Validering af fæces-calprotectin, på BEP 2000 Advance

Validering af fæces-calprotectin, på BEP 2000 Advance - med undersøgelse af en udskiftning af ekstraktionsmetode og afprøvning af Quantum Blue på klinisk biokemisk afdeling, Køge Mia Kühl Laursen 03-01-2014 Bachelorprojekt UCSJ Næstved

Validering af fæces-calprotectin analysen, på BEP 2000 Advance med undersøgelse af en udskiftning af ekstraktionsmetode og afprøvning af Quantum Blue, klinisk biokemisk afdeling, Køge Validation of feacal-calprotectin analysis, with BEP 2000 Advance - with an investigation of a replacement of extraction-method and testing of Quantum Blue, at the clinical biochemistry department, Køge Forfatter: Mia Kühl Laursen Professionsbachelorstuderende Bioanalytikeruddannelsen UCSJ Campus Næstved Vejledere: I-vejleder: Kim Blanksø Pedersen Underviser UCSJ Campus Næstved K-Vejleder: Heidi Hvid Nielsen Bioanalytikerunderviser Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus Anslag: 41.843 tegn (uden mellemrum) Forsidefoto fotograf: Karina Maria Jensen 1

2

Resume Baggrund Analysen fæces-calprotectin bliver ikke udbudt i region Sjælland så der er et ønske om at få den implementeret på biokemisk afdeling på Køge sygehus. Der laves en delvis validering af BEP 2000 Advance (Siemens) med analysemetoden ELISA, ved brug af Calprotectin ELISA kit (Bühlmann Laboratories). Yderligere bliver en udskiftning af ekstraktionsmetode af fæces undersøgt, samt miniforsøg med Point Of Care Testen Quantum Blue (Bühlmann Laboratories). Formål Udførelse af en delvis validering, som baggrund for en implementering, af calprotectin analysen til brug på biokemisk afdeling, Køge. Materialer og metoder Der blev anvendt fæces prøver fra i alt 49 patienter. 29 ekstraktioner, med kendt koncentration, fra Randers biokemiske afdeling samt 20 prøver fra patienter, på gastroenterologisk ambulatorium, Køge. Af reagenser blev anvendt Calprotectin ELISA kit fra Bühlmann til ekstraktioner. Til analysering af prøverne, blev BEP 2000 Advance fra Siemens anvendt. Til sammenligning og holdbarhedsforsøg, blev der yderligere anvendt ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann som ekstraktionsmetode. Procedurer for analysering på BEP 2000 Advance, samt kit-indlæg fra Bühlmann blev fulgt til analysering og ekstraktioner. Resultater Metodesammenligning med Randers, gav R 2 =0,96 samt en gennemsnitlig % bias på 0,3. Den Intermediære præsion gav en middelværdi på CV % på 32,8 % og den intramediære præcision en middelværdi på CV % på 6,2 %. Metodesammenligning af ekstraktionsmetode gav R 2 =0,98 samt en gennemsnitlig % bias på -0,2 %. Konklusion Der kan ikke, på baggrund af forsøgene, begrundes en implementering af analysen, da yderligere undersøgelser er nødvendige. 3

Indholdsfortegnelse Resume... 2 Introduktion... 6 Calprotectin... 6 Problembaggrund... 6 Validering... 7 Afgrænsning... 8 Problemformulering... 9 Brug af prøvemateriale... 9 Ekstraktion... 9 Analysering af calprotectin...10 Analyseprincip calprotectin ELISA...10 Standarder...11 Intermediær og intramediær præcision...12 Eksterne kontroller...12 Quantum Blue...12 Materialer og metoder samt metodiske/teoretiske overvejelser....13 Patientmateriale...13 Metodesammenligning med Randers...13 Metodesammenligning af ekstraktioner...14 Holdbarhed af ScheBo Quick-Prep ekstraktioner...14 Sammenligning af Quantum Blue med BEP 2000 Advance...15 Resultater...16 Standarder...16 Metodesammenligning med Randers...16 Intramediære præcision...17 Intermediære præcision...18 Kontroller...18 Eksterne kontroller...18 Metodesammenligning af ekstraktioner...19 Diskussion...20 Standarder...20 4

Korrekthed...21 Præcision...21 Metodesammenligning af ekstraktioner...23 Holdbarhedsforsøg på ScheBo Quick-Prep...24 Sammenligning af Quantum Blue med BEP 2000 Advance...25 Andet...25 Økonomi...26 Etik...26 Konklusion...27 Perspektivering...28 Referenceliste...29 Bilag 1...31 Bilag 2...32 Rådata...32 Bilag 3...36 Bilag 4...38 Bilag 5...40 Litteraturliste - Analyseskema...43 5

Introduktion Indledning Når man bliver syg er det af betydning, ikke at skulle igennem, eventuelle unødvendige invasive analyser. Dette er en af problemstillingerne ved Inflammatory Bowel Diseases (IBD), hvor der er et behov for en markør til vurdering og opfølgning [1]. IBD er en overordnet betegnelse for kroniske tilstande af inflammation i tarmen. IBD havde i 2007 en prævalens på ca. 25.000 tilfælde, i Danmark og diagnosticeres hyppigst hos de 20-30 årige [2]. De symptomer der ses hos patienterne er blandt andet vægttab, mavekramper og/eller diarré, der ses som tilbagevendende eller varende over en længere periode [3]. Vurdering af sygdom og sygdomsaktivitet ved IBD sker ved en kombination af symptomer, endoskopi, biopsier samt biokemiske analyser [4]. Endoskopier er dyre at udføre, invasivt, samtidig med at det er til gene for patienterne [5]. En markør der kan vurdere et behov for endoskopi, bør være ikke-invasiv, let udførelig og økonomisk [1]. En ikke-invasiv metode der kan bruges i screeningen af IBD patienter, er analysering af calprotectin i fæces [3]. Calprotectin Calprotectin er et protein fundet i de neutrofile granulocytters cytoplasma, hvor det her udgør ca. 60 % af det samlede antal proteiner [6]. Det har en molekylærmasse på 36 kda og kan binde med calcium. Bindingen med calcium betyder at calprotectin er resistent overfor enzymatisk nedbrydning [7]. Calprotectin findes normalt i fæces med en værdi under 50 mg/kg, hvorimod der hos personer med en aktiv inflammation ofte ses værdier over 500-1000 mg/kg [8]. Problembaggrund I region Sjælland er der i dag ingen laboratorier, der udbyder fæces-calprotectin (f-calprotectin) analysen [9]. Alle fæces-prøver der skal analyseres for calprotectin, bliver derfor sendt, til biokemisk afdeling i Randers [10]. På Køge sygehus er der et ønske om at implementere analysen på biokemisk afdeling, da dette vil være en fordel for både patienterne, gastroenterologisk ambulatorium samt biokemisk afdeling. 6

For patienter kan denne implementering betyde at der kan foreligge et hurtigere prøvesvar og eventuel behandling kan påbegyndes eller reguleres tidligere. For patienter fra privat praksis i regionen kan det betyde at er behov for indlæggelse, kan opdages hurtigere [9]. Implementeringen betyder, for gastroenterologisk ambulatorium at der modtages elektronisk svar, så snart analyseringen er foretaget, samt en eventuel reducering i omkostninger ved analysebestillinger. For biokemisk afdeling kan denne implementering betyde flere arbejdspladser, øget indtægt samt et tværfagligt samarbejde med lægerne på gastroenterologisk ambulatorium og i regionen. BEP 2000 som analysen kan udføres på er implementeret på biokemisk afdelingen Køge, til andre analyser. Der er udviklet forskellige metoder, til eksisterende apparaturer, til måling af calprotectin i fæces. Der er Yderlige udviklet en Point Of Care Test (POCT), Quantum Blue fra Bühlmann [11]. Validering Når der skal implementeres en ny analyse eller analysemetode på afdelingen skal denne valideres inden ibrugtagelse. En validering foretages, på baggrund af afdelingens retningslinjer, for validering af analysemetoder [12]. Den bliver lavet for at sikre kvaliteten af analysesvarende, der bliver givet til lægerne, med henblik på at patienterne får en korrekt behandling. Som del af en validering udføres en række forsøg, med henblik på at kunne vurdere om analysen kan tages i brug. Her iblandt er en metodesammenligning med en, i forvejen, valideret analysemetode, samt en kvalitetssikring med brug af eksterne kontroller [12]. Til valideringen bruges analysetekniske afprøvninger [12]: - Metrologisk sporbarhed - Korrekthed - Måleinterval - Fastlæggelse af måleområdets øvre og nedre grænse - Detektionsgrænse - Analytisk specificitet (selektiv/interferens/matrixeffekter) - Linearitet - Afsmitning - Præanalytiske forhold 7

- Intermedære præcision - Måleusikkerhed Afgrænsning Der ønskes en sammenligning med Randers biokemiske afdeling [9], og det er derfor valgt at validere analysen som den er på Randers biokemiske afdeling [13]. Dette er valgt da prøver fra regionen sendes dertil nu [9]. Valideringen omfatter analysemetoden ELISA på BEP 2000 Advance fra Siemens(BEP 2000) [14], samt calprotectin ELISA kit fra Bühlmann [15]. Ydermere har det været nødvendigt, at udvælge dele af valideringen [12] som udføres. Derfor vil dette projekt ikke indeholde en fuld validering af analysen f-calprotectin. Bühlmann har beskrevet to måleområder, henholdsvis low- og high range. Der er valgt [9] at benytte high range, med et måleinterval på 30-1800 mg/kg, da dette bruges i Randers [15]. Der bliver til inter- og intramediære præcision kun benyttet pools, med koncentrationer ved lav, middel og høj. Disse med henholdsvis, 50-100 µg/g, 500-700 µg/g samt 900-1200 µg/g, da dette dækker måleområdet for analysen. Da der intet korrekt referencemateriale er tilgængeligt for calprotectin [15], giver dette en usikkerhed i sporbarheden af calprotectin standarder. Der benyttes kun producentens eget referencemateriale, hvor sporingen stopper. Calprotectin ELISA kittet fra Bühlmann, er IVD mærket [15]. Dette betyder at der er udført en omfattende validering af producenten. Yderligere er kittet CE godkendt [15], hvilket betyder at det er kvalitetssikret, samt at det opfylder gældende sikkerhedskrav. Dette er udført ud fra standardkriterier, udskrevet af Europa parlamentet og rådet for den Europæiske Union [16]. Der måles med dobbeltbestemmelser på alt materiale, for at sikre kvaliteten af analysen. Der udføres et mini-forsøg med analysering på Quantum Blue ved brug af high-range kit, 100-1800 µg/g [11]. 8

Problemformulering Hvilke resultater kan der opnås ved en delvis validering af f-calprotectin analysen, på BEP 2000 på klinisk biokemisk afdeling, Køge, med henblik på en sammenligning med klinisk biokemisk afdeling, Randers og Bühlmann? - Samt kan en udskiftning, af ekstraktionsmetoden afvejning til ScheBo Quick-Prep, begrundes og eventuelt benyttes til måling på Quantum Blue? Brug af prøvemateriale Der benyttes prøvemateriale, fra patienter med konsultation på gastroenterologisk ambulatorium. Da opsamlingen af fæces skal foretages, til måling på Randers, bliver patienter spurgt om de har lyst til at opsamle to prøver fremfor den ene. De får yderligere udleveret en frankeret kuvert til forsendelsen [9]. Ved modtagelse af prøverne, bliver disse tildelt et prøvenummer, CPR-numre skrives manuelt i et skema og følgesedler makuleres. Skema med CPR-numre gemmes kun med henblik på at få resultaterne, til sammenligning efter analysering på Randers. Efter dette vil skemaet blive makuleret. Yderligere får afdelingen tilsendt, allerede analyserede, fæces prøver samt ekstraktioner fra Randers biokemisk. Der bliver kun videregivet glasnummer så disse prøver er anonyme. Fæces er organisk, ikke biologisk materiale og der er derfor ingen etiske problemstillinger. Ekstraktion Når patienter skal opsamle fæces, får de af lægen udleveret et opsamlingsrør med et låg, hvor en ske er monteret, samt et opsamlingspapir. [17]. Røret med fæces sendes til en biokemisk afdeling hvor ekstraktionen sker efter afdelingens procedure for analysering af calprotectin. Bühlmann, beskriver to ekstraktionsmetoder hvor af opsamlingsmetoden er forskellig [15]. Bühlmann har, som en del af kittet, en standart ekstraktionsmetode, Afvejning [15]. ScheBo Quick-Prep er en ny opsamlingsmetode hvor der bruges en opsamlingspind med riller, som bliver sat i en ekstraktionsbuffer med det samme [18]. Når prøven ankommer til afdelingen skal den opbevares ved 2-8 C, hvor den kan lagres i op til 6 døgn. Ekstraktioner kan opbevares ved -20 C i optil 4 måneder [15]. Benyttelse af Schebo Quick-prep fremfor afvejningsmetoden kan, for afdelingen betyde at der ikke skal udføres ekstraktionsprocedure, udover en homogenisering samt centrifugering [15] før analysering. Yderligere vil patienten, ved denne ekstraktionsmetode, undgå opsamling af en bestemt mængde fæces. 9

Der skal blot sørges for at rillerne på pinden er fyldte, ved at stikke i afføringen, for derefter at sætte den i ekstraktionsbufferen. Analysering af calprotectin En benyttet analysemetode til analysering af f-calprotectin, er et Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay (ELISA) [13]. ELISA er en sandwich-metode. Dette betyder at en mikrotiterpladen er forud coated med et antistof, der er specifikt for det protein det Figur 1: Illustration af en brønd fra en mikrotiterplade, med visning af coatning med monoklonale antistoffer på brøndens inderside. ønskes at undersøge tilstedeværelsen af. Når dette tilsættes, binder det sig til antistoffet. Dertil tilsættes endnu et antistof, og yderligere reagenser, der tilsammen danner et produkt der kan måles spektrofotometrisk og omsættes til en koncentration [19]. Analyseprincip calprotectin ELISA På en mikrotiterplade er de 96 brønde coated med et monoklonalt antistof, der er specifikt mod henholdsvis hetrodimere- og polydimeriske calprotectin komplekser [15]. Først tilsættes fortyndet prøvemateriale til de antistofcoatede brønde. Her vil calprotectin binde sig til antistofferne [15]. Efter et inkuberings og vaske trin, tilsættes et detektionsantistof som er konjugeret med HorseRadish Peroxidase (HRP). Konjungatet binder sig til calprotectinmolekylerne [15]. Efter endnu et inkuberings og vaske trin, tilsættes et substrat, TetraMethylBenzidin (TMB) som reagerer med HRP og dette danner en blå farvning af væsken [15]. Til sidst tilsættes en stopopløsning der hæmmer enzymet og dette giver et farveskift Figur 2: (I forlængelse af figur 1) Her ses trin for trin, proceduren for calprotectin analysen når den udføres med ELISA metoden. Henholdsvis; tilsætning af fortyndet patientmateriale til de antistof-coatede brønde, hvorefter et inkuberings og vaske trin foretages før en tilsætning af konjugat. Inkubering og vask gentages inden tilsættelse af substratet. Derefter en sidste inkubering inden stopopløsningen tilsættes og der ses et farveskifte. Der måles til sidst spektrofotometrisk. 10

fra blå til gul [15]. For at få et resultat måles der på intensiteten af den gule farve ved hjælp af en spektrofotometrisk måling ved 450 nm [15]. Farveintensiteten (OD) er ligefrem proportionalt med indholdet i produktet og dette kan derfor omsættes til et kvantitativt resultat [15]. Standarder Standarder (kalibratorer) benyttes til at kalibrere spektrofotometeret i BEP 2000. Dette er nødvendigt for at sikre korrektheden af resultaterne der udgives. Kalibratorernes absorbans-værdier ligger spredt i måleintervallet, og danner baggrunden for at prøvers absorbans-værdier, kan omsættes til koncentrationer. Til kalibrering af calprotectin ELISA analysen benyttes, fra producenten, oprenset MRP8/14 fra humane granulocytter [15]. Standardkurve Efter en analysering på BEP 2000, med brug af kalibrator A-E fra Bühlmann, udregnes der automatisk en standardkurve, på baggrund af de målte absorbans-værdier. Denne bliver udregnet efter en 4-parametrisk data model [Bilag 1]. Figur 3: En standardkurve udskrevet fra BEP 2000, Køge. Der ses kurven for standarderne fra Bühlmann calprotectin ELISA kittet ved en analysering af calprotectin. Kurven er beregnet ud fra en 4-parametrisk test og viser korrelationen mellem koncentrationen af calprotectin og den målte absorbans-værdi (O.D.) fra spektrofotometeret. De fem punkter på kurven, er de målte værdier på de fem standarder, disse dækker måleintervallet for analysen. Kurven er semilogaritmisk da x-aksen er logaritmisk og y-aksen er linær. 11

På standardkurven kan der ses fem punkter, disse er standardernes målinger, der angiver koncentrationerne heraf. Måleintervallet er styret af kalibrator A og E, der indikerer hvor kurven flader ud. Dette betyder at før og efter disse intervaller, kan koncentrationer beregnet ud fra en målt absorbans, ikke beregnes som pålidelige resultater [20]. Måles absorbans-værdierne for kalibrator A eller E, til at være udenfor måleintervallet, bliver analysen ikke accepteret og der kan derfor ikke modtages koncentrationer på analyserede prøver. Sker dette skal analysen gentages [20]. Intermediær og intramediær præcision Tre pools med henholdsvis lav, middel og høj koncentration, til at vurdere intermediære - og intramediære præcision, laves med ekstraktion ud fra afvejningsmetoden [15], da dette er den benyttede metode på Randers [13]. Kontroller Der medfølger en høj og en lav kontrol med calprotectin ELISA kittet [15], men Bühlmann anbefaler at afdelingerne selv laver egne kontroller af prøver med kendt værdi, da der ikke findes noget korrekt referencemateriale [15]. Eksterne kontroller Der benyttes eksterne kontroller, bestilt igennem DEKS, fra den svenske organisation EQUALIS til at kvalitetssikre analysen. Der laves en sammenligning af resultaterne på fire ekstraktioner, med et gennemsnit af målinger fra andre laboratorier der har calprotectin analysen implementeret. Der benyttes gennemsnittet af resultater, fra målinger med Bühlmann ELISA. Quantum Blue Quantum Blue er en hurtigtest der ved hjælp af testkassetter kan analysere en prøve på 15 min [11].Denne har et måleinterval på henholdsvis low range 30-300 µg/g og high range 100-1800 µg/g [11]. Quantum Blue benytter et sandwich immunoassay [11], med samme analyseprincip som ved ELISA. Dette er lavet som test-kassetter med brug hvor et monoklonalt antistof, der er specifikt for calprotectin, er coated på en testmembran, mens et andet monoklonalt antistof, konjugeret til et guld kolloid. Dette konjugeres til et frigørelsesområde hvorfra det, ved tilsættelse af prøvematerialet, bliver frigjort til en 12

reaktion [11]. I testkassetten er der også en kontrollinje der kvalitetssikrer analysen [11]. Materialer og metoder samt metodiske/teoretiske overvejelser. Patientmateriale Der blev anvendt fæces prøver fra 49 patienter i alt. 29 ekstraktioner med kendt koncentration, fra Randers biokemiske afdeling samt 20 prøver fra patienter på gastroenterologisk ambulatorium, Køge. Metodesammenligning med Randers Metodiske og teoretiske overvejelser Til metodesammenligningen på BEP 2000 mellem Randers- og Køge biokemiske afdelinger, skal indholdet af statistiske tests vise om der er en korrelation mellem målingerne. Dette kan beregnes med brug af % bias til at beregne den procentvise systematiske variation, X/Y-plot for at få en korrelationskoefficient samt linær regression og et differenceplot for at vise den % bias. Materialer Ved metodesammenligning på BEP 2000 Advance blev der anvendt et kit fra Bühlmann (lot nr. 1945, 1552, 1552.1) indeholdende ekstraktionsbuffer, mikrotiterplade coatet med anti-calprotectin, vaskebufferkoncentrat, inkubationsbuffer, kalibratorer A til E, en lav og en høj kontrol, mærket enzymkonjugat, TMB-substrat og stopopløsning. Af apparatur blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools, samt en mini-rotator til homogenisering af suspensionerne. Metode Ved metodesammenligning på BEP 200 Advance blev ekstraktionerne fra Randers biokemiske afdeling analyseret. Bühlmann kittet blev taget ud og tempereret til stuetemperatur og reagenser blev vendt. De optøede prøver samt pools til intermediære præcision blev vendt på mini-rotator i 10 minutter hvorefter de blev overført til afpipetteringsglas med låg og centrifugeret i 5 minutter ved 3000 g. Vaskebuffer blev fortyndet 1:9 med deioniseret vand og påsat på BEP 2000. Analysen blev udført ud fra afdelingens procedure om brug af BEP 2000 [13]. 13

Metodesammenligning af ekstraktioner Metodiske og teoretiske overvejelser Til metodesammenligning af ekstraktionsmetoder, skal indholdet af statistiske tests vise om der er en korrelation mellem målingerne. Dette kan beregnes med brug af % bias til at beregne den procentvise systematiske variation, X/Y-plot for at få en korrelationskoefficient samt linær regression og et differenceplot til at vise den % bias. Materialer Der blev til forsøg med ekstraktionsmetode, anvendt samme reagenser som ved, metodesammenligning med Randers, til analyseringen på BEP 2000 Advance. Til selve ekstraktionen af fæces blev der anvendt, ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann (lot nr. 2313), engangsspartler, spidsrør med skruelåg, 82 x 13 mm afpipetteringsglas med låg fra Sarstedt og 2 ml rør. af apparatur blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools, mini-rotator og minishaker til homogenisering af suspensionerne, analysevægt (10-150 mg) til afvejning af fæces og brug af stinkskab under ekstraktionen. Metode Afvejning Til ekstraktionerne blev der afvejet fæces og tilsat ekstraktionsbuffer 1:49 efter forskrift [14]. Prøverne blev efterfølgende frosset ved -20 C. Schebo Quick-Prep En ScheBo Quick-Prep blev mærket med samme prøvenummer. Ekstrahering blev udført efter procedureforskrift [17] og blev frosset ved -20 C. Analysering blev lavet efter afdelingens procedure, beskrevet for BEP 2000 [13]. Holdbarhed af ScheBo Quick-Prep ekstraktioner Metodiske og teoretiske overvejelser Ved holdbarhedsforsøget på ScheBo Quick-Prep, kan der udarbejdes en parret t-test i Excel for at kunne udregne en p-værdi. P-værdien kan fortælle om der er en signifikant forskel i målinger ved 0, 24 og 48 timer, ved henholdsvis køleskabs- og stuetemperatur. 14

Materialer Til holdbarheden af ekstraktioner, blev der anvendt fem ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann (lot nr. 2313), til ekstraktion af en udvalgt patientprøve. Af apparatur blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens, til analysering af prøverne, samt centrifuge til centrifugering af prøver og mini-rotator til homogenisering af suspensionerne. Metode Der blev ved holdbarhedsforsøget udvalgt en fæces-prøve, med en kendt koncentration af calprotectin. Denne prøve blev ekstraheret til fem ScheBo Quick-Prep efter forskrift [17]. Hver ScheBo Quick-Prep blev delt i to, til henholdsvis køl og stuetemperatur mærkede afpippeteringsglas. Prøverne blev natten over opbevaret, henholdsvis i køleskab og ved stuetemperatur. Efterfølgende blev prøverne analyseret på BEP 2000 efter procedure [13], henholdsvis ved 0, 24 og 48 timer. Sammenligning af Quantum Blue med BEP 2000 Advance Metodiske og teoretiske overvejelser Til metodesammenligningen af ScheBo Quick-Prep, på BEP 2000, med Quantum Blue, kan beregninger med brug af % bias, X/Y-plot for at få en korrelationskoefficient samt lineær regression og et differenceplot til at vise den % bias, anvendes. Da dette kun bliver lavet som et mini-forsøg bliver der ikke benyttet kontroller hertil. Materialer Til metodesammenligning på Quantum Blue blev der anvendt et rapid quantitative kit fra Bühlmann [11] indeholdende ekstraktionsbuffer, Chase-buffer (fortyndingsbuffer), test cartridge og RFID chip card (lot nr. 0108.XHR). Yderligere blev der anvendt ScheBo Quick-Prep ekstraktioner fra ekstraktionsmetode forsøget, spidsrør med låg og stopur. Af apparatur blev der anvendt Quantum Blue fra Bühlmann til analysering af prøverne. Desuden anvendtes mini-shaker til homogenisering af prøverne. Metode Til Quantum Blue blev ekstraktionerne på ScheBo Quick-Prep, fra sammenligning af ekstraktionsmetoder, benyttet. Ekstraktet blev fortyndet 1:150 med medfølgende fortyndingsbuffer i et spidsrør med låg. Herefter blev procedure for Quantum Blue fulgt [11]. 15

Resultater fra BEP 2000, Køge Mia Kühl Laursen Resultater Resultatberegningen blev foretaget med Microsoft office-pakkens Excel program på resultater printet fra BEP 2000. Standarder Resultater fra målinger af kalibratorer A-E (kal A-E) fra Bühlmann calprotectin ELISA kit [14]. Udregninger lavet på absorbans-værdier, til beregninger af middelværdi, standarddeviationen og CV %. Standarder CV [%] O.D. Bühlmann Middelværdi O.D. Bühlmann Middelværdi O.D. SD CV [%] kal A 4,2 0,068 0,072 0,0 24,3 kal B 2,7 0,158 0,180 0,1 27,8 kal C 0,4 0,510 0,553 0,2 30,1 kal D 3,3 1,310 1,376 0,4 29,5 kal E 4,5 2,008 1,834 0,5 26,7 Tabel 1: Sammenligning af absorbans-værdier (O.D.) med Bühlmann. Der ses CV % fra Bühlmann på kal A-E, samt middelværdier fra Bühlmann på kal A-E [Bilag 1]. Middelværdi samt standarddeviation og CV % på absorbansen fra 8 serier, analyseret på BEP 2000 Advance, Køge. Metodesammenligning med Randers Resultat beregninger med brug af x/y-plot for korrelation, samt difference-plot for % bias. Yderligere oversigt over korrelation af resultater. Metodesammenligning med Randers y = 0,9898x Koncentratione + 6,6024 R² r; = 1390; 0,9646 1422,5 Koncentratione Koncentratione r; 970; r; 1078,5 1190; 1097 Koncentratione Koncentratione Koncentrationer r; 694; 899 r; 914; 876,5 Koncentratione Koncentratione Koncentratione r; 610; 669,5 r; 916; Lineær 669 r; 512; 582,5 (Koncentrationer) Koncentratione Koncentratione r; 296; r; 361; 306,5 323 Koncentratione r; r; 285; 306; 287,5 320,5 Koncentratione Koncentratione r; r; r; 169; 185; 186; 188,5 186,5 176 r; r; r; r; 47; r; 62; 56; 77; 63; 84; 85; 74; 108; 133; 51,5 63,5 66,5 68 70,5 92,5 6190,5 128 Værdier fra Randers Figur 4: Sammenligning af 25 ekstraktioners resultater ved analysering på BEP 2000, Randers og på BEP 2000, Køge. 16

% Bias Mia Kühl Laursen % Bias på målinger fra BEP 2000, Køge modsat Randers værdier % Bias; 694; 29,5 296 185 694 % Bias; 512; % Bias; % Bias; 56; 12,5 169; % Bias; 970; 169 13,8 % % Bias; Bias; Bias; 47; 63; 85; 11,5 9,6 7,9 8,8 % Bias; 610; 9,8 11,2 512 % Bias; 296; 306; 3,5 4,7 % Bias; 1390; % Bias; % 62; Bias; % 2,4 Bias; 185; 285; 0,8 0,9 2,3 610 % Bias; % Bias; 133; 186; - - % Bias; 914; - 3,8 4,1 % Bias; 1190; 361-5,4 % Bias; 361; - % Bias; 77; - 7,8 84; 10,5 63 %% Bias; Bias; 74; 108; - - 13,6 17,6 16,1 16,2 1190 % Bias; 916; - 914 Randers resultater 27,0 Figur 5: Differenceplot der viser % bias for resultaterne fra 25 fæces prøver, analyseret på BEP 2000, Køge ved sammenligning med resultaterne fra Randers. Korrelation: Lineær korrelation, r 2 : 0,96 Hældningskoefficient: 0,99 Skæring med y-akse: 6,60 Gennemsnitlig % bias: 0,3 Tabel 2: oversigt over korrelationen i metodesammenligningen samt den gennemsnitlige % bias. Intramediære præcision Resultater med beregninger af middelværdi, standarddeviationen og CV % samt middelværdi heraf. Koncentration Middelværdi SD[µg/g] CV[%] Lav 70,1 3,7 5,3 Middel 756,5 23,4 3,1 Høj 1933,5 197,1 10,2 Middelværdi 6,2 Tabel 3: Middelværdi af målinger på samme pool, delt i fem, ved henholdsvis lav, middel og høj koncentration, på samme serie. Samt udregninger af standard afvigelse og variationskoefficient, på prøverne med koncentrationer på henholdsvis lav, middel og høj. Der ses yderligere middelværdien for variationskoefficienten, af den intramediære præcision. 17

Intermediære præcision Resultater med beregninger af middelværdi, standarddeviationen og CV % samt middelværdi heraf. Koncentration Middelværdi SD[µg/g] CV[%] Lav 76,2 4,5 5,9 Middel 651,3 60,8 9,3 Høj 950,7 790,6 83,2 Middelværdi 32,8 Tabel 4: Middelværdi af målinger over seks serier, samt udregning af standard afvigelse og variationskoefficient, på prøver med koncentrationer på henholdsvis lav, middel og høj. Der ses yderligere middelværdien af CV %, af den intermediære præcision. Kontroller Resultater med beregninger af middelværdi, standarddeviationen og CV %. Kit kontroller Forventet Middelværdi SD[µg/g] CV [%] Low 108 108,2 7,1 6,6 High 459 395,8 14,1 3,6 Tabel 5: Sammenligning af den forventede koncentration af kontrollerne fra Bühlmann [Bilag 1] og en middelværdi af resultater fra 8 serier analyseret på BEP 2000 Advance, Køge. Yderligere ses standard deviationen samt den CV %. Eksterne kontroller Resultater med beregning af % bias og middelværdien heraf. Prøve BEP 2000, Køge Equalis % Bias 1 28,5 42,7-33,3 2 119 153-22,2 3 196 247-20,6 4 432,5 578-25,2 Middelværdi -25,3 Tabel 6: Sammenligning af Equalis resultater med målinger på BEP 2000, Køge med % bias. Equalis resultatet er baseret på 12-14 målinger med Bühlmann ELISA metoden på 4 ekstraktioner, på forskellige afdelinger der bruger Bühlmann calprotectin ELISA metoden. 18

% Bias ScheBo Mia Kühl Laursen Metodesammenligning af ekstraktioner Resultat beregninger med brug af x/y-plot for korrelation, samt difference-plot for % bias. Yderligere oversigt over korrelation af resultater. Metodesammenligning af ekstraktioner y = 1,1636x Koncentratione - 19,055 R² r; = 881; 0,9899 1011,5 Koncentrationer Lineær (Koncentrationer) Koncentratione r; 263; 316 Koncentratione Koncentratione r; 200; 149 r; 54,5; 71,5; 67; 65,5 83 r; r; 54,5; r; 61; 92,5; 66,5 51,5 59,5 56,5 Afvejning Figur 6: Metodesammenligning af 9 fæces prøvers resultater ved ekstraktionsmetoderne afvejning og ScheBo Quick-Prep. % Bias; % Bias 54,5; mellem afvejning og ScheBo ekstraktioner 52,3 % Bias; 61; 9,0 % Bias; 263; 20,2 % Bias; 54,5; 67; -2,2-5,5 % Bias; 71,5; - 16,8 % Bias; 200; - 25,5 % Bias; 92,5; - 38,9 Afvejning af ekstraktioner 881 71,5 200 % Bias; 881; 14,8 263 67 54,5 54,5 61 92,5 Figur 7: Differenceplot der viser % bias i resultaterne fra 9 fæces prøver, ved sammenligning af ekstraktionsmetoderne afvejning og Schebo Quick-Prep Korrelation: Lineær korrelation, r 2 : 0,98 Hældningskoefficient: 1,16 19

Skæring med y-akse: -19,05 Gennemsnitlig % bias : -0,2 Tabel 7: Oversigt over korrelationen i metodesammenligningen samt den gennemsnitlige % bias. Diskussion Standarder Der er valgt at beregne på absorbans-værdier, for at en sammenligning med Bühlmann var mulig. Hvis der ses på standarddeviationen, indikerer disse at der ikke er en stor spredning, af absorbansværdierne målt, i forhold til middelværdien. Denne er dog stigende fra den lave kal A til den høje kal E, hvilket kan indikere at når absorbans-værdierne, når op omkring måleintervallets endepunkt på 1800 µg/g, så vil der være en større usikkerhed på resultaterne. En sammenligning af CV % absorbans-værdierne, med Bühlmann [Bilag 1] viser at der er over 20 % til forskel i målingerne. Der blev ved analyseringerne, ved brugen af lot nummer 1945, ændret i acceptgrænsen for kal E, da absorbans-værdien for denne, lå for lavt i forhold til acceptgrænsen [19]. Dette menes at være fordi dette kit blev doneret til afdelingen, da der var tvivl om kvaliteten af vakuumpakningen af mikrotiterpladen [9]. Hvis der til en sammenligning med absorbans-værdierne med Bühlmann [Bilag 1] fjernes resultater for serier med brug af lot nummer 1945, ser resultaterne anderledes ud, se tabel 8 nedenfor. Standarder CV [%]O.D. CV [%] O.D. Bühlmann Cal A 4,2 4,2 Cal B 2,7 4,7 Cal C 0,4 4,9 Cal D 3,3 4,5 Cal E 4,5 5,9 Tabel 8: Resultater på standarder ved fjernelse af absorbans-værdier (O.D.) for lot nummer 1945. Der ses en sammenligning af Bühlmann s CV % på absorbansen (O.D.) samt CV % beregnet på absorbansen ved kørsel på BEP 2000 Køge. Disse resultater af CV % kan accepteres da serierne, beregninger er fortaget på, blev accepteret indenfor måleintervallet. 20

Dette stemmer overens med fundet da et brud på vakuumpakningen kan betyde at coatingen på indersiden af brøndende går tabt og at der derfor ikke bindes lige så meget calprotectin. Korrekthed Metodesammenligning med Randers Metodesammenligning af f-calprotectin analysen, mellem BEP 2000 på Randers, og BEP 2000 på Køge, undersøges med henblik på at kunne implementere analysen. Korrelationen på sammenligningen viser at R 2 =0,96, hvilket betyder at målingerne på BEP 2000 i Køge og Randers stiger sammen. Dette betyder at der er en god overensstemmelse i resultaterne. Der blev beregnet en 0,3 % bias på sammenligningerne af ekstrakterne fra Randers. Dette udtrykker at BEP 2000 på Køge i gennemsnit, på de 25 prøver, har målt en lidt højere koncentration i prøverne end Randers. Ved valideringen af BEP 2000 på Randers [12], blev der fundet en 7,9 % forskel i målingerne ved en sammenligning med BEP 2000 på Hvidovre. Forskellen i % bias fra dette forsøg og fra Randers validering [12] kan være grundet, forskellen i antal af prøver benyttet i forsøget. Randers har benyttet otte prøver [12], hvor der til dette forsøg blev benyttet 25 til sammenligningen. Dette kan have en betydning for, hvorfor der her ses en lavere % bias. En metodesammenligning bør ske på baggrund af 30-50, prøver som dækker hele måleområdet [11]. Det vurderes at en medtagelse, af omkring ti prøver mere, ikke vil have en stor nok indvirkning på resultatet. Randers [12] har fastsat et krav om en % bias på 7 % og da den i dette forsøg er beregnet til 0,3 % kan dette accepteres. Præcision Intramediære præcision Den intramediære præcision, viser intra-assay variationen for en serie. Denne bruges til at vurdere variationen på samme serie, på benyttede reagenser eller måleapparat. Den intramediære præcision er i dette forsøg beregnet til en middelværdi på 6,2 %, hvorimod Bühlmann har en CV % på 4 % [14]. Forskellen i CV % kan skyldes at der i dette forsøg blev lavet fem dobbeltbestemmelser ved hvert koncentrationsniveau, i forhold til Bühlmann der har beregnet ud fra 20 21

dobbeltbestemmelser [14]. Ydermere er der ved den høje koncentration, medtaget værdier over måleintervallet. Der bliver altså set en 2 % variation fra producentens beregnede CV %, hvilket kan skyldes den høje pool, hvor der ses en CV % på 10,2 % samt en middelværdi der ligger over måleintervallet. Intermediære præcision Den intermediære præcision, viser dag-til-dag variationen på analysen. Dette bruges til en vurdering af hvor stor en variation, i resultater der er ved målinger over flere dage. I dette forsøg ligger CV % på 32,8 %. Dette er udregnet på gennemsnittet af CV % værdierne for målinger på tre pools, med koncentrationer på henholdsvis lav, middel og høj. Bühlmann har en intermediære præcision, udregnet på baggrund af fem prøver, med forskellig koncencentrationer indenfor måleintervallet, hvor gennemsnittet af CV % er 10,6 % [14]. Randers havde i et lignende forsøg fået en gennemsnitlig CV % på <15 % [12]. Denne store forskel i resultatet af CV % kan skyldes mængden af serier der er målt over. I dette forsøg blev der målt på seks forskellige serier, hvor Bühlmann og Randers havde målinger over ti serier [12,14]. CV % ved den høje koncentration ligger på 83,2 %, dette høje tal kan skyldes, at der er medtaget værdier over måleintervallet i beregningerne. Resultatet af beregningerne er med en CV %, der er forhøjet med næsten 20 %, i forhold til Randers er ikke acceptabel. Der er i forsøget ikke taget højde for variationerne, disse er derfor heller ikke en del af beregningerne. Der blev blandt andet benyttet tre forskellige lot numre, hvilket også betyder en variation af kalibratorer og kontroller, så resultatet af dette forsøg er ikke brugbart til en validering. Pools benyttet til intermediære og intramediære præcision Pools til analysering af den intermediære og Intramediære præcision blev blandet af ekstraktioner fra fire forskellige prøver med kendt værdi. Der blev ikke tænkt over sammensætningen af disse, så den oprindelige værdi kan ikke fastslås. Efter de første to analyseserier, blev middel og høj, vurderet til at være for høje i koncentrationen. Dette blev forsøgt rettet, ved at fortynde med niveauet lavere men den høje pool havde stadig en alt for høj koncentration, i forhold til måleintervallet. Forsøget bør derfor laves om, inden ibrugtagelse af analysen, med en koncentration imellem 1200-1300 µg/g på den høje pool. Målinger over ti serier bør også laves, for at sikre at analysens variation kan accepteres. 22

Kontroller Kontrollerne fra Bühlmann calprotectin ELISA kittet (14), blev analyseret på otte serier i alt. Dette gav med kontrollen Low en CV % på 6,6 %, i forhold til koncentrationen givet fra Bühlmann [Bilag 1], hvor der med to målinger på kontrollen er en CV % på 6,2 % (14). Kontrollen High gav en CV % på 3,6 % i forhold til koncentrationen fra Bühlmann [Bilag 1], hvor der med to målinger på kontrollen er fået en CV % på 0,6 % (14) Yderligere er der fra Bühlmann opstillet et spredningsinterval for hvor meget kontrollerne må variere i µg/g [Bilag 1]. Resultaterne for dette forsøg viste en middel værdi på henholdsvis 108,2 µg/g på Low og 395,8 µg/g på High. Dette er i sammenligning med Bühlmanns spredningsinterval, på henholdsvis 60-156 µg/g for Low og 321-597 µg/g for High, indenfor intervallet. Ved analysering af kontrollerne Low og High blev der fundet en CV % på henholdsvis 6,6 % for den lave og 3,6 % for den høje. Dette er beregnet ud fra otte serier, hvor der på Randers blev beregnet en gennemsnitlig CV %, på 5,10 % for den lave og 4,62 % for den høje, ved 91 målinger [12]. Randers [12] har et acceptkrav på kontroller med en CV % på 20 og resultater fra dette forsøg kan derfor accepteres. Eksterne kontroller Eksterne kontroller benyttes, som en sikring af kvaliteten på tværs af sygehuse. Middelværdien af % bias for de eksterne kontroller ligger på -25,3 %. Dette betyder at analyseringen med Bühlmann ELISA metoden på BEP 2000, måler 25,3 % lavere end den samlede middelværdi, fra målinger på andre laboratorie med samme analysemetode. Randers [12] har, ud fra en ekstern kontrol, analyseret flere gange, fundet en CV % på 12 %. Hvis der sammenlignes med de fire analyserede eksterne kontroller, der kun blev analyseret en gang, så kan der stadig ses en for høj CV %, da de enkeltvis lå over 20 %. Metodesammenligning af ekstraktioner Der blev, med henblik på en udskiftning af ekstraktionsmetoden afvejning til ekstraktion med ScheBo Quick-Prep, opsat et metodesammenlignings forsøg. Det var forventet at der ville ses en stor variation i resultaterne, da Randers allerede har afprøvet denne og frarådede at denne blev brugt [9]. 23

Metodesammenligningen af ekstraktionerne, ved henholdsvis afvejning og ScheBo Quick-Prep, viser dog en korrelation på R 2 =0,98, Hvilket betyder at der er en rigtig god overensstemmelse mellem resultaterne. Der ses en -0,2 % bias ved brug af ScheBo Quick-Prep, fremfor afvejning som ekstraktionsmetode. Dette er et udtryk for at ScheBo Quick-Prep, i gennemsnit på de ni prøver der blev analyseret, målte en lidt lavere koncentration end ekstraktionerne med afvejningsmetoden. Der bør udføres yderligere forsøg med ekstraktionsmetoderne, da ni prøver ikke er tilstrækkelige data. Ekstraktionssammenligningen viser en god sammenhæng i resultaterne. Der er dog ikke tilstrækkeligt med data i dette forsøg, til at kunne bekræfte om ScheBo Quick-Prep kan indføres. Der er ingen publikationer hvor brug af denne ekstraktionsmetode er beskrevet. En fuld validering af ekstraktionsmetoden ScheBo Quick-Prep, kunne derfor blive en nødvendighed. Alpco [21] anbefaler primært ScheBo Quick-Prep, hvis der er mange prøver der skal ekstraheres, samt til fæces-prøver med fast konsistens, da der er minimalt tidsbrug samt en bedre ekstraktions effektivitet. Dette er i forhold til ekstraktioner fortaget med Smart-Prep, hvor Bühlmann calprotectin ELISA ekstraktionsbuffer anvendes [22]. Holdbarhedsforsøg på ScheBo Quick-Prep Holdbarhedsforsøget af ScheBo Quick-Prep, havde ikke tilstrækkelig data til at der kan udregnes en T-test. Dette skyldes delvist at der ikke kunne afpippeteres væske fra prøven, hvilket menes at kunne undgås ved at ekstraktionerne bliver centrifugeret ved højere hastighed eller i længere tid. Yderligere var målingerne for 48 timer ikke brugbare, da der blev byttet rundt på reagenserne inden opsæt på BEP 2000. Dette kan undgås fremover med en procedure-beskrivelse på afdelingen, hvor der tilføjes et tjek af rækkefølgen på reagenser før analysering påbegyndes. Meningen med dette forsøg var at finde ud af, om kvaliteten af ekstraktionsbufferen forringes, ved opbevaring ved stuetemperatur. Dette er med henblik på om patienterne, i hjemmet, kan benytte denne til opsamlingen af fæces, uden at den skal opbevares i køleskabet frem til afsendelse. Yderligere bør en indberegning af transporttiden, for at prøven når frem til afdelingen laves. Røseth AG [7] benyttede i et forsøg en Tris-buffer saline, til ekstraktionen, og lod prøverne stå ved 20 C i en uge. Målinger blev foretaget ved start, med friske prøver, efter 48 timer og efter syv dage. Der blev observeret et signifikant fald i koncentrationen på 17,5 % efter 48 timer, men da der blev målt efter syv dage, var koncentrationens variation mindre end 1 %, sammenlignet med startkoncentrationen. Der blev konkluderet at fæces var stabil i en uge i denne buffer ved 20 C. 24

Sammenligning af Quantum Blue med BEP 2000 Advance Det var ikke muligt at få tilstrækkelig data til at lave en sammenligning af hurtigtesten Quantum Blue og BEP 2000 Advance. Quantum Blue analyserer med et måleinterval på <100 µg/g til >1800 µg/g [11], i forhold til ELISA måleintervallet på <30µg/g til >1800µg/g [19]. ScheBo Quick-Prep ekstraktionerne der var benyttet til dette forsøg, var ikke lavet på prøver med en kendt koncentration, og der blev ved analysering på BEP kun fundet tre ekstraktioner med værdier over 100 µg/g. Brugen af Quantum Blue apparatet er forholdsvis let. Der er dog et tidsinterval da prøven, efter blanding af ekstraktionen med Chase-bufferen, skal hvile i 10 minutter for at blive overført til test-kassetterne. Herefter skal denne stå i 15 minutter før der kan aflæses. Lobatón T [23] sammenlignede Quantum Blue fra Bühlmann med Calprotectin ELISA, dette gav en korrelationskoefficient på 0,911. Der konkluderes at der var en god korrelation imellem resultaterne for disse metoder og at den ville være nyttig i en klinisk praksis. Bühlmann [11] har sat korrelationskoefficienten for en metodesammenligning af Quantum Blue calprotectin High Range kit[11] med Bühlmann calprotectin ELISA [19] til 0,86-0,93. Dette vil i sammenligning med Lobatón T [23] antyde at der ligeledes i dette forsøg, kunne have været gode fund, hvis der var blevet målt på ekstraktioner med en højere værdi, eller hvis der var benyttet low range kittet. Andet Analyseringen af calprotectin på biokemisk afdeling, Køge skal erstatte behovet for at sende prøver til Randers, uden at der ændres i referenceintervallet, i forhold til svarudgivelse. Dette betyder at der er dele af valideringskriterierne, der kan anvendes fra Randers validerings rapport [13], samt Bühlmann calprotectin ELISA kittet s egen validering [14], på biokemisk afdeling, Køge. Der er løbende vurderet på resultaterne fra analyseringerne, hvilket har betydet ændringer af procedurer. Blandt andet blev der, efter en række målinger på samme ekstraktion, set en forskel i resultaterne. Dette blev vurderet til at være mangel på homogenisering, af reagenser og prøver før brug. Rettelse af proceduren, blev fortaget ved efterfølgende analyseringer. En beskrivende procedure på afdelingen ville hjælpe på undgåelse af disse problemer. Yderligere er der manglede resultater, der først blev vurderet til at skyldes bobler i prøvens overflade. Der blev efterfølgende udført tjek af prøver før hver analysering, men fejlen blev stadig set. 25

Efter grundige overvejelser af dette, blev der vurderet at dette kunne skyldes at centrifugeringen af prøverne ikke var tilstrækkelig. En forøgelse af centrifugeringstid eller hastighed, ville måske kunne gøre at fejlen undgås. Der anbefales dog en yderligere undersøgelse af dette. Der er skiftet imellem tre lot numre, løbende imellem analyseringerne. Dette er der ikke taget højde for i alle resultaterne, men dette kan have været medvirkende til en større variation i resultaterne. Randers [13] har fundet en lot til lot variation på 2 %, indeholdende kalibratorer, hvilket betyder at en nærmere undersøgelse af dette burde have været taget i betragtning. Økonomi Der vil, ved implementeringen af calprotectin analysen på Køge biokemisk afdeling, kunne ses en udgift i form af indkøb af materiale til analyseringen. Dette vil være henholdsvis for hvert Bühlmann calprotectin ELISA kit, som kan analysere optil 84 patientprøver ved enkeltbestemmelse per mikrotiterplade, omkring 4000 kroner [9]. Dette indeholder ekstraktionsbuffer til ekstraktion af fæces med afvejning. Hvis der bliver valgt et skift fra afvejningsmetoden til ScheBo Quick-Prep vil en yderligere udgift på 15 kroner [9] per ekstraktion, være forventet. Der vil være en en-gangs udgift på indkøb af udstyr, for at kunne udføre ekstraktionsmetoden afvejning på afdelingen. Denne kræver at der forefindes et stinkskab, præcisionsvægt samt eventuelt en centrifuge. Dette udstyr er ikke tilgængeligt på afdelingen og skal derfor installeres efterfølgende. Dette vil også have betydning for afdelingens pladsudnyttelse. For gastroenterologiske afdelinger i regionen, vil implementeringen af denne analyse kunne betyde en, estimeret, halvering i omkostningerne, for hver analysering af calprotectin der skal foretages [24]. Dette kan dog blive omregnet efter valg af ekstraktionsmetode. Etik For at diagnosticere, og skelne patienter med IBD, kan det blive nødvendig med en endoskopi eller biopsi af tarmen. Dette er til gene for patienterne [5] Fæces-calprotectin analysen er, ifølge Smith LA [1], Rheenen PFV [3] og Jahnsen J [8] en pålidelig markør til at bestemme sværhedsgraden af inflammationen, monitorering af behandling samt til at vurdere, om der er behov for invasive undersøgelser af patienterne. Hvis man ser på dette ud fra Kants pligtetik [25] skal mennesket ses som et mål og ikke blot et middel. Altså skal patienternes velbefinde vægtes højt, i forhold til metodeudviklingerne til sygdomsvurdering. Fundet af 26

calprotectin og brugen af den til vurdering af behov for endoskopi, er altså ifølge denne etiske retningslinje, en yderst tiltrækkende analyse. Når en læge modtager en patient med symptomer på IBD, bør der handles ud fra pligtetikken. Læger bør kun udsætte patienten for invasive undersøgelser, hvis dette er af yderste nødvendighed. Der kan her også henledes til brug af dydsetikken [25], hvor der lægges vægt på en vurdering af sygdomsbilledet, med brug af både en teoretisk viden og praktisk erfaring. Da lægerne har speciale indenfor gastroenterologi kan den praktiske erfaring, sammen med vurderingen af resultater fra analysering af calprotectin, betyde en yderligere reducering af invasive undersøgelser. Sensitivitet og specificitet Sensitiviteten og specificiteten fortæller hvor god en analyse er til at skelne de raske fra de syge. Bühlmann [15] har fundet at, en grænseværdi på 50 µg/g betyder en sensitivitet på 84,4 % og en specificitet på 94,5 %, til at differentiere mellem en organisk og en funktionel sygdom. Dette er vigtigt da patienterne, har en 84,4 % chance for at en eventuel sygdom bliver opdaget ved denne analyse. Denne procentdel bør, etisk set ønskes forbedret da dette antyder, at der stadig er 15,6 % patienter der ikke diagnosticeres. Konklusion Der blev fundet en god sammenhæng i resultaterne, ved analysering på ekstrakter fra Randers. Dette kan henledes på en korrekthed i målingerne, ved brug af BEP 2000 på henholdsvis Randers og Køge. En implementering af f-calprotectin på biokemisk afdeling i Køge, ved brug af BEP 2000 ville derfor kunne lade sig gøre. En udskiftning af ekstraktionsmetode kan på nuværende tidspunk ikke anbefales. Selvom sammenligningen viste en god sammenhæng er dette ikke baseret på et tilstrækkeligt antal prøver. Ydermere er der ingen publiceringer om brugen af ScheBo Quick-Prep til at verificere brugen heraf. Der kan ikke, på baggrund af denne delvise validering, bekræftes brugen af Bühlmann calprotectin ELISA kittet på BEP 2000 til en implementering af f-calprotectin analysen på Biokemisk afdeling, Køge. Yderligere kan der ikke fuldt begrundes en udskiftning af ekstraktionsmetode, eller brugen heraf til måling på Quantum Blue, da data var utilstrækkeligt. Anbefaling til Biokemisk afdeling Køge vil være at lave en fuld validering fra starten. 27

Perspektivering Hvis der havde været mere tid og flere ressourcer, var mange af forsøgende lavet om, efter resultatvurderingerne. Der var for mange variabler og en eventuel yderligere opdeling af forsøgene, kunne hver for sig, og med brug af mere tid, have betydet at der var undgået mange af fejlkilderne. Yderligere kunne opstillingen af forsøg, med hensyntagen til lot skifte, have givet valide resultater. Der er i denne rapport undersøgt brugen, af nyere elementer til udførelsen af f-calprotectin analysen. ScheBo Quick-Prep ville ifølge Alpco [21] ikke egne sig til ekstraktion hos patienten da den fungerer bedst i fast afføring. Patienterne der skal have analyseret calprotectin, kan have diarre hvilket betyder at fæces er delvist eller helt flydende. Fæces opsamlingen med ScheBo Quick-Prep, kan derfor måske have en indflydelse i målingerne, da rillerne ikke er effektive til opsamling af flydende væske. Dette ville gøre, at brugen af den stadig skal forgå på biokemisk afdeling, inden analyseringen fortages, og det ville derfor være en unødig udgift. En nyere ekstraktions anordning fra Bühlmann, som er en videreudvikling af ScheBo Quick-Prep, er i øjeblikket på vej mod produktionsfasen. Denne anordning kaldes Calex og har samme opsamlings princip som ScheBo Quick-Prep, med opsamling af fæces i riller på en pind. Denne har dog den ekstra funktion, at når den lukkes, så kan enden med pinden på, ikke tages op igen. Der findes dog ingen litteratur om den endnu, så denne kunne også være en eventuel mulighed at teste på afdelingen, når den udgives. Det kunne tænkes at ekstraktions-bufferen i Calex er anderledes fra de tidligere produkter. Da det er en videreudvikling kan et nyt holdbarhedsforsøg til sammenligning af Calex og ScheBo Quick-Prep måske vise om der er sket en udvikling af bufferen såvel som udseendet. En buffer der er holdbar i flere dage ved stuetemperatur, vil være en foretrukket metode da en ekstraktion, allerede hjemme hos patienterne, kan spare afdelingen, for ressource brug til udstyr. Så frem prisen er billigere end ved brugen af ScheBo Quick- Prep vil dette også have sin fordel. Quantum Blue som måleapparat til en biokemisk afdeling vil heller ikke være at anbefale endnu, da den ikke dækker hele det ønskede måleinterval. Der skal derfor indkøbes to forskellige kits med henholdsvis low og high range for at dette kan dækkes. Yderligere skal analyseres på en ekstraktion to gange hvis denne falder udenfor det individuelle måleinterval. Dette vil både være tidskrævende og dyrt på længere sigt. Kunne der udvikles et POCT udstyr der målte indenfor måleområdet på 30-1800 µg/g ville dette måske være af interesse. 28