Antistofidentifikation på AutoVue Innova

Transkript

1 2015 Antistofidentifikation på AutoVue Innova - Med anvendelse af tre forskellige panel-testerytrocytter Antibodyidentification with AutoVue Innova - Using three different panel-testerythrocytes Kilde: Kamilla Christensen, Ba12S006, Modul 14 University College Syddanmark Degnevej 16, 6705 Esbjerg Ø, Bioanalytikeruddannelsen, BA12 Klinisk uddannelsessted: Sygehus Lillebælt Skovvangen 2-8, 6000 Kolding Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr af 16/12/2013 kap. 5, 19 Omfang: anslag Anslag: Klinisk vejleder: Hanne Nielsen Side 1 UC Vejleder: Anja Dalsgaard Jørgensen

2 Forord Denne professionsbachelor er udarbejdet på Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling (KIBA) på Vejle og Kolding Sygehus med University College Syddanmark i Esbjerg som uddannelsesinstitution. Tak til afdelingernes personale på de to respektive sygehuse, som har bidraget til projektets tilblivelse ved, at tilsidesætte plasma fra patientprøver indeholdende irregulære antistoffer, samt givet os den plads i laboratoriet som vi behøvede. Et særligt tak til følgende personer, som har gjort en ekstra indsats: - Funktionsbioanalytiker Tobias Hermansen, fra Klinisk Immunologisk- og Biokemisk Afdeling (KIBA) på Vejle Sygehus, som har hjulpet med fremstilling af stregkoder til prøver og paneltesterytrocytter. - Funktionsbioanalytiker Kim Aakjær Jakobsen, fra KIBA på Kolding Sygehus, som har givet tilladelse til projektet, samt hjulpet os med, at finde mange af de ting som har været nødvendige for projektet. - Kent Elkrog, produktspecialist fra Ortho-Clinical-Diagnostics, som har brugt tid på, at oplære os i brugen af softwaren Resolvigen 3, samt opsætte apparaturet AutoVue Innova til, at kommunikere med softwaren. Derudover har han stået til rådighed ved vores utallige spørgsmål. - Illustrator Jakob Strandberg, samt forlaget Munksgaard som har givet tilladelse til brug af deres illustrationer fra bogen Immunologi. Den praktiske del af projektet er udarbejdet i samarbejde med to medstuderende, Sebastian H. F. Christensen og Vivi H. Skøtt. Derudover har de været en stor støtte og nogen fantastiske sparingspartnere igennem opgaveskrivningen, hvorfor der skal lyde et stort tak til dem. Projektet henvender sig til personer, der er interesserede i transfusionsmedicin, irregulære antistoffer, identifikationen af irregulære antistoffer, apparaturet AutoVue Innova, softwaren Resolvigen og ikke mindst automatisering af analyser til prætransfusion. Side 1

3 Abstrakt Baggrund: Selvom transfusions komplikationer er sjældne i Danmark, er enhver transfusion forbundet med en risici. Immunisering sker dog langt hyppigere og kan ligeledes medfører konsekvenser for patienten, hvorfor identifikation af irregulære antistoffer er vigtigt. Tre forskellige paneler af testerytrocytter fra henholdsvis Ortho-Clinical Diagnostics, Odense Universitets hospital og BioRAD, afprøves til antistofidentifikation på AutoVue Innova. Projektet vil ligeledes undersøge, hvilen betydning det kan have for Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling i Kolding (KIBA), at anvende et sådant panel til automatiseret antistofidentifikation. Metode: Prøvematerialet er gamle NEQAS prøver samt plasma fra patienter med irregulære antistoffer, indsamlet på KIBA på Kolding og Vejle sygehus fra den 23/06/ /10/2015. Til identifikation af irregulære antistoffer anvendes apparaturet AutoVue Innova i Kolding, samt softwaren Resolvigen 3. Derudover foretages antistofscreentest og titrering. Til bearbejdning af rådata anvendes bl.a. deskriptiv statistik og Chi2 test. Resultater: De tre paneler var alle bedst til, at identificerer irregulære antistoffer i NEQAS prøverne frem for patient prøverne. Derudover blev panelernes identifikationsevne ringere, jo flere irregulære antistoffer der var til stede. Der blev ikke fundet nogen statistisk sammenhæng imellem panelerne og antallet af rigtige eller forkerte antistofsvar. Konklusion: Det kan kluderes, at panelerne varierer på punkter som pris og antigramsammensætning, men der er ingen statistisk signifikans forskel i deres præstation. Ved implementering af analysen og et sådant panel, vil der være konsekvenser for afdelingen i form af øget automatisering, oplæring af personale, bedre arbejdsmiljø, hurtigere svartid og ikke mindst færre fejl. Side 2

4 Indholdsfortegnelse Introduktion... 5 Baggrund... 5 Formål... 6 Problemformulering... 6 Teoretisk baggrund... 6 Antigener... 6 Blodtypesystemer og dets antigener... 6 Antistoffer... 8 Dannelsen af antistoffer Komplikationer vedrørende irregulære antistoffer Antistofscreentest ved søjleagglutination Antistofidentifikation & AutoVue Innova Antistoftiter Materiale Apparatur Kontroller Forsøgsmateriale In- og eksklusionskriterier Metode Projektets design Databearbejdning Litteratursøgning Etik Resultater Diskussion Egen metode Panelerne Resolvigen Resultater Side 3

5 Fremtiden for KIBA Konklusion Perspektivering Referenceliste Referenceliste over billeder, figurer, ligninger og tabeller Bilag 1: AutoVue opbygning Bilag 2: Antigram for Panel A Ortho-Clinical Diagnostics Bilag 3: Antigram for Panel B Odense Universitetshospital Bilag 4: Antigram for Panel C BioRAD Bilag 5: Plan for pilotprojektet Bilag 6: Protokol over udførelse af professions bachelor projektet Bilag 7.1: Rådata - Reaktionsstyrkerne for alle prøverne med de tre anvendte paneler Bilag 7.2: Rådata antistofsvar for alle prøver med de tre anvendte paneler Bilag 8: Forskrift til manuel antistof titrering fra Qualiware Bilag 9: Rådata Titreringsresultater Bilag 10: qq-plot over de gennemsnitslige reaktionsstyrker for de tre paneler Side 4

6 Ba12s006 Antistofidentifikation Klinisk Immunologisk afdeling Introduktion Baggrund I 2014 blev der i Danmark transfunderet blodkomponenter og indberettet 19 transfusionskomplikationer til Dansk Registrering af Tranfusionsrisici (DART). Selvom alvorlige konsekvenser for patienten kun optræder ved ca. 1:60.000, er enhver blodtransfusion forbundet med en risiko for komplikationer (1,2). Mindre alvorlige komplikationer som immunisering af patienten er meget hypperigere, og kan senere skabe problemer for patienten i forbindelse med anden blodtransfusion, graviditet eller transplantation af organer. Ligeledes kan visse immuniseringer forårsage aktivering af immunforsvarets komplementsystem (2,3). For at undgå transfusionskomplikationer for immuniserede patienter, er det vigtigt at få identificeret hvilke irregulære antistoffer blodet indeholder, så patienten kan modtage de rette blodkomponenter ved transfusion i fremtiden (3). Undersøgelser viser, at automatisering af analyser til prætransfusion, herunder Antistofidentifikation kan være fordelagtigt, bl.a. nedsættes mængden af fejl og hastigheden på analysesvar øges (4,5). Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling (KIBA) i Kolding anvender lige nu apparaturet AutoVue Innova fra Ortho-Clinical Diagnostics til automatiseret blodtypebestemmelse og BAC-test (Blodtypebestemmelse-Antistofscreentest-Computerforlig). I fremtiden ønskes analysen Antistofidentifikation ligeledes implementeret. Hertil findes flere muligheder i forhold til valg af testerytrocytter (panelblodlegemer). Afdelingen anvender i dag et selvfremstillet panel fra Odense Universitetshospital (OUH) til manuel Antistofidentifikation. Denne undersøgelse skal derfor bidrage med viden omkring anvendelsen af andre testerytrocytter til selvsamme analyse samt undersøge, hvilke fordele og ulemper en automatisering kan få for afdelingen. I forbindelse med projektet laves ligeledes et titreringsforsøg, så der skabes en viden omkring kvaliteten/detektionsgrænsen af de forskellige panel-testerytrocytter. Side 5

7 Formål Formålet med denne undersøgelse er, at afprøve tre forskellige paneler af testerytrocytter til antistofidentifikation på AutoVue Innova, så der kan opnås en større viden om forskelle og ligheder på paneler til denne analyse. Undersøgelsen er baseret på plasma fra patienter med irregulære antistoffer samt gamle NEQAS prøver. Indsamling af prøvemateriale og udførelse af undersøgelsen foregår på Sygehus Lillebælt, Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling i Kolding og Vejle. Projektet vil ligeledes sættes fokus på, hvilken betydning det kan have for afdelingen, at anvende et sådant panel til automatiseret antistofidentifikation. Problemformulering Hvordan adskiller panelerne fra Ortho-Clinical Diagnostics, BioRAD og Odense Universitetshospital sig fra hinanden ved identifikation af irregulære antistoffer på AutoVue Innova? Hvilke konsekvenser vil det have for Klinisk Immunologisk- og Biokemisk afdeling på Kolding Sygehus, at anvende ét af panelerne til identifikation af irregulære antistoffer på AutoVue Innova? Teoretisk baggrund I dette afsnit beskrives antigener, de overordnede blodtypesystemer og der redegøres for antistoffers opbygning, funktion og betydning, alt sammen med særlig vægt på emnet blodtransfusion. Derudover beskrives nogle af de komplikationer der kan opstå som følge af irregulære antistoffer hos recipienten. Til sidst beskrives teorien bag antistofscreentest, titrering af antistoffer, paneler- og analyseprincippet ved antistofidentifikation på AutoVue Innova. Antigener Antigener er en fælles betegnelse for stoffer der kan genkendes af kroppens immunforsvar, herunder immunforsvarets T-celler, B-celler og antistoffer. Antigener kan ligeledes fører til dannelsen af de såkaldte antistoffer, og kaldes i sådanne tilfælde for immunogene. Antigener kan fremstå i form af både proteiner, polysakkarider, lipider, nukleotider og ikke mindst en kombination af disse. Derudover indeholder de en eller flere epitoper, som er de områder på antigenet hvortil antistoffer eller T-celle receptorer binder sig (6,7). Blodtypesystemer og dets antigener Der kendes til ca. 300 forskellige blodtypeantigener indenfor 30 anerkendte systemer. Erytrocyttens membran indeholder overflademolekyler i form af proteiner, glycoproteiner og Side 6

8 Billede 1: Opbygning af blodtypeantigenerne 0, A og B (9). glycolipider, hvor variationer i sammensætningen af disse udgør de forskellige blodtypeantigener. De to klinisk vigtigste blodtypesystemer er AB0 og Rhesus (8,9). AB0 antigenerne findes på overfladen af alle kroppens celler, hvorimod de fleste andre blodtypeantigener kun findes på erytrocytter. Forskellen på AB0 blodtyperne afgøres af den endestillede kulhydratkæde i cellemembranens glykoprotein. Blodtype 0 er kendetegnet ved, at den ikke har en sådan kæde, men kun indeholder det såkaldte H-antigen (basisenheden i alle AB0 blodtype antigener). Type A har derimod en N-acetylgalaktosamin som yderste kæde og type B har en galaktose kæde, se billede 1. Som noget unikt ved AB0 systemet, vil der altid findes regulære antistoffer imod de blodtypeantigener man ikke selv har, dette beskrives senere under Antistoffer (8,9). Disse antistoffer betyder, at patienten altid skal transfunderes med AB0 major forligeligt blod om muligt. Dog kan blod af Typen 0 anvendes som universalblod, da dette antigen som sagt ikke indeholder nogen endestillet kulhydratkæde og personer af Typen A, B eller AB dermed heller ikke har dannet nogen regulære antistoffer imod dette (9). Rhesussystemet består af blodtypeantigenerne D, C, c, E og e. Af disse er RhD klart den mest immunogene, hvorfor der altid tages hensyn til denne ved blodtransfusion på lige fod med AB0 systemet. Transfunderes en RhD negativ med RhD positivt blod vil 50 % danne et kraftigt immunrespons og danne irregulære antistoffer, i dette tilfælde Anti-D. De andre blodtypeantigener kan ligeledes skabe et immunrespons og stimulere til dannelsen af irregulære antistoffer, men dette sker dog ikke nær så hyppigt (8,9). Ud over disse to systemer findes som tidligere nævnt en lang række andre blodtypesystemer. Disse antigener er mere eller mindre immunogene, og kan dermed skabe et immunrespons og danne irregulære antistoffer hos patienten. Som ved Rhesussystemet sker dette dog kun ved en eventuel immunisering (9). Side 7

9 I særlige tilfælde kan en patients fænotype kortlægges, f.eks. hos patienter med livslang transfusionsbehov. Herefter vides præcis hvilke blodtypeantigener patienten har, og på den måde kan der gives forligeligt blod, uden dannelsen af antistoffer i patienten (8). Antistoffer Den samlede betegnelse for de forskellige antistoffer kaldes immunglobuliner (Ig). Der findes 5 forskellige typer, hvor alle kan binde sig til antigener, men har ellers forskellige fysiologiske funktioner grundet forskelligheden i aminosyresekvensen. I denne opgave beskrives kun immunglobulin Gamma (IgG), som har relevans for projektet (10).(11) IgG består af to forskellige polypeptidkæder, to tunge og to lette kæder der danner en Y form og er bundet sammen ved en disolfid binding. På både de tunge og lette kæder findes en variabel og konstant del, se billede 2. I de variable områder af både de lette og tunge kæder, findes tre hypervariable domæner. Det er de mest betydningsfulde områder af antistoffet, det er dem der kan variere og dermed passe specifikt til antigenet (7,10). Billede 2: Opbygningen af Immunglobulin Gamma (11) Immuglobuliner kan spaltes med enzymer som f.eks. papain. Herved fås to Fab fragmenter og et Fc fragment, se billede 2. Fab delene binder antigener, imens Fc delen bl.a. kan binde et sekundært antistof, samtidig kommunikerer Fc delen med resten af immunsystemet (10). IgG er det antistof der findes mest af i plasma og kan som det eneste antistof overføres igennem placenta. Det ses ved inflammatoriske reaktioner, og i størst mængde ved en sekundær inflammation. Generelt er det mugligt for IgG antistoffer, at aktiverer komplementsystemets klassiske aktiveringsvej, derudover bindes de til makrofager og fungerer som opsoniner (7,10). Antistoffer er altså en del af kroppens immunforsvar og kan inddeles i tre hovedtyper: - De såkaldte regulære antistoffer dannes uden at møde det egentlig mål-antigen, de dannes ud fra krydsreaktion ved mødet med f.eks. bakterier der har antigener der minder meget om humane antigener. F.eks. har en personer med blodtypen 0, Anti-A og Anti-B i sit plasma. Selvom personen aldrig har været udsat for A og B antigener, har kroppens Side 8

10 immunforsvar mødt antigener der minder meget om disse A og B antigener. Regulære antistoffer er af typen IgM og kaldes også for komplette antistoffer. Grundet deres størrelse kan de skabe selvstændig agglutination og aktiverer komplementsystemet (9). - Dette er ikke helt det samme som naturlige antistoffer. Helt naturligt danner immunforsvarets B celler antistoffer uden at have mødt nogen fremmede antigener overhovedet. Disse er dog meget uspecifikke og har en bred affinitet overfor alle fremmede celler. Når der så opstår et møde med et fremmed antigen, kan B cellerne hurtigt producerer endnu flere antistoffer (12). - Til sidst findes de irregulære antistoffer. Disse dannes ved mødet med fremmede antigener, f.eks. vil en person med Kell negative erytrocytter, først danne irregulære antistoffer imod Kell (Anti-K) hvis personen transfunderes med Kell positivt blod. Irregulære antistoffer er oftest af IgG type og kan derfor ikke forårsage selvstændig agglutination af erytrocytter, hvorfor de også kaldes for inkomplette antistoffer. Binding af irregulære antistoffet til erytrocytter forårsager derimod fagocytose via makrofager. De vigtigste irregulære antistoffer findes inden for Rh, Duffy, Kidd og Kell systemet (8,9). I tabel 1 nedenfor ses nogen klinisk relevante irregulære antistoffer (9): Tabel 1: Klinisk relevante irregulære antistoffer (9) Antistoffer Anti-D Anti-E Anti-K Anti-c Anti-Fy b Anti-Jk a Anti-C Anti-S Anti-e Andre Rh antistoffer Anti-Jk b Blodtypesystem Rh Rh Kell Rh Duffy Kidd Rh MNSs Rh Rh Kidd Side 9

11 Dannelsen af antistoffer Produktionen af antistoffer forårsages af immunforsvarets B-celler (B lymfocytter). Først og fremmest skal cellen præsenteres for det fremmede antigen, der skal produceres antistoffer imod. Dette er B-cellen selv i stand til og fungerer altså også som en antigenpræsenterende celle (APC). Efter mødet med dette fremmede antigen, internaliseres dette og nedbrydes via lysosom inde i B-cellen. Herefter vil fragmenter af det fremmede antigen præsenteres på cellens overflade via et MHC II molekyle (Major Histocompatibility Complex). Den efterfølgende aktivering af B-cellen kræver tre signaler, se billede 3 (13): Billede 3: Aktivering af immunforsvarets B-celler, signal 1, 2 og 3 (12) 1. MHC II genkendes af en T-celle receptor (TCR) og et CD4 kompleks på en Th-celle (T lymfocyt/ T-hjælpe celle). Bindingen imellem MHC II på B-cellen og CD4 på Th-cellen skaber signal et, som får Th-cellens CD40L receptor til at bindes til CD40 på B cellen og disse opreguleres (13). 2. CD40 bindingen opregulerer CD80 og cytokin receptor i B-cellen. CD80 vil bindes med CD28 i Th-cellen, dette starter signal to, som medfører proliferation af B cellen samt cytokin secernering i Th-cellen (13). 3. B-cellen kan nu modtage det tredje signal fra Th-cellen i form af de dannede cytokiner. Disse afgør hvilken plasmacelle B-cellen skal differentierer til. De forskellige plasmaceller producerer nemlig forskellige antistoffer, se billede 4 (13). Billede 4: Differentiering af af B-cellen til antistofproducerende plasmacelle (12) Side 10

12 Komplikationer vedrørende irregulære antistoffer Irregulære antistoffer hos patienten kan give anledning til hæmolytiske transfusionskomplikationer og erytroblatose, hvorfor disse vil beskrives herunder; Akut intravaskulær hæmolytisk transfusionskomplikation opstår inden for et døgn efter transfusionen. Tilstanden er sjælden, men meget alvorlig, og skyldes uforlig af erytrocytter imellem doner og recipient. De svære tilfælde ses ved AB0-major uforligelig blod, som f.eks. transfusion af blodtype A til en patient med blodtype 0, da Anti-A hos recipienten er stærk komplement bindende. Enkelte irregulære antistoffer kan ligeledes aktiverer immunforsvarets komplementsystem, heriblandt anti-jk a og anti-vel, og kan dermed skabe akut intravaskulær hæmolyse (2). Akut ekstravaskulær hæmolytisk transfusionskomplikation opstår også inden for de første 24 timer efter transfusion. Komplikationen opstår når irregulære antistoffer (f.eks. Rh- og Kell antistoffer) hos recipienten angriber de transfunderede donor erytrocytter. Da de fleste irregulære antistoffer kun er svagt eller slet ikke komplement aktiverende, sker hæmolysen af de antistofdækkede erytrocytter ved fagocytose via makrofager. Symptomerne er kulderystelser, hæmoglobin fald, hæmoglobinuri og icterus. Komplikationen behandles sjældent, men ved meget lav hæmoglobin kan der gives ny blodtransfusion med blod der er negativ for de antigener som patienten har antistoffer imod (2,3). Forsinket hæmolytiske transfusionskomplikationer er hyppige men sjælden alvorlig. Komplikationen indtræder få dage til uger efter blodtransfusionen. Dette opstår ved patienter der tidligere er blevet immuniseret med det pågældende erytrocytantigen, og der opstår her et sekundært immunrespons. De hyppigste ansvarlige antistoffer er fra Rh eller Kidd systemet. Ved blodtransfusionen er antistofkoncentrationen svag og ikke påviseligt hos patienten, men under og efter transfusionen sker det sekundære immunrespons, hvorefter koncentrationen af antistoffer stiger, hvilket resulterer i destruktionen af de transfunderede doner erytrocytter. Symptomerne er manglende stigning i hæmoglobin eller hæmoglobinfald, icterus og mørkfarvning af urinen pga. øget udskillelse af bilirubin. Tilstanden behandles som ovenstående komplikation (2,3). Forekomsten af akutte hæmolytiske transfusionskomplikationer (AHTK) og forsinket hæmolytisk transfusionskomplikation (FHTK) ses i tabel 2 nedenfor (14): Side 11

13 Antal transfusions komplikationer Kamilla Christensen Professions Bachelor Projekt Tabel 2: Antallet af akutte og forsinkede hæmolytiske transfusionskomplikationer fra (13) Total % Ratio/ AHTK ,2 FHTK ,4 I figur 1 nedenfor ses hvilke antistoffer der er fundet ved AHTK og FHTK i perioden Ad Y aksen ses antal transfusionskomplikationer og ad X aksen ses de pågældende antistoffer. Tabellen bekræfter hermed, at de forsinkede hæmolytiske transfusionskomplikationer optræder hyppigst og det oftest er anti-e, anti-jk a og anti-c der identificeres hos patienten. Ved de akutte hæmolytiske transfusionskomplikationer er det Anti-Jk a og anti-wra der optræder oftest (1) Antistoffer ved transfusionskomplikationer AHTK FHTK Figur 1: Implicerede irregulære antistoffer fundet ved AHTK og FHTK (1) Graviditet kan også skabe immunisering og dannelse af irregulære antistoffer. Under graviditeten kan der opstå føtomaternelle blødninger, hvorved der kommer blodceller fra fosteret ind i maters kredsløb. Ved forskel på mater og fosters blodtypeantigener, kan mater danne irregulære antistoffer imod fosterets erytrocytter. Da irregulære antistoffer som sagt er af typen IgG, er de i stand til at placerer placenta og på den måde sensibiliserer fosterets erytrocytter, der efterfølgende destrueres af makrofager. Herefter vil fosteret kompenserer for tabet af erytrocytter, ved en kraftig nydannelse af disse, hvorfor tilstanden kaldes for erytroblatose. Hvis nydannelsen af erytrocytter hos fosteret ikke kan kompenserer for mængden af destruktion, vil Side 12

14 fosteret udvikle anæmi som kan udløse en kaskade af komplikationer, f.eks. hydrops foetalis. Sker immuniseringen ved den første graviditet, opstår sjældent større komplikationer, men mater har nu memory celler (B lymfocytter), hvilket betyder, at hun ved en anden graviditet eller blodtransfusion med uforligelige blodtypeantigener, vil starte et sekundært immunrespons og ovenstående komplikationer kan opstå. RhD immunisering er hyppigst og mest alvorlig, da disse erytrocytantigener er fuldt udviklet tidligt i fosterstadiet, hvorimod AB0 antigenerne først er fuldt udviklet når barnet er ½ -1 år gammelt. Samtidig er det meste Anti-A og Anti-B regulære antistoffer af typen IgM, som ikke kan placerer placenta, og dermed heller ikke udgøre en fare for det ufødte barn (15). Irregulære antistoffer inden for Kell, Kidd og Duffy systemet kan også give anledning til erytroblatose hos fosteret. Immunisering mod K antigenet er specielt alvorlig. Disse antigener findes på meget tidlige stadier af både erytrocytter og trombocytter, hvorfor Anti-K både kan medfører manglende erytropoiese og trombocytpoiese hos fosteret (dannelse af nye erytrocytter og trombocytter). Grundet dette kan fosteret i et meget tidlig stadie udvikle en svær anæmi med død til følge. Da der ikke er tale om en direkte destruktion af erytrocytterne, vil parametre som bilirubin være normal, hvorfor tilstanden er nemmere at overse. Dette er også grunden til, at piger og kvinder i den fertile alder kun bør transfunderes med Kell negativt blod, så evt. komplikationer i forbindelse med graviditet undgås (15). Antistofscreentest ved søjleagglutination Antistofscreentest anvendes til at påvise irregulære antistoffer i patientens plasma. Testen udføres i forbindelse med AB0 og Rh blodtypebestemmelse, og ligeledes ved udførelsen af en BACtest (Blodtype-kontrol-Antistofscreentest computerforlig). Ved testen screenes for de mest klinisk vigtige irregulære antistoffer. Til dette anvendes testerytrocytter med en antigensammensætning der opfylder kravene fra Transfusionsmedicinske Standarder (TMS). Ifølge TMS skal testerytrocytterne til dette formål være bestemt som blodtype 0, derudover bør følgende antigener være repræsenteret: C, c, D, E, e, C w, K, k, Fy a, Fy b, Jk a, Jk b, S og s. Da de irregulære antistoffer er af typen IgG kan de ikke skabe selvstændig agglutination. Gelkort til antistofscreentest indeholder derfor Anti-IgG (Coombs reagens), som vil binde sig til patientens irregulære antistoffer (hvis patienten har sådanne) og danne et agglutinat ved mødet med testerytrocytternes antigener. Gelkuglerne i kortet vil fungerer som en si, og ved centrifugering af Side 13

15 kortet vil et agglutinat ikke kunne passerer igennem og derfor lægge sig oven på gelen, hvorimod der ved en negativ antistofscreentest vil ses et bundfald af testerytrocytter i kortet. På billede 5 ses et sådant gelkort med to positive og en negativ reaktion (2,8,16). Antistofidentifikation & AutoVue Innova Ved en positiv antistofscreentest i forbindelse med Blodtypebestemmelse og BAC test, udføres analysen antistofidentifikation til, at bestemme præcist hvilke irregulære antistoffer patientens plasma Billede 6: Panel-testerytrocytter fra Ortho-Clinical Diagnostics Billede 5: Antistofscreen test i gelkort indeholdende Anti-IgG indeholder. Ved undersøgelsen testes patientens plasma over for et såkaldt panel. Et panel består af 11 erytrocyt-suspensioner som har en nøje udvalgt antigensammensætning, se billede 6. TMS opstiller bl.a. følgende krav til panel-testerytrocytter (2,16): - Alle er af blodtypen 0 - Følgende antigener bør være repræsenteret på panel-testerytrocytter; C, C w, c, D, E, e, K, Fy a, Fy b, Jk a, Jk b, S, s, M, N, Le a, Le b, P1 og Lu a. - Distinkte reaktionsmønstre med de hyppigst forekomne antistoffer skal tilstræbes (f.eks. anti-d, anti-e, anti-c, anti-k og anti-fy a ). - Det bør være muligt at identificere to hyppigt forekomne antistoffer der optræder samtidigt. Ved manuel antistofidentifikation kan analysen bl.a. udføres i gelkort med Coombs reagens, som ved antistofscreentest, hvor et dannet agglutinat vil ligge øverst i gelen. Derudover anvendes den 12. brønd til, at undersøge patientens egne erytrocytter overfor eget plasma, med det formål et opdage eventuelle autoantistoffer (2,16). AutoVue Innova fra Ortho-Clinical Diagnostics er et apparatur der kan udfører immunhæmatologiske in-vitro test, herunder antistofidentifikation. Væskepipettering, kassettehåndtering, Billede 7: Ortho BioVue kassetter til AutoVue Innova, indeholdende Anti-IgG inkubation, centrifugering og reaktionsgraduering foregår automatisk. Til antistofidentifikation anvendes Ortho BioVue kassetter Side 14

16 indeholdende Anti-IgG, se billede 7. I stedet for gel indeholder disse kassetter små glasperler, som dannede agglutinater ikke kan passere (17). På Apparaturet påsættes panel-testerytrocytter og prøvemateriale i hver deres karrusel, hvorefter disse scannes og genkendes. Ved anvendelse af 0,8% panel-testerytrocytter afpipetterer AutoVue Innova 50 µl testerytrocytter og 40 µl patient plasma i hver af de 11 brønde. Herefter inkuberes kassetterne i minutter ved 37 grader og centrifugeres i fem minutter. Til sidst tages et billede ved hjælp af apparaturets AutoReader (kamera) og der rapporteres en reaktionsgraduering på hver brønd. Graduerings styrkerne er som følgende; 4, 3, 2, 1, 0,5 og negativ. Hele instrumentets ombygning kan ses i bilag 1 side 52 (17,18). Antistoftiter Titerværdien angiver styrken af et antistof. Analysen foretages ofte ved gravide med antistoffer der kan udvikle erytroblatose. Stiger titerværdien i løbet af graviditeten danner mater altså antistoffer imod fosteret. Titerværdien bestemmes ved, at undersøge en række fortyndinger af patientens plasma over for panel-testerytrocytter der passer til det antistof man vil bestemme styrken af, se billede 8. Normalt anvendes tofolds fortyndinger (1:1, 1:2, 1:4, 1:8 osv.). Titerværdien angives som den reciprokke værdi af den højeste fortynding hvor der stadigvæk kan observeres en reaktion (8,16). Billede 8: Antistoftiter med faldende reaktionsstyrke grundet fortynding af plasma. Materiale I dette afsnit vil materiale i form af apparatur, utensilier og reagenser nævnes. Derudover beskrives de anvendte kontroller samt forsøgsmaterialet og dets in-og eksklusionskriterier. Som en del af Bachelorprojektet udføres også et titreringsforsøg som ligeledes beskrives under de ovenfornævnte punkter. Apparatur På KIBA i Kolding findes to af apparaturet AutoVue Innova, såkaldt 1 og 2. AutoVue Innova anvendes lige nu til automatiseret blodtypebestemmelse og BAC-test. Efter aftale med funktionsbioanalytikeren anvendes AutoVue 1 til vores forsøg. Til AutoVue Innova tilhører Side 15

17 ligeledes et computersystem, hvorfra apparaturet styres, bl.a. ved påsætning af reagenser, prøver samt åben og luk af AutoVue s døre. Det er ligeledes her resultaterne kommer frem, godkendelse af disse samt bestilling af analyser foregår. Analysen Antistofidentifikation på AutoVue tager ca. 35 minutter pr. prøve og har en kapacitet på fem prøver ad gangen (anbefaling fra Ortho-Clinical Diagnostics produktspecialist). AutoVue kan ikke altid graduere de pågældende reaktioner i kassetternes brønde. Ved disse usikre reaktioner skriver AutoVue s computersystem et?, dette betyder, at man manuelt må vurderer reaktionen og indtaste denne, før et svar fra AutoVue kan godkendes. Andre gange står der FIB hvilket betyder, at AutoVue ikke kan graduerer brønden pga. fibrinogen, og disse skal derfor også vurderes manuelt. I tabel 3, 4 og 5 nedenfor ses en oversigt over de apparaturer, utensilier og reagenser der skal anvendes til både antistofscreentest, antistofidentifikationen og titreringsprojektet. Tabel 3: Anvendt materiale til udførelse af antistofscreentest Screentest Apparatur Utensilier Reagenser Labelprinter til barkoder, Label papir Zebra LP2844 ID-Centrifuge 12S11 (85 G) ID-inkubator 37 S1 Digital pipette + spidser Coobms Anti-IgG ID kort (gelkort) Testerytrocytter / Screenblodlegemer 1, 2 og 3 Tabel 4: Anvendt materiale til antistofidentifikation på AutoVue Innova Antistof identifikation Apparatur Utensilier Reagenser Labelprinter til barkoder, Label papir Zebra LP2844 Megafuge 1,0 R, (1800 G) AutoVue Innova, Ortho- Clinical diagnostic BioVue Kasetter indeholdende Anti-IgG fra Ortho Clinical Diagnostic Panel-testerytrocytter Destilleret vand Natriumhydroxid (NaOH) til rens Side 16

18 Tabel 5: Anvendt materiale til titrerings forsøget Titrerings forsøg Apparatur Utensilier Reagenser Vidalglas Fosfatbufferet saltvand / PBS ID-centrifuge 24 S (85 G) ID-Inkubator 37 SII Digital pipette + spidser Coombs Anti-IgG ID kort (gelkort) (suspension til at lave fortyndinger med) Panel-testerytrocytter Resolvigen 3 Software til antistofidentifikation Derudover anvendes softwaren Resolvigen 3 fra Ortho-Clinical Diagnostics til projektet. Softwaren installeres på AutoVue s computer system, og softwaren er på den måde opkoblet til apparaturet. De antigrammer der ønskes anvendt af softwaren skal lægges ind i programmet af en produktspecialist fra producenten. Resolvigen 3 kan ud fra reaktionerne i kassetterne tilhørende analysen antistofidentifikation, vurdere hvilke mulige irregulære antistoffer der er tilstede i patientens plasma. I nogle tilfælde kommer Resolvigen 3 med flere forskellige forslag til indholdet af antistoffer, hvor det første bud, er softwarens bedste bud på sandheden. Derudover kan Resolvigen foreslå andre analyser der bør foretages ved prøver hvor antistoffet ikke kan identificeres med sikkerhed. Softwaren foreslår f.eks. fænotypebestemmelse af patienten, eller at prøven bør analyseres med et supplerende panel. Softwaren har mange funktioner og jo flere informationer der oplyses i programmet, jo mere har den at arbejde ud fra, f.eks. kan der indlægges supplerende antigrammer/panel-testerytrocytter og under funktionen Patient kan der bl.a. lægges tidligere analysesvar og fænotype ind, og Resolvigen 3 vil dermed tage dette i betragtning når den kalkulerer et svar. Til dette forsøg er kun de tre antigrammer for henholdsvis panel A, B og C lagt ind i Resolvigen 3 og dermed ingen supplerende paneler der kan anvendes ved vanskelig antistofidentifikation. Derudover er det kun funktionen Test og herunder Diagnoses der er anvendt til denne undersøgelse, blot til at se softwarens bud på et antistofsvar. Side 17

19 Paneler til antistofidentifikation og titrering Til forsøget af automatiseret antistofidentifikation på AutoVue Innova testes tre forskellige indkøbte paneler. De tre paneler har hver deres antigramsammensætning som kan ses i bilag 2, 3 og 4. I nedenstående tabel 6 ses informationer omkring panelerne: Tabel 6: Oversigt over diverse informationer på de tre anvendte panel-testerytrocytter Ortho Clinical Diagnostics OUH in-house BioRAD Lot. Nr. 8RA (produktionsdato) Udløbsdato µl testerytrocytter µl µl µl Antal panelanalyser pr. pakke (estimat) 200 (større spild pga. større dram glas) 180 (estimat) 80 (større spild pga. større dram glas) 60 (estimat) Pris (listepriser) 851,51 kr. (19) Ikke oplyst 789 kr. (20) Antal panelanalyser er beregnet som det ses i ligning 1: Ligning 1: Beregning af antal panelanalyser µl testerytrocytter i alt = antal analyser pr. pakke µl testerytrocytter pr. celle Eksempel: 3000 µl 50 µl = 60 analyser Da der i dramglassene vil være en mængde dødvolume tilbage anvendes i stedet et estimat for, hvor mange paneleanalyser der egentlig kan analyseres. På BioRAD og OUH panelet, er dramglassene større, hvorfor dødvolumen her må forventes større. Paneler der ikke kommer fra Ortho (panelerne fra OUH og BioRAD) skal påsættes en unik 10 cifret stegkode, så apparaturet kan genkende dem til lige præcis en antistofidentifikations analyse. Stegkoderne til OUH panelet og BioRAD er fremstillet på hver sin måde, så softwaren der er linket til dem, kan skelne imellem panelernes antigramsammensætning. Side 18

20 Da der udføres titrering af udvalgte prøver/antistoffer med alle tre paneler, udvælges ligeledes hvilke testerytrocytter der passer til de antistoffer der skal titreres. De anvendte paneltesterytrocytter til titreringen er fundet via antigram sammensætningerne, de udvalgte ses i tabel 7 nedenfor: Tabel 7: Udvalgte panel-testerytrocytter til anvendelse ved titrerings forsøget Anvendte paneltesterytrocytter fra Panel A (Ortho) Anvendte paneltesterytrocytter fra Panel B (OUH) Anvendte paneltesterytrocytter fra Panel C (BioRad) Anti-K Nr. 2 Nr. 4 Nr. 2 Anti-Jk a Nr. 1 Nr. 4 Nr. 7 Kontroller Som en del af den daglige rutine analyseres to selvfremstillet kontroller på afdelingen, kontrol 17 og 18. Kontrol 18 indeholder et anti-d og kontrol 17 et anti-k, hvorfor begge skal ende med en positiv reaktion. Kontrollernes formål er at sikre, at parametre som centrifugering, inkubationen og temperatur på AutoVue Innova fungerer som det skal. I dette projekt har vi ikke medtaget nogen positive kontroller, men blot sikret os, at disse to daglige kontroller er analyseret og godkendt, inden vi anvendte apparaturet til vores analyser. Af negative kontroller er medtaget to patientprøver og to NEQAS prøver, som havde en negativ screentest og dermed ikke indeholder nogen irregulære antistoffer. Disse medtages for at sikre, at apparaturet og de anvendte paneler ligeledes kan frikende negative prøver. Forsøgsmateriale Patientmaterialet indsamles på Kolding og Vejle sygehus i form af blodprøver fra perioden 23/06/ /10/2015. Personalet på de to sygehuse nedfryser det overskydende plasma fra blodprøver der blev testet positive for irregulære antistoffer i forbindelse med blodtype- og BAC test i rutinen. Derudover anvendes gamle nedfrosne NEQAS prøver fra Vejle, som indeholder ét eller flere irregulære antistoffer. NEQAS prøverne er fra år 2009, 2011, 2012, 2013 og NEQAS prøver tilsendes fra England flere gange om året og er et kontrolmateriale som laboratoriet skal Side 19

21 identificerer for blodtype, antistoffer mm. I tabel 8 nedenfor ses hvilke irregulære antistoffer, kombinationer heraf og hvor mange af disse der er repræsenteret i dette forsøg. Tabel 8: Irregulære antistoffer medvirkende i denne undersøgelse Antistoffer Antal % Ingen / negative 4 9 C 4 9 C,e 1 2 D 7 15 D,C 3 7 D,K 2 4 E 3 7 E, Jka 4 9 E,Fya 3 7 Fya 1 2 Fya,c 2 4 K 6 13 K,c 1 2 K,Fya 1 2 K, Jkb 1 2 K,Kpa 1 2 S 1 2 S 1 2 I alt ,0 Til titrerings forsøget udvælges ud fra ovenstående prøvemateriale, prøver indeholdende anti-k og anti-jk a. Anti-K er et hyppigt og relativt immunogent antistof og Jk a medtages, da denne som en af de eneste er komplement aktiverende og kan dermed skabe en akut intravaskulær hæmolytisk transfusionskomplikation. Fosfatbufferet saltvand (PBS) ved ph 7,2-7,4 med NaCl indhold på 0,145-0,154 mol/l anvendes til at fortynde patientplasmaet ved fremstilling af en tofolds fortyndigsrække til titrering af antistoffer (2). In- og eksklusionskriterier Som sagt anvendes patientmateriale der tidligere er testes positiv for irregulære antistoffer. Køn, alder mm. på patienten er irrelevant for undersøgelsen. Derudover er det et kriterie, at der som minimum er to ml. plasma tilbage efter personalets rutineundersøgelse, da det er den mængde der som minimum skal bruges til antistofidentifikation med anvendelse af de tre forskellige paneler. Alt prøvemateriale inkl. NEQAS prøver får analyseret en manuel antistof screentest med Coombs Anti-IgG gelkort som sikring for, at prøverne indeholder irregulære antistoffer, prøver med en negativ antistofscreentest frasorteres på nær enkelte udvalgte negative kontroller. Det tilstræbes, at skaffe prøver der indeholder alt fra ét til flere antistoffer. Samtidig vil vi gerne have så mange forskellige antistoffer som muligt, hvor de kliniskrelevante er vigtigst. Prøver hvor resultatet fra den manuelle antistofidentifikation udført af personalet ikke kan spores via ProSang blodbanksystemet, frasorteres ligeledes. Efter sortering er der 18 egnede patientprøver og 28 NEQAS prøver. Side 20

22 Til titreringsprojektet anvendes kun prøver indeholdende antistoffer som kan analyseres på alle tre paneler, så der er et sammenligningsgrundlag. Dette afhænger af antigramsammensætningen på panelet. Derudover kan der kun titreres prøver, hvor der er nok prøvemateriale tilbage efter antistofidentifikation på AutoVue Innova. Metode Professions Bachelor Projektet foregår på Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Sygehus Lillebælt i Kolding og Vejle. Projektet udarbejdes i perioden 2/10/ /12/2015 i samarbejde med to andre bioanalytiker studerende. Projektet består derudover af et pilotprojekt og et titreringsforsøg. Dette afsnit omhandler desuden, projektets design, litteratursøgning, etiske forhold og hvordan de fremkomne resultater skal behandles. Til pilotprojektet anvendes fem gamle patientprøver, som tidligere er brugt som undervisningsmateriale. Alle indeholdende et eller flere kendte antistoffer. Som panel anvendes uddaterede testerytrocytter fra Odense Universitetshospital, som har været anvendt til manuel antistofidentifikation i rutinen. Til pilotprojektet analyseres de dertilhørende prøver på AutoVue Innova og behandles som det er tænkt til Bachelorprojektet. Dette har til formål at træne os i brugen af apparaturet, samt afklare nedenstående punkter. Planen for pilot projektet ses i bilag 5 side Hvor lang tid tager det at analysere et panel? - Hvor mange prøver kan AutoVue Innova analyserer ad gangen? - Hvordan ser resultaterne ud? Og vil AutoVue s computer kommunikerer med Resolvigen 3? - Virker de stregkoder vi får lavet til vores prøver og testerytrocytter? Ovenstående spørgsmål blev belyst og medførte den konsekvens, at vi måtte ændre vores oprindelige stregkoder på vores prøvemateriale og i stedet anvende stregkoder der normalt bruges til nødprocedure. Projektets design Dette projekt er en kvantitativ undersøgelse da det er muligt at optælle resultaterne og dermed lave statistik over dem. Undersøgelsen er ligeledes retrospektiv, da vores prøvemateriale er tidligere anvendte prøver og kontroller, hvor irregulære antistoffer allerede er identificeret og de enkelte forløb er afsluttet. Det kan derfor sammenlignes med arkiv materiale, hvor de tre Side 21

23 undersøgte panelers evne til at identificerer de tidligere bestemte irregulære antistoffer sammenlignes (21). I nedenstående SmartArt (figur 2) ses en oversigt over projektets forløb i kontinuerlig rækkefølge, og inddelt i tre faser, illustreret med hver sin farve. Projektet beskrives desuden mere detaljeret herunder. En protokol for projektets udførelse kan ligeledes ses i bilag 6 side 57. Indsamling af prøver Nye barkoder Bachelor projekt - Analyserer prøver Konstruerer nummersystem til prøverne Pilot projekt Resolvigen Oprette barkoder Oprette profiler i softwaren på AutoVue Innova Opsamle resultater Udarbejde Professions bachelor opgave Screentest Sortering af prøver Titrerings projekt Opsamle resultater Figur 2: SmartArt over projektets forløb, inddelt i 3 faser Fase 1: Prøvemateriale indsamles som beskrevet under Materiale, og hertil konstrueres et simpelt nummersystem, hvor patientprøver tildeles et 100 nr. og NEQAS prøverne et 300 nr. hvor alle numre er fortløbende. Herefter kan barkoderne printes på en manuel labelprinter og påsættes prøverne så det oprindelig rekvisitions nr. eller CPR nr. fra patienter dækkes og sporbarheden elimineres. Til antistofscreentest anvendes Coombs Anti IgG gelkort. I brønd 1, 2 og 3 afpipetteres 50 µl af henholdsvis 0,8% Screen 1, 2 og 3 (testerytrocytter) og 25 µl patientplasma. Kortene inkuberes i 15 minutter ved 37 grader hvorefter de centrifugeres i 10 minutter ved 85 G (22). Herefter frasorteres de prøver der eventuelt skulle vise sig negative ved screentest. Dog medtages Side 22

24 to negative patientprøver og to negative NEQAS prøver, som skal udgøre de negative kontroller til undersøgelsen. Med hjælp fra Kent Elkrog fra Ortho-Clinical Diagnostics, oprettes tre profiler i softwaren på AutoVue Innova og hertil indlægges de dertilhørende antigrammer. Disse profiler skal laves så apparaturet vil acceptere vores tre paneler som ikke har samme antigram og størrelse på dramglas indeholdende testerytrocytter. Fase 2: Pilotprojektet viste, at barkoderne der blev konstrueret til prøvematerialet ikke blev genkendt af AutoVue Innova. Derfor blev disse omnummereret med stegkoder der normalt anvendes til nødprocedurer. Inden analysering på AutoVue Innova centrifugeres alt prøvemateriale i 5 min. med 1800 G. Dette gøres da prøverne har været nedfrosset og tøet op mange gange og indeholder derfor uklarheder. Ved både pilot- og Bachelorprojekt skal analysen Antistofidentifikation bestilles manuelt på apparaturet, da vores prøver ikke figurer i ProSang blodbanksystem, hertil vælges det panel (A, B eller C) der ønskes anvendt til analysen. Herefter kan prøverne sættes på apparaturets karrusel og genkendes af AutoVue Innova. Alle prøver analyseres med ét panel ad gangen, så risikoren for fejl mindskes og der spares tid i form af mindre scanningsarbejde og genkendelse på AutoVue. Alle reaktioner der fremkommer på AutoVue Innova kontrolleres manuelt ved, at sammenligne kassetternes brønde med apparaturets resultat. Alle resultaterne (reaktioner i brøndene) printes, gemmes og indtastes i et Excel ark, disse kan ses i bilag 7.1 side Resultaterne fra AutoVue Innova indhentes i Resolvigen 3 som beskrevet i bilag 6 side 57, hvorefter softwaren kommer med et bud på hvilket/hvilke antistof/antistoffer der passer med den enkelte reaktion, dette indtastes i et Excel ark og udgør hovedprojektets rådata, se bilag 7.2 side 62 og 63. Fase 3: Titreringsprojektet er et delforsøg og udarbejdes for, at undersøge hvor lav koncentration af udvalgte irregulære antistoffer de tre paneler hver især kan detekterer. Titreringen udføres manuelt ifølge forskriften fra Qualiware kvalitetsstyringssystem, hvor der Side 23

25 titreres ud i 12 fortyndinger, forskriften hertil ses i bilag 8 side 64. Det første vidalglas indeholder kun patient plasma, hvorimod der afpipetteres 100 µl PBS i glas Herefter afpipetteres 100 µl plasma fra glas 1 til glas 2. Efterfølgende afpipetteres der 100 µl fra glas 2 til 3, fra 3 til 4 osv. Til vores projekt afpipetteres dog tre gange så store mængder, da prøven skal titreres overfor alle tre paneler. De 12 fortyndinger opdryppes i gelkort indeholdende Coombs reagens, der afpipetteres 50 µl panel-testerytrocytter (se hvilke i skemaet under Materiale) og efterfølgende 25 µl patient plasma pr. brønd. Gelkortene inkuberes i 15 minutter ved 37 grader og centrifugeres i 10 minutter ved 85 G. Resultaterne/titerværdierne indtastes i et Excel ark, rådata for titrerings projektet ses i bilag 9 side 65. Databearbejdning For at illustrere hvordan panelerne adskiller sig fra hinanden ved antistofidentifikation anvendes deskriptiv statistik i form af procentregning, diagrammer og tabeller. Dette skal skabe et overblik over fordelingen af bl.a. antal rigtige og forkerte antistofsvar. Et svar kategoriseres som rigtigt, når panelet som minimum har bestemt samme antistoffer som ved den manuelle validerede metode og for NEQAS prøverne gælder det antistofsvar som firmaet har sendt ud, som værende det rigtige antistof indehold i materialet. Hertil er det også undersøgt, om personalet på sygehuset var i stand til at identificerer de rigtige antistoffer fra NEQAS, hvilket resulterede i 100 % overensstemmelse. Resultater indeholdende de rigtige antistoffer + ekstra fundne antistoffer indgår ligeledes i kategorien rigtig svar. Et svar kategoriseres som værende forkert, når panelet har bestemt et helt andet antistof end det oprindelig, dette indebærer ligeledes de falske negative svar og når panelet kun var i stand til at detekterer ét ud af flere antistoffer. Ligeledes vil de rigtige og forkerte svar opdeles i flere mindre kategorier, der har til formål at illustrere hvad der er årsag til udfaldet, samt hvilke antistoffer der er involveret. Ved nogle af AutoVue s resultater kommer Resolvigen 3 med en lang række bud på antistofsvar. I denne opgave er det kun det første og dermed softwarens bedste bud, der er taget i betragtning. Derudover blev der ved forsøget observeret en score- og en errorværdi ved alle antistofsvar, oplyst af Resolvigen, disse er ligeledes ikke en del af denne opgave. Side 24

26 Der vil anvendes qq-plots til at undersøge, om de gennemsnitlige reaktionsstyrker for de 46 prøver med hvert af de tre paneler er normalfordelte, qq-plots ses i bilag 10 side 66. Observeres en normalfordeling, vil ANOVA (ensidet variansanalyse) anvendes til at teste for statistisk signifikans forskel i reaktionsstyrkerne for de tre paneler. Dette skal medvirke til at opklare, om panelerne adskiller sig på denne parametre, altså om ét af panelerne f.eks. opnår mere distinkte reaktioner end de andre. Derudover anvendes Chi 2 test som konkluderende statistik. Denne skal påvise, om der ses en statistisk sammenhæng imellem rækkevariablerne og kolonnevariablerne, i dette tilfælde en sammenhæng imellem det anvendte panel og antallet af rigtige og forkerte antistofsvar. Til at bestemme dette anvendes antallet af observerede rigtige og forkerte svar i forhold til antallet af forventede rigtige og forkerte antistofsvar for henholdsvis panel A, B og C. Signifikansniveauet for testen er 0,05 og H0 og H1 hypoteserne tilhørende denne Chi 2 test er som følgende: H0: Der er ingen sammenhæng imellem de anvendte paneler og rigtige/forkerte antistofsvar H1: Der er sammenhæng imellem de anvendte paneler og rigtige/forkerte antistofsvar Ud fra observationerne beregnes sandsynlighederne for, at få et rigtigt eller forkert svar. Disse anvendes til at beregne de forventede værdier. Sandsynlighederne er beregnet som i ligning 2: Ligning 2: Beregning af sandsynlighed til anvendelse ved Chi 2 test. Sandsynlighed = Total rigtige el. forkerte observerede værdier Total F. eks. (se evt. resultaterne): Sandsynlighed for rigtige = = 0,74 Der er analyseret 46 prøver med hvert af de tre paneler, man vil således beregne de forventede antal rigtige og forkerte svar ved, at multiplicerer de 46 med de beregnede sandsynligheder, se eksempel i ligning 3 nedenfor. Ligning 3: Beregning af forventede værdier: Forventet rigtig værdi for Panel A = 46 0,74 = 34 Side 25

27 P værdien for Chi 2 testen er beregnet via følgende Excel funktion: Ligning 4: Formel til beregning af Chi 2 test via Excel funktion = CHI2.TEST(oberveret_værdi;forventet_værdi) Titreringsforsøgets titerværdier indsættes i et skema, hvorefter det panel med den højeste titerværdi for den enkelte prøve tildeles en karakter på en 1, og de andre får karakteren 0. Optræder der ens titerværdier imellem panelerne, tildeles de begge/alle karakteren 1. Til sidst regnes en samlet karakter pr. panel. Litteratursøgning Søgning af kilder er foregået fra d. 19/06/ /11/2015. I den indledende fase er der anvendt fagbøger til at skabe en grundviden omkring antistoffers opbygning, funktion og egenskaber, herunder hvilke komplikationer disse kan medfører. Viden om analyseprincipperne til de forskellige anvendte analyser i projektet er ligeledes fundet i fagbøger men også i sygehusets egne forskrifter og protokoller. Derudover er manualer fra apparaturets firma brugt til, at opnå en viden omkring anvendelse, opbygning og analyseprincip for AutoVue Innova. I starten er der også anvendt Google til at skabe et overordnet overblik omkring projektets emner. Yderligere er rapporter som Transfusionsmedicinske Standarder og DART anvendt til et dybere indblik i transfusionsmedicin, herunder irregulære antistoffer. Af andre søgedatabaser kan nævnes PubMed, som er brugt til søgning efter primær litteratur inden for emnet. Anvendte søgeord: Blood transfusion, Alloantibodies, red blood cell alloantibodies, antibody identification, antibody identification automation, AutoVue Innova, irregular antibodies frequencies, Resolvigen 3. Etik Til projektet har vi anvendt plasma fra patienter der i forvejen fik taget disse blodprøver fremfor, at tage vores egne prøver fra patienter med irregulære antistoffer. Dette kan relateres til pligtetikken, da disse patienter ikke udsættes for unødig blodprøvetagning, i en situation hvor de Side 26

28 selv har brug for det. Der tages altså højde for patients behov og tilstand for at opnå målet med projektet (23). Ifølge Den Videnskabsetiske komite er materiale kun anonymt såfremt det ikke kan spores tilbage til doner, hvorfor vi har valgt, at skabe vores eget nummersystem og efterfølgende fjerne de oprindelige numre, så der ikke kan spores tilbage til hvilke patienter der har deltaget. Dette betyder dog også, at patienten ikke får besked, hvis der skulle opstå ny viden omkring indholdet af irregulære antistoffer i patientens plasma (24,25). Prøvematerialet er anvendt uden direkte sammentykke fra patienten, men ifølge Sundhedslovens kap. 7, 32, må biologisk materiale som en patient har afgivet i forbindelse med behandling, videregives til en forsker til brug for et konkret sundhedsvidenskabeligt forskningsprojekt, med mindre patienten har fået registeret en anden beslutning efter 29 stk. 1 i Vævsanvendelsesregisteret. Samtidig er det ifølge Sundhedslovens 29 stk. 4 den sundhedsperson der er ansvarlig for opbevaring af biologisk materiale, der er forpligtet til at undersøge om patienten ikke ønsker materialet anvendt til andet end patienten selv. Foreligger der ikke et særlige krav om dette, kan patientmaterialet anvendes til udvikling af egne analyser og undervisning (25,26). Vores projekt er ligeledes ikke anmeldt til Den nationale videnskabsetiske komite, da komitelovens 14 stk. 3 siger, at Sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter, hvori der alene indgår anonymt menneskeligt biologisk materiale, der er indsamlet i overensstemmelse med lovgivningen på indsamlingsstedet, ikke skal anmeldes medmindre der er tale om et forskningsprojekt vedrørende befrugtede menneskelig æg samt kønsceller (24). Resultater I dette afsnit ses resultaterne opnået ved databearbejdningen af det fremskaffede rådata som kan ses i bilag 7.2 side 62 og 63. Tabel 9 som ses nedenfor viser de opnåede antistof resultater for de tre paneler, den første er svarene for patientprøverne sammenholdt med antistofsvaret fra ProSang blodbanksystemet. Den anden tabel viser svarene for NEQAS prøverne, som sammenlignes med det antistofsvar NEQAS har sendt ud som værende det rigtige. For begge skemaer gælder, at de svar markeret med grøn er rigtige, de røde er forkerte antistofsvar og et betyder, at intet antistof blev identificeret. Hvad der er rigtigt og forkert er defineret under Metodeafsnittet omkring Databearbejdning. Side 27

29 Numre Tabel 9: Oversigt over antistofsvar for patientprøverne og NEQAS prøverne med anvendelse af de tre paneler. Grønne resultater kendetegner rigtige antistofsvar og de røde er forkerte svar Prosang resultat Panel A - Ortho Panel B - OUH Panel C - BioRad Numre NEQAS resultat Panel A - Ortho Panel B - OUH 101 E, Jk a E, Cw, E E, Jk a Jk a 102 C K K K K E D D D D 307 Fy a Fy a Fy a K K K K 109 K K K K 309 K K K K 112 C Cw Cw Js a 310 D D D D 113 K K K K 311 D D D D Panel C - BioRad 114 E, Jk a E, Jk a E, Jk a E, Jka, 312 D, C C w G G Xg a 115 E, Jk a E, Jk a E, Jk a E, Jka 313 Fy a, E Fy a, E Fy a, E Fy a, E 116 E, Jk a E, Jk a E, Jk a E, Jka, 314 D, K D, K D, K Js a Xg a 117 C E K, Kp a K K, Kp a K, Kp a 119 D D D Js a 316 E E E E 122 E E - E 319 K, Jk b K, Jk b K, Jk b Js a 123 C C C C 320 Fy a, c Fy a, c c, Js b c, C w 124 E Fy a, E Jk b, s D, Fy a, Fy a, E E 126 S E, Le b Le b, Lu a D D D D 127 D,C D, C D, C D, C 324 D D D D 325 D D, C w D D 326 K, Fy a C, K, C w, K, K, Fy a Fy a Fy a, S 327 D, C D, C D, C C, Js a 328 K, c c, Fy b E, c, K K, c 329 E, Fy a E, Fy a E, Fy a E, Fy a 332 D, K D, K D, K Js a 334 K K K K 335 C, e C, Fy a, Jk a C, Le a C, e, Jk a, S 336 S S S K, S 338 Fy a, c c, Fy a c, Js b c, C w Side 28

30 Procent - % Procent - % Andel i % Kamilla Christensen Professions Bachelor Projekt I figur 3 til højre ses fordelingen af antallet rigtige og forkerte antistofsvar opnået ved anvendelse af Resolvigen 3 på henholdsvis panel 1, 2 og 3. Tabellen viser resultatet for alle prøverne, det vil sige både patientprøver og NEQAS prøver. I figuren ses det, at panel A opnåede flest rigtige og færrest forkerte svar, hvorimod Panel 3 havde flest forkerte og færreste rigtige antistofsvar. Andel Rigtige & Forkerte svar 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 21,74 % 23,91 % 32,61 % 78,26 % 76,09 % 67,39 % PANEL A - ORTHO Rigtige svar PANEL B - OUH PANEL C - BIORAD Forkerte svar Figur 3: Samlede rigtige og forkerte antistofsvar for de tre paneler Opdeles NEQAS og patientprøverne i hver sin gruppe, ses fordelingen af rigtige og forkerte svar nedenfor i figurerne 4 og 5. Alle tre paneler havde nemmere ved, at identificere antistofferne i NEQAS prøverne. Derudover havde panel B flest rigtige svar ved NEQAS prøverne og Panel A havde flest rigtige svar ved patientprøverne. Panel B og C opnåede samme resultater ved antistof identifikationen af patientprøverne. Figur 4: Rigtige og forkerte antistofsvar for NEQAS prøverne NEQAS prøver Figur 5: Rigtige og forkerte antistofsvar for patient prøverne Patient prøver 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 82,14 % 85,71 % 17,86 % 14,29 % PANEL A - ORTHO PANEL B - OUH 71,43 % 28,57 % PANEL C - BIORAD 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 72,22 % 27,78 % PANEL A - ORTHO 61,11 % 61,11 % 38,89 % 38,89 % PANEL B - OUH PANEL C - BIORAD Rigtige svar Forkerte svar Rigtige svar Forkerte svar Side 29

31 Efterfølgende er både de rigtige og forkerte svar opdelt i forskellige kategorier. I figur 6, ses hvordan de rigtige svar fordeler sig, ud på to kategorier. Den første kategori er de antistofsvar som stemmer 100 % overens med det oprindelige resultat fundet ved den manuelle metode eller bestemt af NEQAS. Den anden kategori er de svar som ligeledes har fundet de rigtige antistoffer, plus ét eller flere antistoffer som der ikke er bestemt oprindeligt. For alle tre Fordeling af rigtige svar Panel A - Ortho Panel B - OUH Panel C - BioRad 91,67 91,43 87,10 paneler gælder, at langt størstedelen af de rigtige svar, stemte helt overens med det 8,333 8,571 12,90 oprindelige bud på antistoffer. 100 % MATCH RIGTIG + FLERE ANTISTOFFER Figur 6: Fordelingen af de samlede rigtige antistofsvar for de tre paneler Ved 22 af de analyserede prøver var alle tre paneler helt enige i deres antistof svar, uanset om dette svar er rigtigt eller forkert, hvilket svarer til 47,83 % af antistofsvarene, se tabel 10. Dog er langt størstedelen af de svar, som panelerne er enige i, rigtige. Panelerne er ligeledes mest enige om antistofsvaret, når der kun skal identificeres ét antistof. Tabel 10: Enighed imellem panelerne, både ved forkerte og rigtige antistofsvar, samt graden af enighed ved antallet af antistoffer Enighed imellem panelerne Antal % Total enighed ud af de 46 prøver 22 47,83 Enighed ved rigtige svar 20 90,91 Enighed ved forkerte svar 2 9,091 Fordeling af enighed Enighed ved ét antistof 15 68,18 Enighed ved ingen antistoffer / negative prøver 3 13,64 Enighed ved mere end ét antistof 4 18,18 I alt Side 30

32 I figur 7 ses hvordan enigheden imellem panelerne fordeler sig over de forskellige antistoffer. De fleste prøver som panelerne er enige i, at identificere, ses ved bestemmelsen af anti-k og anti-d, som tilsammen udgør 50 % af de prøver som panelerne er enige i at identificerer. De forkerte antistofsvar er fordelt over tre kategorier. Den første er antallet af falsk negative svar for de tre paneler. Anden kategori er de antistofsvar, som er helt forskellige fra det oprindelig bestemte og den tredje grupper er de svar som delvist er rigtige, da panelerne kun har bestemt ét eller to ud af flere antistoffer. Fordelingerne i de forskellige grupper ses i nedenstående figur 8. Ud af panel A s forkerte svar var 50 % af dem et helt andet antistof, 20 % 20,00 % 36,36 % 33,33 % FALSK NEGATIVE Fordeling af forkerte svar Panel A - Ortho Panel B - OUH Panel C - BioRad 50,00 % 27,27 % 46,67 % ET HELT ANDET ANTISTOFSVAR 36,36 % 30,00 % 20,00 % KUN ÉT UD AF FLERE ANTISTOFFER ER BESTEMT Figur 7: Fordelingen af de samlede forkerte antistofsvar for de tre paneler, fordelt på tre kategorier. Fordeling af antistoffer E, Fya 9% E, Jka 4% E 9% Negative (-) 14% C 9% D,C 5% var falsk negative og for resten af svarene var antistofferne kun delvist bestemte. For panel B er fordelingen af falsk negative og delvist bestemte antistoffer lige store og de sidst 27,27 % forkerte svar er helt andre antistoffer. For panel C var størstedelen af de forkerte svar et helt andet antistof, efterfulgt af 33,33 % falsk negative og 20 % forkerte svar der kun bestemte ét ud af flere antistoffer. K 27% D 23% Figur 8: Fordelingen af irregulære antistoffer ved enighed imellem panelerne. Side 31

33 Tabel 11: Antistoffer impliceret ved forkerte antistofsvar for de tre paneler. I tabel 11 ses hvilke antistoffer der optræder ved svar som panelerne har haft forkerte. Under kolonnen Antistoffer er skrevet hvilket antistof, der oprindeligt skulle være i prøven. Dette betyder f.eks., at panel A har haft tre forkerte svar, hvor det skulle have bestemt Anti-C, ifølge den anvendte manuelle metode. Fordeling af antistoffer ved forkerte svar Antistoffer Panel A- Ortho Panel B- OUH C E s Fya D Mere end ét antistof Forkerte svar i alt Panel C- BioRad Skemaet viser blandt andet, at alle tre paneler har flest forkerte svar, når der er mere end ét antistof tilstede. Samtidig har alle tre paneler flest forkerte svar ved anti-c, når der kun er ét antistof der skal identificeres. Derudover har panel C som det eneste panel ét forkert svar ved identifikationen af Anti-D samt ét falsk positiv svar. Som nævnt tidligere, kommer softwaren Resolvigen 3 ved visse prøver med en kommentar/ et forslag til yderligere analyser af prøven. I nedenstående tabel 12 ses hvor mange gange en kommentar optrådte for de tre paneler. Samtidig ses det, hvor mange af disse der er NEQAS og patientprøver, samt hvor mange af svarene der var rigtige og forkerte. Tabel 12: Oversigt over mængden af kommentarer fra Resolvigen Panel A - Ortho Panel B - OUH Panel C - BioRad Patient prøver NEQAS prøver I alt Rigtige svar Forkerte svar I alt Side 32

34 Reaktionsstyrkerne for de tre paneler er ikke normalfordelte, se qq-plots i bilag 10 side 66, hvorfor der ikke kan udføres en ANOVA undersøgelse på disse. Figur 3 viste en procentvis forskel i antallet af rigtige og forkerte antistofsvar for de tre paneler. Denne forskel skal undersøges for værende signifikans ved udførelsen af en Chi 2 test. Nedenfor i tabel 13 ses de observerede og forventede værdier ved en Chi 2 test. Testen resulterer i en P-værdi på 0,45 som er større end signifikansniveauet på 0,05, hvorfor H0 hypotesen accepteres og der kan ikke antages nogen statistisk sammenhæng imellem mængden af rigtige og forkerte antistofsvar og de anvendte paneler. Tabel 13: Sandsynligheder for rigtige og forkerte antistofsvar samt observerede og forventede værdier ved en Chi 2 test. Observeret Forventet Rigtige Forkerte Total Rigtige Forkerte Total Panel A - Ortho Panel A - Ortho Panel B - OUH Panel B - OUH Panel C - BioRad Panel C - BioRad Total Total Sandsynlighed for et rigtigt svar 0,74 Sandsynlighed for et forkert svar 0,26 P værdi for Chi 2 test 0,45 I tabel 14 nedenfor ses en oversigt over titreringsforsøget. Hvert panel har opnået en titerværdi og en karakter som beskrevet under afsnittet Databearbejdning. Panel A opnår den højeste karakter og Panel B den laveste. Derudover ses det, at Panel B er negativ ved alle prøverne indeholdende Jk a, selvom panelet fandt antistoffet ved antistofidentifikation på AutoVue, se tabel 9. Tabel 14: Titerværdier og karakter for de tre paneler ved titrering af Anti-K og Anti-Jk a. Titrering af 6 prøver Panel A Ortho Panel B - OUH Panel C - BioRad Prøve Antistof Titer Karakter Titer Karakter Titer Karakter 309 K K K Jk a Jk a Jk a Samlet karakter Side 33

35 Diskussion I dette afsnit diskuteres undersøgelsens metode samt de opnåede resultater, hvor begge dele sammenholdes med teorien inden for området. Samtidig vil den anvendte software, Resolvigen 3 diskuteres og fremtiden for antistofidentifikation på KIBA vil ligeledes behandles i dette afsnit. Derudover anvendes videnskabelige artikler til, at danne belæg for påstande og argumenter samt diskuterer hvad andre undersøgelser med samme emner som er behandlet i denne opgave, har opnået af viden. Egen metode Denne undersøgelse er basseret på både patientmateriale og gamle NEQAS prøver som har været nedfrosset og optøet af flere omgange. Prøvematerialets kvalitet i denne undersøgelse er derfor behæftet med en vis usikkerhed, da man ved, at frysning og tid (alder på materialet) kan påvirke de irregulære antistoffer og i visse tilfælde helt forsvinde fra prøven. Dette er også en af årsagerne til, at der blev udført en antistofscreentest på alle prøver inden projektet. De fleste irregulære antistoffer har temperatur optimum ved 37 grader, men kan ifølge teorien kan de opbevares i flere måneder ved minus 20 grader, mange af vores prøver er dog meget ældre og kan derfor være påvirket af dette (10,27). Alt prøvemateriale blev centrifugeret inden antistofidentifikationen på AutoVue Innova, da mange af prøverne indeholdte uklarheder. Normalt centrifugeres plasma til antistofidentifikation ikke, og det vides derfor heller ikke, om dette har påvirket kvaliteten på vores prøvemateriale. Omvendt kunne det heller ikke risikeres, at uklarhederne påvirkede analyseresultatet eller ligefrem tilstoppede pipetten på apparaturet. I dette projekt er langt fra alle irregulære antistoffer repræsenteret, da dette havde krævet mange flere antal prøver og ikke mindst længere tid, at fremskaffe disse, da nogle antistoffer er meget sjældne. Undersøgelsens resultater kan derfor ikke nødvendigvis direkte overføres eller sammenlignes med identifikationen af andre antistoffer end de undersøgte. I forhold til teoriens beskrivelse af hvilke antistoffer der er kliniske relevante, er alle disse dog repræsenteret i denne undersøgelse, og projektet dækker derfor de antistoffer der har den største betydning for patienterne i forhold til komplikationer som følge af irregulære antistoffer (9). Side 34

36 I undersøgelsen er 4 ud af de 46 prøver negative for irregulære antistoffer. Mængden af negative prøver og apparaturets evne til, at kunne frikende patienter uden irregulære antistoffer er mindre vigtig, da en prøve ved antistofidentifikation hellere må være falsk positiv end falsk negativ. En falsk negativ prøve kan skabe transfusionskomplikationer og immunisering af patienten, hvorimod en falsk positiv ikke har nogen konsekvenser for patientens helbred, da patienten ikke vil blive immuniseret. Det anvendte blod ved en eventuel transfusion, vil blot være negativ for det antigen, man troede patienten havde antistoffer imod (2,8). Som beskrevet under Materiale og Metode er der ikke selvstændigt anvendt nogen positive kontroller i forbindelse med antistofidentifikationen på AutoVue Innova. Men det er noteret, at personalet på afdelingen har analyseret deres daglige kontroller, som sikre at AutoVue s centrifuge, inkubator mm. fungerer som det skal og det burde derfor ikke have nogen betydning for vores analysesvar. I øvrigt medtages der ligeledes ingen specifik kontrol af analysen, ved den nuværende manuelle antistofidentifikation. Derudover er kassetterne anvendt til antistofidentifikation ikke kontrolleret, da disse er indkøbt alene til vores projekt, normalt udføres der modtagekontrol på disse. Da kassetterne udelukkende er anvendt til eget forsøg og ikke i forbindelse med analyser, der kan få konsekvenser for patienten, er betydningen af modtagekontrollen mindre vigtigt, men omvendt kan det heller ikke dokumenteres, at de anvendte kassetter er godkendt til analysering. Titreringsprojektet: I forbindelse med projektet blev der udført et delforsøg i form af titrering. Der blev titreret seks prøver, tre indeholdende anti-k og tre med Anti-Jk a. Projektet var tiltænkt lang større og med flere irregulære antistoffer repræsenteret, men grundet manglende prøvemateriale efter hovedprojektet (antistofidentifikationen), var dette ikke en mulighed. Selvom anti-d er mere immunogent, valgte vi ikke at titrere denne, da der alligevel altid tages højde for dette antistof ved f.eks. blodtypebestemmelse. Men på afdelingen findes et såkaldt Reference Anti-D, hvor den præcise koncentration kendes. Til titreringsprojektet kunne denne med fordel være anvendt på de tre paneler for at undersøge, om de alle var i stand til at titrere den korrekte mængde Anti-D (8,9). Trods forsøgets lille størrelse er det ikke tilfældigt hvilke antistoffer der blev titreret, begge er yderest relevante indenfor transfusionsmedicin. Anti-Jk a kan som et af de eneste irregulære Side 35

37 antistoffer aktiverer immunforsvarets komplementsystem og dermed skabe akut intravaskulær hæmolyse som er en alvorlig tranfusionskomplikation, hvorfor det er vigtigt, at panelerne kan detektere selv små mængder af dette antistof. Immunisering imod K antigenet er ligeledes alvorlig, og samtidig er dette et af de hyppige forekommende irregulære antistoffer. Immunisering er specielt alvorlig for kvinder i den fertile alder, da disse antigener findes på meget tidlige stadier af både erytrocytter og trombocytter og kan dermed forårsage erytroblatose hos et foster, hvorfor panelerne ligeledes bør kunne detektere lave koncentrationer af anti-k (2,15). Titreringen er foretaget i Coombs Anti-IgG ID Gelkort, da dette er den nuværende metode der anvendes til titrering af antistoffer. Til antistofidentifikationen på AutoVue Innova blev der anvendt BioVue Anti-IgG kassetter, og da titreringerne skal anvendes i forhold til de tre paneler hertil, burde der også være anvendt kassetter til udførelse af titreringsforsøget. Til titreringen af Anti-K og Anti-Jk a er der udvalgt panel testerytrocytter fra hvert panel. Ved alle paneler var der mere end én mulighed for valg af testerytrocytter og det vides derfor ikke, om nogen af de andre havde givet mere distinkte titreringsresultater. Panelerne Antigramsammensætning: Alle tre paneler opfylder kravet om hvilke antigener der bør være repræsenteret til analysen Antistofidentifikation ifølge Transfusionsmedicinske standarder (TMS). Samtidig anbefaler TMS, at nogle af de immungene og hyppigt forekommende antistoffer bør give distinkte reaktionsmønstre (Anti-D, Anti-E, Anti-c, Anti-K og Anti-Fy a ). I tabel 15 ses, at alle panelerne har meget distinkte reaktionsmønstre ved Anti-E og Anti-K. Samtidig har alle tre paneler anti-c w som et underliggende antistof for anti-d og et anti-e som underliggende for anti-c (2). Side 36

38 Tabel 15: Oversigt over svagheder ved udvalgte antistoffer i antigrammerne for de tre paneler. Underliggende antistoffer for panelerne ved hyppigt forekomne antistoffer Panel A Ortho Panel B OUH Panel C BioRad Antistoffer der altid er underliggende Antistoffer hvor alle de andre er underliggende Andet Kp a, Lu a Wr a Ingen k, Kp b, Js b, Lu b k, Kp b k, Lu b Js a og Js b er ikke testet Anti-D C w C w, Kp a C w Anti-E Ingen Ingen Ingen Anti-c E, f E E, Kp a, Le a, Lu a Anti-K Ingen Ingen Ingen Anti-Fy a C w Kp a, Lu a C w Derudover har både panel A og B enkelte antistoffer som altid vil være underliggende, da de har negative reaktioner igennem alle 11 brønde, se antigrammerne i bilag 2, 3 og 4 (side 53-55) dette må derfor antages som en svaghed ved disse paneler. Omvendt har panel C, to antistoffer i sit antigram hvor ingen reaktioner er noteret, da disse ikke er testet. Som det også ses i tabel 15 har panel A flest antistoffer som giver positive reaktioner i alle 11 brønde, hvilket betyder, at alle de andre antistoffer dermed også kan være underliggende for dem. Jo flere af disse helt positive og helt negative reaktioner et panel har, jo mindre distinkt må det antages at være. Panel B er et Odense Universitetshospital (OUH) selv laver ud fra donorer med en speciel antigensammensætning. Dette betyder også, at panelet er sårbar over for udmeldelser fra disse donorer. Hvis bare én stopper, er det rigtig besværligt at finde en ny donor der passer ind i panelsammensætningen, da donor skal have den rette antigensammensætning, medmindre der skal laves en helt ny kombination af donorer, som også vil kræve et stort stykke arbejde. Panel A og C fremstilles også ud fra humane donorer og står derfor overfor samme udfordringer, Side 37

39 dog vil internationale virksomheder som producenterne af disse, have tilgang til et meget stort donorkorps. En anden fordel ved panel A og C er, at Ortho-Clinical Diagnostics som fremstiller panel A og Bio-RAD, som fremstiller panel C tilbyder begge supplerende paneler til kompleks antistofidentifikation, hvilket kan være en fordel, så afdelingen ikke skal bruge ressourcer på, at lave supplerende manuelle test ved de prøver, hvor antistofferne er svære at identificere (28,29). Prisen: Prisen på panel B har desværre ikke været muligt at fremskaffe, da denne som sagt produceres af OUH, som er en del af samme region som Sygehus Lillebælt. Dette betyder, at afdelingen ikke direkte betaler for, at modtage dette panel, da det indgår i en stor samlet pulje med andre samarbejdsaftaler der foreligger med OUH. Eftersom det er et selvfremstillet panel, må OUH bruge økonomiske ressourcer i forbindelse med fremstillingen bl.a. i form af utensilier, reagenser, penge til donor og ikke mindst arbejdsløn til den/ de bioanalytikere der skal fremstille panelet. Panel B har en holdbarhed på fire uger, hvorfor det må forventes, at OUH som minimum skal tilsidesætte tid til fremstillingen én gang i måneden. Af de to andre paneler er panel C (BioRad) den billigste med en pris på 789 kr., hvorimod panel A (Ortho) koster 851,51. Dertil kommer, at panel C indeholder 4000 µl panel-testerytrocytter og panel A kun indeholder 3000 µl, hvorfor der kan være økonomiske fordele ved at vælge panel C frem for panel A (19,20). Resolvigen I dette projekt blev Resolvigen 3 fra Ortho-Clinical Diagnostics anvendt til at lette identifikationen af irregulære antistoffer. Den store fordel ved denne software er, at reaktionstyrkerne ikke manuelt skal vurderes over for et antigram. Reaktionerne fra AutoVue s computersystem overføres i stedet for direkte til Resolvigen 3 hvorefter et antistofsvar foreligger. Desuden kan anvendelsen af softwaren sagtens udvides ved, at der indlægges flere antigrammer og patientinformationer i programmet, hvorved Resolvigens grundlag for at identificere et antistof øges. Derudover kan Resolvigen anvende andre paneler, end dem, der fremstilles af producenten Ortho-Clinical Diagnostics, hvilket er en fordel, da den enkelte afdeling selv kan vurdere hvilket panel de finder bedst. Samtidig muliggør det også, at flere forskellige paneler kan kombineres til identifikationen af irregulære antistoffer. Side 38

40 Ulemperne ved Resolvigen 3 er, at softwaren er kompleks og dermed kræver grundig oplæring af en produktspecialist, hvis alle funktionerne skal udnyttes. Derudover bidrager softwaren med langt mere information og diverse forslag ved et antistofsvar, end nødvendigt. Dette kan medføre forvirring omkring hvad der er Resolvigens bedste bud på et korrekt resultat. Disse fordele og ulemper ved Resolvigen bekræftes ligeledes af et Indisk studie fra 2014 som desuden omtales senere i diskussionen (30). Resultater I denne opgave sammenlignes de fundne antistoffer i patientprøverne med det svar der allerede foreligger i ProSang blodbanksystemet fra personalets manuelle antistofidentifikation. Dette svar stammer fra den validerede metode på afdelingen og er derfor antaget som værende det sande svar. Dog kan det ikke vides med sikkerhed, om dette resultatet er mere rigtigt end det der bestemmes via AutoVue Innova og Resolvigen 3. Fordelen ved patientmaterialet er dog, at dette repræsenterer et mere nuanceret billede af hvordan prøvemateriale udspiller sig i virkeligheden. NEQAS prøvernes indhold derimod kendes med sikkerhed, da disse er kommercielt fremstillet til kontrolmateriale, hvorfor resultaterne fra disse er nemmere at stole på, da et resultat fra vores undersøgelse direkte kan sammenlignes med svaret fra NEQAS. Ulemperne ved NEQAS prøverne i denne undersøgelse er, at mange af dem er flere år gamle og det vides ikke, hvor mange gange de har været nedfrosset og optøet igen, samt hvad andre eventuelt har brugt dem til og udsat prøverne for. En mulighed havde også været, at lave selvfremstillede prøver, hvor der til plasma, uden irregulære antistoffer, kunstigt blev tilsat sådanne. Ligesom med NEQAS prøverne ville man opnå en stor sikkerhed i forhold til indholdet i prøverne og der skabes kontrol over hvilke antistoffer og hvor mange af disse der skulle repræsenteres i forsøget. Ikke mindst i forhold til titreringsforsøget havde dette været nyttigt, da man ville vide præcist hvilken koncentration af antistoffer der bør findes i de enkelte prøver. Resultaterne af vores undersøgelse viste, at alle tre paneler havde langt over halvdelen af deres svar rigtigt. Panel A opnåede flest rigtige antistofsvar med 78,26 % rigtige, hvilket er overraskende i forhold til, at dette panel havde flest svagheder i forhold til underliggende antistoffer i antigrammet. Dog er dette panel af samme producent, som laver AutoVue Innova og Resolvigen, hvorfor det kan forstilles, at deres system er designet til fungere optimalt med deres egne panel Side 39

41 testerytrocytter. Et Indisk studie fra 2014 har ligeledes afprøvet Resolvigen til antistofidentifikation over for en manuel metode. Studiet fandt næsten perfekt enighed imellem svaret fra den manuelle metode og svaret fra Resolvigen, når der skulle identificeres ét eller to antistoffer. Så snart der var mere end to, kræves der ofte yderligere analyser for at opnå et sikkert resultat. Dette studie er basseret på 238 patientprøver som er indsamlet specifikt til projektet, hvorfor det er forventeligt, at kvaliteten af prøvematerialet her var højere, da det ikke har været udsat for de samme parametre som vores. Derudover er teststørrelsen en del større, hvilket også kan forklare deres større enighed imellem metoderne i forhold til vores undersøgelse (30). De tre paneler opnåede henholdsvis 9,92 % (Panel A), 24,6 % (Panel B) og 10,32 % (Panel C) flere rigtige svar ved identifikationen af NEQAS prøverne end patientprøverne. Dette kan skyldes at NEQAS prøverne er kontrol materiale og indholdet i disse er dermed mere kontrolleret i forhold til koncentration og mængde, hvorimod indholdet i patientprøverne vil varierer meget fra patient til patient. Desuden var panel B den der opnåede fleste rigtige svar ved identifikation af NEQAS prøverne og Panel A havde fleste rigtige svar ved patientprøverne. Fordelingen af rigtige og forkerte svar: De rigtige antistofsvar er fordelt ud over to kategorier, hvor de fleste stemmer 100 % overens med svaret fra den manuelle metode eller det oplyste NEQAS svar. Dette tyder på, at der er stor enighed imellem den automatiserede metode på AutoVue Innova og den nuværende manuelle metode, hvor kun meget få af resultaterne indeholder et ekstra antistof. De fleste analysesvar indeholdende ekstra antistoffer stammer fra NEQAS prøver. Da det korrekte indehold i NEQAS prøverene er helt sikkert, vides det også med sikkerhed, at disse ekstra antistoffer ikke er til stede i prøven, hvorfor der derfor må være en anden årsag til disse. Ved usikkerhed på reaktionerne i kassetterne tilhørende AutoVue Innova, angiver computersystemet et?, og reaktionen i brønden skal vurderes manuelt og indtastes inden svarafgivelse. Vi kan derigennem have vurderet disse tvivlsomme reaktioner forkert og dermed skabt en reaktion der ikke burde være der og dette kan resultere i ekstra antistoffer, da reaktionsmønsteret bliver anderledes. De ekstra antistoffer kan ligeledes skyldes de underliggende antistoffer i antigrammerne som omtalt tidligere. I denne undersøgelse var det panel C som oftest fandt et antistof ekstra i forhold til det, der var forventet, og Panel A havde flest svar som havde 100 % match, tæt fulgt af panel B. Side 40

42 De forkerte antistofsvar fra panelerne blev uddybet i tre forskellige kategorier med det formål, at redegøre for årsagen til, at panelerne ikke fik det rigtige resultat. Størstedelen af både Panel A og C s forkerte svar skyldes, at de identificerede et helt andet antistof end det svar vi havde forventet. Dette kan skyldes prøvematerialets forringede kvalitet, der desværre udmunder i andre reaktioner i kassetternes brønde, som i sidste ende resulterer i et andet antistofsvar. Samtidig er der også den mulighed, at personalet har lavet en fejl i deres manuelle antistofidentifikation, og det dermed er deres svar, som er det forkerte. Derudover kan vi som tidligere nævnt, have vurderet forkert ved de tvivlsomme reaktioner, der krævede manuel vurdering, og dermed skabt et falsk reaktionsmønster der har udmundet i et forkert antistofsvar. I forbindelse med projektet burde vi derfor have noteret, ved hvilke prøver der blev foretaget en manuel vurdering af reaktionerne. På den måde ville en sammenhæng imellem forkerte antistofsvar og vores manuelle vurderinger kunne observeres, og dette ville medvirke til, at forklare mængden af uoverensstemmelser imellem resultaterne fra den manuelle metode og vores resultater. Årsagen til mængden af falsk negative prøver, samt prøver hvor kun ét ud af flere antistoffer er identificeret kan ligeledes skyldes prøvematerialets kvalitet, som kan være påvirket af gentagne nedfrysninger samt centrifugering. Dette kan medfører, at antistoffer helt forsvinder fra prøven (10,27) I tabel 11 under resultaterne ses hvilke antistoffer, der er involveret, når panelerne fik forkerte antistofsvar, her gælder det for alle tre paneler, at der oftest var mere end ét antistof til stede, når svaret var forkert. Et Italiensk studie der sammenligner to apparaturer (heriblandt AutoVue Innova) til automatiseret analyser til prætransfusion, herunder antistofidentifikation, fandt ligeledes ud af, at så snart der var mere end ét antistof til stede, faldt apparaturernes evne til at identificerer antistofferne, hvilket stemmer godt overens med vores undersøgelse (31). Når man kigger på, hvordan de resterende forkerte svar fordeler sig over enkelte antistoffer, har alle tre paneler flest problemer med at identificere anti-c, hvilket dette forsøg ikke giver nogen umiddelbart begrundelse for. Det var ikke forventet, at dette antistof skulle være sværere at identificere end andre, og det vides derfor heller ikke, om dette er en tilfældighed, eller om dette antistof er mere skrøbeligt over for de parametre vi har udsat det for i forbindelse med denne undersøgelse. Side 41

43 Enighed imellem panelerne: Ud af de i alt 46 prøver er panelerne faktisk enige i deres svar i 22 tilfælde, hvilket svarer til 47,83 %. Det vil sige panelerne er enige i næsten halvdelen, uanset om dette svar så er rigtigt eller forkert. Dog viste det sig, at panelerne var klart mest enige når det gjaldt et såkaldt rigtigt svar, her var 20 ud af de 22 prøver et rigtigt antistofsvar. Mængden af antistoffer i prøven havde også en betydning for, om panelerne var enige, i 68,18 % indeholdte prøverne kun ét antistof. Kun i 4 ud af de 22 prøver kunne panelerne blive enige, når der var mere end ét antistof til stede, hvilket tyder på, at ved et komplekst indhold af antistoffer, skabes større usikkerhed på identifikationen. Dette blev ligeledes bekræftet i ovenstående nævnte studie fra Italien (31). Af de antistofsvar hvor panelerne var enige om at identificere det rigtige, indeholdte 50 % af prøverne anti-k eller Anti-D hvilket tyder på, at alle panelerne har relativt let ved, at identificere disse. Dette stemmer godt overens med kravene fra TMS, og ikke mindst antigramsammensætningerne på panelerne, der skal være distinkte ved antistoffer som disse. Dertil skal det dog siges, at Anti-K og Anti-D ligeledes udgjorde størstedelen af de irregulære antistoffer i teststørrelsen ved denne undersøgelse (28 % tilsammen), hvilket også er med til at forklare, hvorfor der identificeres flere af disse (2). Kommentarer fra Resolvigen: I forbindelse anvendelsen af Resolvigen 3 til projektet fik flere antistofsvar en kommentar med fra softwaren. Disse kommentarer optrådte både ved såkaldte rigtige og forkerte antistofsvar og alle kommentarer var forslag om andre analyser der burde udføres, hvis antistoffet skulle identificeres med sikkerhed. For alle tre paneler var langt størstedelen af kommentarerne knyttet til NEQAS prøver, og kun en enkelt patientprøve ved hvert panel fik en kommentar, hvilket ikke var forventet, eftersom alle panelerne havde lettest ved, at identificere NEQAS prøvernes indhold. Dette er ligeledes en af grundende til, at Resolvigen kan være komplekst at anvende og ikke mindst forvirrende at gennemskue grunden til dens beslutninger, som i visse tilfælde kan fremstå tilfældige (30). I forbindelse med disse kommentarer havde det været relevant, at undersøge om personalet ligeledes har foretaget ekstra analyser for, at identificere antistoffet/antistofferne i de prøver, der fik tilknyttet en kommentar fra Resolvigen 3. Dette havde bidraget til, at vurdere hvorfor Resolvigen ønsker flere analyser. Havde der i forbindelse med udførelsen af en manuel Side 42

44 antistofidentifikation været vanskeligheder, ville det give god mening, at Resolvigen også ønsker flere analyser på prøven. En af grundene til disse kommentarer kan eventuelt skyldes underliggende antistoffer i panelerne, som softwaren ikke kan udelukke pga. antigramsammensætningen. Dette giver god mening i forhold til, at Resolvigen forslår, at fænotypebestemme patientens erytrocytter eller foretage endnu en antistofidentifikation med supplerende panel-testerytrocytter. Begge disse ekstra analyser ville medvirke til, at udelukke eventuelle underliggende antistoffer. Chi 2 test: Der blev anvendt en Chi 2 test til at undersøge om der var sammenhæng imellem de anvendte paneler og mængden af rigtige og forkert antistofsvar. Testen viste ingen statistisk sammenhæng og det kan derfor ikke umiddelbart siges ud fra dette projekt, om det ene panel er bedre til at identificere irregulære antistoffer end det andet. Dette er forventeligt, da to af panelerne produceres af anerkendte firmaer og det tredje af et hospital inden for regionen, som i øvrigt allerede er i anvendelse på KIBA i Kolding, hvorfor alle tre paneler burde ligge på ca. samme niveau af kvalitet. Det har ikke været muligt at finde andre studier der fokuserer på forskellige paneler til antistofidentifikation. Men det tidligere omtalte Italienske studie fra 2007, der sammenligner to forskellige apparaturer (AutoVue Innova vs. Immucor Galileo) til antistofidentifikation, anvendte også to forskellige paneler tilhørende de to apparaturer, og her blev der ligeledes fundet en meget stor overensstemmelse i præstationerne af både apparaturerne og de to forskellige anvendte paneler (31). Titreringerne: Ifølge tabel 14 med titreringsresultaterne ses det, at panel B ikke var i stand til at titrerer nogen af prøverne indeholdende anti-jk a, men panelet kunne godt identificere antistoffet under forsøget med antistofidentifikation, se tabel 9. Kigger man på reaktionsstyrkerne for den brønd hvor Jk a bør identificeres med panel B (brønd 4), ses meget svage reaktioner på kun 0,5 for alle tre prøver (114, 115 og 116), disse reaktionstyrker kan ses i rådata bilag 7.1 side Dette indikerer, at mængden af Jk a er meget lille og dette kan bl.a. være årsag til, at det ikke var muligt at titrere disse. Dette burde der selvfølgelig være taget højde for ved valget af, hvilke prøver der skulle Side 43

45 anvendes til titreringsforsøget. Omvendt viser dette også, at selvom der muligvis findes en meget svag koncentration af et antistof som ikke var muligt at titrere, så var panelet stadigvæk i stand til, at identificere antistoffet via AutoVue Innova og Resolvigen 3. Et Engelsk-Kinesisk studie fra 2015, der omhandler implementeringen af AutoVue Innova som erstatning for manuel analysearbejde forud for blodtransfusion, udførte ligeledes et titreringsforsøg af kliniske relevante irregulære antistoffer. Der blev anvendt kassetter (tilhørende AutoVue) overfor gelkort der anvendes til manuel analyse. Forsøget fandt ingen statistisk signifikansforskel på de metoder, dog var der en generel tendens til, at titerværdierne var højere ved titrering i kassetterne hvilket skyldes kassetternes glasperler, som skaber mere sensitive reaktioner. Blood Transfusion Task Force anbefaler, at en automatiseret metode altid skal være mindst ligeså god som den nuværende, da der aldrig må gås på kompromis med kvaliteten, ovenstående undersøgelse bekræfter her, at automatiseret antistofidentifikation er mindst ligeså god som den manuelle metode (5). Fremtiden for KIBA Færre fejl: Som tidligere nævnt kan komplikationer som følge af irregulære antistoffer have alvorlige konsekvenser for patienten, hvorfor dette til en hver tid bør undgås og eftersom 30 % af alle fejl i forbindelse med transfusion sker i laboratoriet, er der plads til forbedringer (32). Et Amerikansk studie af automatisering inden for transfusionsmedicin vurderede 7 forskellige metoders (både manuelle og automatiserede metoder, herunder AutoVue Innova) totale risiko for fejl (RPN, Risk Priority number). RPN angives ud fra tre parametre; alvorligheden af fejlens konsekvenser, hyppighedsfrekvens og sandsynligheden for at opdage fejlen. Studiet viste, at mængden af fejl kan reduceres signifikant ved anvendelsen af automatiserede analyser, hvor RPN var mellem for de manuelle metoder og kun for de automatiserede. Desuden opnåede AutoVue Innova den laveste RPN af alle de undersøgte automatiserede metoder. Studiet indebærer dog også en interessekonflikt, idet Ortho-Clinical Diagnostics har været en del af udarbejdelsen, hvilket påvirker troværdigheden. Det tidligere omtalte Engelsk- Kinesiske studie fra 2015 viste dog ligeledes, at der var langt færre humane fejl involveret i analysearbejdet, ved implementeringen af AutoVue Innova, hvorfor dette bekræfter ovenstående (4,5). Side 44

46 Brugervenlighed: Det Engelske-Kinesiske studie fra 2015 omkring implementering af AutoVue Innova frem for manuel analysering viste også, at behandlingstiden (turnaround time) af en prøve til prætransfusion faldt med 45 % ved antistofidentifikation og 63 % for blodtypebestemmelse og screentest. En automatisering gavner dermed ikke kun KIBA, men også den rekvirerende afdeling og ikke mindst patienten som hurtigere kan komme i en eventuel transfusionsbehandling (5). Studiet konkluderede ligeledes, at en automatisering af antistofidentifikation skabte en general forbedret arbejdsgang for personalet, da deres arbejdsbyrde blev lettet ved, at apparaturet udførte ting som f.eks. afpipettering automatisk. Derudover kræver den manuelle metode højt kvalificeret personale som nu har frie hænder til andre vigtige opgaver. Det danske sygehusvæsen er udsat for en stor økonomisk udfordring, hvor besparelser også rammer afdelinger som KIBA i Kolding, hvorfor en sådan effektivisering af antistofidentifikation kan være yderst relevant for personalets arbejdsbyrde (5). En anden fordel ved automatisering er den tekniske standardisering, da det ikke kan undgås, at de personer der udfører manuelle analyser, gør det forskelligt, til trods for klare forskrifter. Derudover er der sikkerheds-og sundhedsmæssige fordele for personalet, da en automatisering mindsker den manuelle håndtering og dermed også risikoen for, at blive udsat for potentielt smitsom eller farlig biologiskmateriale (5). KIBA i Kolding har allerede erhvervet sig apparaturet AutoVue Innova og anvender denne til analyser som blodtypebestemmelse og BAC-test, hvorfor implementeringen af antistofidentifikation ikke vil kræve den store økonomiske investering for afdelingen. Derudover giver det god mening, at udnytte de muligheder apparaturet har. Indførelse af Resolvigen: Det tidligere nævnte Indiske studie der bl.a. undersøgte brugervenligheden af Resolvigen oplærte 41 medarbejdere i brugen af softwaren hvorefter de skulle analysere 5 tilfældige prøver indeholdende irregulære antistoffer, og til sidst besvare et spørgeskema. Denne undersøgelse viste, at alle medarbejderne fandt Resolvigen som værende meget nyttig til antistofidentifikation og alle 41 mente, at softwaren gjorde deres daglige arbejde lettere og hurtigere. Derudover blev Resolvigen vurderet som nem at anvende og hurtigt at lære. Dette er dermed nogle af de positive konsekvenser det kan få for KIBA i Kolding, hvis et software som Resolvigen indføres. Et hurtigere Side 45

47 analysesvar vil ligeledes være til gavn for de afdelinger på sygehuset, som venter på resultatet og patientens oplevelse kan forbedres, da en eventuel transfusionsbehandling kan sættes i gang hurtigere (30). Undersøgelsen viste dog også, at klarheden i svarene fra Resolvigen ikke altid var tydelige nok, hvilket stemmer godt overens med vores undersøgelse, som diskuteret tidligere under punktet Resolvigen. Derudover var medarbejderne bekymrede for, at de ved indførelsen af et sådant software, ville miste deres evner til at udføre en manuel antistofidentifikation, hvilket uden tvivl også vil være en uundgåelig bekymring for personalet på KIBA i Kolding, da automatisering ofte anses som en trussel imod personalets kompetencer. Men NEQAS i England har undersøgt landets laboratoriers præstationer inden for udvalgte analyser ved transfusionsmedicin. NEQAS vurderer, at fejl ved identifikation af irregulære antistoffer (ved den manuelle metode) oftest skyldes manglende viden inden for området, som kræver stor erfaring og et dybt kendskab, hvilket altså indikerer, at ikke alt personale kan opnå de tilstrækkelige evner inden for området, hvorfor automatisering kan være en fordel og ikke mindst et bidrag til at mindske mængden af fejl (30,32). Konklusion De tre undersøgte panel-testerytrocytter fra henholdsvis Ortho-Clinical Diagnostics, Odense Universitetshospital og BioRAD adskiller sig fra hinanden på flere punkter i forhold til identifikation af irregulære antistoffer på AutoVue Innova. Antigramsammensætning, pris, og mængden af µl er de områder hvor panelerne adskiller sig mest fra hinanden. Hvad angår evnen til at kommunikere med softwaren Resolvigen, præstation og anvendelse er der stor overensstemmelse imellem panelerne. Der blev ligeledes ikke fundet nogen statistisk sammenhæng på, om panelerne opnåede såkaldte rigtige eller forkerte antistofsvar. Det kan derfor konkluderes, at der ikke er ét af de tre paneler der udmærker sig markant som værende det absolut bedste eller ringeste, derimod er der fordele og ulemper ved anvendelse af de forskellige paneler. Ved af skifte det nuværende panel ud, med ét af de andre vil umiddelbart ikke have den store betydning, men ved implementering af automatisk antistofidentifikation og dermed også paneltesterytrocytter, vil det få visse konsekvenser for Klinisk Immunologisk- og Biokemisk Afdeling på Kolding Sygehus. Ud fra denne og andre undersøgelser kan det konkluderes, at medarbejdernes kompetencer til at udføre en manuel antistofidentifikation vil forringes og der vil være en række nye tiltag som personalet skal oplæres i. Samtidig kan det konkluderes, at der for medarbejderne Side 46

48 på afdelingen vil være mindre manuelt arbejde og et bedre arbejdsmiljø opnås. Derudover vil afdelingen opleve hurtigere svartid på analysen antistofidentifikation og ikke mindst en reduktion i mængden af fejl. Til sidst kan det derfor konkluderes, at en automatisering af antistofidentifikation via AutoVue Innova vil være gavnligt for Klinisk Immunologisk- og Biokemisk Afdeling på Kolding Sygehus. Perspektivering Undersøgelse af forskellige panel-testerytrocytter til antistofidentifikation er relativt nyt, hvorfor det heller ikke var muligt, at finde andre studier der havde fokus på lige netop dette område. Inden valg af hvilke panel-testerytrocytter der skal anvendes på Klinisk Immunologisk- og Biokemisk Afdeling på Kolding Sygehus, bør der eventuelt indhentes mere viden omkring de tre paneler. Denne undersøgelse har en teststørrelse på 46 prøver, hvilket ikke er meget sammenlignet med andre studier inden for transfusionsmedicin og en undersøgelse med en større teststørrelse ville derfor bidrage med mere kvalificeret viden. Derudover var prøvematerialets kvalitet i dette forsøg påvirket af mange parametre som kan have indflydelse på resultaterne, hvorfor yderligere undersøgelse af panel-testerytrocytter bør være af bedre kvalitet og eventuelt med flere irregulære antistoffer repræsenteret. Undersøgelsen viste, at alle tre paneler havde flest fejl ved identifikationen af anti-c, når der vel at mærke kun skulle identificeres ét antistof. Det kunne derfor være interessant at undersøge, om dette var en tilfældighed, eller om anti-c er mere skrøbelig over for de parametre det bliver udsat for. I forbindelse ved vores titreringsforsøg var der mange fejlkilder og forsøget var for småt til egentlig at bidrage med noget særligt, der bør derfor laves et mere omfattende og gennemtænkt titreringsforsøg til undersøgelse af panelernes evne til, at detektere små mængder irregulære antistoffer. Især hvad angår anti-jk a som var et af de antistoffer der gav lidt problemer i forhold til titreringsprojektet i denne undersøgelse. DART rapporten fra 2012 viste at mange hæmolytiske transfusionskomplikationer i Danmark, herunder de alvorlige komplikationer, i perioden 2001 til 2012 skyldtes antistoffer indenfor Kidd systemet (Jk a og Jk b ). Grundet dette, udledes af rapporten, at det bør overvejes hvorvidt patienter med længerevarende kronisk transfusionsbehov bør gives Side 47

49 blod efter Kidd fænotype og dette kan derfor med fordel tages i betragtning med udførelse af yderlige undersøgelser inden for dette område (14). Softwaren Resolvigen 3 var langt hen ad vejen et nyttigt redskab til antistofidentifikation, men samtidig var der også negative elementer i softwaren, da den kommer med mere information end den almindelige medarbejder kan håndtere. I løbet af første kvartal af 2016 udkommer den nyeste udgave, Resolvigen 4, som skulle være mere præcis i forhold til dens informationer, og på mange andre områder være bedre. Softwaren koster kr. inklusiv installation og oplæring. Hvis afdelingen overvejer indførelse af Resolvigen bør de derfor vente til det nye software udkommer og dette projekt bør ligeledes følges op på med en yderligere undersøgelse af Resolvigen 4. Det kunne ligeledes have været interessant at kombinerer de tre antigrammer fra panelerne i Resolvigen, og dermed se, hvilket resultat softwaren ville nå frem til, og om dette ville medfører flere såkaldte rigtige antistofsvar (19). Side 48

50 Referenceliste 1. Aagaard B, Sørensen B, Larsen R, Lustrup F. DART - Hæmovigilancerapport for Aarhus: Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; Report No.: 12. Available from: FINAL.pdf 2. Georgsen J, Hansen MB, Sørensen B. Transfusionsmedicinske Standarder. Aarhus: Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; Report No.: Version 3,5. Available from: 3. Taaning E, Nørgaard A, Glaas GH, Dansk Sygeplejeråd. Immunologi og transfusionsmedicin - Kapitel 18. Kbh.: Dansk Sygeplejeråd : Nyt Nordisk Forlag; South SF, Casina TS, Li L. Exponential error reduction in pretransfusion testing with automation. Transfusion (Paris) Aug 1;52(8):81S 87S. 5. Cheng YW, Wilkinson JM. An experience of the introduction of a blood bank automation system (Ortho AutoVue Innova) in a regional acute hospital. Transfus Apher Sci Aug;53(1): Agger R, Nielsen CH, Leslie G, Aasted B. Immunologi - kapitel 2. Kbh.: Munksgaard Danmark; Taaning E, Nørgaard A, Glaas GH, Dansk Sygeplejeråd. Immunologi og transfusionsmedicin - Kapitel 3. Kbh.: Dansk Sygeplejeråd : Nyt Nordisk Forlag; Taaning E, Nørgaard A, Glaas GH, Dansk Sygeplejeråd. Immunologi og transfusionsmedicin - kapitel 10. Kbh.: Dansk Sygeplejeråd : Nyt Nordisk Forlag; Agger R, Nielsen CH, Leslie G, Aasted B. Immunologi - kapitel 16. Kbh.: Munksgaard Danmark; Agger R, Nielsen CH, Leslie G, Aasted B. Immunologi - kapitel 6. Kbh.: Munksgaard Danmark; Immunoglobulins Available from: Agger R, Nielsen CH, Leslie G, Aasted B. Immunologi - kapitel 1. Kbh.: Munksgaard Danmark; Agger R, Nielsen CH, Leslie G, Aasted B. Immunologi - kapitel 8. Kbh.: Munksgaard Danmark; Riisom K, Aagaard B, Taaning E, Sørensen B, Larsen R. DART - Hæmovigilancerapport for Aarhus: Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; Report No.: 10. Available from: samletfinal-rev v5.pdf 15. Taaning E, Nørgaard A, Glaas GH, Dansk Sygeplejeråd. Immunologi og transfusionsmedicin - kapitel 22. Kbh.: Dansk Sygeplejeråd : Nyt Nordisk Forlag; Jensen TB. Erytrocytserologiske teknikker og metode Udannelses- og brugervejledning til ORTHO AutoVue Innova/Ultra. Version Pub. Nr. J23848DA, Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson, United Kingdom; Ortho Clinical Diagnostics. Ortho Workstation - Ortho BioVue System Handbook. England; 19. Elkrog K, Ortho Clinical Diagnostics, Johnson&Johnson. Lige et par spørgsmål - igen Side 49

51 20. Vinding G, LABEX ApS, Vedbæk. Pris på Bio-Rad panel til antistofidentifikation Videnskabelige udvalg DOS. Godt i gang med forskning - Forskningsvejledning Maj. Available from: BIO-RAD. Coombs Anti-IgG, ID-card, Direct and indirect antiglobulin test. DiaMed GmbH, Switzerland; Available from: Birkler J. Etik i sundhedsvæsnet, kapitel udgave, 5. oplag København: Munksgaard Danmark; 24. Haarder B. Komiteloven - Lov om videnskabsetisk behandling af sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter. Ministeriet for Sundhed og Forebyggelse Jun 14, Available from: Hækkerup N, Kirkegaard LW. Sundhedsloven. Ministeriet for Sundhed og Forebyggelse Nov 14, Available from: Vejledning om biobanker - VEJ nr. 83. Ministeriet for Sundhed og Forebyggelse; Available from: Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged S, Nissen PH. Lyngbyes Laboratoriemedicin, Kapitel 3 - Klinisk biokemi. 2. udgave. Danmark 2010: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; 28. Ortho Clinical Diagnostics. Reagent Red Blood Cells. OrthoClinical Available from: Bio-Rad Laboratories. ID-DiaPanel Plus 6. Bio-Rad Available from: Tiwari AK, Dara RC, Arora D, Aggarwal G, Rawat G, Mitra S, et al. Allo-antibody identification: a software approach! Transfus Apher Sci Oct;51(2): Garozzo G, Licitra V, Criscione R, Comitini N, Noto C, Lomagno R, et al. A comparison of two automated methods for the detection and identification of red blood cell alloantibodies. Blood Transfus Trasfus Sangue Jan;5(1): Milkins C. Performance and practice in UK hospital transfusion laboratories. Transfus Apher Sci Apr;36(2): Side 50

52 Referenceliste over billeder, figurer, ligninger og tabeller Forsidebillede: Rettighederne til brug er købt via Billede 1: Opbygning af blodtypeantigenerne 0, A og B (9) Billede 2: Opbygningen af Immunglobulin Gamma (11)... 8 Billede 3: Aktivering af immunforsvarets B-celler, signal 1, 2 og 3 (12) Billede 4: Differentiering af af B-cellen til antistofproducerende plasmacelle (12) Billede 5: Antistofscreen test i gelkort indeholdende Anti-IgG (Eget billede) Billede 6: Panel-testerytrocytter fra Ortho-Clinical Diagnostics (Eget billede) Billede 7: Ortho BioVue kassetter til AutoVue Innova, indeholdende Anti-IgG (Eget billede) Billede 8: Antistoftiter med faldende reaktionsstyrke grundet fortynding af plasma (Eget billede) Figur 1: Implicerede irregulære antistoffer fundet ved AHTK og FHTK (1) Figur 2: SmartArt over projektets forløb, inddelt i 3 faser Figur 3: Samlede rigtige og forkerte antistofsvar for de tre paneler Figur 4: Rigtige og forkerte antistofsvar for NEQAS prøverne Figur 5: Rigtige og forkerte antistofsvar for patient prøverne Figur 6: Fordelingen af de samlede rigtige antistofsvar for de tre paneler Figur 7: Fordelingen af irregulære antistoffer ved enighed imellem panelerne Figur 8: Fordelingen af de samlede forkerte antistofsvar for de tre paneler, fordelt på tre kategorier Ligning 1: Beregning af antal panelanalyser Ligning 2: Beregning af sandsynlighed til anvendelse ved Chi 2 test Ligning 3: Beregning af forventede værdier: Ligning 4: Formel til beregning af Chi 2 test via Excel funktion Tabel 1: Klinisk relevante irregulære antistoffer (9)... 9 Tabel 2: Antallet af akutte og forsinkede hæmolytiske transfusionskomplikationer fra (13) Tabel 3: Anvendt materiale til udførelse af antisotfscreentest Tabel 4: Anvendt materiale til antistofidentifikation på AutoVue Innova Tabel 5: Anvendt materiale til titrerings forsøget Tabel 6: Oversigt over diverse informationer på de tre anvendte panel-testerytrocytter Tabel 7: Udvalgte panel-testerytrocytter til anvendelse ved titrerings forsøget Tabel 8: Irregulære antistoffer medvirkende i denne undersøgelse Tabel 9: Oversigt over antistofsvar for patientprøverne og NEQAS prøverne med anvendelse af de tre paneler. Grønne resultater kendetegner rigtige antistofsvar og de røde er forkerte svar Tabel 10: Enighed imellem panelerne, både ved forkerte og rigtige antistofsvar, samt graden af enighed ved antallet af antistoffer Tabel 11: Antistoffer impliceret ved forkerte antistofsvar for de tre paneler Tabel 12: Oversigt over mængden af kommentarer fra Resolvigen Tabel 13: Sandsynligheder for rigtige og forkerte antistofsvar samt observerede og forventede værdier ved en Chi 2 test Tabel 14: Titerværdier og karakter for de tre paneler ved titrering af Anti-K og Anti-Jk a Tabel 15: Oversigt over svagheder ved udvalgte antistoffer i antigrammerne for de tre paneler Side 51

53 Bilag 1: AutoVue opbygning Side 52

54 Bilag 2: Antigram for Panel A Ortho-Clinical Diagnostics Side 53

55 Bilag 3: Antigram for Panel B Odense Universitetshospital Side 54