Kvalitetssikring af trombocytpools mht. AB0-systemets kliniske betydning

Transkript

1 Kvalitetssikring af trombocytpools mht. AB0-systemets kliniske betydning Professionsbachelorprojekt 2012 Bioanalytikeruddannelsen VIA university college Produceret af Nanna Haahr Vorsaa (99906) I perioden 8/10 19/ K-vejleder: Margrethe Emilie Nielsen I-vejleder: Karen Koed Antal tegn:

2 Indhold 1. Forord Resume Introduktion Baggrund og formål Problemformulering Målformulering Teori Trombocytter Fremstilling af trombocytpool og udlevering Aferese trombocytter Kvalitetssikring af trombocytter ABO-systemet Transfusionskomplikationer Børn og blodvolume Antistof titer og graduering Glas- og gelmetoden Materialer og metoder Apperatur/utensilier Reagenser Fremgangsmåde ved fremstilling af A 1 testerytrocytter 1 % og 5 % Fremgangsmåde ved 1:50 fortyndingen i gelkort Fremgangsmåde ved titreringsrækken i gelkort Fremgangsmåde ved titreringsrække i glas Data behandling Resultater Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 1 af 33

3 6.1. Rådata kontroller Fortyndingen 1: Titreringsrækken ved gel og glas teknikken Diskussion Kvalitetssikring og overholdes af Europarådets vejledning Forskellen mellem de to teknikker og metoder Fordele og ulemper ved de 2 metoder Transfusionskomplikationer og børn Aferese trombocytter vs. TRPs Kontroller Fejlkilder Konklusion Perspektivering Reference Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 2 af 33

4 1. Forord Dette projekt er opstået efter interessen for titerværdierne for anti-a i trombocytpools og disses indflydelse på komplikationer ved transfusioner til børn under 6 år. Projektet er produceret på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby. Personalet i fraktionering skal have en stor tak for at ville tage prøvemateriale fra til os i perioden og Mikkel S. Petersen skal have stor tak for at finde statistikken omkring transfusion af trombocytpools til børn under 6 år til os. Også en stor tak til vejlederne, de har været en rigtig stor hjælp under hele projektet og rapportskrivningen. Det har været en stor hjælp at kunne snakke med jer om tanker og ideer. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 3 af 33

5 2. Resume Ifølge Europarådets anbefalinger, må der maksimalt være en titer på 1:50 for anti-a og anti-b i plasma. Dette er også gældende for trombocytpools (TRP) da disse er plasmaholdigte produkter. På nuværende tidspunkt undersøges der ikke for anti-a eller anti-b i TRPs, på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby. Der udleveres 0-TRPs til både børn og voksne med blodtype A eller B, selvom hovedreglen for børn er, at der skal udleveres TRPs efter barnet blodtype, hvis dette er muligt. Ved undersøgelse af titerværdier på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, anvendes der på nuværende tidspunkt gelkort med coombs anti-igg, hvor der tidligere blev anvendt glasmetoden, både med og uden anti-igg. I dette forsøg analyseres der på 60 TRPs, disse analyseres ved fortyndingen 1:50 og opdeles i positive og negative. Der analyseres yderligere på de positive prøver ved, at fremstille en titreringsrække, så der kan bestemmes en endelig titerværdi. Denne titreringsrække analyseres med gelkort med indirekte agglutinationsteknik (IAT) og med glasmetoden med direkte agglutinationsteknik (DAT). Dette gøres for at bedømme om begge metoder er anvendelige og giver ens resultater. I første del af forsøget blev der fundet 53 positive og 7 negative ud af de 60 TRPs, hvilket svare til, at der er 88,33 positive prøver ved fortyndingen 1:50. Andet del af forsøget vidste at titerværdierne analyseret med DAT ved glasmetoden gav værdier mellem 1:4 og 1:64, og titerværdiente analyseret med IAT ved gelkort gav værdier mellem 1:32 og 1:2048. Der ses, at der er en meget signifikant forskel på værdierne fundet ved de to teknikker og metoder. Ved DAT (glas) er der 98,11 % der har en titerværdie under de 1:50 og ved IAT (gelkort) er der 11,32 % der har en titerværdi under de 1:50. Hvis der anvendes gelkort med coombs anti-igg, vil det ikke være muligt at overholde Europarådets anbefalinger med en max titerværdi på 1:50, dette vil kun være muligt, hvis der anvendes glasmetoden med DAT. Sensitiviteten tegner dog til at være bedre på gelkortene og disse vil derfor give de bedste resultater og de bedste kvalitets produkter til patienterne. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 4 af 33

6 3. Introduktion 3.1. Baggrund og formål Der findes flere forskellige blodtypesystemer, og AB0-systemet er et af de klinisk mest betydningsfulde i forbindelse med blodtransfusion. Indenfor AB0-blodtypesystemet findes fire forskellige blodtyper; A, B, 0 og AB. Blodtypen er bestemt ud fra A- og B-antigener repræsenteret på organismens celler. Hvis der kun findes A-antigener på erytrocytternes overflade er man blodtype A. Blodtypen nedarves fra ens forældre, hvor A- og B- egenskaberne nedarves kodominat. For at have blodtypen 0, skal man have arvet 0- genotypen fra begge forældre. Man har antistoffer rettet mod de antigener, man ikke selv har repræsenteret på overfladen af erytrocytterne. Antistofferne er naturligt forekommende (regulære) og derfor ikke dannet ved immunisering (1). Blodprodukter udleveres som hovedregel typespecifikt, men der kan opstå akutte situationer, hvor recipientens blodtype ikke er kendt, og man derfor skal udleverer universalprodukter. 0-Erytrocytter, 0-TRC og AB-plasma anses som universalprodukter, da de enten ikke har AB-antigener repræsenteret på celleoverfladen eller anti-a og anti-b i plasma (1). Trombocytpools (TRPs) fremstilles ud fra fire buffy-coats af samme AB0-type og 300 ml SSP+ (se bilag 1 for indhold). En buffy-coat indeholder leukocytterne, trombocytter (TRC) samt erytrocytter og plasma. Den færdige TRP er leukocytdepleteret, der er dog stadig op til 80 ml plasma (evt. indeholdende anti-a og anti-b afhængig af blodtype) i TRPen. På grund af det tilbageværende plasma, vil der i universal-trps altid forekomme anti-a og anti-b. Hvis en 0-TRP transfunderes til en recipient med blodtype A, vil anti-a kunne reagere med recipientens erytrocytter, hvorved disse destrueres vha. komplement-aktivering (1). Europarådet har opstillet en anbefaling vedrørende titerværdien for anti-a og anti-b i plasma/serum. Titerværdien angiver den højeste fortynding, hvor der stadig ses agglutination. Anbefalingen lyder, at titerværdien maksimalt må ligge på 1:50. Hvis titerværdien ligger over 1:50 anses type 0 plasma/serum at have høj risiko for at medfører akut hæmolytisk transfusionsreaktion (AHTR) ved recipienter med blodtypen A, B og AB (2). Titerværdien udtrykker ikke direkte styrken af et anti-a, så derfor kan der udregnes en score, hvor de enkelte gradueringer får tildelt en specifik værdi, der til sidst summeres til den endelige score. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 5 af 33

7 Grunden til at Europarådets anbefalinger har betydning for dette projekt skyldes som før nævnt, at der findes plasma i alle TRPs, og at der derfor altid findes anti-a og anti-b i 0- TRPs, der anses for at være universal-trps. Af anti-a og anti-b er det typisk anti-a, der forårsager AHTR (3). På nuværende tidspunkt undersøges der ikke for titerværdien i 0- TRPs på Klinisk Immunologisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital, Skejby. På afdelingen udleveres TRP til børn under 6 år typespecifikt i henhold til de nuværende retningslinjer. Dog kan der opstå situationer, hvor typen ikke kan matches enten på grund af manglende lagerbeholdning eller manglende blodtypeinformationer. I disse tilfælde er retningslinjerne, at der transfunderes 0-TRPs (4). I 2010 rapporterede Josephson et al. (3) om et dødsfald på et 8 måneder gammel spædbarn, med blodtypen A, efter en transfusion med 0-TRP. Ydermere rapporteres der om en transfusionskomplikation ved et 3 måneder gammel spædbarn med blodtypen A, som har fået transfunderet 0-TRP med en titerværdi mindre end 1:20. Denne viden indikerer vigtigheden af en lavere titerværdi i 0-TRP til spædbørn med anden blodtype. Cooling et al. (5) har i 2008 udarbejdet et studie, der undersøger titerværdierne ud fra to forskellige analyseteknikker (direkte agglutinationsteknik i glas og i gelkort). Studiet viste, at gelmetoden var mere sensitiv og påviste højere titerværdier end glasmetoden. Formålet med projektet er at højne kvaliteten af proceduren for fremstilling og udlevering af TRPs til børn og på den måde højne kvaliteten af TRPen. Derudover finde ud af, om retningslinjerne for brug af 0-TRPs til børn med anden blodtype skal revideres. Endvidere forsøger projektet at belyse, om det er muligt at overholde Europarådets anbefalinger og finde ud af om anbefalingerne er for kritiske i forhold til de nuværende analysemetoder Problemformulering Hvordan overholdes Europarådets anbefalinger for udlevering af 0-trombocytpools til børn under 6 år og i forhold til den analytiske sensitivitet af laboratoriets to anvendte metoder; direkte agglutinations teknik i glas og indirekte agglutinations teknik udført i gelkort? Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 6 af 33

8 3.3. Målformulering - Indsamlingen af prøvematerialet (0-trombocytpools) sker løbende under fremstillingen i den daglige rutine på Klinisk Immunologisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital, Skejby. - Vi vil undersøge, om titerværdien for anti-a er afhængig af, om der anvendes indirekte agglutinations teknik (IAT) i gelkort tilsat Coombs anti-igg eller direkte agglutinationsteknik (DAT) i glas uden hjælpeantistof. - Vi vil analysere ca trombocytpools ved at fremstille en 1:50 fortynding og undersøge om de er positive eller negative for anti-a vha. IAT i Coombs anti-igg gelkort - Vi vil videreanalysere på de positive prøver ved at fremstille en titreringsrække og foretage DAT og IAT for at bestemme titerværdien af anti-a i de enkelte trombocytpools. - Vi vil ud fra resultaterne beregne den procentvise andel af positive prøver ved fortyndingen 1:50 og derudfra vurdere, om Europarådets anbefaling bliver overholdt. - Vi vil sammenligne resultaterne for DAT og IAT og derved undersøge, om der er en signifikant forskel på de to teknikker i forhold til scoreværdierne. - For at få viden omkring hvor mange trombocytpools, der udleveres til børn under 6 år samt hvor mange 0-trombocytpools der udleveres til børn under 6 år med anden blodtype, vil vi forsøge, at få udtrukket statistik fra blodcenter midt i perioden 2011 og Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 7 af 33

9 4. Teori 4.1. Trombocytter Trombocytter, også kaldet blodplader, er små kerneløse partikler. Trombocytter dannes i knoglemarven fra megakaryocytter, som afsnører små pakker af deres cytoplasma. En megakaryocyt kan danne ca trombocytter. Trombocytternes overflademembran bugter sig mange gange ind i cytoplasmaet, så der dannes mange kanaler heri, ved beskadigelse af karvæggen, hvor trombocytterne binder sig til det beskadiget område, bruges disse kanaler til at transportere trombocytternes vesikler ud i omgivelserne. Vesiklerne indeholder et stort antal vigtige biologiske stoffer. Vesiklerne indeholde bla. Adenosindifoafat (ADP), dette påvirker trombocytternes overflade så denne bliver klæbrig og de nemmere klumper sammen og danner proppen der stoppe hullet i karvæggen og dermed blødningen. Figur 1: hul i karvæggen med dannelse af trombocytprop (1). Trombocytter har en levetid på ca. 10 dage, herefter destrueres de af makrofager, dette sker først og fremmest i milten og leveren. Leveren udsender en peptidhormon kaldet trombopoietin (TPO), dette hormon styre dannelsen af trombocytter, ved at accelerere dannelsen af megakarycytter fra stamcellerne(6). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 8 af 33

10 Trombocytter er vigtige i forbindelse med hæmostasen. De er også aktive i bekæmpelse af infektioner. Behandlingen med trombocytter sker for at nedsætte risikoen for blødning eller at standse en igangværende blødning, begge tilfælde forsaget af trombocytmangel (6). Trombocytopeni er et sygdoms tilfælde hvor der ikke er nok trombocytter tilstede i patientens blod til at klare de små karskader der dagligt finder sted. Grunden til denne sygdomstilstand er ofte en nedsat produktion af trombocytter pga. behandling med cellegift eller leukæmi og andre knoglemarvsygdomme(6) Fremstilling af trombocytpool og udlevering En portion blod opdeles i tre blodkomponenter. Erytrocytter, plasma og buffy-coats (koncentrat af leukocytter, plasma og trombocytter (1). Figur 2: opdeling af blodet i 3 poser (1). TRPs fremstilles af 4 buffy-coats. Disse har alle den samme blodtype inden for AB0- og rehsus-sytemet. De 4 buffy-coats samles ved hjælp af et suspensionsmedie SSP+ og centrifugeres herefter og leukocytdepleteres. Dette betyder at der fjernes ca % af alle leukocyt typer. Dette nedsætter risikoen for transfusionskomplikationer, grundet antigener på leukocytter. TRPs opbevares ved o c. Alle TRPs tjekkes for bakterier og er derfor i karantæne i et døgn efter fremstillingen. TRPs er holdbare i op til 7 dage. Derfor produceres der kun TRPs af blodtypen A og 0 på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby. Dette er fordi at der ville være et for stort spild af TRPs af blodtyperne B og AB, da der kun er 15 % af befolkningen der har denne blodtype. (7) Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 9 af 33

11 Udlevering af TRPs til børn sker som hovedregel efter deres egen blodtype. Ved tilfælde hvor dette ikke er muligt udleveres der i henhold til reglerne for normalt typeskift og her gives der som hovedregel TRP af blodtypen 0. Ved blodtypen AB, kan der dog også udleveres A eller B (4,8) Aferese trombocytter Denne metode til høstning af trombocytter benyttes hyppigst når der ønskes trombocytter med en speciel vævstype eller trombocyt typer. Her bliver der udtrukket trombocytter, udelukkende fra en donor og man opnår et produkt der indeholder op til otte gange så mange trombocytter som i en TRP. Trombocytter tappet på ved denne metode opbevares i donors plasma. (1) 4.3. Kvalitetssikring af trombocytter Alle blodkomponenter på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, kvalitetssikres. TRPs vejes og skal ligge mellem g, for at kunne være sikre på at der findes den ønskede mængde trombocytter til patienten. inden udleveringen bliver alle TRPs visuelt tjekket for følgende ting: Swirling, her skal den være positiv, aggregater, her skal den være negativ og farve, her må den ikke være rød. Bakteriekontrollen er også en del af kvalitetssikringen, her skal der være en negativ prøve før TRPen må udleveres(9) 4.4. ABO-systemet AB0-systemet er et af mange blodtype systemer, der findes 30 anerkendte systemer. Der findes derfor stor variation indenfor befolkningen i sammensætningen af blodtypeantigener på organismens celler. AB0-systemet er det mest betydningsfulde i forbindelse med blodtransfusioner. Kun i sjældne tilfælde kan man være tvunget til at hensyn til nogle af de andre systemer. AB0-systemet er antigener lokaliseret i glykoproteiner, som er fastgjort til proteiner i cellemembranden. Indenfor alle blodtyperne findes der glykoproteiner på trombocytoverfladen, men ved blodtypen A, sidder der et N-acetylgalaktosamin på glykoproteinet og ved blodtypen B, sidder der et D-galaktose på glykoproteinet. Ved blodtypen 0, findes der ikke noget ekstra kulhydrat på glykoproteinet. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 10 af 33

12 Figur 3: de forskellige antigener inden for AB0-Systemet (1). Blodtypen er arvelig, A- og B- fænotypen er kodominate og der findes derved 4 forskellige blodtyper i AB0-systemet(A, B, AB og 0). Indenfor AB0-systemet findes der som det eneste blodtype-system også A- og B- antistoffer, disse findes i plasmaet. Disse kaldes regulære antistoffer, fordi de fremkommer naturligt uden foregående immunisering. Anti-A og Anti-B, forekommer både som IgG og IgM antistoffer. Disse fremkommer ved 6 måneders alderen og individet har antistoffer rette med de antigener som individet ikke selv har. Det vil sige at er man blodtypen A, har man A-antigener og B-antistoffer (1). Figur 4: billede af de forskellige immunglobulin klasser (1) Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 11 af 33

13 4.5. Transfusionskomplikationer Hæmolytisk transfusionskomplikationer opstår typisk ved major-uforlig, men kan også opstå ved minor-uforlig, f.eks. ved transfusion med universaltrombocytter, med plasma indeholdende anti-a og anti-b. Ved transfusion med Trombocytter kan dette opstå ved, at man giver en patient med blodtypen A, trombocytter af blodtype 0 (universal trombocytter). Da der ikke findes antigener på 0 trombocytter, kan patientens antistoffer ikke bekæmpe de transfunderet trombocytter, så der opstår ikke major-uforlig, men plasmaet i TRPen indeholder anti-a som kan gå ind og bekæmpe patientens erytrocytter og dermed opstår der minor-uforlig. Dette sker heldigvis yderst sjældent, da TRPs er opbevaret i SSP+ og derfor kun indeholder minimale mængder af plasma, ca. 80 ml. Hæmolytisk transfusionskomplikationer kan forekomme på to forskellige måder. Intravaskulær eller ekstravaskulær. Intravaskulær hæmolytisk tranfusionskomplikationer betyder at erytrocytterne ødelægges i karbanen og erytrcytfragmenterne kan medfører livsfarlige nyreskader. I tilfælde med transfusion af TRPs findes der komplementbindende antistoffer rettet mod patientens erytrocytter. Komplementaktiveringen medfører en ødelæggelse at patientens erytrocytter. Patienter der rammes af intravaskulære hæmolytisk transfusionskomplikationer vil oftest opleve trykken for brystet, kulderystelser, feber, kvalme, hovedpine, rødme af huden, dyspnø, blodtryks fald og evt. hæmolytisk shock (1). Ekstravaskulær hæmolytisk transfusionskomplikationer skyldes de irregulære antistoffer fundet i plasmaet i TRP, rettede mod patientens erytrocytter. De fleste irregulære antistoffer er kun svagt eller ikke komplementaktiverende og derfor sker hæmolysen i makrofagsystemet ved fagrocytose. Derfor ses der ikke frit hæmoglobin i patientens plasma. symptomerne ved denne type af transfusionskomplikationer er kulderystelser, hæmoglobinfald, hæmoglobinuri og efterfølgende icterus (1). Transfusionsrelateret akut lungeskade (TRALS). Denne komplikation er forholdsvis hyppig og ses efter transfusioner af blodkomponenter der indeholder plasma. Denne tilstand er yderst alvorlig og kan have dødelig konsekvenser. Tilstanden skyldes ofte leukocytantistoffer (1). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 12 af 33

14 4.6. Børn og blodvolume Børn har en højere procentvis blodvolume i forhold til deres vægt, i forhold til voksne. Nedstående tabel 1 viser hvordan blodvolume i ml/kg er faldende i hele barndommen og så ligger forholdsvis stabilt ved voksne. Der er dog en lille forskel mellem mænd og kvinder som ikke er vidst i skema da forskellen er på 1 ml/kg (10). Alder Blodvolume (ml/kg krops vægt) nyfødt 83,3 1 år 80 6 år år år 71 Voksen 70 Tabel 1: blodvolumen i ml/kg (10) Nedstående tabel 2 viser den gennemsnitlige vægt for drenge, drenge vejer i gennemsnittet lige lidt mere end piger. Alder Vægt i kg (gennemsnitlig) Nyfødt 3,5 1 år 11,8 2 år 13,3 3 år 15,4 4 år 17,3 5 år 19,0 Tabel 2: viser gennemsnitsvægten for drenge på 0-5 år (11) 4.7. Antistof titer og graduering Titeren er et udtryk for antistoffet styrke, denne findes ved at lave flere fortyndinger af plasma eller andet plasmaholdigt blodkomponent, dette kaldes en titrering. Oftest anvendes en almindelig tofolds fortynding, hvor fortyndingen hele tiden fordobles: 1:2, 1:4, 1:8 osv. Titeren angives herefter som den højeste fortynding hvor der anses en positiv reaktion. Titeren kan udbygges med en score værdi, hvor man alt efter gradueringen af den enkelte fortynding giver hver positiv fortynding en værdi. Dette kan f.eks. være at en fortynding vurderes til gradueringen 4, denne får så værdien 8 og til sidste kan man lægge værdierne sammen. Dette kan gøre da to prøver godt kan have samme titerværdi, men ikke være helt lige stærke, som så ses ved scoreværdien (1). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 13 af 33

15 Graduering af antistofferne sker forskelligt afhængig af om der bruges gelkort metoden eller glasmetoden. Graduering er en bestemmelse af hvor kraftig den positive reaktion er. Graduering er en værdi fra 0-4, hvor 0 er negativ og 4 er den kraftigste reaktion. Figur 2: gradueringsprincippet for gelkort af BioRad Figur 3: gradueringsprincippet for gladmetoden 4.8. Glas- og gelmetoden Gelmetoden er den metode der bliver anvendt på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, til bestemmelse af antistoffer, blodtypebestemmelser og titerværdier. Dette gør den til et oplagt valg i forbindelse med bestemmelse af anti-a i TRPs. Til gelkortene kan der både bruges IAT eller DAT, men da de på afdelingen bruger IAT til bestemmelse af titerværdier, virker denne oplagt som undersøgelses teknik. Glas metoden er den metode der blev brugt inden gelmetoden blev indført. Til glasmetoden bruges der DAT teknik, dette skyldes sammen begrundelse som ved IAT, at det er denne som de har brugt i forbindelse med titreringer. Disse metoder bestå af en antistof/antigen binding. denne sker ved at der findes antistoffer i plasmaet i TRP og antigener på testerytrocytterne. Glasmetoden er en direkte agglutinations teknik (DAT). Dette betyder at der sker en direkte agglutination mellem antistoffet og antigenet, uden hjælp fra eventuelle hjælpemidler. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 14 af 33

16 Ved denne teknik detekteres antistoffer af klassen IgM bedst, da de er pentamer og har dermed 5 antistoffer bundet sammen som et, dermed er de store nok til at danne en bro imellem erytrocytterne og danne den ønskede agglutination. Disse antistoffer kaldes komplette antistoffer. IgG-antistoffer er derimod monomer og er for små til at danne bro mellem erytrocytterne og kan derfor ikke skabe en agglutination. Disse antistoffer kaldes inkomplette antistoffer. Gelmetoden er en indirekte agglutinations teknik (IAT). For at have en indirekte agglutination, skal man have et hjælpe middel, der kan binde til antistoffets konstante del. I dette tilfælde er det anti-igg der binder sig til IgG antistoffer og derved gør at der skabes en agglutination, ved at kunne binde flere sammen, så der dannes en bro mellem erytrocytterne (1). Figur 4: billeder viser en agglutination med i gel kort med Coombs reagens (12). Billedet viser en reaktion mellem erytrocytter med D-antigener og patient prøve med anti- D, hvor man kan se hvordan coombs reagenset går ind og hjælper til en agglutination. Det kunne også have været erytrocytter med A-antigener og en patientprøve med anti-a. Coombs reagenset består af Anti-IgG, som kan finde til antistoffer at typen IgG, de er her illustreret som gule og man ser her hvordan de kan hjælpe med at lave et netværk, så der opstår en synlig agglutination. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 15 af 33

17 5. Materialer og metoder Prøvematerialet er 0-trombocytpools, produceret på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby Apperatur/utensilier Pipetter inkl. Spidser Stativer Analyseglas Gelkortcentrifuge Inkubator Vaskeglas 5.2. Reagenser PBS 0-trombocytpools Cellstab (se bilag 2) Testerytrocytter A 1 1 % (suspenderet i cellstab) Testerytrocytter A 1 5 % (suspenderet i cellstab) Coombs anti-igg gelkort Titreringsstandard 5.3. Fremgangsmåde ved fremstilling af A 1 testerytrocytter 1 % og 5 % Pakning af erytrocytter. Der påfyldes PBS i flere vaskeglas. Derefter tilsættes der ca. 1 ml fyldblod til hvert vaskeglas og de centrifugeres herefter i 2 minutter ved 1500 RCF. Væsken suges herefter væk, så der kun er erytrocytter tilbage i glasset. Herefter tilsættes der igen PBS og centrifugeres og suges, dette gøres i alt tre gange. Alle erytrocytterne samles nu i et glas og centrifugeres en sidste gang og det overskydende væske suges væk. Nu suspenderes erytrocytterne i cellstab. Mængden at de cellstab og erytrocytter er afhængig af suspensionens koncentration. 1 % suspension: µl cellstab og 2µl pakkede erytrocytter Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 16 af 33

18 5 % suspension: µl cellstab og 10µl pakkede erytrocytter De færdige test erytrocytter, skal opbevares ved 2-6 o c og kan bruges i 4 uger efter fremstilling Fremgangsmåde ved 1:50 fortyndingen i gelkort Der udprintes 6 labels med batch nummeret for hver TRP, disse påføres prøveglasset, titreringsrækken, glasteknik rækken og de forskellige gelkort. Prøvematerialet overføres til et plastik glas. Derefter tilsættes der 196 µl cellstab til 10 glas som bruges til fortyndingen, der tilsættes så 4µl prøvemateriale til glassene og fortyndingerne blandes godt med en vortexmixer. Der fremstilles samtidig en positiv og negativ kontrol. Den positive kontrol er en 1:50 fortynding af titreringsstandarden og den negative kontrol er bare cellstab. Der skal bruges 1 brønd i gelkortet pr. prøve. Der tilsættes 50 µl A 1 1 % testerytrocytter til hver enkelt brønd i gelkortet. Herefter tilsættes der 25 µl prøvemateriale eller kontrol materiale til de enkeltbrønde i gelkortet som er mærket med prøvenummeret. Gelkortene centrifugeres herefter i 30 minuttet ved 37 o c og centrifugeres efterfølgende i 10 minutter ved 910 rpm (125 RCF). Til slut aflæses kortene for positiv eller negativ reaktion. Ved positivt resultat, laves der en titreringsrække på de gældende TRPs, ved brug af gelkort teknik og glasteknik Fremgangsmåde ved titreringsrækken i gelkort Der opstilles en titreringsrække med 10 glas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512) første glas mærkes med TRPs batchnummer. 200 µl cellstab til sættes alle glas, på nær glas nr. 1 i alle titreringsrækker. Herefter tilsættes der 200 µl prøvemateriale i glas 2, som blandes ved hjælp af vortexmixeren. Der udtages derefter 200 µl fra glas 2, som tilsættes i glas 3, som så blandes med vortexmixeren. Sådan fortsættes til sidste glas i titreringsrækken. Der laves også en titreringsrække med titreringsstandarden. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 17 af 33

19 Der bruges her ca. 2 gelkort pr. prøve, som mærkes med TRPs batch nummer. Der tilsættes 50 µl A 1 1 % testerytrocytter til de enkelte brønde i gelkortet og derefter 25 µl fra titreringsrækken til hver enkelt brønd i gelkortet, som er mærket efter titreringsrækken. Gelkortene inkubere herefter ved 37 o c i 30 minutter og centrifugeres efterfølgende i 10 minutter ved 910 rpm (125 RCF). Kortene aflæses og der bestemmes den endelige titerværdi Fremgangsmåde ved titreringsrække i glas Der bruges titreringsrækken som er fremstilt ved gelkort teknikken. Der udtages 100 µl fra titreringsrækken til 10 nye glas som er mærket med batch nummeret fra TRP og den pågældende fortynding. Der tilsættes 50 µl cellstab til hvert glas og herefter 50 µl A 1 5 % testerytrocytter. Glassene oprystes og inkuberes ved 37 o c i 30 minutter. Prøverne aflæses og der findes den gældende titerværdi Data behandling Alt data behandling foregår i Excel. Der er en tabel for resultaterne ved fortyndingen 1:50 og lavet en procentvis udregn af positive og negative prøver. Der er fremstillet tabel til indsættelse gradueringerne og scoreværdierne, samt de endelige resultater for titerværdierne og samlet scoreværdi. Der er lavet et samlet søjlediagram over de endelig titerværdier for de 2 anvendte metoder, dette er gjort ved at anvende formlen Tæl.hvis i Excel som tæller antallet af en given værdi. Der er produceret tabeller til indsættelse af de daglige kontrol værdier. Der er yderligere fremstillet et differenceplot ved hjælp af Excels punkt diagram. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 18 af 33

20 6. Resultater 6.1. Rådata Bilag 3: fortyndingen 1:50 Bilag 4: titreringsrækken Bilag 5: kontroller Bilag 6: transfusions data af TRP 6.2. kontroller Der er dagligt analyseret på positive og negative kontroller i forbindelse med fortyndingen 1:50, dette for at sikre sig at metoden virker og resultaterne er brugbar. Den positive kontrol gav dagligt 3 og den negative kontrol blev altid negativ. Der er dagligt analyseret en kontrol titreringsrække for hver metode og denne har givet titerværdien 1:32 for glas teknikken og titerværdien 1:512 for gel teknikken Fortyndingen 1:50 antal positive 53 negative 7 samlet 60 Tabel 3: antal prøver analyseret ved fortyndingen 1:50 i Coombs anti-igg gelkort, fordelt i positive og negative. procent positive 88,33 procent negative 11,67 Tabel 4: procentvis fordeling af de positive og negative prøver ved fortyndingen 1:50 Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 19 af 33

21 Gelmetoden - glasmetoden hyppighed Nanna Haahr Vorsaa 19. December Titreringsrækken ved gel og glas teknikken 25 titerværdier med cut-off gel teknik glas teknik titerværdi Figur 5: samlet graf over titreringsværdierne ved de 2 metoder. Den røde streg indikerer titerværdien 1:50. Gel teknikken procent over fortyndingen 1:50 88,68 procent under fortyndingen 1:50 11,32 Tabel 5: viser den procentvise fordelingen med titerværdierne over og under fortyndingen 1:50 Glas teknikken procent over fortyndingen 1:50 1,89 procent under fortyndingen 1:50 98,11 Tabel 6: viser den procentvise fordelingen med titerværdierne over og under fortyndingen 1: Differensplot over scoreværdierne Middelværdi Figur 6: differensplot, der viser forskellen mellem de opnået scoreværdien, ved de 2 metoder. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 20 af 33

22 Hypotesen: t-test: Parvis dobbelt stikprøve for middelværdi H 0 : gelteknik = glasteknik H 1 : Gelteknik glasteknik Variabel 1 Variabel 2 Middelværdi 37, ,11321 Varians 34, ,98694 Observationer Pearson-korrelation 0, Hypotese for forskel i middelværdi 0 fg 52 t-stat 33,10633 P(T<=t) to-halet 1,28E-36 t-kritisk to-halet 2, Tabel 7: viser udregningen af T-testen fremstillet ved hjælp af Excel formler. T-testen er beregnet ud fra prøvernes scoreværdi. T-stat er t-test størrelsen og t-kritisk to-halet er den maksimale værdi for t-test størrelsen hvis H 0 skal accepteres. antal procentvis Patient og TRP blodtype ens ,86 Patient blodtype A - TRP blodtype ,64 Patient blodtype B - TRP blodtype ,36 Patient blodtype AB - TRP blodtype A 1 0,57 Patient blodtype AB - TRP blodtype 0 1 0,57 Udleveret TRPs i alt ,00 Tabel 8: Udleveret TRPs inddelt efter hensyn til om patienten under 6 år har modtager TRP af egen blodtype eller universal TRP. Transfusionskomplikationer antal procent patient blodtype 0 - TRP blodtype 0 2 1,14 Tabel 9: antallet af patienter under 6 år der har fået transfusions komplikationer, samt blodtype information på patient og TRP Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 21 af 33

23 7. Diskussion Ud fra resultaterne burde der indgå en bestemmelse af anti-a titeren, i kvalitetssikringen af TRPs, for at 0-TRPs kan anvendes som universal TRPs. Dette grundet de meget forskellige titerværdier og den enkelt meget høje prøve der fik en titerværdi på 1:2048, samt at titerværdierne generelt ligger over Europarådet anbefalinger Kvalitetssikring og overholdes af Europarådets vejledning Europarådet har opstillet en anbefaling omkring titerværdien for anti-a og anti-b i forbindelse med plasma. Denne titerværdi må maksimalt være på 1:50 (2). Der er ikke beskrevet hvilke metoder der bruges til bestemmelsen af titerværdien. Derfor vælger de forskellige laboratorier, selv hvilken metode der bruges til at bestemme titerværdien på plasma. Da der også findes plasma i TRPs, er den overstående anbefaling også gældende for TRPs. På kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, bruges der IAT til bestemmelse af titervædier, vha. gel kort med coombs anti-igg (13). I første del af forsøget er der på 60 prøver, blevet testet for positiv eller negativ ved fortyndingen 1:50, dette er gjort ved IAT i gelkort. I tabel 3 ses det samlet antal prøver, samt at der var 53 positive og 7 negative prøver. I tabel 4 ses den procentvise fordeling, her ses at 88,33 % er positive og 11,67 procent er negative ved fortyndingen. Med disse resultater vil over 88 % af alle 0-TRPs være ubrugelige i forhold til universal TRPs, da de opnår en for høj titerværdi, i forhold til Europarådets anbefaling. Hvis man se på figur 8 og tabel 5, ser man at ca. seks af de prøver der gav et positivt udslag ved fortyndingen 1:50, ikke opnår en titerværdi højere end 1:32 og disse ville derfor blive medregnet som brugbar som universal TRPs, hvis man udelukkende laver titreringsrækken, dermed vil man opnå at 21,6 % ville kunne bruges. Grunden til at man opnår flere brugbare ved titreringsrækken skyldes, at fortyndingen 1:50 ligger mellem 2 fortyndinger i titreringsrækken og antistoffet ikke er kraftig nok til at opnår reaktioner ved 1:64 og derfor opnås der kun en titerværdi på 1:32. I anden del af forsøget er de 2 teknikker sammenlignet, IAT ved gelkort metoden og DAT ved glasmetoden. De er sammenholdt ved fremstilling af en titreringsrække for hver enkelt prøve, som så er blevet testede med begge teknikker. I figur 8 er titerværdiene for de 2 tekniker indført, her ses det er der ikke opnås den samme titerværdi for prøverne ved de 2 teknikker. IAT ved gelkort giver titerværdier mellem 1:32 og 1:2048, hvorimod DAT ved glasmetoden kun giver titerværdier mellem 4 og 64, dette tyder på at IAT i gelkort er mere Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 22 af 33

24 sensitiv. Da der ikke er defineret en sandværdi, kan man ikke udelukke at det er DAT, der giver de korrekte værdier. A- og B-antistoffer findes i 2 type af immunogloboliner, IgM og IgG. IgM er en polymer og er derfor bedre i stand til at lave agglutinationer, da den består af 5 antisstof grund substanser og selv kan samle flere trombocytter i et netværk. IgG er en monomere og har derfor kun et antistof grundsubstans og er ikke selv i stand til at fremstille et samlet netværk, da den er for lille til at danne de krævede broer, men har mulighed for det ved hjælp af hjælpemidler, f.eks. i form at anti-igg (1). I de anvendte gelkort er der tilsat coombs anti-igg og dette findes ikke ved glasmetoden, så derfor kan der formodes at der findes fleres antistoffer ved gelmetoden og derved kan den anses som den mest sensitive og resultatet burde derfor være det mest korrekte. I Tabel 5 og 6 ses der procentvis hvor mange prøver der har en titerværdi over eller under 1:50. Ved gelkortene ses det at knap 89 % ligger over fortyndingen 1:50 og dermed vil være ubrugelige som universal TRP. Hvor der ved glas metoden ses at der kun er ca. 2 procent der ligger over fortyndingen 1:50 og dermed er ubrugelige som universal TRPs. Det at metoder giver så forskellige resultater har stor betydning i forhold til at overholde Europarådets anbefalinger for titerværdien i TRP. Da man med den ene metode nemmere kan overholde Europarådets anbefaling og den anden ville være tvunget til at kassere en stor del som universalpools og man derved måske ikke har nok til antallet af patienter. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, ville ikke kunne overholde anbefalingerne, da der ikke ville være kunne produceres nok materiale, når så stor en andel af deres nuværende produktion ligger uden for grænserne. De ville kunne overholde det ved at indfører glasmetoden igen, men dette ville være en større omkostning og ville ud fra de overstående vurderinger ikke give det bedste produkt til patienterne, som jo er det man stræber efter ved hjælp af forskellige kvalitetssikrings procedure, som bestemmelse af titerværdien ville være en del af. Overholdelse af Europarådets anbefalinger, sikrer et kvalitets blodprodukt til patienterne og det er dermed vigtigt at kvaliteten er den samme i hele landet og hele Europa, samt hele verdenen. Det er den ikke, grundet den manglende information omkring metode og teknik valg. Resultaterne er for forskellige ved de valgte metoder og teknikker til at kunne opnår en ens kvalitet i hele Europa og dette bekræftes også i artiklen af Laura L. Cooling et al. (5) hvor der ikke er forskel i teknikken, da der her kun anvendes DAT, men der er forskel i Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 23 af 33

25 metoden da de bruger glas og gel. Ved dette forsøg ses der også en betydelig forskel ved titerværdierne mellem de 2 anvendte metoder. Transfusionskomplikationer indberettes årligt til Dansk Registrering af Transfusionsrisici (DART). I 2010 blev der transfunderet trombocytter, ud af disse opstod der transfusionskomplikationer i 1 tilfælde og dette var pga. bakterier i TRPen (14). I perioden har der kun været 6 tilfælde af immunologiske komplikationer grundet transfusion af trombocytter (14).. Ud af de 6 anmeldte transfusionskomplikationer, er der kun en der er en akut hæmolytisktranfusions komplikation, som er den komplikation, der forsøges undgået ved den bestemme titervædi i plasmaholdige produkter. 4 af de overstående komplikationer er TRALS, som ofte skyldes leukocytatistoffer, disse forsøges i forvejen at fjernes ved at alle TRPs leukocytfiltreres, og titerværdien for anti-a i TRPs vil derfor ingen betydning have haft for disse 4 patienter (14). Som tidligere nævnt ses der i tabel 5, at der var hele 88,33 % der ikke ville kunne bruges som universal TRP, på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, skejby, hvis Europarådet anbefalinger skulle overholdes og man anvender IAT ved gelmetoden, men ud fra overstående tal kan vi se at det ikke har haft nogen betydning for patienterne at så stor en del faktisk ikke overholder europarådets anbefaling, hvilket tyder på at anbefalingen er for lav i forhold til anvendelse af IAT (gel) I tabel 9 ses der også at der ikke har været nogen transfusions komplikationer ved børn i perioden 1/ /6 2012, ved blodcenter midt, der har modtaget 0-TRPs selvom de har haft anden blodtype. Dette tyder derfor også på at anbefalingen på 1:50 er for lav i forhold til hvad der skal til for at det bliver kritisk for patienterne, da der i forsøget kun har været 11,63 % der har haft en titerværdi lavere end 1:50. Dette er kun over en periode på 3 uge, men giver en ide om hvordan værdierne ville have været i perioden 1/ / hvis de var blevet målt i den periode. Dette indikerer dermed at grænsen er for lav, hvis den er vurderet ud fra værdier fundet med gelkort med eller uden coombs anti-igg Hvis der udelukkende ses på titerværdierne og forskellen i disse, bør der indføres analyse af titerværdien i kvalitetssikringen af TRPs. Når man så også ser på DARTs rapporter om hvor mange der har fået hæmolytisk transfusions komplikationer i en periode på 11 år, her har der kun været et tilfælde og der kan derfor drages tvivl om det ville være en spildt analyse i forhold til de økonomiske aspekter. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 24 af 33

26 7.2. Forskellen mellem de to teknikker og metoder I tabel 7 og figur 9 ses der at der er en signifikant forskel på de to teknikker. Forskellen mellem de to teknikker er belyst vha. en beregnet score værdi for hver enkelt prøve. Ud fra scoreværdien, er der så beregnet differencen mellem de to teknikker og dette er plottet ind i et differensplot. For der ikke skulle være en signifikant forskel mellem de 2 teknikker, skulle punkterne ligger ligeligt fordelt og tæt på 0. Her ligger de alle et godt stykke over 0 og dermed ses det, at der er en signifikant forskel på de to teknikker. Dette er yderligere bevidst i tabel 7 som er en beregnet T-test med følgende hypotese: H 0 : gelteknik = glasteknik H 1 : Gelteknik glasteknik For at kunne opnår H 0, skal t-test størrelsen være mindre end 2, (t-kritisk), men t- test størrelsen ligger på 33,10633 og ligger derfor betydeligt over den tilladte værdi. Det at der er en så signifikant forskel mellem de to anvendte teknikker, viser klart at det ikke er ligegyldigt hvilken teknik der bliver brugt til bestemmelsen af titerværdien. P(T<=t) fortæller os sandsynligheden for at de 2 teknikker måler ens og her er sandsynligheden for at de 2 teknikker måler ens, altså at t-test størrelsen er mindre end eller lig med t-kritisk. P er i dette forsøg 1,28E-36, hvilket er så lavt at man helt sikkert kan sige at der er stor signifikant forskel på de 2 teknikker. Ved glasmetoden kan der inkuberes ved stuetemperatur eller ved 37 o c og ved gelkortene skal der inkuberes ved 37 o c. Ved dette forsøg er der inkuberet ved 37 o c ved begge metoder, for at have så få variabler med som muligt, da det er IAT (gel) og DAT (glas) teknikkerne der undersøges og ikke selve metoderne. I artiklen af L.G. Larsson et. Al ses der at opnås 2 forskellige titer, hvor de har anvendt samme teknik og metode, men forskellige inkubations tider og temperaturer til bestemmelse af de to titer. Titeren var højere når der inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter forhold til ved 37 o c i 15 minutter (15). Det er ikke til at vide uden yderlige undersøgelse om forskellen skyldes tid eller temperaturen eller begge dele. Men kan have den betydning at resultaterne ved glasmetoden kunne have været højere og forskellen mellem de 2 teknikker ikke var signifikant. Der er dog opnået det samme kontrolværdi for titreringstandarden, som afdelingen opnår ved at inkubere ved 20 o c, hvilket tyder på at det er tiden der har en betydning for titerværdien. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 25 af 33

27 Laura L. Cooling et al. (5) har undersøgt forskellen mellem 2 metoder, men med samme teknik. Det er de samme 2 metoder, gel og glas, men de har udelukkende brugt AT.. Glasmetoden giver titerne 8 og 16 og gelmetodene giver titerne 32 og 64, så også her ses de højeste værdier ved gelmetoden. I tabel 5 ses der at største delen af prøverne ved gelmetoden, men med IAT, gav 62 eller 128, altså ligger de lige lidt højere end ved DAT metoden med gel. De to resultater kan ikke helt sammenlignes, da det ikke er de samme prøver som er brugt i begge forsøg, men der er ved begge forsøg opnået forskellige resultater alt afhængig af om der bruges glas- eller gelmetode, hvor der ved begge forsøg opnås højest titerværdi ved gelkortene. Dette tyder på at gelmetoderen med eller uden coombs anti-igg, er mere sensitiv og derfor den mest korrekte metode og den metode der bør tilstræbes at anvende på alle immunologiske laboratorier, der fremstiller blodprodukter til medicinsk behandling. Det at resultaterne, hvor der bruges gelkort med coombs anti-igg, er højere end ved neutrale gelkort, kan skyldes at der her bliver opfanget flere anti-a af IgG karakter. Anbefalingerne fra Europarådet stemmer godt overens med titerværdierne fundet vha. glasmetoden, så er det denne der er brugt er anbefalingerne brugbare i et vidst udstræk. Men er der i stedet brugt gelmetoden med coombs anti-igg, er anbefalingerne sat alt for lavt og grundlaget for anbefalingerne kommet fra meget anderledes resultater end de opnået i det overstående forsøg eller forsøget fra Laura L. Colling et al. artikel (5), hvor resultater giver at 97,6 % ved glasmetoden og 40 % ved gel metoden ligger under fortyndingen 1:50. I artiklen af Laura L. Colling et al. (5) er den kritiske grænse for hvornår TRP er højtitret 1:64 og her kommer de frem til, at den ligger for lavt og bør ligge på minimum 128. Dette skyldes at det målte titer i forsøget ved gelkort ligger på 1:64 og 1:128, og disse resulter ligger betydeligt under de reporterede titerværdi ved tilfælde af akut hæmolytisk transfusionskomplikationer og derfor kan man evt. sætte grænsen endnu højere end 1:128. C.D Josephson et al. (16) har også lavet et lignede forsøg som Laura L. Colling et al. og denne rapports. I deres forsøg anvender de 2 forskellige teknikker (DAT og IAT), men den samme metode (gelkort). Her har de fastsat nogle cut-off titerværdi, 1:62 for DAT og 1:256 for IAT. De måler fra 1:32 til 1:1024. Ifølge deres resultater ligger 34 % af DAT resultaterne under 1:64 og 62 % af IAT resultaterne ligger under 1:256. hvis man overføre disse kritiske værdier til denne rapports forsøg, vil der være 98,11 % der ved DAT ville ligger under værdien 1:64 og 88,68 % der ved IAT ville ligge under 1:256. Disse kritiske Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 26 af 33

28 værdier hænger godt sammen med antallet at patienter med hæmolytiske transfusionskomplikationer, da disse næsten godkender alle afdelingens trombocytpools og da der også skal medregnes spild pga. udatering af produktet, som lige så vel kunne være de produkter med en høj titer Fordele og ulemper ved de 2 metoder Fordele: Allerede i brug på afdelingen Materialerne er der Kendt test metode Nem aflæsning hurtigere oplæring Gelmetoden (IAT) Ulemper: Dyre gelkort Glasmetoden (DAT) Fordele: Ulemper: Glassene er billiger end gelkort Svær aflæsning lang oplæring Tidskrævende grundet den svære aflæsning Genindføring er tidskrævende 7.3. Transfusionskomplikationer og børn I Tabel 8 ses der at ca. 14 % af de udleveret TRPs til børn under 6 år i perioden 1/ /6 2012, har været 0-TRP udleveret til børn med blodtypen A. Der er ikke sket nogen Transfusions komplikationer ved de gældende udleveringer. Men det at så stor en procentdel får den 0-TRPs, øger stadig risikoen for at de modtager den enkelte TRP, med en titer på 2048, som øger risikoen for komplikationer. Det gældende barn var kun 0 år og er derfor i endnu højere risiko, da plasma mængden i TRP svare til ca. 7 procent af barnet samlet blodvolumen, alt afhængig af barnets vægt. Barnet har også fået transfunderet de 4 TRP over en periode på 2 dage, hvilket også øger chancen for komplikationer, da barnet hele tiden modtager mere plasma med anti-a. I artiklen af D.T. Sadani et al. (17) ses et tilfælde med en 65-årig kvinde med blodtype A, der tre gange modtager aferese trombocytter type 0, alle mærket lav-titer, hun udvikler efter den 3 trombocyt transfusion, hæmolytisk transfusions komplikationer og ender med at dø nogle dage derefter (17). Dette tyder på at der Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 27 af 33

29 også forefindes en risiko ved at man udlevere flere TRPs af forkert blodtype til samme patient over et meget kort tidsrum. I en TRP er der ca. 80 ml plasma, med antistoffer. I et barn på 1 år, er der ca. 944 ml blod, det vil sige at den mængde af plasma i TRP svare til ca. 8,5 % af barnet blodmængde. En vokse mand på ca. 80 kilo har til sammenligning en blodmængde på 5680 ml blod og her ville plasma mængden i TRPs svare til ca. 1,5 % af den samlede blodmængde. Dette viser at plasma med antistoffer rettet mod patientens egne erytrocytter, vil have større betydning ved et barn end ved en voksen. Da den mængde der vil kunne destrueres grundet antistofferne i plasmaet er en meget større procentdel af den samlet blodmængde, ved det lille barn end ved den voksne. I artikel af Cassandra D. Josephson et al. (3) ses der i en tabel, børn der har fået komplikationer efter transfusion med 0-trombocytter, hvor de selv har været enten blodtype A eller AB. Der er målt en titerværdi for nogle af donor trombocytterne og dette er både i saltvand og AHG (anti human globulin). Disse værdier er meget forskellige, de ligger mellem 1:20 og 1:8192 ved saltvandsteknik og mellem 1:4096 og 1:32000 ved AHG. Titerværdierne ses mest i saltvandsteknik, hvilket tyder på at denne er den mest udbredte teknik til bestemmelse af titerværdier. En der springer i øjnene er et barn på 3 måneder, der er af blodtypen A, denne har fået trombocytter med en saltvands titer på under 20 (3). Denne ligger godt under Europarådets anbefaling og når man ser i figur 8, ses der at der er en TRP med en saltvands titerværdi på 64, denne ligger langt over de 20 og ville derfor kunne være meget skadelig for dette lille barn, hvilket tyder på vigtigheden af nogle fælles kvalitetsprocedure i forbindelse med anti-a i TRPs. Ifølge vejledningerne på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, skal børn under 6 år som hovedregel have TRP, svarende til deres egen blodtype (4). Der må ved særlige tilfælde hvor overstående krav ikke kan overholdes evt. ved manglende TRP af rette type eller ukendt type på barnet, udleveres efter akutreglerne for voksne (18). Som det ses i tabel 8, sker dette ofte, ca. 26 % af de udleveret TRP er udleveret til anden blodtype. Da der stort set kun produceres TRP af blodtypen A og 0, grundet TRPs korte leve tid, produktionsomkostninger og mængde af mennesker med blodtype B eller AB, ca. 15 % af den samlet befolkning. Vil man i tilfælde med børn af blodtypen B eller AB ofte ikke kunne matche blodtypen. Dette kunne være et problem, da der også findes anti-b i 0- trombocytpools, men det er påvist at anti-a hyppigst er grunden til højtiter trombocytter Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 28 af 33

30 (3). Og ved blodtypen AB, kan man også give A-TRPs, da man derved kun indgiver anti-b mod patienten egen celler. I Storbritannien, er der lavet en samlet guideline for fremstilling, opbevaring og udlevering af blodkomponenter. Her er anbefalingen af børn under 16 skal have aferese trombocytter (19). Dette ville evt. kunne være med til at fjerne de 2 børn der har fået transfusionskomplikationer efter de har modtaget blod af egen blodtype. Men eftersom der findes en større mængde plasma i aferese produkterne vil der være en større risiko i forbindelse med minor-uforlig hvis patienten modtager trombocytter af anden blodtype Aferese trombocytter vs. TRPs I artiklen af Cassandra D. Josephson et al. (3) er det hovedsageligt tilfælde med aferese trombocytter der er nævnt. Aferese trombocytter opbevares i plasma og der er dermed en større mængde plasma end i TRPs som opbevares i SSP+. I nogle lande opbevares TRPs i plasma for de forskellige donor, her fås der stadig en større plasma mængde end ved TRP opbevaret i SSP+, men man fortynder plasma med høj titer i de andre donors plasma, derved mindsker man risikoen for at få et højtiter produkt (15). At der findes forskellige typer mængder af plasma og det kan være fra flere donorer, kan betyde manglende sammenlignings grundlag med titerværdiene ved kendte transfusions komplikationer, hvis disse opstår efter transfusion med Aferese produkter. Der er også det at ved TRP, som ofte består af fire donorer, som også har forskellige titerværdier for deres anti-a i plasma og det at der så er en med høj titer har ikke samme betydning som ved single donor trombocytter, da de 80 ml plasma i en TRP er en sammenblanding af plasma fra 4 forskellige donor. Derfor kan man have en donor med høj titer, men stadig have en TRP med en lav titerværdi. Ved at TRP opbevares i SSP+, gør også at plasmaet fortyndes i forhold til ved single donor trombocytter. Derfor burde det være muligt at gå ud fra at TRPs er at fortrække frem for single donor trombocytter. men i artiklen af Laura L. Cooling et al. (5) måler de titerværdien på en række TRP ved hjælp af to metoder. Disse resulter sammenligner de med nogle resulter for single donor trombocytter opnået i et andet forsøg og her finder de frem til at titerværdierne er sammenlignelige Kontroller Alle kontrollerne er med for at sikre at teknikkerne kan frembringe de samme resultater fra dag til dag. Da alle kontrollerne gav de samme resultater alle dage, betyder det at prøve re- Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 29 af 33

31 sultaterne er brugbar og kan sammenholdes, selvom de er produceret over flere dage. Den negative kontrol sikre at der ikke er sket nogen tilblanding under udførelsen af testen og dermed sikre at det kun er det der er tilstede i trombocytprøverne der reagere. Igen her har været en klar negativ kontrol alle forsøgsdage og dermed er tilblanding undgået. Titreringsrækken gav en titerværdi på 1:512 ved gelkortene alle dage, men ifølge data fra klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby, skal den kun give 256, grunden til forskellen mellem de 2 værdier kan skyldes at det på afdelingen kun analyseres med en inkubationstid på 15 minutter, men at der her i forsøget er blevet analyseret med en inkubationstid på 30 minutter, da dette er tiden der skal bruges ved glasmetoden og man ønskede så få forskelle mellem de 2 teknikker som muligt, for at gøre dem mere sammenlignelige og man bedre ville kunne vurdere om den ene metode er mere sensitiv end den anden. Se bilag 7 for Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, værdier for titreirngsstandarden Fejlkilder Manglende erfaring med aflæsning af gelkort og især ved glasteknikken kan anses som en fejlkilde, da det evt. er vurderet en lille smule anderledes end hvis de var aflæst af nogen med større erfaringsgrundlag. Dette ses især ved glasteknikken, som kan være noget besværlig at aflæse, pga. det meget er en vurderings sag om det man se er agglutination eller bare normalt grumset. Forskellen mellem graduering 1 og negativ er meget lille. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 30 af 33

32 8. Konklusion På klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby udleveres der som hovedregel TRPs efter blodtypen til børn under 6 år, men dette er desværre ikke altid muligt og der udleveres så 0-TRP. På nuværende tidspunkt overholdes Europarådet guidelines ikke hvis man undersøger med DAT vha. gelmetoden, men de overholdes i 98,11 % af tilfældene hvis man bruger IAT vha. glasmetoden. Sensitivitet er forskellig for de 2 teknikker og det ville derfor ikke være muligt at opfylde Europarådet anbefalinger på en fyldestgørende måde da der ikke er angivet nogen specifik teknik eller metode til bestemmelse af titerværdien for anti-a og anti-b. Der bør evt. også laves regler om udlevering af flere universal trombocytpools til børn af blodtypen A, grundet den konstante påvirkning af anti-a mod deres egne erytrocytter kan være skadelige og ende op med en hæmolytisk transfusions komplikationer, især ved i forvejen svage børn eller voksne. 9. Perspektivering På sigt ville det være en god ide med en kontrol af titerværdien for anti-a i 0-TRPs i forbindelse med kvalitetssikringen af disse. Dette kan dog først indføres når det er udført flere konkret forsøg i forbindelse med bestemmelse af titerværdi grænsen, samt udvælgelse af de bedst egnet og mest sensitive metoder og teknikker til bestemmelsen. Som der ses i de fleste artikler er det stadig stor uenighed omkring titerværdi grænsen og for at opnår det bedste resultat for alle transfusioner med trombocytter, bør der indføres ens kvalitetsbestemmelser i hele landet og helst indenfor hele Europa. Europarådet har som beskrevet tidligere ikke givet noget retningslinjer for bestemmelsen af titerværdien. Derved kan afdelingen selv bestemme hvilken teknik der bruges og dermed selv vælge den metode der gør at de overholder anbefalingerne. Europarådet skal fremstille en anbefaling for at gøre titerværdi anbefalingen mere brugbar, beskrive grundlaget for deres anbefaling og hvilke metode der er brugt til at finde det gældende resultat. Det er resultaterne er så forskellige gør også at der evt. skulle være forskellige anbefalinger afhængig af hvilke metoder der bruges på laboratoriet. Da et laboratorium har bedre muligheder for at indfører nye undersøgelse, hvis metoden allerede bruges på afdelingen, frem for helt nye metoder og materialer. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 31 af 33

33 10. Reference 1. Ellen Taaning, Astrid Nørgaard, Gitte Holm Glaas. Immunologi og transfusionsmedicin. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck i samarbejde med Dansk Sygeplejeråd; Europarådet. Guide til præparation, brug og kvalitets sikring af blodkomponenter, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: df 3. Cassandra D. Josephson, Marta-Ines Castillejo, Kathleen Grima, Christopher D Hillyer. ABO-mismatched platelet transfusions: strategies to mitigate patient exposure to naturally occurring hemolytic antibodies. Transfusion and Apheresis sience 2010;42: Blodcenter midt. Udlevering af blodkomponenter til børn, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: 5. Laura L. Cooling, Theresa A. Downs, Suzanne H. Butch, Robertson D. Davenport. Anti-A and anti-b titers in pooled group O platelets are comparable to apheresis platelet. Transfusion 2008;48(10): Olav Sand, Øystein V. Sjaastad, Jan G. Bjålie. Menneskets anatomi og fysiologi. København: Gads forlag; Blodcenter midt. Fremstilling af trombocytpool, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: 8. Blodcenter midt. Udlevering af blodkomponenter med anden AB0- eller RhD-type end patientens (set november 2012) tilgængelig fra: URL: 9. Blodcenter midt. Kvalitetssikring af blodkomponenter (set november 2012) tilgængelig fra: URL: IRBMED. Oversigt over blodvolumen, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: Syge børn. Oversigt over børn vægt, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 32 af 33

34 12. Stanford school of medicine. The coombs test, (set December 2012) tilgængelig fra: URL: Blodcenter midt. Titrering, 37 C IAT i IgG gelkort, BioRad (set november 2012) tilgængelig fra: URL: Dansk registrering af transfusionsrisici (DART). Årsrapport fra 2011 (set novemeber 2012) tilgængelig fra: URL: L.G. Larsson, V.J. Welsh, D.J. Ladd. Acute intravascular hemolysis secondary to out-of-group platelet transfusion. Transfusion 2000:40: C.D. Josephson, N.C. Mullis, C. Van Demark, C.D. Hillyer. Significant numbers of apheresis-derived group 0 platelet units have high-titer anti-a/a,b: implications for transfusion policy. Transfusion 2004;44: D.T. Sadani, S.J. Urbaniak, M. Bruce, J.E. Tighe. Repeat ABO-incompatible platelet transfusions leading to haemolytic transfusion reaction. Transfusion Medicine 2006;16: Blodcenter midt. Akut udlevering af plasma og trombocytpool (set november 2012) tilgængelig fra: URL: Britisk komite for standarder indenfor hæmatologi. Anbefalinger for administrationen af blodkomponenter i Storbritannien, (set november 2012) tilgængelig fra: URL: pdf Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 33 af 33

35

36

37 Bilag 2 ID-CellStab ID-System > Solutions for Red Cells and Reagents Name Description ID-CellStab ID-CellStab is a specially formulated glycine buffered saline which stabilises red cells at 0.8% concentration for use in the ID-System for up to 4 weeks after preparation. Stabilisation solution for red cells (Id-n : 05740) Pkg. size Profiles or single test REF 1 x 500 ml

38 Bilag 3 fortyndingen 1:50 fortyndingen 1:50 prøvenummer: pos/neg graduering prøvenummer: pos/neg graduering

39 Bilag 4 Gelkort prøvenummer: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 1:8192 titerværdi scoreværdi

40

41

42

43 glasteknik prøvenummer: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 1:8192 titerværdi scoreværdi

44

45

46

47 Bilag 5 standard gelkort dato: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1: okt okt okt (1) okt okt okt standard glasteknik dato: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1: okt okt okt (1) okt okt okt

48 Bilag 6 Udtræk fra ProSang over transfunderede trombocytter til børn, der på udleveringstidspunktet var under 6 år. Udtrækket dækker perioden fra og med til Dato Blodbanknr PatientID Patientens alder ved transfusion (år) Patient blodtype Produkt blodtype Lager Produkt Produktbeskrivelse Evt reaktion B+ B+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ VIBORG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret VIBORG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret VIBORG E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKSGEM E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret

49 AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ B+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ B+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0- AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0- AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret

50 SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt TRANSFUSIONSREAKTION A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ VIBORG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKSFRAK E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A- A- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret

51 A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ HERNING E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ HERNING E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ HERNING E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ AS-NBG E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ AS-NBG E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKSFRAK E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- B- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- B- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- B- SKEJBY E5026 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- B- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- B- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret

52 B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B- 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ B+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKSFRAK E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt TRANSFUSIONSREAKTION SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret HERNING E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret AB+ A+ SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ A- SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret AB+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret

53 SKEJBY E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret AS-NBG E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret B+ 0+ SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A- 0+ NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A- 0+ NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A- 0+ NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret A+ 0- SKEJBY E5396 T-TrombChkEryt Ingen registreret NBGGEM E5395 T-TrombChkEryt Ingen registreret

54

55

56 USIONSREAKTION

57

58 USIONSREAKTION

59 Bilag 7

60