effekt på analysesvaret ved komponenter der er en større mængde af i erytrocytterne (9). F.eks. ved LD som er 150 gange større i erytrocytten end i plasma (3). Folat bør heller ikke analyseres ved hæmolyse da erytrocytterne indeholder ca. 30 gange mere folat end plasma. Ud af alle fejlmeldinger skyldes 70% præanalytiske problemer og 98% af dem skyldes in vitro hæmolyse (11). Side 9 af 40

Figur 1 viser laboratorieværdier der rammes af hæmolyse eller cellelysering i prøven (11). B12 vitamin (cobalamin) Cobalamin syntetiseres af tarmbakterier hos dyr, derfor kan cobalamin tilføres gennem kosten via animalske produkter som kød, fisk, mælk og æg. Derfor ses cobalaminmangel ofte hos veganere og vegetarer, da de ikke får tilført vitaminet gennem kosten, da det ikke findes i grøntsager og frugt. Cobalamin er bundet til proteiner i kosten og frigives ved nedbrydning af proteinet i ventriklen og derefter kan cobalamin bindes til haptocorrin. Herefter spaltes cobalamin fra haptocorrin i duodenum og bindes til intrinsic factor, som er et glykoprotein som dannes i ventriklen som danner et specifikt kompleks sammen med cobalamin. Komplekset binder sig til en receptor på tarmcellernes overflade i ileum og optages i cellerne. Intrinsic faktoren nedbrydes så cobalamin frigøres. Cobalamin bindes herefter til transcobalamin, denne form omsættes hurtigt (2). Cobalamin er vigtig i forbindelse med syntesen af DNA, mere specifikt er cobalamin vigtigt i forhold til produktionen af kernemateriale til dattercellerne ved celledeling. Hvis man har cobalaminmangel vil det derfor gå ud over celledelingen. Det kan resultere i perniciøs anæmi, som ses ved færre men store erytrocytter. Den hyppigste årsag til cobalaminmangel er ikke mangelfuld tilførsel af vitaminet, men mangelfuld absorption i ileum og perniciøs anæmi. Det er i forbindelse med betændelse i Side 10 af 40

ventrikelslimhinden, at dannelsen af intrinsic factor nedsættes. Dette kan nemt behandles med injektion med cobalamin (12). Forhøjede cobalaminværdier ses ved kronisk myeloid leukæmi, hvor der ses en forhøjet koncentration af haptocorrin. Forhøjede værdier ses også ved leversygdomme som akut hepatitis, levercirrose, hepatom og levermetasraser. Årsagen kan være frigørelse af cobalamin fra det beskadiget leverceller (2). B12 vitamin kan holde sig syv dage i køleskab og to dage ved stuetemperatur. Referenceinterval: 0-200 år: 200-600 pmol/l (13) Folat Folater er en gruppe af stoffer der består af pteridin og paraaminobenzosyre koblet til en eller flere glutaminsyreenheder. Folat dannes af planter, og findes derfor i grøntsager, frugt, brød, lever, nyre og mælkeprodukter. Folat findes ca. 90% som polymere, der før absorptionen spaltes til monomere. Under spaltningen methyleres og reduceres folat til 5- methyl-tetrahydrofolat (5-methyl-THF) som cirkuler rundt i plasma. Når 5-methyl-THF skal absorberes, sker det i vævscellerne ved hjælp af folattransporter, som er afhængig af cobalamin. Således hænger cobalaminmangel sammen med en høj folat i plasma, da 5- methyl-thf ikke kan afgive sin methylgruppe, hvis der ikke er cobalamin tilstede. I cellerne afgiver 5-methyl-THF sin methylgruppe ved hjælp af cobalamin, som her fungerer som et coenzym. Herefter vil THF fungerer ved syntese af DNA og RNA. Folatmangel ses hos personer der spiser lidt grøntsager og frugt, eller andre årsager som alkoholisme og malabsorptionstilstande som gastrektomi, cøliaki, tyndtarmsresktion og Mb. Crohn. Det har ydermere vist sig, at folatmangel er blevet associeret med svangerskabskomplikationer, idet der er et øget forbrug af folat under graviditet, hvilket der også ses ved leukæmi, hæmolytisk anæmi, kroniske inflammationer, maligne tumorer og leversygdomme. Forhøjede værdier ses ved cobalaminmangel, da optagelsen af folat er nedsat (2). Folat kan holde sig syv dage i køleskab og to dage ved stuetemperatur. Referenceinterval: 0-1 år: 15-50 nmol/l 1-18 år: 6-35 nmol/l 18-200 år: > 9 nmol/l (14) Lactatdehydrogenase (LD) LD er en gruppe enzymer, som findes inde i cellerne i kropsvæv som hjertet, leveren, nyrer, skelet muskulatur, hjernen, erytrocytter og lungerne. LD er et vigtigt enzym i forbindelse med produktionen af celleenergi, idet LD sørger for omdannelsen af Side 11 af 40

muskellaktat til pyrovat. Erytrocytter indeholder 150 gange højere LD-aktivitet end plasma, hvorved hæmolyserede prøver ikke kan anvendes. LD kan se forskelligt ud idet det forekommer i fem forskellige isoenzymer, som er opbygget af fire peptidkæder bestående af to underenheder. Man kan ikke skelne mellem isoenzymerne, hvorved man ikke kan se hvilken vævstype det kommer fra. LD-analysen bruges til diagnosticering af hæmolytisk anæmi og tumormarkør. LD er en uspecifik markør og anvendes i samarbejde med andre markører (4). Forhøjet LD ses ved celleskader i hjerte, lever, blod og lunger samt ved perniciøs anæmi, hæmolytisk anæmi og myeloid leukæmi. Det ses også i forbindelse med akut myokardieinfarkt, pericaditis, lungeemboli, nyreinfarkt, hepatitis, leverstase, maligne lidelser og inflammation (15). For lavt LD har ikke klinisk betydning (16,19). LD kan holde sig syv dage ved stuetemperatur og fire dage i køleskab. Referenceinterval: 0-1 md: 125-765 U/L 1 md-4 år: 155-450 U/L 4-16 år: 100-345 U/L 16-18 år: 105-235 U/L 18-70 år: 105-205 U/L >70 år: 115-255 U/L (15) Analyseprincipper Hæmolyse Hæmolyse måles på Architect c-modulet i samme måling med ikterus og lipæmi kaldet HIL-indeks (hæmolyse, ikterus og lipæmi). Det er en måling af prøveinterferensindeks for de forskellige parametre. Det er en fotometrisk måling, som er en måling af en mængde lys som en prøve absorberer, når der bliver sendt en lysstråle igennem prøven. Man kan blande prøvematerialet med et reagens eller saltvand, alt efter hvad man ønsker at bruge som reference til bestemmelse af indekser. Hvis man vælger et reagens, skal man tage i betragtning, at det skal være farveløst og måles ved en anden bølgelængde end de andre parametre. Derefter måles der absorbans for alle tre parametre ved forskellig bølgelængde. Hæmolyse måles ved ca. 400 nano-meter. Efter aflæsning af de fotometriske målinger bruges der beregninger til at bestemme interferenskoncentrationen (17). Side 12 af 40

Figur 2 viser absorbtiosspekter for hæmolyse, ikteriske og lipæmiske prøver (17). Kemiluminiscensmikropartikelimmunanalyse (CMIA) Både B12 vitamin og folat er en CMIA-metode som analyseres på i-modulet på Architect. Det er en metode til at måle og kvantificere analysekomponentkoncentrationen. Til det bruges paramagnetiske mikropartikler coatet med et bindingsmolekyle, der er specifik for analysekomponenten, acridinmærket konjugat samt prætrigger- og trigger-opløsning som reaktanter. Først dispenseres de paramagnetiske mikropartikler i reaktionsbeholderen med prøvemateriale. Reaktionsblandingen skal inkubere, så de paramagnetiske mikropartikler binder sig til analysekomponenten og danner et immunkompleks. Efter inkubation tiltrækker en magnet de paramagnetiske mikropartikler til indersiden af reaktionsbeholderen, så der kan foretages en vask af reaktionsblandingen for at vaske ubundet materiale fra. Når man har en totrinsanalyse som B12 vitamin og folat, tilsættes der reagenser inden reaktionsblandingen tilsættes paramagnetiske mikropartikler. Herefter dispenseres kemiluminescent acridinmærket konjugat som enten bindes direkte til analytten eller til immunkomplekset. Bagefter vaskes der igen for ubundet materiale. Dernæst tilsættes prætriggeropløsningen, som består af hydrogenperoxid, hvorefter der foretages en baggrundsmåling med CMIA-systemets optik. Prætriggeropløsningens funktion er, at forhindre tidlig frigivelse af lysemission, og sørger for at mikropartiklerne ikke klumper sammen og adskiller acridin fra konjugatet. Til sidst dispenseres triggeroløsningen, som består af natriumhydroxid, hvilket gør at acridin oxideres når stoffet udsættes for peroxid og en alkalisk opløsning, som medfører kemiluminescensreaktionen. Der dannes N-methylacridon som frigiver energi når stoffet Side 13 af 40

vender tilbage til sin grundtilstand. CMIA-system-optikken måler kemiluminescenemissionen over et bestemt tidsrum ved en optisk måling, der måler de relative lysenheder (RLU). Det kan både være omvendt proportionelt eller direkte proportionelt (17). B12 vitamin Analysen af B12 vitamin udføres via CMIA-metoden som beskrevet ovenfor. Ved denne analyse er der et forbehandlingstrin inden de paramagnetiske mikropartikler tilføjes. Her bruges tre reagenser som indeholder henholdsvis, natriumhydroxid, alfa-monothioglycerin + EDTA og cobinamiddicyanid i boratbuffer med proteinstabilisatorer. Efter prøvematerialet er forbehandlet, tilsættes de paramagnetiske mikropartikler som er coatede med intrinsic factor. Der vaskes og tilsættes derefter acridinmærket B12-konjugat. Ved sidste trin tilsættes prætrigger- og triggeropløsning og den kemiluminescerende reaktion måles. Mængden af B12 vitamin og lysenheder er omvendt proportional, det vil sige, at jo mere lys der fremkommer desto mindre er koncentrationen af B12 vitamin (6). Figur 3 viser analyseprincippet for B12 vitamin (18). Side 14 af 40

Folat Folat analysen udføres via CMIA-metoden som beskrevet ovenfor. Der er et forbehandlingstrin for at frigøre folat fra folatbindingsproteinet. Det gøres med et reagens indeholdende dithiothereitol, hvorefter reagens to som indeholder kaliumhydroxid tilsættes. Efter prøvematerialet er forbehandlet tilsættes paramagnetiske mikropartikler som er coatet med folatbindingsprotein (FBP) og analysefortyndingsopløsning tilsættes. Efter vask tilsættes acridinmærket konjugat med pteroisk syre, som binder på de FBPcoatede mikropartikler. Til sidst tilsættes prætrigger- og triggeropløsning, så reaktionen kan måles. Mængden af folat og mængden af lysenheder er omvendt proportional (7). Figur 4 viser analyseprincippet for folat (18). Side 15 af 40

LD LD måles på Architect c-modulet via en fotometrisk måling. Fotometri er en måling af den mængde lys som en prøve absorberer (17). LD vil katalysere oxidering af laktat til pyrovat, med NAD + som hydrogenacceptor (se figur 5) og er en kinetisk analyse (4). Figur 5 viser oxidering af LD (3). Under fotometrisk måling er det en kinetisk analyse, hvor aflæsningen af absorbansændringen er konstant. Der foretages mange aflæsninger i det tidsrum reaktionen foregår og absorbansændringen bliver beregnet pr. minut, hvilket skal bruges til udregning af resultatet. Der bliver målt med 16 forskellige bølgelængder. Til at beregne resultatet brugers den lineære mindste kvadraters metode. Der skal være mindst tre fotometriske punkter og maksimum 33 punkter (17). Materialer og metode Design Litteratursøgning Jeg startede min søgning af litteratur med at finde basal viden omkring analyserne B12 vitamin, folat og LD. I brugsanvisningerne for Architect fra Abbott fandt jeg brugsanvisninger der indeholdt oplysninger om analysering af B12 vitamin, folat og LD, hvilket jeg vil anvende. Derudover fandt jeg betjeningsprincipper i brugermanualen til Architect-systemet. Derefter søgte jeg i laboratoriehåndbogen Klinisk Biokemisk Afdeling under analyseblade samt på e-dok for at finde procedurer og dokumenter som afdelingen selv benytter til analysering af B12 vitamin, folat og LD. Derudover har jeg også benyttet bøger fra uddannelsesforløbet, som jeg fandt relevante i forbindelse med analyseparametrene og teoretisk. Derefter søgte jeg på hæmolyse under fritekst på www.bibliotek.dk, hvilket gav ti Side 16 af 40

resultater. Heraf vurderede jeg materialet, ved at se på udgivelsesår samt udgiver for at vurderer om materialet var relevant i forbindelse med problemstillingen. Herefter foretog jeg en kaskade søgning, hvor jeg slog artikler op på pubmed i form af reviews eller hentet gennem VIA bibliotekerne, hvis artiklen ikke var frit tilgængelig. Artiklerne blev udvalgt efter vurdering af abstract indholdet, kvalitet af referencer og faglighed i form af kildekritik. Materialer Prøvemateriale: Patientplasma som allerede er analyseret på Architect for: - B12 vitamin koncentration: < 200 pmol/l og 200-600 pmol/l - Folat koncentration: < 9 nmol/l og > 9 nmol/l - LD koncentration: 105-205 U/L Erytrocytter fra medstuderende Apparatur: Architect fra Abbott bestående af to moduler: - c16000 (75c01, SN: C1600469 og 75c02, SN: C1600489) - i2000sr (75i03, SN: ISR08266) Centrifuger: Eppendorf 5804R centrifuge (SN: 580500666) Eppendorf 5810R centrifuge (SN: 581120162026) Reagenser: i2000sr-modulet: - B12 vitamin reagenskit, ref: 7K61, lot-nr.: 28921UI00 - Folat, reagenskit, ref: 1P74, lot-nr.: 27902UI00 - Trigger solution, lot nr: 31281LF00 - Pre-trigger solution, lot nr: 31392LF00 - Wash buffer, lot nr: 32109LF00 c16000-modulet: - LD reagenssæt, ref: 2P56-21, lot-nr.: 50263UN13 - Vand fra Elix vandanlæg, Milipore Side 17 af 40

Utensiler: Pipetter: - Biohit m100, 10-100 µl - Biohit proline, 200-1000 µl - Biohit m10, 0,5-10 µl Pipettespidser: - Spidser fra Sartorius: Biohit optifit tip lot-nr.: PR106200 - Spidser fra Sartorius: Biohit optifit tip lot-nr.: PR108838 - Spidser fra Sratorius: Biohit safetyspade filter tip lot-nr.: PR105541 Øvrige utensiler: - 5 ml Prøveglas uden tilsætning - Låg til prøveglas - Engangspipetter - Stativer til prøveglas - Magnetomrører + magnet - Fryser - Køleskab - Målebæger Etik Da der til forsøget er brugt prøvemateriale som i forvejen er analyseret for B12 vitamin, folat og LD, er der blevet vurderet, at det ikke er nødvendigt at overveje etiske problemstillinger, i forhold til brugen af prøvematerialet. Til pilotforsøget valgte en medstuderende sig frivilligt til, at der måtte benyttes hendes erytrocytter og plasma. Dataindsamling Pilotforsøg Der blev først udarbejdet et pilotforsøg, for at sikre at forsøget kunne lade sig gøre og at der kunne laves en kvalificeret hæmolyserække, samt for ikke at gøre unødigt brug af patientplasma til selve forsøget. Først skulle der fremstilles et hæmolysat, som ville være passende at spike plasma med til opnåelse af hæmolyse. Der blev taget blodprøver på en medstuderende, som blev foretaget efter KBA HeV forskrift (20) i lithium heparin glas, Side 18 af 40

hvoraf der blev brugt erytrocytter til hæmolysatet og plasma til fremstilling af hæmolysat. Erytrocytterne vaskes i saltvand og hæmolyseres ved at lægge dem i en min s fryser i et kvarter. Erytrocytterne tilsættes i forskellig mængde til 1,5 ml plasma for at lave et passene hæmolysat til at spike plasmaet med, hvorefter hæmolysegraden på fremstillet hæmolysat måles på Architect. Ved benyttelse af fortyndingsformlen: (21), udregnes det bedste hæmolysat til at spike med (se bilag 2, tabel 4). Ud fra dette vurderes der at fortyndingen med tilsat 100 µl erytrocytter er mest anvendelig. Dette udregnes ud fra fortyndingsformlen, hvor mange µl hæmolysat der teoretisk skal tilsættes 1,5 ml plasma, for at opnå den ønskede fortyndingsrække (se bilag 2, tabel 5). Det blev herefter afprøvet og efter vurdering af dette, er det lykkes af få en tilfredsstillende hæmolyserække (se bilag 2, tabel 6). Udførsel af forsøget Først indsamles patientplasma ved at søge på B12, Folat og LD på computeren, for analyser der allerede er blevet analyseret på Architect. Vi søgte på prøver fra dagen før, for at få alle prøver fra én dag af gangen. Herefter sorteres prøver med ønskede koncentration fra, som gemmes til forsøget. Ønskede koncentrationsniveauer blev bestemt i samarbejde med overlæge Kaj O. Pedersen (19). Her blev der bestemt, at der skulle måles på B12 vitamin og folat ved lavt og normalt niveau samt LD ved normalt niveau. Derefter blev alle prøverne, som blev sorteret fra, tjekket for hæmolyse i Architects computersystem. Hæmolysen skal være under eller lig med 0,04 g/l for at være hæmolysefri og kunne bruges til forsøget. Der blev samlet prøver ind i løbet af en uge for at have nok prøvemateriale. Prøvematerialet blev opbevaret efter forskriften og kunne ikke holde sige længere end en uge (13-15). Plasmaet fra patientprøverne blev afpippeteret med en engangspipette over i et prøveglas, og 1 ml plasma blev gemt til personalet i en prøvekop til efterbestillinger. Der blev sat stregkode på prøveglasset med prøvenummer og der blev skrevet dato for hvornår plasmaet blev afpippeteret fra prøven, for at sikre at plasmaet ikke var blevet for gammelt. Der laves fem pools med plasma, for henholdsvis: - En pool med lav B12 vitamin koncentration < 200 pmol/l. - En pool med normal B12 vitamin koncentration 200-600 pmol/l. Side 19 af 40

- En pool med lav folat koncentration < 9 nmol/l. - En pool med normal folat koncentration > 9 nmol/l. - En pool med normal LD koncentration 115-205 U/L. Alle pools blandes i hver deres målebæger på en magnetomrører. Efter omrøring fordeles hver pool ud på 11 glas med 1,5 ml plasma i. Der skal bruges 1,5 ml plasma til hver hæmolysegrad ved hvert niveau, for at sikre der er nok prøvemateriale til at analysere prøverne to gange samt hæmolyseanalysen. Architects krav er minimum 1 ml prøvemateriale (13-15), og Architect bruger 150 µl prøvemateriale til B12 vitamin og folat og 35 µl prøvemateriale til LD ved hver analyse (25-27). Hvert glas fik en stregkode der indeholdt oplysninger omkring analyseparameter, koncentrationsniveau og dato. Hæmolysatet blev fremstillet af erytrocytter fra en medstuderende som blev vasket i saltvand og blev hæmolyseret i en minus 80 C fryser i 15 minutter. Der blev anvendt de samme hæmolyserede erytrocytter som i pilotforsøget. Der blev tilsat 100 µl hæmolyserede erytrocytter i et glas med 1,5 ml plasma for hver pool, for at fremstille hæmolysatet, som blev brugt til at spike de resterende ni glas med for hver pool. Tabel 1 viser, hvor meget hæmolysat der blev tilsat, for opnåelse af den ønskede hæmolysegrad i 1,5 ml plasma. Ønsket 0,01 0,04 0,05 0,07 0,1 0,15 0,2 0,3 0,4 0,5 hæmolyse g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l Tilsat hæmolysat µl 0 4 5 6 9 13 18 27 36 44 Tabel 1 viser den tilsatte hæmolysat for opnåelse af ønsket hæmolyse. Efter tilsætning af hæmolysat blev prøven vendt, så det blev en homogen blanding, hvorefter prøverne blev centrifugeret i ti minutter ved 2200 G. Først blev der målt HIL-indeks på alle prøveren på c-modulet, hvor hæmolyse-svaret var relevant. Der blev ydermere foretaget en tidobbelt bestemmelse på HIL-analysen på tre forskellige hæmolysegrader, for sikring af hæmolyseanalysens pålidelighed. Dette blev gjort for at se om resultaterne kunne bruges, samt for at se om der forekom en variation for analysen som havde en signifikant betydning. Det var vigtigt at vide om analysen for hæmolysen var pålidelig, da koncentrationen man får på hæmolysen var afgørende for Side 20 af 40

videre behandling af resultaterne. Derefter blev koncentrationen for henholdsvis B12 vitamin, folat og LD målt i førnævnte koncentrationer. Der blev foretaget dobbeltbestemmelse for alle tre analyseparametre. Værdierne blev indsamlet på computere og skrevet ind i skemaer som findes i bilag 3 og 4. Databearbejdning For at finde ud af hæmolyseanalysens korrekthed (Bias) blev en t-test med en stikprøve lavet, for at vurdere om middelværdien afveg signifikant fra prøvens sande værdi. Til dette analyseres tre forskellige prøver ti gange. Prøvens sande værdi blev fastlagt på henholdsvis 0,02 g/l, 0,2 g/l og 0,6 g/l (bilag 2), som var de værdier for hæmolysen der blev brugt i forsøget for LD, fordi for LD er hæmolyseværdierne som ønsket i hæmolyserækken. Derfor blev der antaget at hæmolyseværdierne for LD var korrekte. Signifikant betyder at der er mindre end 5% sandsynlighed for, at forskellen skyldes tilfældigheder. Hvis forskellen mellem middelværdien og den sande værdi er lille, skyldes forskellen sandsynligvis tilfældig variation, hvorimod er forskellen stor, er det usandsynligt at variationen udelukkende skyldes tilfældig variation, men også skyldes systematisk variation. En systematisk variation er en variation som påvirker alle målinger på samme måde, som f.eks. stigende grad af hæmolyse (22). Hypoteserne hedder: - H 0 : middelværdi = sandeværdi - H 1 : middelværdi sandeværdi. - Hvis t udregnet t- tabel = H 0 : accepteres og korrektheden er tilfredsstillende, der er ikke signifikant forskel, skyldes alene tilfældige fejl. - Hvis t udregnet >t- tabel = H 0 forkastes og korrektheden er ikke tilfredsstillende, der er signifikant forskel, skyldes også systematiske fejl (22). For at vurdere om der var signifikant forskel mellem analyseparametrenes målte hæmolyses middelværdi og sande værdi, blev der lavet en t-test. Hvis der forekom signifikant forskel, skulle der findes ud af, om det havde negativ klinisk betydning for analysesvaret for B12 vitamin, folat og LD. For at finde ud af om det havde negativ klinisk betydning, blev den relative ændring i form af differencen i procent udregnet i forhold til målingen der anses som hæmolyse fri, som var uden tilsætning af hæmolysat for alle analyseparametre for alle niveauerne. Derudover blev analyseusikkerheden inddraget i form af et 90%-konfidensinterval. Dette var for at udelukke, at det skyldtes tilfældigheder hvis analyseusikkerheden lå inden for tilladte totalfejl (TE). Den tilladte totalfejl blev indført i differenceplottet og blev fundet på Westgard QC (23), og skulle afgøre om Side 21 af 40

hæmolysen havde negativ klinisk betydning for analyseresultatet. For de analyser der ville vise sig at have en negativ klinisk relevans, kunne man lave den bedste rette tendenslinje, hvis der forekom nogenlunde linearitet, for at kunne komme nærmere hvornår den negative relevans indtrådte (22,24). Resultater Rådata som ligger til baggrund for tabel 2 og 3 samt graf 1-5 i dette afsnit findes i bilag 3 og 4. Analyse af hæmolysen Ved udførsel af t-test for hæmolyseanalysen, viser det sig t udregnet er mindre end t tabel for alle prøvenumre. Resultatet af dette findes i tabel 2. Prøve nr. H 0 - hypotesen Signifikant forskel 1710132100 Accepteres Nej 1710132050 Accepters Nej 1710132090 Accepters Nej Tabel 2 viser resultater for-test for hæmolyseanalysen. Resultater for B12 vitamin, folat og LD Ved udførsel af t-test for analyseparametrene B12 vitamin, folat og LD, viser det sig t udregnet er mindre end t tabel for B12 vitamin ved lavt niveau og folat ved normalt niveau, hvor der for B12 vitamin ved normalt niveau, folat ved lavt niveau og LD ved normalt niveau viser sig at t udregnet er større end t tabel. Resultatet af dette findes i tabel 3. analyse parameter H 0 -hypotesen Signifikant forskel B12 vitamin lav Accepteres Nej B12 vitamin Forkastes Ja normal Folat lav Forkastes Ja Folat normal Accepteres Nej LD normal Forkastes Ja Tabel 3 viser resultater for udregnet t-test B12 vitamin, folat og LD. Graf 1-5 viser den relative ændring i form af et differenceplot for niveauerne lav og normal ved B12 vitamin og folat, samt ved et normalt niveau af LD med indtegnet 90%- Side 22 af 40

Difference i % Difference i % konfidensinterval. Den røde streg viser grænsen for den tilladte totalfejl (TE), fundet på Westgard QC (23). Derudover er der tilføjet den bedst rette tendenslinje for LD, da der forekommer linearitet. 40 30 20 Differenceplot for lav B12 vitamin 10 0-10 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7-20 -30-40 Graf 1 Hæmolyse g/l Graf 1 viser at der ingen variation i koncentrationen er, da resultaterne ligger tæt på den sandeværdi. 40 30 Differenceplot for normal B12 vitamin 20 10 0-10 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7-20 -30-40 Graf 2 Hæmolyse g/l Graf 2 viser forekomsten af et fald i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Side 23 af 40

Difference i % Difference i % Differenceplot lav folat 80 60 40 20 0-20 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7-40 -60 Graf 3 Hæmolyse g/l Graf 3 viser forekomsten af stor variation i en stigning som funktion af hæmolysen. Differenceplot for normal folat 50 40 30 20 10 0-10 -20-30 -40-50 Graf 4 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 hæmolyse g/l Graf 4 viser at der ingen betydelig variation er i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Side 24 af 40

Antal prøver med hæmolyse Difference i % 50 40 30 20 10 0-10 -20 Graf 5 Differenceplot for normal LD Rette linjes skæring med TE 11,4 =0,23 g/l y = 70,874x - 5,0243 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Hæmolyse g/l Graf 5 viser en systematisk stigning i form af linearitet vist i form at bedste rette linje. Den rette linjes skæring med TE 11, viser der indtræder klinisk betydning ved 0,23 g/l. Antal prøver med svar Hæmolyse Der analyseres med en hæmolysegrænse på 0,04 g/l, som betragtes som hæmolysefri i januar og februar på Architect. Hæmolysegrænsen blev ændret første gang i marts til 0,1 g/l, ved en visuel vurdering af udvalgt personale. Ændringen viser kun et lille fald i antallet af afviste prøver. Derfor bliver hæmolysegrænsen ændret anden gang i juni til 0,2 g/l, også ved gentagelse af visuel vurdering. Månederne juni til december er de måneder der analyseres med en hæmolysegrænse på 0,2 g/l, som er dét problemstillingen omhandler (8). 350 Antal prøver med svar "Hæmolyse" 300 250 200 150 100 50 B12 vitamin Folat LD Total 0 jan feb mar apr maj jun jul aug sep okt nov dec Graf 6 Graf 6 viser en graf med indtegnet kurve for hvor mange prøver der blev afvist på grund af hæmolyse i 2012 for B12 vitamin, folat, LD og total for de 3 analyser. Der skete også en ændring af hæmolysegrænsen fra nultolerance 0,4 g/l til 0,2 g/l (1). Side 25 af 40

Diskussion Design Efter vurdering med overlæge Kaj O. Pedersen (19), besluttede vi at måling i de høje niveauer ikke var nødvendig. Vi gik ud fra at koncentrationen blot ville blive højere, hvilket ikke ville give nogen ændring på analysesvaret. Inden hæmolysen blev tilsat, var koncentrationen høj nok til, at man kunne betegnes værende syg, hvilket man stadig ville betegnes som, hvis koncentrationen blev højere. Det lave niveau for LD er ikke relevant, fordi et for lavt LD-niveau ikke har klinisk betydning (16). Grunden til at vi tager de lave niveauer for B12 vitamin og folat er, at vi vil undersøge om hæmolysen gør koncentrationen så meget højere, at der vil forekomme et falskt negativt svar, så patienten fejlagtigt får at vide at patienten er rask, idet koncentrationen går fra et lavt niveau til et normalt niveau, og man vil derfor ikke opdage at man er syg. De normale niveauer for B12 vitamin, folat og LD undersøges for at se om der vil forekomme et falskt positivt svar, da koncentrationen går fra normal til for høj, og dermed får man analysesvaret at man er syg. I begge tilfælde, vil man enten ikke få den behandling man burde, eller også vil man indgå i et behandlingsforløb som ikke er nødvendigt. Begge dele har konsekvenser for patienten. En anden vurdering vi diskuterede med Linda Ø. Henriksen (28), var hvorvidt det havde en indvirkning for plasmaet for LD analysen, at det blev afpippeteret efter de fem timer som stod oplyst i analysevejledningen (15). Grunden til at dette ikke var muligt, var på grund af at transportordningen ikke passede med hvornår vi kunne indsamle prøvemateriale. Efter en samtale og vurdering i samarbejde med Linda Ø. Henriksen, fandt vi frem til, at det ingen betydning havde at tiden blev overskredet, idet vi skulle bruge koncentrationen af LD inden for et bestemt koncentrationsniveau. Selvom om afpippeteringen blev foretaget efter de fem timer, havde det ingen betydning når plasmaet blev samlet i en pool, og da vi lavede en måling uden hæmolysat til at bekræfte at koncentrationen lå inden for ønsket koncentrationsniveau. Hæmolyseanalysen En vurdering af hæmolyseanalysen skulle til, for at udelukke at der forekom en signifikant forskel mellem middelværdien og den sande værdi. Det var for at udelukke, at der forekom præanalytiske fejlkilder ved udførsel af forsøget. Udførslen blev gennemført ved den samme procedure ved hver plasma-pool, i håb om at kunne undgå en signifikant forskel der skyldtes præanalytiske fejl ved præparering. En signifikant forskel kunne også Side 26 af 40

forekomme i form af systematisk variation for analysen. Udregninger af en t-test for tre forskellige koncentrationer (se tabel 2) viser, at der ikke forekommer signifikant forskel på middelværdien og den sande værdi. Dette betyder at H 0 -hypotesen accepteres, hvilket betyder at korrektheden på analysen er tilfredsstillende, og de variationer der forekommer, er tilfældige. Derfor kan det udelukkes, at der forekommer variation for hæmolyseanalysen på grund af det præanalytiske arbejde. På dette grundlag er resultaterne i orden, idet det er hæmolysen der ligger til grund for videre vurdering af resultaterne for B12 vitamin, folat og LD. B12 vitamin Lav T-testen for B12 vitamin i et lavt niveau viser, at der ikke er signifikant forskel mellem middelværdien og den sande værdi, som betyder at H 0 -hypotesen accepteres og korrektheden er tilfredsstillende samt at variationen skyldes alene tilfældigheder. Dette afspejler sig også i differenceplotte (graf 1), da der kun forekommer en lille variation i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Det betyder også at ingen af resultaterne falder uden for den øvre og nedre tilladte totalfejl som er fundet til 30% (23), som betyder der ikke er nogen negativ klinisk relevans for analyseresultatet. Resultaterne falder heller ikke udenfor tilladte totalfejl ved 90%-konfidensintervallet, som blev udregnet til 12%. Dette betyder at selvom der vil forekomme analyseusikkerhed, vil analyseresultatet stadig ligge inden for tilladte totalfejl, og det ikke er en tilfældighed, at de ligger indenfor grænserne. Hæmolyse i det undersøgte område ser ikke ud til at have den store indvirkning på B12 vitamin ved et lavet niveau. Normal T-testen for B12 vitamin ved normalt niveau viser, at der er signifikant forskel mellem middelværdien og den sande værdi, hvilket betyder at H 0 -hypotesen forkastes og korrektheden ikke er tilfredsstillende, hvilket sandsynligvis skyldes systematiske fejl, måske i form af stigende hæmolyse. Dette giver sig også til udtryk i differensplottet (graf 2), hvor der forekommer en større variation i koncentrationen, som viser sig som et fald som funktion af hæmolysen. Ingen af analyseresultaterne falder uden for den øvre og nedre tilladte totalfejl på 30% (23), på trods af der forekommer en signifikant forskel. Dette betyder, at selvom der er en signifikant forskel, har den ikke en negativ klinisk betydning for analyseresultaterne. Resultaterne falder heller ikke udenfor den tilladte totalfejl ved 90- %-konfidensintervallet som er udregnet til 12%, selvom der er en større variation i Side 27 af 40

koncentrationen. Dette betyder, at selvom der vil forekomme analyseusikkerhed, vil analyseresultatet stadig ligge inden for tilladte totalfejl og det ikke er en tilfældighed, at de ligger inden for grænserne. Hæmolyse for B12 vitamin ved normalt niveau går ind og påvirker analyseresultatet, således at H 0 -hypotesen forkastes, men det har ikke en negativ klinisk betydning i det målte område. Det kan diskuteres om hvorvidt hæmolysegrænsen bør sættes op for B12 vitamin. Det kan tyde på, at niveauet af koncentrationen har betydning for hæmolysen, hvilket viser sig ved, at der ikke er en signifikant forskel ved et lavt niveau af B12 vitamin, hvor der er en signifikant forskel ved normalt niveau af B12 vitamin. På trods af at målingerne var svingende (se bilag 3), viste det sig ikke så tydeligt i differenceplottet. De svingende målinger kan også have haft betydning for forekomsten af en signifikant forskel for B12 vitamin ved et normalt niveau. Målingerne i de lave koncentrationer af hæmolysekoncentrationen svinger også meget, hvilket kan skyldes det tætte interval af hæmolysekoncentrationen. Hvis man kigger udelukkende på differensplottet, kan man vurdere, at hæmolyse ikke har en negativ klinisk relevans i det målte område op til en hæmolysegrad op til 0,58 g/l, og derfor har hæmolysegrænsen på 0,2 g/l ikke haft en negativ klinisk relevans. Folat Lav T-testen for folat ved et lavt niveau viser, at der er signifikant forskel mellem middelværdierne og den sande værdi, som betyder at H 0 -hypotesen forkastes og korrektheden ikke er tilfredsstillende, hvilket sandsynligvis skyldes systematiske fejl, måske i form af stigende hæmolyse. Dette kommer til udtryk i differenceplottet (graf 3), hvor der forekommer stor variation i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Variationen er ikke systematisk, da resultaterne både falder og stiger, hvilket også kan skyldes, at det ikke alene består af systematiske fejl, men også af tilfældig variation. To af resultaterne rammer den øvre grænse for tilladte totalfejl som er 39% (23) for nedre og øvre grænse. Første gang resultaterne rammer, er ved koncentration 0,24 g/l og anden gang er ved en koncentration på 0,55 g/l. Disse to målinger viser, at der er en negativt klinisk relevans for analysesvaret. Målingerne derimellem viser dog ikke tegn på en negativ klinisk relevans, da de ikke er større end den tilladte totalfejl. For den ene af målingerne ligger 90%-konfidensintervallet udregnet til 19,8% udover den tilladte totalfejl, Side 28 af 40

hvor resultatet på af grund af analyseusikkerhed kan ligge uden for den tilladte totalgrænse, hvor det er en tilfældighed at resultatet ligger inden for grænsen. Dette gælder også for to målinger inden 0,24 g/l. På grund af dette er det svært præcist at sige, hvornår hæmolyse har en negativ klinisk relevans for analyseresultatet, men man kan antage et sted mellem 0,13 g/l og 0,24 g/l, hvor sker der en jævn stigning, hvor jeg vil antage, at der derimellem indtræder en negativ klinisk relevans. Målingerne inden og efter 0,13 g/l og 0,24 g/l virker ustabile og varierer i fald og stigning, hvilket kan tyde på at koncentrationen af hæmolyse ikke spiller ind. Inden 0,13 g/l, er intervallerne meget små for hæmolysegraden, og kan næsten minde om hinanden, hvilket også kan skyldes forekomsten af variation. Efter 0,24 g/l er intervallerne større, men det kan tyde på, at selvom koncentrationen bliver større, giver det ikke en yderligere variation. Normal T-testen for folat ved et normalt niveau viser, at der ikke er signifikant forskel mellem middelværdien og den sande værdi, som betyder at H 0 -hypotesen accepteres og korrektheden er tilfredsstillende, samt at forskellene kunne skyldes tilfældig variation. Dette afspejler sig også i differenceplotte (graf 4), da der kun forekommer en lille variation i koncentrationen som funktion af hæmolysen. Det betyder også, at ingen af resultaterne falder uden for den øvre og nedre tilladte totalfejl som er fundet til 39% (23), som betyder at der ikke er nogen negativ klinisk relevans for analyseresultatet. Resultaterne falder heller ikke udenfor tilladte totalfejl ved 90%-konfidensintervallet som blev udregnet til 19,8%, hvilket betyder, at selvom der vil forekomme analyseusikkerhed, vil analyseresultatet stadig ligge inden for tilladte totalfejl og at det ikke er en tilfældighed, at de ligger indenfor grænserne. Hæmolyse ser umiddelbart ikke ud til at have den store indvirkning på normal folat i det målte område op til 0,5 g/l. Det kan diskuteres om hæmolysegrænsen bør sættes op for folat. Det kan tyde på, at niveauet af koncentrationen har betydning for hæmolysen, hvilket viser sig ved, at der ikke er signifikant forskel ved normalt niveau af folat, hvilket der er ved et lavt niveau af folat. Dette kan måske skyldtes analysen, der ikke er god til at måle folat i det lave niveau, eller at hæmolyse kun spiller ind i det lave niveau, idet der ikke skal meget folat til før koncentrationen ændrer sig, så det har en negativ klinisk betydning. Hvilke af delene der har betydning for forekomsten af en signifikant forskel er svær at sige, men der sker en linearitet for lav folat mellem 0,13 g/l og 0,24 g/l. Mens det for folat ved normalt niveau Side 29 af 40

ikke synes, at hæmolysen har nogen betydning. Det kan være meget svært at vurdere om hæmolysegrænsen bør sættes højere op, og om den nuværende grænse på 0,2 g/l har haft betydning, og om der burde laves yderligere undersøgelser for et lavt niveau af folat, for at kunne sige præcis, hvornår der indtræder en negativ klinisk betydning. Resultaterne for et lavt og normalt niveau af folat viser ikke de samme resultat, idet hæmolysegrænsen ved et lavt niveau af folat vil være mellem 0,13 g/l og 0,24 g/l. Derimod vil en hæmolysegrænse for et normalt niveau af folat kunne sættes op til 0,5 g/l, hvilket resultere i at folat i et lavt niveau trækker hæmolysegrænsen ned for folat ved normalt niveau. LD T-testen for normal LD viser, at der er signifikant forskel mellem middelværdierne og den sande værdi, som betyder at H 0 -hypotesen forkastes og korrektheden ikke er tilfredsstillende, hvilket sandsynligvis skyldes systematisk variation. I differensplottet (graf 5) viser der sig linearitet i form af en stigning som funktion af hæmolysen. Den første måling der er større end til tilladte totalfejl på 11,4% (23) er ved 0,26 g/l. Her indtræder en negativ klinisk relevans for analyseresultatet. For at komme det nærmere er der indtegnet den bedste rette linje med skæring af den tilladte total fejl. Linjerne skærer hinanden på 0,23 g/l, hvilket betyder at den negative kliniske relevans indtræder her. Under 0,23 g/l er der to målinger hvor 90%-konfindensintervallet udregnet til 7%, som rammer uden for den tilladte totalfejl. Det betyder, at der er en analyseusikkerhed og det kan være tilfældigt at analyse resultatet ligger inden for grænsen for tilladte total fejl. Der forekommer alligevel en lille variation i de små hæmolyse koncentrationer, hvilket kan betyde, at der ikke er en stor indvirkning her. Intervallerne ligger ret tætte og det har derfor ikke den store betydning at målingen på 0,12 g/l ligger uden for grænsen med 90%-konfidensintervallet. Da der forekommer linearitet, er det nemt at kunne fastsætte en grænse for, hvornår hæmolysen har en negativ klinisk betydning for analyseresultatet, da der er linearitet. Den udregnede skæring på 0,23 g/l ligger ikke langt fra den nuværende hæmolysegrænse på 0,2 g/l. I validering og QC i AMS fra Odense Universitetshospital omhandler deres fastlagte grænser for HIL-værdierne, hvilket inkluderer hæmolysegrænserne for B12 vitamin, folat og LD. I skemaet over HIL-indeks-værdierne, er følgende værdier opgivet for B12 vitamin 4 g/l, folat 1,2 g/l og LD 0,2 g/l som H-indeks (29). Deres grænse for B12 vitamin virker høj, i forhold til mine resultater, hvor jeg har fået en Side 30 af 40